Vutrisiran

作者｜豆苗 1998年，Andrew Fire和Craig Mello首次描述了RNAi现象，他们在实验中发现双链RNA（dsRNA）可以特异性地抑制在秀丽线虫中相应基因的表达，这一发现最终为他们赢得了2006年的诺贝尔生理学或医学奖。在RNAi被发现后的25年里，这种转录后基因调控机制为疾病的治疗提供了新的可能性。目前RNAi药物的研发逐步进入临床试验阶段，例如，用于治疗遗传性ATTR淀粉样变性的Patisiran，这是第一个获得FDA批准的基于RNAi的治疗药物，于2018年上市。同时更多基于RNAi的药物正在开发中，针对各种疾病，如病毒感染、肿瘤和遗传疾病等。 图1：RNAi从发现到临床应用的25年合成小干扰RNA（siRNA）通过触发RNAi，具有特异性沉默几乎任何治疗靶点的潜力，拥有前所未有的效力和持久性。当然将这一类创新药物带给患者面临着诸多挑战（比如递送问题），需要持续的进行创新。宏观上看来，随着研究的深入和技术的进步，RNAi也将在生物医药领域扮演越来越重要的角色。  01  RNAi的关键步骤及参与者通过RNAi降解目标mRNA或抑制其翻译的过程涉及多个关键步骤和分子参与者：1） 触发分子的产生：RNAi通常由dsRNA触发，这些dsRNA可以来源于病毒，也可以是基因表达过程中产生的自然副产品，或者是实验室合成介入，在一些情况下，小的发夹RNA（shRNA）或微小RNA（miRNA）也可以引发RNAi机制。2）dsRNA的处理：dsRNA首先被DICER酶切割。DICER是一种核糖核酸酶，能够将长的dsRNA切割成约21-25个核苷酸长的siRNA，siRNA是双链的，含有一个乘载链（guide strand）和一个乘客链（passenger strand）。3）RISC装载：siRNA被纳入到RNA诱导的沉默复合体（RISC）中，在这个过程中，乘客链被降解，而乘载链被保留在RISC中。RISC是一个多蛋白复合体，其核心成分之一是Argonaute蛋白，具有内源性的核酸内切酶活性。4）mRNA识别与降解：装载有siRNA的RISC复合体通过siRNA的乘载链与目标mRNA序列特异性结合。乘载链作为模板，识别并与互补的mRNA序列进行杂交。一旦RISC成功与目标mRNA结合，Argonaute蛋白就会切割mRNA，从而抑制其表达。这种切割发生在siRNA与mRNA杂交的区域。5）翻译抑制与基因沉默：除了通过切割mRNA使其降解外，RNAi机制还可能通过阻止mRNA的翻译来抑制基因表达。在某些情况下，即使mRNA没有被完全降解，RISC的存在也能阻碍翻译机制，从而降低蛋白质的产量。 图2：siRNA药物作用机制  02  siRNA设计的化学修饰策略未修饰的 siRNA代谢稳定性较差，容易在体内立即降解（一分钟内降解 >50%），双链 siRNA 还可以触发先天免疫反应并引起脱靶效应。目前通过引入某些 2′-核糖和末端骨架修饰，包括 2′-OMe、2′-F和硫代磷酸盐（PS），这些问题在很大程度上得到了解决。为了提高siRNA的稳定性、特异性和递送效率，研究者们开发了多种化学修饰策略。这些修饰能够保护siRNA不被降解、减少免疫反应并增强其在体内的生物利用度。一些常见的siRNA化学修饰策略包括：1）磷酸二酯骨架修饰：此类修饰目的在于提高基础的骨架稳定性，包括硫代磷酸盐（Phosphorothioate, PS）和甲基膦酸酯（Methylphosphonate, MP）修饰。PS将磷酸二酯骨架中的一个非桥氧原子替换为硫原子，提高siRNA的稳定性和抗核酸酶降解能力。MP通过在骨架中引入甲基膦酸酯基团，增加siRNA的稳定性。2）核糖修饰：第一种方式是2'-O-甲基（2'-O-methyl, 2'-OMe），在核糖的2'位引入甲基，增加siRNA的抗降解能力，同时减少免疫反应。2'-氟代（2'-Fluoro, 2'-F）也是一种有效的修饰方式，其在核糖的2'位引入氟原子，能够显著提高siRNA的稳定性。此外还有锁核酸（Locked Nucleic Acid, LNA）方法，通过在核糖环上引入一个额外的桥环，使核酸处于锁定构象，提高了结合亲和力和稳定性。3）末端修饰：末端修饰策略包括5'端修饰和3'端修饰，在5'端引入磷酸基团、脂质分子或荧光团，或者在3'端添加氨基、硫醇或脂质分子，可以增强siRNA的稳定性或实现可视化追踪，以及细胞膜穿透能力（3'端修饰）。4）核苷酸碱基修饰：假核苷（Pseudouridine, Ψ）和2-硫代尿苷（2-thiouridine, s2U）等修饰，可以增强siRNA的稳定性并降低免疫反应。5）脂质和聚合物修饰：脂质修饰如胆固醇修饰，可以提高siRNA的细胞摄取效率和血清稳定性。聚乙二醇（Polyethylene Glycol, PEG）修饰则是通过将PEG链连接到siRNA上，增加其水溶性和循环时间，减少免疫反应。6）其他化学修饰：在siRNA中引入部分DNA片段，形成脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleic Acid, DNA）嵌合体，以提高稳定性和减少脱靶效应。此外还有烷基化修饰如烷基磷酸酯修饰，以增强siRNA的抗降解能力和细胞摄取效率。调整siRNA的全局支架对其功能具有重要意义，通过2′-OMe、2′-F、PS和5′-VP修饰能够实现支架的最佳配置，能够有效地形成RISC、导链载荷和目标识别。这些化学修饰策略为siRNA在基因沉默和治疗应用中的有效性和安全性提供了重要保障，通过不断优化这些修饰技术，siRNA在临床应用中的潜力也将不断增加。图3：siRNA结构修饰策略  03  计算机设计与生物筛选siRNA药物的设计需要对遗传信息进行全面分析，包括mRNA表达谱、单核苷酸多态性（SNP）的存在、序列特异性和同源性。生物信息学可以帮助我们在实验验证之前预测 siRNA 的功能、特异性和跨物种靶向性，最终提高 siRNA 先导化合物鉴定的成功率。而多种因素会影响siRNA的治疗效果，有些很容易预测，可信度很高，而另一些则需要大量的实验筛选，因此通常需要联合方法才能确定最佳 siRNA 序列。影响生物信息学在预测高功能siRNA方面整体性能的关键因素包括以下几种。1）siRNA修饰与未修饰的影响。上文我们提到siRNA的化学修饰对于提高其功能性的重要性，但是大多数公开可用的 siRNA 预测算法都基于未经修饰的 siRNA 数据集，这就限制了它们预测修饰 siRNA 的能力。目前的预测方法都比较有限，基于修饰的siRNA开发的算法对未修饰的化合物仍然没有显示出显著的预测能力。2）siRNA在体外与体内的效力。化合物的最佳临床疗效高度依赖于效力，而效力可能因化学修饰和递送实体而有很大差异。体外、体内和临床效力之间的确切关系因为现有数据通常不匹配可能难以解决，尤其是在序列、修饰模式和给药方案发生变化的化合物中。超功能序列有据可查，但对驱动超功能的因素及其预测的信息学的基本理解尚未得到很好的建立。目前的大多数临床先导物都靶向 3' 非翻译区 （UTR），这些区域富含 miRNA 结合位点，为增强基因沉默的局部环境提供了更高的机会。尽管已经探索了许多方法来提高预测准确性，但计算输出与实际运用之间的相关性仍然有限，这主要是由于生物学的复杂性，机器学习方法的使用可以帮助识别序列、修饰和功效之间的模式或相关性，或将推动功能性 siRNA 信息学的发展，而前提是需要在一致的实验条件下从生物学验证中获得大规模、高质量的数据集。3）特异性。靶点特异性是需要考虑的关键因素，脱靶现象的存在使得信息学筛选的准确性受到进一步挑战，由于脱靶而产生的毒性在体内与体外仍然存在差异，据报道，与体外相比，siRNA的脱靶miRNA样调控在体内似乎问题不大，不会产生毒性，这是十分庆幸的一点，但体内组织与细胞类型的差异仍然是需要考虑的因素。4）跨物种靶向性。具有跨物种靶向性的siRNA可以简化并加快候选药物从临床前开发到临床试验的转化，而鉴定此类 siRNA 需要对人类与目标物种之间靶序列的同源性进行分析。转录本的初始比对常用的数据库有NCBI BLAST、Ensembl 和 UCSC Genome Browser。通常情况下人类和实验物种之间的转录组学存在一定程度的差异，因此进行预测以尽量减少两个物种的脱靶效应是具有挑战性的。目前关于介导跨物种活性差异的生物学机制仍然知之甚少且可能是多因素共同调控的，而完全解决这些挑战的计算工具目前还没有被设计出来。  04  siRNA的递送优化策略siRNA 向靶组织或细胞类型的功能递送受多种因素的影响，包括给药途径、生物屏障、外渗、组织或细胞摄取和内体逃逸。