Fresolimumab

近日，Cell期刊上公布了一篇名为“Strategies to boost antibody selectivity in oncology”的文章。文章题目该文章主要探讨了提高治疗性抗体的选择性，以减少对健康组织的损害并提高疗效的策略。    01  研究背景用于肿瘤治疗的抗体被配备了有毒的载荷和效应功能，能够在极低浓度下杀死细胞。但是，大多数癌细胞上的靶点也存在于一些健康细胞上。共享的靶点可能导致非肿瘤部位的结合，从而降低药物的安全性和治疗潜力。为了解决这一问题，研究人员最初引入了单特异性的治疗性抗体，但往往疗效不足且容易产生耐药性。而目前使用的新一代抗体则具有更高的细胞毒性潜力，包括抗体-药物偶联物（ADCs）和多特异性抗体。在ADCs中，抗体被用作载体，将细胞毒性化学载荷递送至肿瘤。这些载荷通常对患者来说毒性过大，若不与抗体结合则无法使用，甚至还有更具毒性的载荷正在研究中。多特异性抗体能够同时结合不同的表位，包括T细胞衔接器，它们能够将免疫细胞招募至肿瘤细胞。在这种情况下，一个T细胞衔接器分子就足以杀死整个细胞。鉴于其具有高细胞毒性潜力，许多ADCs和多特异性抗体存在剂量限制性毒性，这可能会限制到达肿瘤的生物制剂的量及其治疗效果。此外，即使是非肿瘤部位的轻微结合，也可能导致严重的副作用伤害。例如，针对B细胞恶性肿瘤中CD19的双特异性抗体还可能影响健康的B细胞，引发B细胞再生障碍和感染风险增加。因此，提高治疗性抗体药物对肿瘤的选择性，对于其安全、有效地应用于癌症治疗至关重要，同时也有助于它们在联合疗法中的应用。  02  提高抗体选择性的策略鉴于此，该文章提出了多种策略来，主要分为三类：三类提高抗体选择性的策略一、利用肿瘤细胞的独特特征1. 肿瘤特异性抗原（TSAs）提供高选择性靶点癌细胞可能会表达在健康细胞中沉默的基因，或者表达基因突变产生的蛋白质变体（新抗原），这些新抗原构成了肿瘤特异性抗原（TSAs）。具有高突变负荷的肿瘤，如黑色素瘤和肺癌，往往拥有更多的新抗原，尽管其中很少有能在许多患者之间共享（所谓的“公共新抗原”）。为了利用这些TSAs，可能需要个性化疗法，如疫苗或基于细胞的疗法。不幸的是，TSAs往往在细胞内，而传统的生物制剂通常无法被动地穿过脂质双层，包括细胞膜，来与它们结合。那么，针对这一缺陷，作者总结了三种靶向细胞内TSAs的策略。图1.利用抗体（Abs）靶向细胞内癌症靶点的多种方法。利用主要组织相容性复合体（MHC）：抗原呈递是一种针对细胞内威胁的自然监视机制（图1A），蛋白质的片段被展示给T细胞，T细胞使用T细胞受体（TCR）来检查它们，并对其作出反应。类似地，治疗性抗体可以模仿TCR并与特定的肽-MHC复合物结合。以这种方式利用TSAs，需要识别一种能够与特定构象表位结合的生物制剂，即肽-MHC，它需要包含足够的内容以确保特异性和安全性。此外，靶肽-MHC的潜在低丰度以及患者人群中MHC等位基因的自然变异可能会给增加额外的治疗复杂性。利用细胞内表达生物制剂：生物制剂通常是单链抗体片段（scFv），其以核酸的形式被递送到细胞中，随后在其中表达并结合细胞内靶点（图1B）。利用跨膜生物制剂送入细胞：生物制剂跨越膜的能力可以通过多种方式实现，包括通过包囊、某些肽基序的整合、与细胞穿透肽（CPPs）或其他载体的结合，或膜不稳定剂的控制释放（图1C）。例如，一种能够通过组织蛋白酶B诱导释放1,2-乙二胺（一种膜不稳定剂）的生物制剂。一些癌细胞系具有高活性的组织蛋白酶B，这有利于膜不稳定剂在内质网释放和生物制剂的选择性递送。除了直接到达细胞质外，还可以利用自然循环于细胞中的受体的结合，以更好地接触细胞内靶点。例如，利用IGF-1受体在上皮细胞中的转胞吞作用，使用二聚体IgA靶向KRASG12D。2. 肿瘤相关抗原更为常见，但选择性较低癌症蛋白质组的变化倾向于定量而非定性变化，大多数在肿瘤细胞中富集的抗原也存在于一些健康细胞上，这些被称为肿瘤相关抗原（TAAs）。