Dimethyl Sulfoxide

导读：随着mRNA疫苗在新冠疫情的推动下异军突起，mRNA在解决未满足的治疗需求方面展示了其潜力。目前，mRNA在感染性疫苗和肿瘤免疫治疗领域较为成熟，并且作为平台技术，在体内外基因编辑、细胞治疗、蛋白质替代疗法以及再生医学疗法领域也取得欣喜的进展。体外转录（IVT, in vitro transcription）是制备mRNA等长链RNA的首选方法，在实验室规模下即可得到μg至mg量级的mRNA。对于科研用户来讲，试剂供应商已摸索出较为通用的IVT反应体系，对于不同长度的RNA（1000~10000 nt）仅需细微调整。但企业用户会考虑工艺放大效应导致的IVT反应体系差异，因此会更加细致地摸索IVT转录比的影响因素。下文中，菌菌将汇总IVT转录比的影响因素，为IVT体系优化和工艺放大提供理论基础。01 IVT反应基本原理mRNA药物生产工艺大致包括质粒生产、质粒线性化、体外转录合成反应（IVT）、mRNA 纯化、LNP 包封五部分。其中，又以IVT反应最为核心、且关键工艺参数最多。IVT反应以 DNA 为模板，并利用 RNA 聚合酶（例如，T7 RNA聚合酶-T7 RNAP）在体外转录合成。主要过程为利用含有 T7 启动子序列的 DNA 为模板在含有 RNA 聚合酶的条件下，以 NTP 为底物、根据碱基互补配对原则(A-U、T-A、G-C)，各核苷酸间通过磷酸二酯键相连形成与模板 DNA 中一条链互补的 mRNA，简单快速获得大量的 mRNA 分子。 图1 IVT反应机理示意图（参考文献[1]）如图1所示，IVT 反应过程可分为模板识别、转录起始、转录延伸、转录终止4个阶段。模板识别阶段主要指RNA聚合酶识别启动子序列并与启动子DNA双链特异性结合的过程。转录起始不需要引物，在此期间，RNA聚合酶结合在启动子上以后，使启动子附近的DNA双链解旋并解链，以促使底物核糖核苷酸与模板DNA的碱基配对。转录起始就是RNA链上第一个核苷酸键的产生。镁离子通过支持RNAP的活性，稳定RNAP-DNA复合物，促进NTP与RNAP的结合，在IVT过程中发挥关键作用。一旦进入转录延伸阶段，底物NTP不断被添加到新生RNA链的3’-OH端，随着转录泡复合体与RNA聚合酶沿着DNA模板向前移动，DNA双螺旋持续解开，暴露出新的单链DNA模板，新生RNA链的3’端不断延伸，在解链区形成稳定且持续的酶伸长复合物。而在解链区的后面，DNA模板链与其原先配对的非模板链重新结合成为双螺旋，RNA链被逐步释放。在遇到终止子序列时，RNA聚合酶和DNA模板之间的相互作用开始被破坏，转录终止。此时，RNA 链中不会继续添加互补 NTP，RNA聚合酶也不再形成新的磷酸二酯键，DNA恢复成双链状态，而RNA聚合酶和RNA链都被从模板上释放出来[2-3]。02 IVT反应关键工艺参数IVT是个复杂的动态反应过程（图2），影响因素除T7 RNAP、NTP、DNA模板以外，转录buffer中的各种成分也是制约IVT反应的关键工艺参数。图2 IVT过程的分子反应示意图（参考文献[1]）（E-RNA聚合酶、D-DNA模板、M- RNA复合物/产物）表1为文献已报道的部分关键工艺参数对IVT反应的影响程度。下文菌菌将依次从关键原料以及转录buffer中的逐个因素，深入梳理各参数对于IVT反应的影响情况。表1 关键工艺参数对IVT反应的影响情注：影响等级由0~3依次变高。2.1 DNA模板DNA模板设计是成功转录的一个组成部分。mRNA 的 IVT 需要一个 DNA 模板，该模板使用上游 RNA 聚合酶启动子位点编码所需信息。模板可以是线性化质粒或PCR产物的形式。转录模板必须包含 T7 RNA 聚合酶启动子序列、5'-UTR、ORF 和 3'-UTR。poly（A）尾部可以包含在质粒中，或通过PCR添加，或通过酶促多聚腺苷酸化在转录后添加。质粒设计必须包括一个独特的限制性内切酶切割位点，用于在所需 3′-末端下游进行线性化。在IVT反应中，DNA模板浓度应该足够高，以保证不会限制反应速率，一般应使用高于 40 nM 的 DNA 浓度来保证最佳IVT生产。 图3 DNA 模板结构示例（参考文献[4]）2.2 T7 RNAPT7 RNA聚合酶是一种来自 T7 噬菌体的 RNA 聚合酶，可催化 DNA 以 5'→3' 方向形成 RNA。T7 聚合酶具有极高的启动子特异性，仅转录 T7 启动子下游的 DNA。如图4所示，T7线性基因组的关键基因可以分为三大类，并且这三大类基因在T7感染周期的不同阶段进行表达：I类基因在感染早期表达，为噬菌体生长建立有利条件；II类是主要参与DNA复制、蛋白编码的基因；III类基因则在噬菌体生长的后期表达，主要编码结构基因。T7RNAP 由 N 端（残基 1-325）和聚合酶（残基 326-883）结构域组成[6-7]。