Dimethyl Sulfoxide

生物活性分子氯代后可以改变生理特性，改善药物代谢动力学和药理学属性。因此，氯带反应对药物发现和药物发展来说是一类很重要的策略。然而，复杂的生物活性分子的直接氯带反应太困难了，以至于不好操作。事实上，很多官能团如羟基，氨基，酰胺基，和羧酸等会通过形成卤键从而较强烈地抑制氯正离子的反应活性。来自北京大学药学院焦宁团队（前一段时间焦老师团队在国际顶刊Science发表了硝基甲烷作为氮供体的 Schmidt类型反应）在著名的Nature子刊Nature Catalysis上报道了DMSO作为催化剂（很常见的有机溶剂吧），NCS作为氯源的芳环的高效氯带反应。该反应体系条件温和，催化剂和试剂廉价易得并且稳定（这个不用阐述了吧，很常见，很便宜吧），关键是反应官能团兼容性很好，可用于复杂天然产物，药物，和肽类化合物的后期修饰。反应体系的克级实验和便宜的DMSO/NCS体系彰显了工业方面的应用价值。 图片来源：Nature Catalysis 在这里我们直接跳过条件筛选吧，直接看一下这个反应体系的应用，该反应体系的最佳反应条件是：DMSO（20%），NCS（1.2 eq.），氯仿作溶剂，25度反应12个小时。首先看一下这个体系用于已批准的药物和天然产物的后期氯带修饰。从下图可以看出，该反应体系具有非常好的催化选择性和催化活性，对多种官能团都表现出良好的兼容性。作者对催化剂进行了比较，最终结论是在DMSO的作用下产率最高。 图片来源：Nature Catalysis 接着，作者考察了该反应体系在多肽类化合物中的应用，表现同样出色。当前，多肽类药物的研究火热，该催化体系可助力多肽药物的化合物筛选和修饰。 图片来源：Nature Catalysis 考察完复杂的活性分子和多肽类化合物后，作者接着考察了普通杂环化合物和普通芳环化合物的底物普适性。同样，底物普适性，官能团兼容性都非常出色，产率最高可达到99%。更为重要的是，该反应体系可用于活性分子Naproxen, gemfibrozil和吲哚类化合物的克级氯代制备，彰显了极大的潜在应用价值。 图片来源：Nature Catalysis 作者对该反应体系进行了一系列的控制实验和理论计算研究，以弄清反应的机理。小编对理论计算一窍不通，在这里只把机理给大家展示一下。大家有兴趣的话，可自行阅读学习。首选，NCS的氯原子和DMSO的氧原子配位，通过A形成极化的中间体DMSO·Cl+ B，中间体B的活性比NCS更高，中间体B与芳环的π电子作用得到中间态C，接着释放出产物和DMSO，DMSO接着进行下一步循环。 图片来源：Nature Catalysis 这里，小编从该篇文章的Supporting Information里把反应的操作截图下来，置于下面，大家可参考。小编相信，该方法的开发必将引领科研院校和公司企业做氯带反应添加DMSO的浪潮，大家觉得呢？ 参考文献：Nat Catal (2019) doi:10.1038/s41929-019-0398-0；首发于【有机合成路线】公众号，为了方便各个公众号转载，故未申请原创！转载和二次转载请注明出处！ 有机合成路线 做一个有用有料有情怀的公众号 很赞的分享↓↓↓

中文摘要 目的   建立并验证肺炎球菌多糖结合物原液中二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）的检测方法。 方法   通过优化反相高效液相色谱法（reversed phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC）中的流动相、柱温以及流速，建立最优检测方法，并对该方法的专属性、线性、准确度、精密度、稳定性等进行验证。 结果   以10%乙腈为流动相、流速为0.6 ml/min，柱温35 ℃时，RP-HPLC检测方法最优。该方法检测干扰成分试验组和对照组中DMSO含量的相对误差在-2.6%~2.1%，分离度均≥1.5；浓度与峰面积呈良好的线性关系，回归决定系数＞0.990 0；各浓度水平检测所得的偏倚值均在-5.31%~-0.89%，95%的偏倚置信上限也低于8.0%；不同浓度精密度在0.70%~4.45%，95%的精密度置信上限不超过8.0%；方法综合能力评价显示在4~50 μg/ml范围内方法总变异不超过7.0%，95%/90%容忍区间和95%预测区间均在80%~120%范围内；检测供试品溶液在20 h内峰面积均值的相对标准偏差均≤2.0%。 