鉴于此，提高对肿瘤细胞的选择性需要利用其他特征，例如靶点密度的差异或多个靶点的共表达。图2. 生物制剂的多价性和几何形状可以被利用来提高其对特定抗原密度的选择性。利用靶点密度差异：通过多价性（multivalency）和多特异性抗体，可以提高对肿瘤细胞的选择性。多价性提供了一种利用靶点密度差异并提高对肿瘤细胞上富集的单一TAA的结合选择性的方法。拥有多个具有适当亲和力的结合位点可以使治疗药物优先集中在表面抗原密度高的细胞上（图2），这种现象被称为“超选择性”。整体的结合亲和力或结合力可以通过单个结合臂的亲和力以及生物制剂的价态和几何形状来调节。通过包括IgM在内的形式以及IgG六聚体化等策略，可以实现比IgG更高的价态和结合力。同样，catenation和AvidiMabs通过在结合时引入抗体恒定区之间的非共价相互作用，增加了它们在肿瘤细胞上的停留时间。另一种可能性是，多价融合蛋白纳米颗粒可以围绕二价阳离子自组装，并且可以在体内以显著的选择性靶向CXCR4+和PDGFR+细胞。多价性也可以引入到抗体的恒定区，这可能允许调节其效应功能和药代动力学。利用多个靶点共表达：通过靶向同一肿瘤细胞上的多个TAAs，也可以提高生物制剂对肿瘤细胞的选择性。在顺式方向上同时靶向多个抗原可以缩小生物制剂积累的位置。相关的方法涉及蛋白酶靶向抗体（PROTABs），这些是多特异性抗体，它们利用肿瘤细胞上富集的E3泛素连接酶来加速附近生物分子的降解。靶向多个细胞途径也可以实现更强大的抗肿瘤反应。最大化生物制剂对其靶点的结合亲和力并不总是最佳策略。如果抗体强烈结合健康细胞上少量的TAAs，或者增加毒性，那么在体内可能会表现不佳。过高的结合亲和力还可能增加抗体的内化速率，减少其从晚期内体的回收，并加速其降解，从而限制其半衰期和肿瘤穿透。高亲和力的另一个潜在问题是与细胞内信号传导有关：紧密的结合可能会减少受体聚集和信号传导。实际上，对T细胞衔接器的研究发现，在中等结合亲和力时，其效力和选择性达到最佳。二、利用肿瘤微环境特征的策略肿瘤微环境（TME）是一个动态的生态系统，它与肿瘤相互塑造，随着时间的推移形成双向关系。TME通常表现出一些表型特征，包括持续的炎症、细胞外基质（ECM）的重塑、异常的血管生成、坏死等。这些独特的特征可能会促进恶性表型的发展，但也可以被利用来设计选择性的生物制剂。图3. 抗体被设计为可以在肿瘤微环境（TME）中选择性结合，而不是在健康微环境中结合。1. 肿瘤微环境的特征可作为选择性抗体的合适靶点肿瘤微环境（TME）的一个特征是存在免疫细胞。抗体可用于减少TME中的免疫抑制或增强免疫激活。例如，针对CTLA-4和PD-1/PD-L1的免疫检查点抑制剂能够重新激活一些效应细胞，并已被证明对某些患者非常有效。Tocilizumab和Siltuximab分别靶向IL-6R和IL-6，旨在增强树突状细胞的抗原呈递能力。此外，一些针对TME的免疫抑制剂也正在研究中。2. 肿瘤微环境的其他特征可作为选择性抗体的合适靶点肿瘤微环境（TME）的另一个特征是存在癌症相关成纤维细胞（CAFs）。CAFs是TME的主要组成部分，在肿瘤的免疫调节和侵袭性方面发挥着关键作用。通过使用fresolimumab等抗体靶向TGF-β信号通路，可以干扰CAFs的功能。研究人员也在探索针对CAFs分泌的基质金属蛋白酶以及在CAFs中经常过表达的CAF标志物——成纤维细胞激活蛋白-α（fibrilastin-α）的抗体。异常血管生成也是实体瘤的一个常见特征。肿瘤部位代谢需求高，可以通过新生血管生成（neoangiogenesis）和血管生成（vasculogenesis）招募新的血管。因此，干扰患者的血管生成可以优先影响肿瘤的生长。一些抗体已被批准用于规范化肿瘤血管并抑制新生血管生成，包括靶向VEGF-A的bevacizumab和靶向其受体VEGFR-2的ramucirumab。坏死区域是晚期实体瘤的另一个特征性标志。晚期实体瘤的核心区域可能营养物质、氧气和代谢废物交换不良，导致细胞坏死。