为保证IVT转录比，应添加一定活性的T7 RNA聚合酶；此外，缓冲液中的pH、镁离子等也会影响T7 RNA聚合酶的活性，详见下文。图4 T7 RNA聚合酶结构（参考文献[5]）2.3 NTP浓度如前所述，底物浓度和辅助因子之间存在密切关系，如NTP和Mg2+形成复合物添加到新生mRNA 链中。NTP浓度必须足够高以促进反应。然而，超过一定值的浓度增加则对反应没有显著影响。现有文献报道的数据为，NTP浓度高于7mM对mRNA的产生有积极影响。表2 不同NTP浓度下IVT反应产生mRNA的情况2.4 反应温度现有文献尚未报道反应温度与IVT的直接关系，但温度确实会影响酶与模板启动子的结合，一般IVT反应温度应使用至少为37°C，建议在37°C~44°C之间。同时，如图5所示，高温还可以减少dsRNA的形成，降低产品的免疫原性。此外，在温度控制中应该保证良好的热传导，不完全传热会导致反应产率低，一般混合水浴是最佳选择。图5 IVT 中 dsRNA形成的示意图（参考文献[8]）2.5 转录buffer体系中的影响因素除了上文提到的关键原料，常用的10×转录buffer体系中也有诸多影响IVT反应的因素。10×转录buffer体系一般组成为Tris盐酸盐（Tris-HCl）、氯化镁（MgCl2）、二硫苏糖醇（DTT）、亚精胺，其中Tris-HCl buffer的pH一般为8.0（25℃）。2.5.1 pH值pH值反映了氢（H）离子的浓度，在IVT过程中对酶与DNA模板的结合、酶活性和RNA降解速率起着关键作用。因此，在 IVT 过程中持续监测和控制 pH 值并评估其影响至关重要。T7 RNAP 在 7.9∼ 8.1 的 pH 范围内表现出最佳活性，甚至某些野生型T7RNAP的最佳酶活性谱pH值在7.9~9.5。但在IVT反应期间以及任何下游过程中，应将pH值保持在7~8的范围内，以避免mRNA的碱性水解。如表3所示，为不同pH下，IVT反应产生mRNA的量。表3 不同pH下IVT反应产生mRNA的情况2.5.2 Mg2+浓度与无机焦磷酸酶Mg2+浓度被发现是有效转录的关键因素，它是T7 RNAP酶与DNA模板结合的媒介，同时Mg2+也需要与NTP复合物形成与RNA链的磷酸二酯键。当游离Mg2+浓度低于 5 mM时，转录速率和掺入的NTP的效率会大大降低。然而，Mg2+浓度过高也有利于RNA降解。一般建议浓度范围为40-60mM 以促进mRNA 的合成。在IVT过程中，每个NTP的添加都会导致无机焦磷酸离子和质子H的释放，而无机焦磷酸盐作为反应的副产物，其可与Mg2+发生螯合而形成沉淀物焦磷酸镁（Mg2PPi），进而直接抑制反应速率。因此，为保证RNA产量，IVT反应中常需要加入无机焦磷酸酶来水解PPi，以避免无机焦磷酸盐的过多累积，并确保镁离子留在溶液中，从而优化 T7 RNAP 酶活性[9-10]。2.5.3亚精胺亚精胺是一种脂肪族多胺，对核酸具有高亲和力，可中和负电荷，从而促进DNA的凝聚和聚集。在IVT反应中，亚精胺在转录起始中起重要作用，可使 RNA 聚合酶从质粒模板上解离，作用于 RNA 合成的起始和延伸阶段，刺激转录反应。同时，高浓度的亚精胺也会抑制反应。一般建议浓度为1 ~ 3 mM 之间，以保证促进 mRNA 的IVT进程。2.5.4 DTTDTT是一种还原剂，在转录过程中对维持酶的活性起着重要作用。但现有研究表明，超过10 mM DTT不会改善较短RNA的合成。反应缓冲液需要新鲜的DTT才能获得最佳的酶活性。氧化缓冲液可能导致低产量或低 mRNA 质量，并增加截短转录本的产生。因此，一般建议将DTT分装后进行储存，或者对10×buffer采用现用现配的原则[11]。2.6 其他影响因素除上述因素外，反应中应避免使用反应抑制剂，如RNase和EDTA。EDTA作为Mg2+螯合剂，只在反应终止时加入。RNase应在全程避免，包括使用RNase-Free的物料，及时更换手套等。同时，也有文献报道将通过添加尿素（0.8-1.2M）也可以降低产物中的dsRNA 含量。此外，有研究发现二甲基亚砜（DMSO）可将转录效率提升高15%，但10% DMSO 对于 RNA 产量没有影响，且对于小 RNA 分子，添加 DMSO 会导致全长转录本和流产转录本生成更快[12]。03 总结本文从关键反应原料（DNA模板、T7 RNAP、NTP）、反应温度、转录buffer中等因素，全面梳理了IVT的重要工艺参数，便于大家快速理解IVT反应原理、并针对性地优化IVT反应体系。当前技术下，实验室规模的IVT反应本身没有难度可言，但是如何实现产量的最大化、保证完整性和纯度，同时减少副产物的形成，以达到最佳的反应工艺，这其中为摸索IVT关键工艺参数、交叉影响因素而涉及的实验次数就显得非常庞杂、数量巨大。参考文献[1] K. 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