LNP 和偶联物是临床批准的 siRNA 递送方法，目前，偶联介导的递送是临床上siRNA递送的主要平台。在 LNP 和 GalNAc 介导的肝脏递送的开发后，当前适合递送的组织正在扩大，对于非肝组织，中枢神经系统（CNS）、眼睛、肺、肌肉和皮肤显示出有希望的进展；其他组织包括肾脏、心脏、脂肪、胎盘和胰腺，也正在探索中。这种扩张主要归因于递送平台和管理模式的创新。虽然使用 GalNAc 偶联物选择性地将 siRNA 递送至肝脏很简单，但选择性递送至 CNS、眼睛、肺和皮肤是通过局部给药实现的。全身给药用于到达肌肉、肾脏、心脏、脂肪、胎盘和胰腺，尽管不是选择性的，但siRNA能够优先以可接受的剂量水平在这些组织的某些细胞类型中积累。 图4：siRNA系统分布及肝脏肾脏的清除作用尽管肝脏是siRNA治疗的主要靶器官，但将siRNA递送到肝外组织仍然是一个重要的研究方向。为了实现这一目标，研究者们开发了多种先进的递送系统，包括靶向递送系统（靶向配体修饰和特异性受体介导的内吞）、非病毒递送载体（纳米颗粒、聚合物载体以及无机纳米材料）、细胞穿膜肽（Cell-Penetrating Peptides, CPPs）（TAT肽）、其他CPPs（Penetratin和Arginine-rich peptides）、工程化外泌体递送以及联合递送策略（多功能纳米载体和局部递送策略）。这些策略提高了siRNA的递送效率和靶向性，已经成熟应用于各领域的研究，比如利用表皮生长因子受体（EGFR）靶向纳米颗粒递送siRNA，用于中枢神经系统疾病的研究；使用PSMA（前列腺特异膜抗原）靶向的siRNA纳米载体，用于前列腺癌的治疗；通过脂质纳米颗粒递送siRNA，靶向心肌细胞，研究心脏病相关基因的功能。随着新材料、新技术和新策略的不断发展，siRNA的肝外递送将会更加高效和安全，进一步扩大其在基因治疗中的应用范围。表1：在各种组织中实现治疗性RNAi的递送技术   05  RNAi疗法已批准及临床药物RNAi疗法近年来在临床研究中取得了显著进展，一些关键的临床进展和已获批准的siRNA药物包括：5.1 已获批准的siRNA药物：a.Patisiran（Onpattro）：由Alnylam Pharmaceuticals开发，用于治疗遗传性甲状腺素转运蛋白淀粉样变性（hATTR）。这是第一个获FDA批准的siRNA药物，通过脂质纳米颗粒（LNP）递送siRNA。b.Givosiran（Givlaari）：同样由Alnylam开发，用于治疗急性肝卟啉病（AHP）。它通过直接抑制ALAS1基因的表达，减少有害代谢物的生成。c.Lumasiran（Oxlumo）：用于治疗原发性高草酸尿症1型（PH1），通过抑制Hao1基因表达，减少草酸盐的生成。d.Inclisiran（Leqvio）：由Novartis开发，用于治疗高胆固醇血症，通过抑制PCSK9基因的表达，降低低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平。5.2 临床试验中的siRNA药物：a.Vutrisiran：用于治疗hATTR，目前正在进行III期临床试验。b.Fitusiran：用于治疗血友病，通过靶向抗凝血酶（AT）来增加凝血因子水平。c.Nedosiran：用于治疗原发性高草酸尿症，通过靶向LDH基因来减少草酸盐的生成。 图5：siRNA药物未来应用前景RNAi临床发展方向事实上也已明了：首先要考虑扩展适应症，包括神经退行性疾病如阿尔茨海默病和帕金森病，通过靶向相关致病基因，调控神经炎症和蛋白质错误折叠。以及向癌症治疗方向发展，靶向肿瘤相关基因或信号通路，如PD-L1、VEGF等，增强免疫应答或抑制肿瘤血管生成。此外还有罕见遗传病治疗方向，通过精准靶向致病基因，提供新的治疗方案，如杜氏肌营养不良症（DMD）、囊性纤维化（CF）等。然后改进递送系统，开发更有效的递送系统，将siRNA递送到肝外组织和器官，如心脏、肺部、肌肉等，提高治疗范围。开发生物相容性更好的聚合物、无机纳米颗粒和外泌体等，增强siRNA的稳定性和递送效率。开发局部给药途径如皮下注射、肌肉注射、鼻腔喷雾等，减少全身副作用，提高靶向组织的药物浓度。然后探究降低脱靶效应和免疫反应的策略，做到使用生物信息学工具精确设计siRNA序列，以及通过化学修饰减少siRNA引发的免疫反应，提高其在体内的稳定性和安全性。最后是联合疗法的运用，与传统小分子药物或生物制剂联合使用，增强治疗效果，降低耐药性；与基因编辑技术如CRISPR-Cas9系统联合使用，提供多层次的基因调控手段，实现更精准的治疗。 图6：临床适应症和靶点选择随着技术的不断进步和对siRNA生物学机制的深入了解，siRNA疗法在临床上的应用前景广阔。未来，siRNA有望在更多的疾病领域展示其治疗潜力，尤其是在难治性和罕见病治疗方面。同时，通过优化递送系统和降低副作用，siRNA疗法将变得更加安全和有效，为患者带来更多的治疗选择。参考文献：1.Tang Q, Khvorova A. RNAi-based drug design: considerations and future directions. Nat Rev Drug Discov. 2024;23(5):341-364.2.Hoy, S. M. Patisiran: first global approval. Drugs 78, 1625–1631 (2018).3.Khvorova, A. & Watts, J. K. The chemical evolution of oligonucleotide therapies of clinical utility. Nat. Biotechnol. 35, 238–248 (2017).4.Trajanoska, K. et al. From target discovery to clinical drug development with human genetics. Nature 620, 737–745 (2023).  BiG 十周年预告  本次BiG十周年庆典，将首次分为国内和国际篇章，以原创科学和临床需求为出发点，讨论创新技术平台和创新疗法（PROTACT/分子胶、双抗/ADC、siRNA/ASO、CGT、AI制药）的重大进展和发展前景，十年一药曙光现，大浪淘沙始见金！▼报名参会 会议门票：审核制(免费)；含主论坛+分论坛，不含餐；优先biotech/Pharma、临床、院校科学家共建Biomedical创新生态圈！如何加入BiG会员？

前言此前，BiG的专题系列归纳总结了国内外龙头企业的小核酸核心平台、管线、商业布局、交易融资等情况。其中，第一篇介绍了“Alnylam：引领RNAi二十年，目标成为TOP5 Biotech”。本文，让我们站在 Alnylam Pharmaceuticals 制药公司前任创始CEO John Maraganore 的独特视角，一起深入了解这家小核酸龙头企业的二十年非凡历程！作者｜John Maraganore, Alnylam Pharmaceuticals制药公司前任创始CEO19 年非凡旅程，他带领一家治疗方式未经证实的小型初创公司成为一家成熟的制药公司，在近 20 个国家/地区拥有上市产品、拥有超过1,600 名员工。“理性的人使自己适应世界;不讲道理的人坚持试图让世界适应他自己。因此，一切进步都取决于不讲道理的人。”——爱尔兰剧作家萧伯纳（George Bernard Shaw）2021 年 12 月 31 日，我离开了 Alnylam Pharmaceuticals，结束了 19 年的创始首席执行官之旅。随着 Alnylam 作为一家引领RNA干扰（RNAi）革命的公司开始其第20年旅程，我想重点介绍建立这家公司所经历的高潮和低谷，从早期的创业公司到成熟的独立全球生物制药公司，这种案例在生物技术史上是很少实现的。RNAi的核心技术，最早由Andrew Fire和Craig Mello在秀丽隐杆线虫中提到，前景广阔，但该领域面临着巨大的障碍，包括知识产权（IP）之争，学习如何将药物递送至相关器官和细胞类型，展示动物和人类的概念验证（POC）以及建立强大的管道。我们需要在做到这一点的同时，确保能够获得持续融资。如今，随着四种RNAi治疗药物在全球上市，第五个药物项目也正在注册，十几个项目处于临床开发阶段。令人欣慰的是，Alnylam团队能够克服这些障碍，因为我们学会了如何建立一个纯粹的创新型公司（图1）。