可以设计抗体靶向坏死时暴露的分子，这种方法被称为肿瘤坏死疗法（TNT）。研究人员发现了几种与坏死靶点高度特异性结合的抗体，包括来自细胞核的DNA/组蛋白H1复合物、单链DNA和RNA以及核糖体蛋白。由于TNT不与活细胞结合，因此需要能够扩散或远距离杀伤的药物，如放射性核素、免疫调节剂和释放的化疗药物。3. 生物制剂可被设计为在TME中选择性激活构建在TME中选择性激活的抗体前药：这些分子也被称为前体抗体或条件性活性生物制剂。通过使生物制剂与TME中丰富的分子发生反应，触发药物的局部释放或选择性地暴露抗体的互补决定区（CDRs）（见图3），可以实现选择性激活。例如，Amunix制药公司的双特异性抗体，能够结合HER2或EGFR以及T细胞上的CD3共受体的分子。为了提高肿瘤选择性，将具有特定切割位点的XTEN多肽融合到双特异性scFv的两端。在非肿瘤部位，XTEN掩蔽物可防止抗原结合。然而，在TME中，丰富的蛋白酶会特异性识别这些切割位点，切割掩蔽物，从而使双特异性抗体能够结合其抗原。值得注意的是，这种策略使该分子在食蟹猴中的最大耐受浓度比未掩蔽的双特异性抗体提高了400倍以上。此外，还可以利用酶促切割通过可切割连接子从抗体药物偶联物（ADCs）中选择性释放载荷。对于能够影响邻近细胞的膜可渗透载荷（旁观者效应），可切割ADCs可能特别适用。这种效应可能提高在抗原丢失或减少的异质性肿瘤中ADCs的有效性。优化抗体以在特定pH下发挥作用，提高其选择性：通过赋予Fc区pH敏感性结合，有利于将效应细胞招募到通常呈酸性的TME（图3D），或者通过FcRn介导的抗体回收来延长抗体的半衰期。具有pH敏感性结合的CDRs（图3C）也可以增加治疗肿瘤的价值。通过精心设计蛋白序列来实现pH敏感性结合，其中组氨酸的离子化（pKa约为6）通常起着重要作用。相互作用的pH敏感性可能涉及抗体、靶点或两者质子化状态的变化，也可能涉及介质中存在的第三种物质，如碳酸氢盐。将抗体设计为依赖于TME中特征性的其他分子：TME中某些肿瘤的细胞外ATP浓度显著增加。这种增加被研究人员巧妙地利用来识别需要ATP才能与CTLA-4和CD137结合的CDRs。在这些情况下，ATP实际上起到了分子胶的作用，补充了抗原和CDR之间的界面（图3B）。也可以设计生物制剂，使其结合在第三种分子存在时被阻止。这些方法可以扩展到其他靶点和代谢物。三、利用外部干预的策略除了设计生物制剂以利用肿瘤或TME的特征外，还可以通过外部干预来选择性地增加肿瘤中活性药物的浓度，或减少肿瘤外的药物浓度。构建用于生成特异性结合分子的替代性非抗体蛋白支架的结构。其中β-折叠以绿色显示，α-螺旋结构以黄色显示，二硫键以红色显示。增加肿瘤中活性药物的浓度改变给药途径：给药策略会影响生物制剂的运输和积累。生物制剂的给药途径，如静脉注射、动脉内注射、脑脊液内注射、胸膜内注射或腹膜内注射，会影响其在肿瘤部位的浓度。此外，正在研究新的给药途径，例如皮肤癌的局部抗体给药、呼吸道或中枢神经系统的鼻内抗体给药、淋巴系统的皮内给药以及直接的瘤内给药。一项研究显示，与静脉注射相比，腹膜内注射抗PD-L1分子在腹膜播散性癌模型中使生物制剂在肿瘤中的积累量增加了8倍。利用外部刺激：可在空间或时间上控制活性治疗药物的浓度，从而提高其选择性。可以使用辐射仅在照射区域触发抗体功能。还有报道称，通过微束辐射暂时提高治疗药物的局部血管通透性，以及将免疫检查点阻断与光热疗法相结合。外部刺激还可能涉及额外分子的给药。通过诱导表型变化的预处理也可以提高生物制剂对肿瘤的选择性。减少肿瘤外活性药物的浓度：减少治疗药物的非肿瘤结合有许多可行的方法。一种是使用治疗药物的非毒性类似物来阻断非肿瘤结合。这种方法非常适合抗体药物偶联物（ADCs），在实际给药ADC之前，可以先给药不含载荷的抗体，从而使更高比例的ADC定位到肿瘤。第二种是利用非肿瘤部位靶点密度通常较低的事实。在间接主动靶向（INTACT）中，研究人员预先给药以结合脂质体表面的靶点来控制抗体的浓度。