结论   成功建立了肺炎球菌多糖结合物原液中DMSO的检测方法，该方法的专属性、线性、准确度、精密度、稳定性良好，综合评价能力高。 正文 肺炎球菌是引起脑膜炎、菌血症、急性中耳炎等疾病的主要病原体，在我国儿童和成年人中导致的发病率和死亡率较高。根据结构特异性可将肺炎球菌分为90多个血清型，其中1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F、23F 10种最常见的血清型引发了全球62%的相关病例。接种多价肺炎球菌荚膜多糖疫苗虽然是预防相关疾病的有效途径，但由于荚膜多糖属于T细胞非依赖性抗原，不能产生高亲和力和免疫记忆抗体，因此不适用于婴幼儿。肺炎球菌荚膜多糖与蛋白的共价偶联能迅速激发人体免疫应答及诱导人体产生免疫记忆抗体，弥补了多糖疫苗的不足。目前国内外已有多种肺炎球菌结合疫苗相继上市，还有多家企业对多种血清型结合疫苗进行了研究，并相继开展了临床前申报或临床试验研究。 肺炎球菌结合疫苗的生产工艺包括氰基活化法、胺还原法、缩合剂缩合法等，工艺不同会产生不同的杂质。为确保工艺的稳定，对于杂质的定量研究是疫苗开发过程中不可缺少的环节，也是结合疫苗质量控制的重要指标。由于二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）作为非质子性溶剂，越来越多地被用于结合疫苗的生产工艺过程中，因此，必须作为工艺相关杂质被纳入质量控制范围。本研究应用反相高效液相色谱法（reversed phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC）建立肺炎球菌多糖结合物原液中DMSO残留量的检测方法，并对该方法的性能进行验证，旨在为未来类似产品研发过程中DMSO残留量的检测提供依据。 1 材料与方法 1.1 材料与仪器 供试品肺炎球菌结合物原液（批号：12F-2310002）、白喉毒素无毒突变体CRM197（批号：2205001）、肺炎球菌降解多糖（批号：20231227001）由北京民海生物科技有限公司自行制备；甲醇（批号：I1291307321）、乙腈（批号：JB128930）均为HPLC级，购自美国Merck公司；DMSO对照品（批号：RNBK8940）、高碘酸钠（批号：MKCP4233）均购自美国Sigma公司；乙二醇（批号：20210319）、十二水磷酸氢二钠（批号：20230213）、二水磷酸二氢钠（批号：20190628）、氯化钠（批号：20230606）均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司，氰基硼氢化钠（批号：20230426）购自北京沃凯生物科技有限公司。以下研究中所用溶液均为纯化水稀释后的溶液。 XPR205DR/A电子天平购自瑞士梅特勒托利多公司，LC-20AD高效液相色谱仪购自日本岛津公司，色谱柱购自美国安捷伦公司，Milli-Q IQ7000超纯水仪购自美国Millipore公司。 1.2 方法的建立与优化 1.2.1　RP-HPLC方法的建立　采用RP-HPLC方法检测DMSO，HPLC检测的具体参数设定如下：色谱柱为Agilent C18（规格：250 mm×4.6 mm，5 μm），流速为0.8 ml/min，进样体积为20 μl，柱温为35 ℃，检测波长为207 nm，运行时间为10 min。 1.2.2　RP-HPLC方法的优化　分别选择10%甲醇、15%甲醇、20%甲醇和10%乙腈作为流动相，其他色谱条件不变；取20 μl 12.5 µg/ml DMSO对照品溶液上样，记录色谱图，通过比较DMSO对应色谱峰的分离情况，选择最佳流动相。分别将柱温设定为25 ℃和35 ℃，流动相选取优化后的结果，其他色谱条件不变；于肺炎球菌结合物原液中加入50 µg/ml DMSO作为供试品，取20 μl上样，测定理论塔板数、分离度、色谱峰的保留时间和峰面积，通过比较以上检测指标数值，选择最佳柱温。分别将流速设定为0.6、0.8、1.0 ml/min，流动相和柱温选择优化后的结果，其他色谱条件不变；于肺炎球菌结合物原液中加入50 µg/ml DMSO作为供试品，取20 μl上样，测定理论塔板数、分离度、色谱峰的保留时间和峰面积，通过比较以上检测指标数值，选择最佳流速。 