有些经验教训可能是我们自己的，但更多的经验教训是建立任何企业的共同点：需要明确的愿景和使命、强大的创始知识产权、强大的科学平台可供利用，以及有弹性的文化，以抵御将新疗法推向市场时不可避免地出现的挑战。图1：Alnylam时间线  01  新的开始2001年初，在千禧制药（Millennium Pharmaceuticals）公司工作时，我接到了麻省理工学院（MIT）著名教授、诺贝尔奖获得者菲尔·夏普（Phil Sharp）的电话。菲尔和我在渤健工作了十年，是渤健的创始人、董事和科学顾问委员会主席。在我们的电话中，菲尔想知道Millennium是否有兴趣更多地了解他和合作者在RNAi和哺乳动物细胞上所做的工作。我当时对RNAi知之甚少，总体印象是它是一种仅限于无脊椎动物和植物的生物工艺。在短短几周内，一群Millennium科学家会见了菲尔、戴夫·巴特尔Dave Bartel（怀特黑德研究所）、菲尔·扎莫尔Phil Zamore（马萨诸塞大学）和汤姆·图施尔Tom Tuschl （当时在马克斯普朗克研究所，现在在洛克菲勒大学）。Tuschl介绍了他的实验室的发现（后来于2001年5月发表在《自然》杂志上）表明，合成的小干扰RNA（siRNA）可以通过哺乳动物细胞中基于序列的机制介导靶向基因沉默。研究结果的重要性一目了然。对于像Millennium这样从事后基因组学研究的公司来说，通过特异性沉默任何单个mRNA来询问基因功能的工具将非常强大。会议结束后的几天，我打电话给Phil，告诉他Millennium将对RNAi IP的独家许可感兴趣，并愿意投资一家新公司来探索siRNA的治疗潜力。但在与他的合作者和麻省理工学院的技术许可办公室专家丽塔·尼尔森（Lita Nelsen）商议后，菲尔提出了一个非排他性的研究许可，并表示不愿意创办一家治疗公司。因此，Millennium成为“Tuschl I”和“Tuschl II”研究用途专利的首批被许可人之一。不到一年，我就开始听说他们成立了Alnylam。当时在Polaris Ventures工作的Christoph Westphal和Cardinal Partners的John Clarke为新公司提供了250万美元的A轮融资。Christoph为这项工作带来了强度和激情，而John则带来了必不可少的经验。菲尔和他的四位合作者与斯克里普斯研究科学家和生物企业家保罗·施梅尔（Paul Schimmel）一起成为公司创始人。Paul （应菲尔的要求）在那里主要帮助引导初创公司，他将公司的原名“Precision Therapeutics”改为“Alnylam Pharmaceutics”。Paul 最喜欢的姨妈是一位阿拉伯学者，而“al nilam”的意思是“一串珍珠”（对RNA中核苷酸链的致敬），也是猎户座腰带中心恒星的名字。2002年初夏，在与Atlas Ventures的Jean-Francois Formela和Peter Barrett的电话中，我得知他们已经加入了Arch Ventures的Bob Nelson团队，成为B轮投资者，以完善Alnylam集团。他们想知道我是否有兴趣加入 Alnylam 担任首席执行官，并建议与 Phil 进行后续会面，听听他对科学的看法。我很难拒绝与菲尔的会面，那年夏天晚些时候我和他谈过。虽然在Millennium很满意，但当我开始进一步深入研究RNAi时，我清楚地认识到它有可能创造一类新的创新药物。与此同时，很明显，实现siRNA的递送将是该技术的关键障碍。每天早上开车去上班时，我都会不停地思考RNAi作为一种新方法的潜力。这就像在七十年代末或八十年代初创办一家单克隆抗体治疗公司一样。然而，许多朋友和同事（包括我的两个大孩子）认为我犯了一个错误，并警告我不要这样做。当时，“基因组学泡沫”破灭后，生物技术行业处于黑暗的冬天，对新科学的投资非常不受欢迎。能否克服并在合理的时间内完成实现 siRNA 递送的挑战吗？这家新企业能否成功筹集到数十亿美元，来创造一个成功的生物技术公司？是否有可能摆脱传统药物发现的变幻莫测，建立一个可靠、可重复和模块化的研发平台，以实现可持续的创新？这些问题在我的脑海中盘旋。当时Millennium所处的激动人心的时期也让我犹豫不决。同类首创的蛋白酶体抑制剂Velcade（硼替佐米）有望加速批准用于治疗多发性骨髓瘤，Millennium首席执行官Mark Levin希望我留下来，帮助公司进入新的商业阶段。然而，Mark也是一位朋友和导师，他鼓励我去追求最让我兴奋的事情。我一直在想的是，如果技术障碍可以被克服，RNAi疗法是一个不容忽视的机会。在个人层面上，我最近再婚了。我的 Alnylam CEO 录取通知书被寄到了我在毛里求斯的蜜月套房。我觉得我正处于一个新的开始时期。我决定冒险一试。  02  操盘IP 在 2002 年 12 月我作为 Alnylam 首席执行官的第一次董事会会议上，我提出了我的愿景和使命，以明确公司的抱负和方向。这是Mark在Millennium教给我的东西。我们的愿景：利用生物学的革命促进人类健康。我们的使命：建立一家基于RNAi的独立顶级生物制药公司。值得注意的是，这些官方用语自那以后就没有改变过。我从一开始就知道，Alnylam需要从投资者和制药合作伙伴那里筹集大量资金，才能将RNAi疗法带给患者。我们计划需要 10 亿到 20 亿美元的资本和 10-20 年的时间来实现这一目标。我还知道，在这门新兴科学上拥有强大的知识产权地位至关重要。因此，我在慕尼黑工作的第一天，与马克斯·普朗克技术许可办公室（当时称为Garching Innovation）会面，这也许并不奇怪。我们的目标是敲定Tuschl I和II基本专利家族的许可协议，其中马克斯·普朗克（Max Planck）代表四个学术机构（其他机构是麻省理工学院，怀特黑德研究所和马萨诸塞大学）牵头处理治疗应用的许可权。马克斯·普朗克（Max Planck）带头是合适的，因为关键的Tuschl II专利家族是其唯一的发明，而Tuschl I则由四个机构共同拥有。马克斯·普朗克（Max Planck）对这项发明在欧盟带来经济增长有着浓厚的兴趣。因此，马克斯·普朗克（Max Planck）要求我们在几年内为Alnylam建立欧盟业务，以获得许可证。这对我们来说很难下咽，尤其是在融资困难的情况下，但我们别无选择。为了最终敲定协议，马克斯·普朗克需要其他三位共同所有者的同意。马萨诸塞大学不同意这些条款，经过竞争性招标过程，最终以> 600 万美元的现金将其 Tuschl I 权利授权给 Sirna Therapeutics——另一家从 Ribozyme Therapeutics 改造而来的 RNAi 新贵。因此，我们的许可证在Tuschl I上与UMass共同排他，但在Tuschl II上独占。接下来，我们需要获得该领域的另一个早期知识产权家族：德国初创公司Ribopharma持有的Kreutzer-Limmer专利。Kreutzer-Limmer专利的优先权日期在1999年，远远早于Tuschl I和Tuschl II，紧随Fire和Mello专利之后，这些专利以卡内基研究所的非排他性许可形式广泛提供。2003 年初，我们与 Roland Kreutzer 和 Stefan Limmer会面，讨论与 Ribopharma 的潜在合并。然后，我们参观了他们在库尔姆巴赫的设施，并对他们组建的由生物化学家Hans-Peter Vornlocher领导的科学团队印象深刻。与Ribopharma合并将扩大我们的专利领导地位，增强我们的研究能力，并一举履行我们在欧洲的马克斯普朗克义务。我们于 2003 年 7 月宣布了对 Ribopharma 并购。在一年之内，我们开始准备首次公开募股（IPO），我们还聘请了我在Millennium的前同事巴里·格林（Barry Greene）担任首席运营官（他后来成为总裁）。在2004年初我们向美国证券交易委员会（SEC）提交S-1文件后不久，我们对Isis Pharmaceuticals（现为Ionis）的索赔感到惊讶和困惑，该声明称我们与siRNA治疗相关的活动侵犯了Ionis的某些化学专利。我们正处于研发的早期阶段，距离siRNA疗法的商业化还有数年时间，因此在“安全港”范围内，药物开发商可以免受侵权索赔。此外，我们在成立之初就对RNAi的知识产权环境进行了广泛的调查，并相信我们可以在任何现有知识产权之外运作。然而，我们确实认识到Ionis的索赔可能会影响我们的IPO，因此我们开始谈判并达成了一项广泛的交叉许可协议，此后多年创建了“pax oligo”。