脂质体上的靶点丰度减少了抗体向非肿瘤区域的损失，这些区域的靶点浓度较低，与脂质体相比，它们的释放更集中在肿瘤部位，靶点浓度较高。第三种是利用治疗药物在非肿瘤部位更高的可及性和更快的清除。例如，可以在非肿瘤结合清除后延迟给药某种分子。OncoOne的PreTarg-it平台涉及一种放射性核素，该放射性核素仅在ADC在肿瘤中浓集并从血液中清除后才与ADC结合。反向靶向是另一种与ADC兼容的方法，涉及（延迟）给药针对ADC化学载荷的抗体，以加速其在非肿瘤部位的清除。同样，最近的研究还展示了通过给药小分子药物使双特异性T细胞衔接器脱离的能力，从而减轻非肿瘤毒性。   03   未来展望文章最后提出了未来研究的方向，包括：整合实验、动物模型和人工智能：以更快地开发选择性治疗药物。评估分子靶点的质量：确定哪些靶点最适合用于癌症治疗。预测非肿瘤结合的次级效应：了解药物对不同细胞和组织的潜在影响。结合不同的分子设计策略：以最大化安全性和疗效。预测新型生物制剂的行为：在人体中的表现。生成分子设计的合理预期：基于当前的数据和知识，确定哪些目标是可行的。点击下方阅读原文获取文章来源欢迎感兴趣的朋友进群讨论，群二维码如下：推文用于传递知识，如因版权等有疑问，请于本文刊发30日内联系医药速览。原创内容未经授权，禁止转载至其他平台。有问题可发邮件至yong_wang@pku.edu.cn获取更多信息。©2021 医药速览 保留所有权利往期链接“小小疫苗”养成记 | 医药公司管线盘点 人人学懂免疫学| 人人学懂免疫学（语音版）综述文章解读 | 文献略读 | 医学科普|医药前沿笔记PROTAC技术| 抗体药物| 抗体药物偶联-ADC核酸疫苗 | CAR技术| 化学生物学温馨提示医药速览公众号目前已经有近12个交流群（好学，有趣且奔波于医药圈人才聚集于此）。进群请扫描上方二维码，备注“姓名/昵称-企业/高校-具体研究领域/专业”，此群仅为科研交流群，非诚勿扰。简单操作即可星标⭐️医药速览，第一时间收到我们的推送①点击标题下方“医药速览”  ②至右上角“...”  ③点击“设为星标

中文摘要转化生长因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）是一种多效性细胞因子，属于调节细胞生长和分化的TGF-β超家族。在肿瘤发展的后期，自分泌和旁分泌的TGF-β可能通过诱导上皮-间质转化、促进肿瘤血管生成、调节免疫抑制来调控肿瘤的转移和复发。因此，TGF-β被认为是晚期肿瘤生长、进展和转移潜能的重要因素。中和或阻断TGF-β是一种干预和干扰肿瘤生长关键启动子的独特方法，可能会提供一个新的治疗机会。此文就TGF-β的结构、功能及其在肿瘤微环境中的作用机制进行综述，并列举了一些在研的靶向TGF-β药物，旨在为抗肿瘤药物的开发和临床应用提供参考。正文肿瘤微环境是肿瘤细胞在机体内赖以生存的局部组织环境[1]，包括肿瘤细胞周围的各种细胞（内皮细胞、免疫细胞、成纤维细胞等）和各种细胞外组分（细胞外基质、细胞因子、激素等）。它们围绕在肿瘤细胞周围，由血管网滋养，并相互作用，共同阻碍机体对肿瘤细胞的免疫杀伤作用，从而促进肿瘤的增殖、恶化和转移[2]。作为一种多功能细胞因子，肿瘤微环境中的转化生长因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）在众多恶性肿瘤的发生、发展和转移中都发挥了至关重要的作用，越来越多的证据表明其具有成为肿瘤免疫治疗靶点的潜力。本文对TGF-β的结构、功能及其靶向药物研究进展等进行综述，为靶向TGF-β抗肿瘤药物的研发提供参考。1TGF-β及信号通路概述TGF-β家族庞大，自1978年首次分离获得该家族第一个成员TGF-β以来，迄今已有TGF-β的5种亚型、抑制素/激活素、骨形态发生蛋白和抗穆勒管激素等家族成员被相继发现[3]。其中，TGF-β是该家族中研究较多的一种多功能细胞因子。