1.3 方法验证 1.3.1　专属性　将1 000 μl供试品肺炎球菌结合物原液和500 μl 40 μg/ml DMSO溶液混合，加入500 μl纯化水作为对照组，分别加入500 μl 40 μg/ml白喉毒素无毒突变体CRM197、80 μg/ml肺炎球菌降解多糖、80 μg/ml乙二醇、40 μg/ml高碘酸钠、4 μmol/L氰基硼氢化钠、20 989 mmol/L PBS干扰物质作为实验组。取空白溶剂（10%乙腈）、对照品溶液和供试品溶液按照1.2.2优化后的方法上样，记录色谱图，并计算相对误差，计算公式如下： 比较干扰物质与目标物质DMSO分离度及对DMSO浓度的影响。可接受标准：添加干扰物质后DMSO的测定值与对照样品间的相对误差在±5.0%范围内，DMSO的分离度≥1.5。 1.3.2　线性与范围　分别将DMSO对照品溶液用纯化水稀释至1、2、4、10、20、30、40、50 μg/ml，按照1.2.2优化后的方法分别上样检测2次，每次进样20 µl，记录色谱图和目的峰的峰面积。以配制浓度为x轴，峰面积均值为y轴，建立回归方程，并计算回归曲线的决定系数（R2）。可接受标准：R2≥0.990 0。 1.3.3　准确度与精密度　取1批肺炎球菌结合物原液，并加入1.3.2稀释后的不同浓度的DMSO对照品溶液，至DMSO终浓度分别为4、10、20、30、40、50 μg/ml。每个浓度点每次实验平行制备2份。2名实验人员（A1、A2）按照1.2.2优化后的方法分别在2台型号相同的液相色谱仪（E1、E2）于2个不同时间段（R1、R2）上样，并计算各浓度点的回收率及回收率均值，然后计算不同浓度样品实测值的回收率与样品理论值（100%）的差值，通过偏倚值来判断该方法的准确度。可接受标准：样品各浓度的偏倚值在±10.0%范围内，95%的偏倚置信上限不超过8.0%。通过比较每个浓度之间回收率的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）来判断该方法的精密度。可接受标准：样品各浓度回收率的RSD≤10%，95%的偏倚置信上限不超过8.0%。 1.3.4　方法能力的综合评价　通过应用PCMV 1.0和LabSolutions软件分析1.3.3法中检测的关于准确度和精密度的数据，判断1.2.2优化后方法的总变异、方法能力指数、方法误判率、方法分级、预测区间和容忍区间。可接受标准：预测区间和容忍区间在80%~120%范围内，方法能力指数（method capability index，MCI）不低于0.67。 1.3.5　稳定性　由于结合物原液中未检出DMSO残留，因此选择在肺炎球菌结合物原液中加入DMSO（5 μg/ml）作为供试品，进行溶液稳定性考察。使用1.2.2优化后的色谱条件，分别在0、5、10、15、20 h平行进样2次，最后计算所有检测结果中DMSO峰面积均值的RSD。可接受标准：20 h内DMSO峰面积均值的RSD≤2.0%。 1.4 统计学分析 使用PCMV 1.0软件建立检测数据库并进行数据分析，使用LabSolutions软件拟合标准曲线。 2 结果 2.1 RP-HPLC方法的建立与优化结果 由图1可知，当甲醇浓度在10%~20%范围内时，10%甲醇为流动相，DMSO对照品出峰与溶剂倒峰分离更好；由图2可知，10%甲醇与10%乙腈分别为流动相时，10%乙腈为流动相的DMSO对照品出峰与溶剂倒峰分离更好。选择10%乙腈作为流动相。由表1可知，柱温分别为25 ℃和35 ℃时，相邻峰的分离度、峰面积及保留时间无明显差异，但35 ℃条件下检测到的理论塔板数和峰面积均大于25 ℃的检测值，因此选择35 ℃作为检测时柱温。由表2可知，当流速分别为0.6、0.8、1.0 ml/min时，随着流速增大，DMSO保留时间缩短，流速为0.6 ml/min时，分离度最好，大于1.5，且检测到的理论塔板数、峰面积及其保留时间均大于其他2组，选择0.6 ml/min为流速。综上，RP-HPLC方法优化后的条件为：10%乙腈为流动相，流速为0.6 ml/min，柱温35 ℃，进样量20 μl，波长207 nm，运行时间10 min。 2.2 方法验证 2.2.1　专属性　由表3可知，各干扰成分试验组和对照组中DMSO含量的相对误差在-2.6% ~2.1%之间，DMSO的分离度均≥1.5，均符合可接受标准，表明该方法具有良好的专属性。 