然后，我们推进了我们的IPO计划。你可能以为知识产权的故事到此已经结束了，但当制药巨头默克在2006年底以11亿美元收购Sirna时，情况突然发生了变化。默克公司仍然需要获得Tuschl II的许可，才能将siRNA疗法商业化。在Tuschl I申请中引进和起诉Tuschl II专利权利要求的努力导致Tuschl II权利要求无法获得批准。唯一的出路是通过法院，2009 年，我们对于马克斯·普朗克和阿尼拉姆诉马萨诸塞大学、怀特黑德和麻省理工学院提起诉讼。两年后，该协议得到解决，此后我们获得了多项Tuschl II专利。但直到 2014 年，Tuschl IP 遗产的传奇故事才最终平息，当时 Alnylam 以 1.75 亿美元的价格从默克手中收购了 Sirna，将 Tuschl I 和 Tuschl II 的专有权牢牢地带到了 Alnylam 内部。默克公司坚信，Sirna的技术最好由像Alnylam这样有决心的创业公司来提供。他们是对的！事后看来，也许我们应该在2003年向马萨诸塞大学支付更多的前期现金，并超过Sirna的出价，但另一方面，从默克公司内部收购Sirna后，我们不仅得到了超过10亿美元的额外投资，还得到了宝贵的技术和人才。当然，Alnylam 和 Sirna 的故事也为企业文化在生物技术公司中的重要性提供了难得的一课（插文 1）。插文1 生物技术领域的“企业文化的随机、对照研究”Sirna Therapeutics（原名 Ribozyme Pharmaceuticals）成立于2003年初，此前包括 Venrock、Oxford Biosciences 和 TVM 在内的一些蓝筹投资者对业务进行了资本重组。Sirna 成为Alnylam的劲敌，经常争夺知识产权和商业交易。在幕后，我能够与Sirna首席执行官Howard Robin（现任Nektar Therapeutics首席执行官）保持亲切友好的关系，包括在旧金山摩根大通医疗保健会议期间在克利夫特酒店举行的年度午餐。到 2006 年，Alnylam 和 Sirna 具有相似的特征：各自拥有约 100 名员工，市值约为 5 亿美元，并且各自拥有两到三个经过验证的制药合作伙伴关系。同年10月，默克以11亿美元的价格收购了Sirna，溢价102%。Sirna的收购是RNAi领域的一个决定性事件，但它也创造了我所说的生物技术领域的“关于企业文化的随机、对照研究”。事实上，从 2006 年到 2014 年初的大约七年时间里，Alnylam 保持独立，在其科学上投资了 ~5 亿美元，创造了 40 亿美元的市值，并提交了 8 项 IND（其中两项用于现在上市的产品）。相比之下，该研究的“Sirna部门”在科学上投资了~15亿美元，但没有产生任何IND，并于2014年被Alnylam以1.75亿美元的价格收购，仅占默克收购和投资成本的一小部分。这些截然不同的结果凸显了企业文化在生物技术中的力量。在Alnylam，我们愿意承担适当的风险，甚至将“不完美”的分子推进到开发阶段，以安全地从早期的人体研究中学习。此外，作为一个纯粹的玩家，Alnylam有一种“对死亡的恐惧”，这使得我们成功地将RNAi疗法推向市场。但Sirna是一家大公司的一部分，需要满足候选药物的某些标准，而RNAi离“生死攸关”的命题还很远。著名的管理顾问彼得·德鲁克（Peter Drucker）曾经说过：“文化能把战略当早餐吃掉”（意思是无论你的战略多么的有效，如果没有企业文化的有效支撑，最终可能只是一纸空文）。就 Alnylam 的故事而言——也许还有许多其它生物技术公司——这种说法还很保守！  03  理性繁荣Alnylam的早期以“理性繁荣”为标志，认为RNAi是一种潜在的新药颠覆性技术。2003年初，《科学》杂志授予siRNA“年度分子”称号，《福布斯》在RNAi上发表了一篇文章，称其为“生物技术的十亿美元突破”。当时的情绪让人想起今天对基因编辑技术的热情。对于Alnylam来说，投资者和制药公司的浓厚兴趣使我们能够在获得临床数据之前就筹集资金并建立稳固的合作伙伴关系。我们还吸引了一支强大的创始科学家团队，包括来自Ionis的首席化学家Muthiah 'Mano' Manoharan;来自Biogen的Victor Kotelianski;和来自Millennium的雷切尔·迈耶斯（Rachel Meyers）。作为一家私营公司，我们还很年轻。我们在 A 轮和 B 轮融资（均为 2002 年）中共筹集了 1750 万美元，在 2003 年与 Ribopharma 合并相关的 C 轮融资中筹集了 2460 万美元，当时我们增加了 Abingworth 作为新投资者。然后，我们转向了公开市场。尽管对RNAi充满热情，但当时大多数上市公司的资产都处于第二或第三阶段，甚至已经上市。我们于 2004 年 5 月在生物技术市场不稳定的情况下完成了IPO（我们曾争论过是否推迟上市），以 9800 万美元的投前估值（比我们的发行价低 ~50%）和 6 美元的股价筹集了 3000 万美元。这使我们成为自基因组学泡沫破裂以来第一家进入公开市场的临床前公司。IPO经常被公司管理层和董事会浪漫化为一个特殊的“小鹰”时刻，但实际上它们只是融资事件。对我们来说，关键是要有足够的新闻流，包括科学和管道的进展，以及合作伙伴关系，以吸引公众投资者的持续兴趣。我们有信心。Alnylam还受益于与主要制药公司的合作。在观察了Millennium在过去十年中非凡的交易后，我认识到制药联盟主要与资金和外部验证有关，如果结构正确，可以对公司推进自己的科学和管道的能力征收最小的“税”。尽管明显有例外，但伙伴关系很少能提供经常宣传的“老大哥”利益（如药物发现和开发专业知识）。我们的第一笔交易是在2003年底与默克公司达成的。时任默克公司分子分析和癌症研究负责人的斯蒂芬·弗兰德（Stephen Friend）热衷于利用RNAi技术进行体内靶标验证。我们不愿意做一项仅限于使用RNAi作为“工具”的交易，因此我们扩大了合作伙伴关系，包括默克公司提供的治疗靶点的工作。虽然这笔交易只为我们带来了 750 万美元的预付款，但它仍然代表了对 Alnylam 科学的关键验证。此外，RNAi还引起了时任诺华生物研究所（NIBR）负责人马克·菲什曼（Mark Fishman）的注意。Mark对RNAi疗法的兴趣要大得多，并责成他的业务发展主管Jeremy Levin评估与Alnylam或Sirna Therapeutics的潜在交易。Alnylam 以 5680 万澳元的预付款中标，其中包括购买该公司 19.9% 的股份。与Sirna相比，我们是一个更强大的科学合作伙伴，我们也是邻居，就在剑桥的肯德尔广场。在联盟中，诺华获得了针对30个靶点开发RNAi疗法的权利。当时，我们在授予诺华的权利范围上非常纠结，但最终认为RNAi的机会范围将远远高于这个数字。也许是为了回应我们的诺华交易，默克很快通过竞争程序收购了Sirna。在审查了与Sirna收购相关的SEC文件后，我们推测罗氏也是竞标者，并与他们联系，以探索对非独家获得我们平台的转型交易的兴趣（在许多方面都是前所未有的设计）。我们达成了一项协议，罗氏赢得了有限数量治疗领域的Alnylam IP的非独家使用权，并以3.31亿美元的预付款收购了我们的Kulmbach工厂（前身为Ribopharma）。重要的是，Alnylam保留了Ribopharma IP的所有权和控制权。在我设法与罗氏和我们的董事会达成一致后，Barry 帮助推动了这笔交易的完成。一年后，我们与武田达成了类似的非独家平台协议，这是与日本一家大型制药公司达成的最大技术交易之一。同样，Barry 是这里成功的关键，但这次他能够与我们的业务发展主管 Jason Rhodes 合作。有好一阵子，人们都觉得似乎没有什么能阻止RNAi快车前行。RNAi疗法作为一类潜在的新药具有巨大的光环，许多制药研发负责人都不想错过这个机会。Alnylam的资产负债表得到了数亿美元现金的支持。但在新十年开始时，情况开始变得更糟。我们的制药合作伙伴发现递送比最初希望的更具挑战性，部分原因是他们希望将RNAi纳入其既定的治疗领域（例如肿瘤学），而不是简单地遵循科学和技术可能引导他们的方向。早期我们认为相对容易的项目，不管是利用“直接递送”靶向眼部或肺部疾病基因，还是利用“全身递送”靶向肝脏疾病基因，都是不够的。当面对在肝脏基因靶点上建立广泛的RNAi联盟的机会时，一位制药研发主管感叹说，感兴趣的靶点太少了！RNAi疗法的低迷始于2010年9月，当时诺华拒绝行使其1亿美元的选择权，以收购Alnylam技术的广泛非排他性权利。