TGF-β是相对分子质量为25 000的同源二聚体，由2个相对分子质量为12 500的亚基通过二硫键连接而成[4]。TGF-β不同亚型在物种间的分布略有不同，TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3在哺乳动物中高度保守，编码基因具有70%~80%同源性，被认为出现在后生动物进化的早期[5]；TGF-β4和TGF-β5目前研究较少，主要存在于鸟类和两栖类动物体内。由于包括大多数免疫细胞在内的几乎所有细胞均分泌潜伏形式TGF-β1[6-7]，且TGF-β1是肿瘤细胞中表达最高的亚型[7]，故而TGF-β1是研究TGF-β的焦点。TGF-β通过自分泌或旁分泌的方式以前体蛋白质的形式表达[8]，在肿瘤微环境中经过剪切其N端延迟相关肽后形成成熟肽，2个TGF-β成熟肽分子再通过形成链间二硫键最终得到具有生物活性的同源二聚体[6]。成熟的TGF-β从其潜伏形式中激活和释放，并与质膜上的受体直接结合启动信号转导的级联反应，从而引发对响应细胞的生物作用。研究表明，发育中的胚胎和成年动物中所有类型细胞都携带TGF-β受体（TGF-β receptor，TGF-βR)，共有5种亚型[9]，即TGF-βRⅠ—TGF-βRⅤ。这些受体可以通过内在催化活性发出信号，也可以作为促进或抑制配体呈递给信号受体的感受器TGF-βR来发挥作用，其中表现出内在催化活性的TGF-βRⅠ和TGF-βRⅡ是ATP依赖性蛋白激酶，N端是亲水性胞外区，能识别配体的特定结构域，其次是a螺旋跨膜结构域，C端是具有激酶活性的胞内区，接受ATP并磷酸化下游底物的丝氨酸/苏氨酸位点[10]；发挥调节作用的感受器TGF-βRⅢ是镶嵌在细胞膜上的糖蛋白，不直接与TGF-β结合，但能促进TGF-β与TGF-βRⅠ、TGF-βRⅡ的结合[11]。TGF-β与受体的结合启动下游信号通路，包括Smad通路与非Smad通路。Smad蛋白穿梭于细胞质与细胞核之间，是TGF-β信号转导进核的介质蛋白。在Smad通路中，TGF-β首先与TGF-βRⅡ胞外段结合，其胞内段结合并磷酸化TGF-βRⅠ的胞内区[12]，接着TGF-βRⅠ通过在其C端区域的特定丝氨酸残基处的磷酸化激活Smad2蛋白和Smad3蛋白，再招募Smad4蛋白形成Smad2/Smad3/Smad4异源三聚体复合物,该三聚体复合物通过核孔进人细胞核，继续与各种辅因子相互作用以调控TGF-β依赖的基因表达[10]，见图1。除了Smad介导的经典信号通路，TGF-β也可以通过其他信号通路调控机体生理过程，包括丝裂原活化蛋白激酶通路、PI3K/Akt通路以及JAK/STAT等信号通路[13]。丝裂原活化蛋白激酶广泛存在于真核细胞内，能通过TGF-β信号通路引起细胞发生上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）[14]。PI3K/Akt通路则是TGF-βR与磷脂酰肌醇3激酶的p85亚基结合后，磷酸化并激活下游底物Akt调控基因表达，进而促进肿瘤细胞的增殖和转移。此外，激活的Akt可防止Smad3的磷酸化，从而衰减Smad3依赖性信号传导。JAK/STAT信号通路中信号转导和转录激活因子3（signal transduction and activator of transcription 3，STAT3）被JAK激酶（与TGF-βRⅠ相互作用）磷酸化并激活，以响应TGF-β并调节TGF-β靶基因亚群的表达。在成纤维细胞中，JAK/STAT通路充当TGF-β促纤维化作用的介质[15]。TGF-β通过上述信号转导网络，对细胞增殖、分化、凋亡以及血管生成等方面产生重要影响。因此，进一步明确TGF-β对肿瘤细胞发挥的生物学功能可能在临床上为肿瘤靶向治疗提供参考。2TGF-β与肿瘤肿瘤微环境中的TGF-β通过作用于肿瘤细胞及机体免疫细胞来影响肿瘤的发生、发展和转移。