2.2.2　线性　应用优化后的RP-HPLC上样检测1~50 μg/ml的样品，检测结果以配制浓度为x轴，峰面积平均值为y轴，建立的线性回归方程为y=11 742.1x+4 603.0，拟合度R2=0.999 95，R2符合可接受标准，表明该方法在1~50 μg/ml范围内峰面积的均值与浓度呈现良好的线性关系。 2.2.3　准确度和精密度　由表4—5可知，DMSO样品浓度为4~50 μg/ml时，各浓度水平检测所得的偏倚值均在-5.31%~-0.89%之间，95%的偏倚置信上限也低于8.0%，满足可接受标准，说明该方法的准确度良好。另外，DMSO样品浓度为4~50 μg/ml时，各浓度水平检测所得回收率间的RSD均低于10%，对应的置信上限也均低于8%，均满足要求，说明该检测方法的精密度良好。 2.2.4　方法能力的综合评价　通过分析上述应用优化后的RP-HPLC检测的关于准确度和精密度的数据，对该方法的综合能力进行评价。由表6可知，容忍区间和预测区间均在80%~120%范围内，MCI在0.98~4.42之间，均高于0.76；总变异随着浓度的升高，总体呈减小趋势；方法误判率总体较低，级别为四级时其方法误判率也仅有0.33%。综上说明优化后的RP-HPLC检测方法具有很好的综合能力。 2.2.5　稳定性　应用优化后的RP-HPLC检测方法检测供试品溶液在20 h内的峰面积。检测结果显示，虽然峰面积随着时间的延长呈下降趋势，但在20 h内峰面积均值的RSD均≤2.0%，满足可接受标准，说明该方法的稳定性良好。 3 讨论 本研究成功建立了肺炎球菌结合疫苗原液中DMSO含量的检测方法，并对该方法的专属性、线性、准确度、精密度、稳定性等进行了验证。近年来，国内学者提出了有关方法验证的研究很难从整体体现方法的变异，所用方法是否能满足预期用途缺乏相关的评价分析。从本研究结果来看，精密度、准确度及方法的总变异结果较好，在方法能力指数评价中也显示了较好的结果。在选择的浓度范围内（4~50 μg/ml），各浓度点的MCI在0.98~4.42之间，方法误判率较低。此次验证选择了精密度和准确度联合判定，更加合理、全面地对各个浓度进行精密度、准确度验证，同时也能得到检测方法的总变异及相应的预测区间，为相关技术人员和监管者更好地把握所得参数的可靠性提供依据，更有利于后续的方法转移。 在方法验证中，检测限、定量限的确定也是讨论较多的因素。如何得到科学、可靠的定量限和检测限，中国药典、美国药典等文件给出了较多参考方法，而在实际应用过程中选择哪种方法则需要结合实际情况进行具体分析。本研究选择中国药典2020年版三部中基于响应值标准偏差和标准曲线斜率法进行了定量限和检测限的计算，分别为1.28和0.42 μg/ml，理化方法验证统计软件PCMV预测（利用线性95%的预测区间确定）定量限和检测限分别为1.36 μg/ml和0.48 μg/ml，结果差异较小。但在早期使用不同设备方法进行摸索时发现，计算定量限为3.7 μg/ml（也存在更高浓度的定量限，具体数据省略），主要原因可能是该方法在较低浓度时不同时间、不同设备的响应存在差异。因此，基于前期多次线性结果的分析预测，本研究在精密度和准确度联合验证时样品浓度选择4~50 μg/ml范围，选择可靠性更高、浓度较大的4 μg/ml作为曲线的第1个点。本次实验设计选择了不同时间、不同设备、不同分析人员的3因素2水平全析因设计，最终结果也证明了该范围满足要求，能达到方法预期用途。 总体来说，本次建立的方法专属性良好，能达到肺炎球菌结合疫苗中结合物原液的DMSO残留量检测的要求，在4~50 μg/ml线性良好，准确度和精密度等均符合要求，在方法能力评价中均显示了极低的误判率，达到四级水平以上，在20 h内溶液稳定性良好，为该方法后期的应用和转移提供判断依据。 作者 邓海清 杜闪 王斌 贾松华 郭龙静 朱留强 王艺霞 刘建凯 尹珊珊 北京民海生物科技有限公司结合疫苗新技术研究北京市重点实验室， 北京  102600 通信作者：尹珊珊， Email：yinshanshan@biominhai.com 引用本文：邓海清, 杜闪, 王斌, 等. 肺炎球菌多糖结合物原液中二甲基亚砜残留量检测方法的建立与验证 [J]. 国际生物制品学杂志, 2024, 47(5): 306-311.   DOI: 10.3760/cma.j.cn311962-20240418-00016 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。