在此之后，罗氏的领导层变动和经济衰退导致的损益压力导致其在仅仅三年的踮跺后就放弃了对RNAi的投资。至少可以说，关于RNAi的外部情绪急剧恶化。2011年初，《纽约时报》科学记者安德鲁·波拉克（Andrew Pollack）在一篇题为“制药商对RNA干扰力量的狂热已经冷却”的文章中对此进行了最好的描述。直到今天，我的办公桌上还保留着这篇文章的纸质副本。随着制药公司退出该领域，许多投资者也退出了这一领域。ALNY只能开始以现金价格交易，一个重要的资金来源枯竭了。虽然我们从商业联盟和股权融资中积累了强劲的现金资产负债表，但是我们还有很长的路要走，公司很快就要成立十周年了，却没有一项人体 POC。我们别无选择，只能裁员，以便我们可以“多活一天”。在我担任首席执行官的职业生涯中，最痛苦的决定之一是，我们在 2010 年 9 月解雇了 ~25% 的员工，然后在 2012 年初又解雇了 ~33%。我学会了以同理心和同情心处理这样的艰难时刻的重要性。巴里和我积极努力为所有离职员工寻找新工作。我们保留了一份受影响员工及其新的潜在工作前景的名单，并每周在我们的管理委员会会议上对其进行审查。我亲自联系了整个行业内的许多联系人，为我们的离职人员寻找新的去向。我们的前库尔姆巴赫同事，从罗氏分离出来，成立了一个成功的RNA服务企业Axolabs，以向蝾螈（ axolotl salamander）的再生特性致敬。  04  征服递送我们从一开始就知道，将siRNA从实验工具转化为药物并不容易！双链siRNA分子大，带电荷高，易生物降解，易刺激免疫，体内给药后迅速清除。实现将 siRNA 递送至靶细胞和组织的细胞质以影响 RNA 诱导的沉默复合物 （RISC） 介导的基因沉默成为我们“曼哈顿计划式”的主要关注点。我们的策略是多管齐下，包括偶联物、脂质纳米颗粒（我们创造的一个术语）和生物材料。在早期，我们的递送工作占Alnylam研发投资的>80%，包括与学术团体和公司的多次外部合作。在Alnylam的第一个十年中，对一系列组织的数十种外部采购的递送系统进行了评估，结果几乎都令人失望。使用胆固醇偶联物取得了早期的胜利。在 2004 年 Soutschek 等人发表的一篇开创性论文中，我们证明了小鼠治疗性基因沉默的第一个证据，靶向肝脏表达的载脂蛋白B（apoB）。我们能够显示 apoB 的强劲敲低和低密度脂蛋白 （LDL） 胆固醇水平的降低。不幸的是，这些胆固醇-siRNA偶联物需要非常高的剂量，50-100 mg/kg，我们提高其效力的所有努力都失败了。当时，我们错误地避免对siRNA进行广泛的骨架修饰，担心反义寡核苷酸（ASO）经常出现的毒性;结果，共轭似乎是一条死胡同。事后看来，我们非常接近实现一个递送解决方案，该解决方案可以将我们的产品上市时间缩短数年，但我们受困于不完整的知识和确定偏差——这些都是阻碍科学努力的常见因素。我们将注意力转向脂质纳米颗粒（LNPs），与麻省理工学院的Bob Langer和Dan Anderson的合作，以及与温哥华公司Protiva（后来与Tekmira合并，现在更名为Arbutus）的单独合作，显示出有希望的早期结果。我们的合作在非人灵长类动物研究中，使用含有可电离脂质、1,2-二乙醇氧基-N，N-二甲基-3-氨基丙烷（DLinDMA）和靶向apoB的siRNA的脂质纳米颗粒取得了早期成功。这项工作发表在Zimmerman等人2006年的一篇开创性论文中。这激发了上述提及的制药公司对该领域的大部分兴趣，包括默克公司以 11 亿美元收购 Sirna。LNPs的问题在于治疗指数狭窄，对病态毒性的急剧发作具有陡峭的剂量反应。Akshay Vaishnaw（当时的首席医疗官，现任 Alnylam 总裁）和他的团队在领导我们的整体开发工作时，找不到可接受的治疗指标来支持开发。我们最初的LNP工作之一是针对肝细胞癌，并使用了从Langer-Anderson合作中发现的可电离脂质，但在啮齿动物和灵长类动物毒理学研究后，我们停止了开发，我们发现没有可接受的治疗指标来支持临床开发，即使在癌症适应症中也是如此。我们对这些发现感到清醒，并转向Protiva与基于DLinDMA的LNP的合作，以推进ALN-VSP肝癌项目（靶向血管内皮生长因子（VEGF）和驱动蛋白家族成员11（KSP）的两种siRNA的混合物）。但在这里，治疗指数也受到限制，开发这这个项目被认为是棘手的。很明显，我们需要新的脂质来改善LNP的效力和安全性。为此，我们在 2006 年与 Inex 建立了合作关系。Inex 由不列颠哥伦比亚大学的 Pieter Cullis 创立，是 Protiva 的母公司。2008年5月，Inex和Protiva达成法律和解（部分由Alnylam斡旋），两家公司宣布合并。合并后的公司更名为Tekmira，并将重点从发现新型脂质转移到使用DLinDMA作为其“首选”可电离脂质的输送。我们仍然相信我们需要更有效的可电离脂质，在Tekmira的同意下，我们与Cullis和两名前Inex员工Tom Madden和Mick Hope建立了合作关系。他们成立了一家名为AlCana的公司（Alnylam和加拿大的合资公司），Alnylam-AlCana的关系开始寻求新型可电离脂质，最终导致了MC3脂质（例如，1,2-二亚油酰甲基-4-二甲氨基丁酸酯;DLin-MC3-DMA）。Alnylam 在这项合作项目中的主要支持者之一是 Akin Akinc，他是 Langer 实验室的门徒，也是 Alnylam 的早期科学家。与 DLinDMA LNP 相比，含 MC3 的 LNP 显示出 ~100 倍的效力提高，并且治疗指数也类似地扩大。这种影响的最终证据体现在我们针对转甲状腺素蛋白 （TTR） 介导的淀粉样变性 （ATTR） 的前两个临床项目中，即 ALN-TTR01 和 ALN-TTR02 （patisiran）。ALN-TTR01 和 ALN-TTR02 包含相同的靶向 TTR 的 siRNA 有效载荷，但分别采用 DLinDMA LNP 或 MC3 LNP。结果令人惊叹：新型MC3 LNP（DLin-MC3-DMA）实现了有效的TTR沉默和可接受的耐受性，最终导致第一个RNAi疗法Onpattro（patisiran）进入市场。随着MC3的发展，RNAi疗法的递送似乎已基本掌握在手中。2011 年和 2012 年的一系列事件，包括 Alnylam 和 Tekmira 之间的法律纠纷，教会了我，我们需要掌握自己的命运，拥有专有的递送技术和对制造的完全控制。为此，Alnylam 扩大了对非 LNP 递送方法的研究工作，并与 Tekmira 达成了和解，以明确确立 Alnylam 生产基于 LNP 的药物的权利和能力，以及 Alnylam 专有脂质分子的明确所有权。也许，回想起来，我应该更清楚，Alnylam需要更好地控制RNAi递送的核心技术。毕竟，从第一天开始，它就是关于“递送，递送，递送”。Alnylam 故事的一个重要部分是我们的研发战略，它平衡了领导层的明确方向和团队层面的持续创新努力（见插文 2）。后者往往发生在我们的正式努力之外。随着 2010 年到 2011 年，“20% 时间”项目对我们来说变得越来越重要。Mano 支持基于偶联物的递送工作，同时推进基于 LNP 的计划。具体来说，他和他的团队已经将他们的兴趣从基于脂质的偶联物转向基于N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）的方法，目的是通过asialoglycoprotein受体将siRNA靶向肝细胞.这显示出一些早期的希望，但最后依然药效不加。对偶联物的长期投资正在消磨殆尽。在我办公室的一次令人难忘的会议上，Mano呼吁进行“最后一次实验”，以评估siRNA骨架的更大稳定性，以此作为增强效力的一种方式。Akshay同样直言不讳地认识到偶联物的潜力，并对开发基于静脉注射LNP的给药平台的挑战表示尊重。多年来，我学会了倾听同事的意见;毕竟，我们一起站在科学的前沿，没有人知道所有的答案。我同意继续GalNAc的努力，并实现最后一个实验的结论。赌注得到了回报！在 2012 年春天在罗德岛州纽波特举行的一次场外会议上，Mano 分享了最初的 GalNAc 数据，其中稳定的 siRNA 显示灵长类动物的效力为每公斤个位数毫克。在那一天，我比以往任何时候都更加知道，我们将成功地将RNAi疗法推向市场。时任我们的生物分析和药物代谢与药代动力学 （DMPK） 负责人 Renta Hutabarat 用一件“我爱偶联物”的 T 恤来纪念这一成就，我至今仍珍藏着这件 T 恤。