随着肿瘤发展进程，TGF-β表现出双重作用，即在肿瘤细胞的恶变前期，TGF-β通过抑制肿瘤细胞增殖和促进肿瘤细胞凋亡这两种途径来阻止肿瘤形成，而一旦肿瘤在机体中形成，TGF-β则通过诱导EMT、促进肿瘤新血管生成、帮助肿瘤细胞发生免疫逃逸等途径来实现肿瘤的继续发展与转移。TGF-β在肿瘤发生、发展进程中扮演双刃剑的角色，这种功能的相悖性被称为“TGF-β悖论”[16]。2.1TGF-β对肿瘤的抑制作用在肿瘤形成之前，TGF-β可以通过抑制肿瘤细胞增殖和促进肿瘤细胞凋亡2种途径来发挥抗肿瘤作用。其中，抑制肿瘤细胞增殖又有2种途径：（1）TGF-β诱导细胞周期性依赖性激酶抑制因子p15、p21和p27的表达，阻止肿瘤细胞在分裂周期中由G1期向S期过渡；（2）c-Myc是参与细胞生长和分裂的主要转录因子，TGF-β通过下调c-Myc的表达，抑制肿瘤细胞分裂[17]。TGF-β不仅可以抑制肿瘤细胞增殖，也可以通过作用于凋亡相关效应分子来促进肿瘤细胞凋亡。Humbert等[18]的实验表明在人黑色素瘤中，TGF-β能通过TGF-β/Smad信号通路诱导白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF）分泌增加，而LIF通过磷酸化STAT3使其结合到p21启动子上从而诱导p21基因表达，后者以胱天蛋白酶3/7依赖方式诱导肿瘤细胞凋亡。此外，在原发性肝癌中TGF-β能上调死亡相关蛋白激酶的表达，诱导肝细胞发生细胞凋亡[19] ，提示增强TGF-β诱导的肿瘤细胞凋亡，可能作为肿瘤在早期阶段的治疗策略。2.2TGF-β对肿瘤细胞的促进作用2.2.1  TGF-β促进肿瘤发生EMT    肿瘤形成后，肿瘤细胞通过EMT介导肿瘤的浸润转移进程。在此过程中，立方形的上皮细胞转变为狭长的纺锤体形的间质细胞，失去细胞极性，上皮细胞标志物E-钙黏蛋白减少，间质细胞标志物波形蛋白表达增加，细胞与基底膜的连接丧失，细胞流动性增加，肿瘤细胞获得向周围组织迁移、侵袭的能力[20]。EMT过程被普遍认为是肿瘤转移的根本原因，而TGF-β是几乎所有上皮组织中发生EMT必不可少的诱导因子[11]。王栋等[21]通过对食管癌细胞转染TGF-β1小干扰RNA降低TGF-β1表达，随后发现该细胞的E-钙黏蛋白表达上调，波形蛋白表达下调，且肿瘤细胞的侵袭能力降低，说明TGF-β1是促进食管癌细胞发生EMT过程的有效因子。此外，在肿瘤转移后的定植位点发生的EMT逆向过程间质-上皮转化会促进形成肿瘤转移后的病灶[22]。2.2.2  TGF-β促进肿瘤血管生成    肿瘤的发展和转移需要经血管从宿主摄取大量的养分。肿瘤血管的生成是指在原来已存在的血管中形成密集的新血管。肿瘤微环境中的TGF-β能作用于肿瘤细胞，使之分泌血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），从而刺激内皮细胞和毛细血管腔生成，对晚期肿瘤的血管形成起到关键性作用[23]。李桃英等[24]在临床研究中发现增生期子宫内膜肿瘤患者血清中VEGF、TGF-β1的表达量均高于健康对照组女性，且恶性肿瘤组高于良性肿瘤组，同时TGF-β1表达量与VEGF呈现正相关。刘竞等[25]在人膀胱癌细胞中构建并转染TGF-β1小干扰RNA表达载体，发现VEGF表达量下调；而在高表达TGF-β1的癌细胞系中VEGF表达量随之升高。这些证据说明在肿瘤微环境中TGF-β1可能通过上调VEGF的表达来促进肿瘤新血管的生成，进而促进肿瘤发生迁移。另外，TGF-β能促进基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）的表达，而MMP能够分解细胞外基质，降低细胞黏附性，增强血管内皮细胞的迁移能力，从而利于新血管生成[26]。2.2.3  TGF-β诱导肿瘤细胞免疫逃逸    在肿瘤发生过程中，肿瘤微环境中的TGF-β可以使肿瘤细胞逃避机体免疫系统的监视。自然杀伤（natural killer，NK）细胞通过其独特的能力对肿瘤细胞做出反应，在没有适应性应答的情况下识别应激细胞，从而实现快速免疫应答。