GalNAc偶联随后成为寡核苷酸递送的领先技术，几乎被RNA治疗领域的每家公司用于肝脏递送，包括ASO巨头Ionis和LNP冠军Tekmira/Arbutus。凭借适合皮下给药的专有递送技术，我们开始使用我们新颖的“标准模板化学”（STC）方法推进我们的第一个GalNAc偶联物的开发（见框3）。第一个分子是 revusiran，一种皮下递送的靶向 TTR 的 GalNAc 偶联 siRNA（我将在下面回到 revusiran）。当我们开发 revusiran 时，我们了解到 siRNA 骨架的进一步稳定会带来更大的效力改进（图 1）。2和框3），推动了我们的“增强稳定化学”（ESC）设计和fitusiran的第一个临床项目，靶向抗凝血酶治疗血友病。我们早期的临床研究显示，令人不安的肝酶升高的发生率为10-20%，但在一系列引人注目的调查性毒理学研究中，在当时的高级科学家Maja Janas的带领下，我们能够确定GalNAc-siRNA的脱靶杂交是原因。我们的化学团队由Martin Maier领导，通过将不稳定的乙二醇核酸（GNA）核苷酸引入siRNA反义链的种子区域，找到了一种解决方案，这就是我们的“ESC+”化学设计（未发表的数据）。最后，也是最近，我们的平台专家 Vasant Jadhav 通过一种称为“Ikaria”的方法确定了 siRNA 化学和设计的进一步进展，使 siRNA 的年度给药方案成为可能（未发表的结果）。这告诉我们，面对以管道为重点的研发和公司其他领域成本逐渐增加的情况，我们始终必须为研究团队留出一些自由，以继续开发平台。图2：偶联siRNA设计的演变我们的递送工作并没有止步于肝脏。由于科学家的“20%时间”文化和我们的“kainotomia”精神（插文3），我们的一些科学家开始用新型C16偶联物探索中枢神经系统（CNS）和siRNA的眼部递送。值得庆幸的是，这是另一个“臭鼬项目”，就像我一样，因为肝脏输送系统（LNP，GalNAc）的临床成功决定了进一步的肝外工作会分散注意力。但啮齿动物的早期数据令人鼓舞，在非人灵长类动物中转化结果使我们的工作更加大胆。有了这些临床前数据，我们在2018年与再生元达成了一项价值8亿美元的前期协议，以推进用于中枢神经系统和眼部疾病的RNAi疗法产品线。就在刚刚过去的12月，首个靶向淀粉样蛋白前体蛋白（阿尔茨海默病的关键靶点）的RNAi疗法进入临床开发阶段。我们很快就会看到这个新领域是如何发挥作用的！毫无疑问，征服递送是建立 Alnylam 的基础。这是将诺贝尔奖获得者科学转化为医学的关键技术障碍。解决方案从来就没有“直线”——无论是在科学界还是在商业界，都很少有这样的解决方案。归根结底，关键是要坚持不懈，遵循科学，营造创新的环境。最终的解决方案依赖于应用于siRNA本身的新型递送方法和新化学方法的根本性进展。大胆地承担风险，将原型带入早期临床研究，并学习如何（当然是安全的）根据人体的发现进行优化，这一点也很重要。最后，递送，对我们来说从未“结束”。我们将继续不断地优化技术，为患者带来我们最好的创新。插文2 Alnylam kainotomia古希腊古典讽刺喜剧作家Aristophanes于公元前 420 年在《kainotomia》中首次使用了希腊语中的“kainotomia”，意为创新。作为一名讽刺作家，他嘲笑创新者是社会中不寻常的成员。这引起了Alnylam的共鸣，尤其是在早期，因为许多人质疑我们在RNAi疗法上取得成功的可能性。kainotomia精神是我们鼓励科学家和临床医生发挥创造力的口号，但我们也将其应用于各个学科。我们制定了“20%时间规则”（这是我在1980年代在渤健工作时学到的），鼓励我们的科学家将多达五分之一的时间用于追求自己的想法。我们明确地将 kainotomia 作为我们“创新和发现”核心价值观的关键原则之一。这种方法产生了许多有意义的发现。2005 年，我们的一些科学家发现了“拮抗剂”作为靶向 miRNA 的一种方式。2013 年，我们发表了关于“快速消除”脂质的研究成果，这是 mRNA 疫苗制造商在 COVID-19 大流行期间使用的一项进展。当然，这种精神导致了GalNAc-siRNA偶联物的发现，为广泛的RNAi治疗药物管线铺平了道路。即使在 Alnylam 成长的过程中，我们仍然保持着这种精神，同时专注于开发和商业里程碑。为了帮助实现这一目标，我们每年都为我们的平台工作投入资金，并不断将这项投资的目标提升为公司层面的目标。此外，我们从2002年12月开始并一直持续到今天的科学顾问委员会会议，为我们的核心科学点亮了一盏明灯。这些会议向所有 Alnylam 员工开放;每年都有数百名员工参加。虽然我已经离开了Alnylam，但我仍然参加这些会议。插文3 难题：在推进管道的同时改进平台随着Alnylam临床管线的成熟，我们对平台活动的投资保持稳定且不断增长。从先进的临床前甚至早期临床试验结果中学习，我们有一个持续的反馈循环，将它们带回我们的平台团队进行改进。这些平台投资使我们能够发现静脉注射LNP制剂的替代品，例如GalNAc偶联siRNA。他们还通过肝外递送将递送解决方案扩展到肝脏之外。如何将平台进步与管线开发相结合，其中最令人心酸的例子也许是来自我们的 GalNAc 偶联平台的故事，以及随着时间的推移优化效力、耐受性和药理学特性（如耐久性）的故事。我们开始开发具有“标准模板化学”（STC）设计的GalNAc-siRNA偶联物。在 STC 形式中，交替的 2′-O-甲基和 2′-氟修饰被放置在双链 siRNA 分子的两条链中，除了在双链体的中心，其中三个连续的 2′-氟部分和三个连续的 2′-O-甲基部分被放置在距离 5' 末端的 9、10 和 11 个核苷酸处的 21 核苷酸正义链中，以及位于位置 11 的反义链中， 12 和 13 分别来自 5' 终点。STC-GalNAc偶联siRNA的例子包括revusiran（靶向TTR）治疗遗传性TTR介导的淀粉样变性。Revusiran 是 GalNAc-siRNA 偶联物的原型，但在 3 期试验中因耐受性差而停产。在了解到STC-siRNA偶联物代谢不稳定，需要非常高的剂量但耐受性差后，我们专注于更稳定的GalNAc-siRNA偶联物设计，例如“增强稳定化学”（ESC）siRNA。在 ESC 设计中，双链 RNA 骨架在两条链的 5' 末端包含两个额外的硫代磷酸键，总共有六个硫代磷酸键。此外，siRNA含有较少的2′-氟取代，进一步提高了分子的代谢稳定性。此类偶联物的例子包括用于急性肝卟啉症的 Givlaari（givosiran，靶向氨基乙酰丙酸合酶 1 mRNA）、用于杂合子家族性高胆固醇血症或需要额外降低 LDL 胆固醇的临床动脉粥样硬化的成人的 Leqvio（inclisiran，靶向前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶 kexin 9 型 （PCSK9） mRNA），以及用于血友病 A 或 B 的 fitusiran（靶向抗凝血酶 mRNA）。ESC-GalNAc-siRNA偶联物显示出明显高于STC的效力，暴露量低200倍。他们还表现出耐久性的意想不到的改善，促进了每 6 个月一次的给药频率。尽管 ESC siRNA 平台能够高效且持久地敲低靶标 mRNA，但其中一些分子在早期人体研究中显示出脱靶效应的证据。这些脱靶效应通过一部分患者在注射后 30 天内发生的肝酶升高的证据而变得明显。尽管有证据表明肝脏效应可以适应，即使继续给药，使我们的RNAi治疗药物尽可能耐受符合我们的利益：毕竟，如果我们要成功地将siRNA推进到大型人群疾病中，我们将需要一个非常良好的耐受性。因此，我们设计了“ESC+”形式，其分子与ESC形式不同，在siRNA的种子区域包含单个热不稳定的核苷酸乙二醇核酸（GNA），这已被证明可以减少种子介导的脱靶效应。该化学在ESC设计中保留了六个硫代磷酸键，并进一步减少了2′-氟修饰的数量，并相应增加了2′-O-甲基修饰。例如，ALN-AAT02（靶向α1-抗胰蛋白酶mRNA）治疗α1肝病，ALN-HBV02（靶向所有乙型肝炎病毒（HBV）蛋白mRNA）治疗乙型肝炎，ALN-HSD（靶向17β-羟基类固醇脱氢酶13（HSD17B13）mRNA）治疗非酒精性脂肪性肝炎。使用 ALN-HBV02 和 ALN-AAT02，我们能够证明 ESC+ siRNA 在人类中实现了更好的耐受性特征。我们的工作并没有止步于ESC+，因为我们开始对确定可以像疫苗一样每年给药一次的RNAi疗法感兴趣。