TGF-β能抑制NK细胞中的IFN-γ和T-bet表达，从而抑制Th1应答[23]。此外，树突状细胞（dendritic cell，DC）是最有效的APC，在肿瘤免疫中起着关键作用。TGF-β通过抑制MHC-Ⅱ基因的表达在体外抑制DC的抗原呈递能力。DC的耐受由TGF-β信号诱导免疫抑制分子吲哚胺2，3-双加氧酶（indoleamine 2，3-dioxygenase，IDO）和精氨酸酶介导，在乳腺癌和黑色素瘤的模型中TGF-β通过上调浆细胞类DC中的IDO和骨髓DC中的CCL22趋化因子来介导免疫逃逸[27]。与此同时，肿瘤微环境中的TGF-β能促进T细胞向调节性T细胞方向分化，进而抑制CD8+ T细胞介导的对肿瘤细胞的杀伤作用，诱导肿瘤发生免疫逃逸[28]。此外，肿瘤微环境中的TGF-β能促进巨噬细胞从具有抗肿瘤作用的M1表型向抗炎、免疫抑制的M2表型转变[11]。3靶向TGF-β的在研药物鉴于TGF-β信号通路在肿瘤的发生、发展和转移过程中发挥着巨大的作用，通过抑制TGF-β的产生或者阻断其信号转导等途径以限制肿瘤进展已成为抗肿瘤治疗的一种有效手段。目前，临床上已有多种靶向TGF-β的在研药物，主要包含单克隆抗体（单抗）和TGF-βR融合蛋白、靶向TGF-β的反义寡核苷酸链及TGF-βR激酶抑制剂。3.1单抗和融合蛋白Fresolimumab（GC1008）是一种人源性 IgG4抗TGF-β单抗，由1D11鼠源抗体经嵌合改造获得，可同时靶向TGF-β1、2、3，目前在晚期恶性黑色素瘤和肾细胞癌患者中进行Ⅰ期临床试验。患者在第0、28、42和56天接受静脉注射Fresolimumab，剂量递增。至少达到疾病稳定的患者可接受延长治疗，包括每2周4剂注射，最多2个额外的疗程。有29例患者接受了治疗，其中22例在剂量递增中，7例在安全队列扩展中。没有观察到剂量限制性毒性，并且确定最大剂量15 mg/kg是安全的。其中可逆性皮肤角膜棘皮瘤/鳞状细胞癌（4例患者）和角化过度的发展是观察到的主要不良事件。1例恶性黑色素瘤患者获得部分缓解，6例病情稳定，中位无进展生存期为24周[29]。SAR439459是法国赛诺菲公司在研的一种靶向TGF-β的单抗，SAR439459单药或联合抗程序性死亡蛋白1药物西米普利单抗治疗进展期实体瘤安全性及抗肿瘤活性的临床试验正在招募患者(NCT03192345)。LY3022859是一种抗TGF-βRⅡ单抗，在临床前评估中对乳腺癌有疗效，但Ⅰ期临床试验在14例转移性肿瘤患者中观察到不可控的细胞因子释放综合征，使试验提前终止[30]。SRK-181是一种IgG4/kappa亚型的全人源抗体，能高特异性、高亲和力地结合TGF-β1前体复合物，但不结合TGF-β2或TGF-β3。在临床前研究中，使用SRK-181联合抗PD-1单抗治疗小鼠肿瘤模型能够让效应T细胞在肿瘤微环境中浸润并扩增，观察到持续的抗肿瘤效应[31]。同时由于高特异性，SRK-181在成年大鼠中的最大剂量增加到每周给药100 mg/kg也没有观察到药物毒性。AVID200是一类高亲和力TGF-βRⅡ Fc融合蛋白药物，可在pmol级水平有效中和TGF-β1和TGF-β3，但不结合TGF-β2。AVID200的选择靶向性使其成为纤维化疾病和肿瘤免疫治疗中极具开发潜力的药物。目前该药已进入Ⅰ期临床研究[32]。M7824是德国默克公司研发的一种双功能融合蛋白，能特异性地同时结合程序性死亡受体配体1（programmed death-ligand 1，PD-L1）和 TGF-β。在小鼠肿瘤模型中，M7824比用抗PD-L1抗体或TGF-β陷阱治疗能更有效地抑制肿瘤生长和转移[33]。使用M7824治疗晚期非小细胞肺癌，患者中位总生存期为17.1个月，与抗PD-1单抗治疗相比有显著延长。另外，长达3年的随访结果表明M7824对PD-L1高表达的患者具有可控的安全性，且具有较长的缓解持续时间和较好的长期临床获益[11]。但在治疗接受过免疫检查点抑制剂后疾病进展的微卫星高度不稳定/错配修复缺陷实体瘤患者的Ⅱ期临床研究（NCT03436563）中，M7824未显示出抗肿瘤活性而以失败告终，包含159例患者的M7824单药二线治疗局部晚期或转移性胆道癌的Ⅱ期临床试验也因未达到主要终点而终止。目前，M7824还有宫颈癌、乳腺癌、尿路上皮癌、非小细胞肺癌联合疗法等多项处于不同阶段的临床试验。3.2靶向TGF-β的反义寡核苷酸链反义寡核苷酸链AP12009靶向沉默TGF-β2 mRNA，用于恶性黑色素瘤和胶质瘤的治疗。在难治型胶质瘤的Ⅰ/Ⅱ期临床试验中，10 μmol/L AP12009治疗组的中位生存期为12.0个月，80 μmol/L AP12009治疗组为13.1个月，标准化治疗组为11.0个月，表明AP12009可能是一种很有希望的抗肿瘤药物[34]，具有较高的开发潜力。目前，AP12009已进入治疗转移性黑色素瘤、胰腺癌和转移性结直肠癌的Ⅲ期临床研究。STP705是一种在研的靶向TGF-β1和COX-2基因的小干扰RNA治疗药物，由多肽纳米颗粒配制而成。在临床前动物模型中，STP705给药增加了T细胞对肝脏肿瘤的渗透，并增加了肝细胞癌模型中抗PD-L1抗体的疗效。在1项正在进行的评估STP705的Ⅱ期临床研究中，通过每周1次病灶内注射，共持续6周用于治疗非黑色素瘤皮肤癌，中期分析表明一些患者的病变出现组织学清除，且接受治疗的患者没有出现皮肤不良反应[35]。3.3TGF-βR激酶抑制剂小分子抑制剂SB-431542能特异性结合到TGF-βRⅠ，通过抑制其激酶活性来阻断下游Smad2/3磷酸化，从而阻断TGF-β/Smad信号通路。SB-431542在恶性神经胶质瘤细胞中能够抑制血管生成，阻断肿瘤细胞的迁移作用，同时能有效抑制TGF-β诱导的人骨肉瘤细胞增殖和迁移[36]。Galunisertib（LY2157299）是目前研究最广泛的新型口服小分子抑制剂，其作用机制与SB-431542相同，能抑制TGF-βRⅠ激酶活性[37]。Galunisertib在乳腺癌、结肠癌、肺癌和肝癌异种移植肿瘤中具有抗肿瘤活性[38]。在人体剂量研究中，56例胶质瘤患者中有12例观察到临床获益，且300 mg/d的Galunisertib安全性良好，可用于未来的临床研究[39]。Vactosertib（TEW-7197）是处于临床开发中的TGF-βRⅠ选择性小分子抑制剂，特异性靶向TGF-βRⅠ的腺苷-5’-三磷酸结合位点，从而抑制Smad2和Smad3的磷酸化来阻断下游信号通路。Ⅰ期剂量递增研究在晚期实体瘤患者中评估了Vactosertib的安全性、有效性以及与TGF-β反应特征的相关性，患者在剂量范围内（30~340 mg）每日1次接受Vactosertib，持续5 d，休息2 d。结果表明Vactosertib的安全性和耐受性良好，但最大耐受剂量尚未确定；接受≥140 mg治疗的17例患者中有6例病情稳定（35.3%），并且成纤维细胞TGF-β反应特征比进行性疾病患者更高[40]。4展望TGF-β是一种多效细胞因子，根据所处的肿瘤微环境，可以产生促肿瘤或抗肿瘤作用。在肿瘤形成后，TGF-β能通过介导EMT、促进血管生成、诱导免疫逃逸等作用来促进肿瘤细胞的生长、浸润与转移。尽管大量临床前和转化研究表明，阻断TGF-β是一种潜在有效的治疗策略，但从实验室到临床的转化进展缓慢，目前尚未有靶向TGF-β药物被批准用于癌症治疗，这可能与TGF-β的双重作用有关。阻断TGF-β信号通路，同时解除肿瘤微环境的免疫抑制，已成为目前研究靶向TGF-β药物的热门方向，而如何设计TGF-β抑制剂与免疫检查点抑制剂的联用还需要进一步思考与探索。引用本文：马钧. 转化生长因子β在肿瘤微环境中的作用及其靶向药物研究进展 [J]. 国际生物制品学杂志, 2023, 46(2): 103-108.  DOI: 10.3760/cma.j.cn311962-20220127-00009