这一崇高目标最终通过“Ikaria”设计方法实现，该方法使用新优化的化学修饰模式，将出色的代谢稳定性和效力与高特异性相结合（未发表的数据）。一个例子是ALN-TTRsc04（靶向TTR）治疗ATTR淀粉样变性，其潜在的年度给药siRNA可实现>90%的TTR敲低，如临床前研究表明的那样。  05  Alnylam 5×15战略2010年底，Alnylam损失惨重。制药公司已经退出了siRNA领域，投资者逃离了我们的股票，业内大多数人都认为我们已经死了，只是我们还没有躺下！我知道现在是时候放弃我们对RNAi疗法广泛适用的浪漫愿景，而是专注于建立一个临床管道，我们可以最好地实现递送，即在肝脏中。我召集了我的核心团队成员，包括 Barry、Akshay 和我们的监管事务主管 Sara Nochur，讨论将重点从平台转移到管道。我确信，恢复对RNAi的信心的唯一方法是证明无懈可击的人类POC结果。用听到叮当声和相信圣诞老人（来自儿童故事《极地快车》）的类比，我推断我们的外部利益相关者需要听到人体数据的“叮当声”。在即将到来的2011年1月摩根大通会议上，我们讨论了一系列五年目标。我想提出一项名为“Alnylam 5×15”的新战略，承诺在2015年底之前将五个RNAi治疗项目推进到临床开发阶段。这些项目都将集中在肝脏表达的、经过基因验证的疾病靶点上（我们已经在灵长类动物中取得了可靠的递送结果）。此外，我们将根据生物标志物，专注于最早可以在第一阶段实现人类POC的目标，我们将创建具有终点的关键研究，以支持监管部门的批准并证明对付款人的价值。然而，该团队对此进行了反击。由于当时只有一个肝脏靶向项目（ALN-TTR01）正在开发中，并且手头没有人类POC数据，该团队建议“2×15”或“3×15”可能是一个更易于管理的目标，可以公开推广。我不同意，说减少目标数量不会让我们的利益相关者兴奋，也不会激励我们的团队。所以，Alnylam 5×15 就这样定了！我们的研究机构支持新战略。由生物学家、化学家和医生组成的团队对众多肝脏表达的靶基因进行分类。研究主任黛娜·萨（Dinah Sah）支持TTR淀粉样变性，这已经是一个进入临床的项目。她的同事凯文·菲茨杰拉德（Kevin Fitzgerald）现在是Alnylam的首席科学官，他推进了几个项目，包括靶向PCSK9治疗高胆固醇血症的RNAi疗法。我们计划尽快将这些项目投入开发。其他项目，包括ALN-VSP肝癌和呼吸道合胞病毒的项目，在我们围绕新战略进行调整时，都被搁置或砍掉了。2011年秋天，我们的第一声“叮当声”响起。在我们的 ALN-TTR01 1 期研究中，患者 50-03 显示出明显的 TTR 敲低，首次展示了在人体中利用 RNAi 的能力。在剑桥大学公园酒店举行的场外会议之前，与一小群人分享了第一批数据。不敢想象，如果我们没有在那个病人身上看到清晰的RNAi信号，会发生什么。我们在临床前研究中改进了LNP技术，所以我怀疑我们会回去尝试优化的脂质。也就是说，我们对实现我们雄心勃勃的Alnylam 5×15目标的能力的信心几乎肯定会动摇。在撰写本文时，患者 50-03 在 11 年后继续接受 patisiran 治疗遗传性 ATTR 伴多发性神经病。患者 50-03 是 RNAi 疗法一系列非凡的临床转化结果的开始。首先，我们能够证明使用 ALN-TTR01 后继分子 ALN-TTR02 （patisiran） 以及 GalNAc 偶联物 revusiran 皮下给药，改善了 TTR 沉默，。我们能够证明PCSK9的有效沉默和高胆固醇血症患者LDL-C的稳健降低。在我们的血友病治疗药物fitusiran的情况下，我们能够证明凝血酶生成的增加和止血改善的早期迹象。在我们的 givosiran 项目中，针对急性肝卟啉症患者的氨基乙酰丙酸合酶-1，我们证明了毒性疾病代谢物的降低。“叮当声”现在响亮而清晰，外界开始注意到。随着2015年接近尾声，我们已经成功地将八个项目推进到临床开发阶段，远高于我们五个项目的目标。我们也在构建一个可复制的模块化平台。在 5×15 计划结束时，我们可以在 1.5-2 年的时间框架内实现可靠地从靶点概念到提交研究新药申请 （IND），并且通过对肝脏递送的人体验证，我们有信心任何进入 1 期的项目一般都会导致靶点敲低。随着这一新发现的成功，我们意识到我们需要优先考虑我们的工作，并找到一种方法来为我们蓬勃发展的管道提供资金。首先，在 2013 年初，我们决定合作开展 PCSK9 项目。当时，ALN-PCS02作为静脉注射LNP产品处于第一阶段;其GalNAc偶联的后续化合物（inclisiran）仍在探索中。此外，由于其他公司针对PCSK9的四种单克隆抗体处于晚期临床阶段，竞争格局并不具有吸引力。我们求助于The Medicines Company作为合作伙伴，因为我们知道首席执行官Clive Meanwell和他的团队在开发和商业化抗凝剂Angiomax（比伐卢定）方面非常出色，这是我在1997年授权给他的一种分子，也是我在Biogen工作时发明的。其次，我们为我们的核心5×15产品组合寻找全球合作伙伴，我们将保留在北美和西欧的权利，该合作伙伴将领导世界其他地区的开发和商业化。2013年夏天，我们当时的首席商务官劳伦斯·里德（Laurence Reid）和我开始向一系列制药合作伙伴抛出橄榄枝。赛诺菲刚刚收购Genzyme，就热衷于重建其罕见病产品线，并对广泛的Alnylam合作伙伴关系产生了兴趣。9月，Genzyme负责人David Meeker和赛诺菲首席执行官Chris Viehbacher在“Genzyme中心”举行了会议，达成了这笔交易。Chris看到了我们正在构建的平台的力量，也看到了全球市场的增长机会。2014 年初宣布了 7 亿美元的前期合作伙伴关系，我们的股价首次飙升至 100美元以上。这使我们能够完成一些二级融资以支持增长。  06  新一类创新药物Alnylam 5×15 为 RNAi 作为一类新型药物奠定了基础，但仍需要做很多工作才能将这些药物带给患者并将 Alnylam 转变为一家完全整合的生物制药公司。2015年初，我们推出了一套名为“Alnylam 2020”的新目标，目标是在2020年底之前将三种或更多RNAi疗法推向市场。这是另一个崇高的目标，因为我们在2014年才刚刚开始招募患者参加我们的第一次3期试验。五年计划的美妙之处在于，我们的员工将其作为口号，减少了战略怀疑和二次猜测。它使我们的团队更加协调，并理解了为什么这些目标对公司以及我们为患者提供药物的最终使命很重要。从早期临床开发过渡到晚期临床开发并非易事。我们的第一个 3 期 APOLLO 研究的设计需要与全球监管机构进行大量审议和协调。我们知道我们必须把这件事做好，因为生物技术领域到处都是现在已经倒闭的公司，这些公司在早期瞥见有希望的数据后未能在第三阶段取得成功。Akshay带领他的团队进行了一系列激烈的讨论和辩论，以严格考虑试验设计参数和研究终点。这些努力包括外部专家的投入和获取自然历史数据。与监管机构保持一致需要多次公路旅行。例如，在与葡萄牙当局的会议上，我们需要在毒理学研究中沟通一只猴子的不明原因死亡。我们还需要获得付款人的意见。Barry 的新生商业团队 Oved Amitay 和 Rena Denoncourt 开始与英国国家临床卓越研究所 （NICE） 和美国的商业支付方进行讨论。2013年底，我们在APOLLO招募了第一位患者，这是我们的第一项随机、双盲、安慰剂对照研究，旨在评估patisiran在遗传性ATTR（hATTR）多发性神经病患者中的疗效和安全性。大局已定。我们也有竞争，因为 Ionis 已经领先于我们，他们的 TTR 靶向 ASO，inotersen，从 1 期进入 3 期试验。由于 inotersen 是一种皮下给药的 ASO，我们担心静脉注射的 patisiran 对医生和患者的吸引力会降低。值得庆幸的是，我们的GalNAc偶联进展正在取得成果，我们能够在2015年将降低TTR的revusiran推进到名为ENDEAVOR的3期研究中。ENDEAVOR 旨在评估 revusiran 在 hATTR 心肌病患者中的疗效和安全性，这比多发性神经病患者群体可能有更大的机会。还有一个麻烦。在ENDEAVOR入组时，我们听到了正在进行的revusiran 2期开放标签研究中神经病变恶化的报道，这是一个奇怪的发现，因为我们预计降低TTR的药物会产生相反的结果。出于谨慎考虑，我们要求 ENDEAVOR 研究的独立数据和安全监测委员会 （DSMB） 在正在进行的随机研究中对 revusiran 耐受性进行非盲评估。2016 年 10 月初，在开车去佛蒙特州度过一个秋季周末时，我接到了 Akshay 的紧急电话。DSMB 建议我们停止 ENDEAVOR，不是因为神经病变的发现，而是因为死亡率与药物组的不平衡。我们立即停止了这项研究。我刚刚从大型制药公司聘请了伊冯娜·格林斯特里特（Yvonne Greenstreet）担任我们的首席运营官，我请她协调我们的工作，以确保与许多利益相关者进行有效沟通。对于Yvonne来说，这是对生物技术的一次鲜明介绍！10 月 5 日的 revusiran 公告令世界各地的许多人感到震惊。患者非常失望，因为许多人希望revusiran能为他们通常致命的疾病提供一种新的治疗方法。Alnylam的投资者纷纷撤资，ALNY在短短一天内就损失了超过70亿美元的市值。投资者担心更广泛的平台安全问题将应用于整个Alnylam管道和RNAi治疗领域。他们正在寻找我们无法给出的答案，因为我们对当时死亡率失衡的解释很少。为了了解更多信息，我们展开了一项内部调查，并责成我们的顶级科学家之一劳拉·塞普-洛伦齐诺（Laura Sepp-Lorenzino）领导这项工作。六年后，我们仍然不完全知道原因。但似乎代谢不稳定的revusiran siRNA分子在患有晚期心力衰竭的虚弱人群中耐受性较差，所有死亡都发生在最晚期患者中。值得庆幸的是，当时我们在The Medicines Company的合作伙伴已经在数百名患者中获得了inclisiran的丰富的人体安全经验，他们向我们保证，本身不存在根本的平台问题。无论如何，许多外部利益相关者对Alnylam的前景持怀疑态度。虽然我们公布了 revusiran 的调查结果，一些人批评我们花了太长时间才这样做。我不敢苟同，因为在这个艰难而不确定的时期，我们实现了非凡的透明度——包括多次演讲。引用弗里德里希·尼采（Friedrich Nietzsche）的话，“杀不死我们的终将使我们更强大”。尽管 ENDEAVOR 对患者来说是一个可怕的结果，对 Alnylam 来说是一个极其困难的事件，但我们的团队坚持了下来。不到一年后，9月下旬，我在一个星期天的下午接到了当时的首席医疗官普什卡尔·加格（Pushkal Garg）的电话。225 名患者的 APOLLO 3 期研究取得了巨大成功，主要终点是称为“mNIS+7”的神经病变损伤评分，P 值为 9.26 × 10（−24）。所有次要终点和一些探索性终点也达到了统计学意义。当在2017年11月的EU-ATTR会议上公布完整数据时，当首席研究员David Adams介绍结果时，观众们倒吸了一口凉气。巴里、阿克谢和我坐在礼堂前面，全神贯注。这是RNAi疗法和Alnylam的分水岭。最重要的是，它为hATTR多发性神经病患者带来了新的希望！在接下来的几年里，我在周日下午接到了普什卡尔打来的许多报喜电话。2019 年，我们在 ENVISION 3 期研究中报告了 givosiran 在急性肝卟啉症患者中的积极结果，2020 年，我们在 1 型原发性高草酸尿症患者的 ILLUMINATE-A 3 期研究中报告了 lumasiran 的积极结果。最近，vutrisiran在hATTR多发性神经病患者的HELIOS-A 3期研究中显示出积极的结果;vutrisiran 与命运多舛的 revusiran 具有相同的序列，但采用了我们更先进的 GalNAc 偶联物 ESC 化学，实现了代谢稳定性。这些项目中的每一个都有自己丰富的故事要在未来讲述。在其他地方，我们在The Medicines Company的同事也取得了强劲的成果。2019 年 8 月，Clive 打电话给我，分享了数千名患者的 ORION 研究数据，其中一年两次的 inclisiran 显示 LDL-C 降低了 >50%，安全性与安慰剂相当。那个夏天的夜晚，我和家人在楠塔基特吃晚饭，我知道RNAi疗法将成为一类全新的药物，帮助患有罕见病和流行病的患者。Alnylam 2020 也见证了公司的进一步成熟。我们在研究中展示了我们的创新能力、韧性和实力，但我们现在也可以声称在开发方面拥有同样的实力。随着每个新的 1 期 POC，然后是积极的 3 期，一系列论文随之而来（总共 10 篇《新英格兰医学杂志》论文）9,10,11,12,13,14,15,16,17,18从 2013 年到 2021 年）。这些论文说明了RNAi疗法在解决以前“不可成药”的靶点方面的潜力，但也显示了我们正在解决的疾病的益处/风险状况的变革性质。这些论文是我们早在2003年就做出的决定的一部分——在我家的餐桌上——持续地发表我们的研究结果，选择优先考虑同行评审的好处，而不是支持竞争对手的坏处。这些科学论文的背后是药物开发学科的大量独创性：毒理学、DMPK、监管批准、药理学、药理学、药理计量学和临床研究。每个小组都建立了RNAi疗法的路线图，而以前没有。我们已经进入了一系列疾病的新领域——ATTR 淀粉样变性、急性肝卟啉症和原发性高草酸尿症——这些疾病从未获得美国食品和药物管理局的显着药物批准，并且几乎没有自然史、临床试验方法或终点。然而，该策略的原则被证明是关键，因为我们可以可靠地证明，在每种疾病状态下近端起作用的基因验证靶点可以用RNAi疗法解决。将药物带给患者还需要卓越的商业化。毕竟，只有当药品进入市场时，公司才能履行对患者的义务。我们致力于将我们的创新推向市场。我们首先在2017年提出了一套“患者准入原则”，承诺将患者放在首位，放弃高于通货膨胀率的药品价格上涨，并积极寻求与付款人达成基于价值的协议。2018年初，我们通过与赛诺菲的互换获得了核心管线项目的全球权利，作为回报，他们获得了血友病药物fitusiran的全球权利。Barry 率先开展了我们的商业转型，在 20 个国家/地区建立了直销能力，并为其他市场建立了分销协议。我们开始在金融、法律、道德与合规、信息技术、通信和其他职能领域建立商业化能力。随着 2018 年 8 月以 Onpattro 商标名推出 patisiran，我们证明了 Alnylam 可以像作为一家研发公司一样，作为一家商业组织表现出色。在接下来的两年里，我们又有两个药物（Givlaari（givosiran）和Oxlumo（lumasiran））上市。诺华公司刚刚在美国获批的Leqvio（inclisiran）上市，预示着RNAi疗法的崛起 已是“轰轰烈烈，而非悄无声息”（这是对T.S.艾略特诗歌《空心人》中著名台词的有意转折）。  07  结论要讲述Alnylam的完整故事，需要一本书才能讲完。我没有介绍我们如何学会制造药物并致力于良好生产规范 （GMP） 生产;我们如何建立一个拥有 >1,600 名员工的全球性组织;我们如何在多个适应症中将药物商业化;多年来，我们如何筹集 77 亿美元来资助我们的工作;还有更多！因为我是一名科学家，我的心在研发上，但我不能不承认制造、法律、合规、财务、项目管理、人力资源、医疗事务、商业、企业传播和许多其他团队为公司的成功做出了贡献。在这个有限的篇幅里，我选择点名提及某些同事，以感谢他们的贡献，但当然还有数百名其他同事也对我们的故事至关重要。2021 年 10 月，我决定将 Alnylam 的领导权移交给 Yvonne Greenstreet，一位杰出的领导者。在成为 Alnylam 和 RNAi 疗法的“竞技场上的人”19 年后，现在是我探索新篇章并帮助其他人建立未来 Alnylam 的时候了。我为在一个伟大团队的帮助下能够取得的成就以及他们的热情和承诺感到自豪。我还对公司于 2021 年初推出的新 P5 × 25 五年战略的未来抱负感到兴奋。在我 19 年的旅程中，共同的主题是我们所有人对我们的文化和核心价值观的深深赞赏：创新和发现、追求卓越的热情、紧迫感、开放和透明以及对人的承诺。虽然我的 Alnylam 故事已经结束，但我毫不怀疑 Alnylam 的故事和 RNAi 疗法才刚刚开始对科学、医学和患者产生影响。参考来源：https://www-nature-com.libproxy1.nus.edu.sg/articles/s41587-022-01304-3  BiG 十周年预告  本次BiG十周年庆典，将首次分为国内和国际篇章，以原创科学和临床需求为出发点，讨论创新技术平台和创新疗法（PROTACT/分子胶、双抗/ADC、siRNA/ASO、CGT、AI制药）的重大进展和发展前景，十年一药曙光现，大浪淘沙始见金！▼报名参会 会议门票：审核制(免费)；含主论坛+分论坛，不含餐；优先biotech/Pharma、临床、院校科学家共建Biomedical创新生态圈！如何加入BiG会员？