Amphotericin B

注射为临床常用的给药方式之一，相关药物递送平台(复杂注射剂)的开发也是近年来的热点。目前复杂注射剂无官方明确定义，通常认为复杂注射剂包括脂质体、微球、胶束、微晶、原位凝胶等，其活性成分在体内行为受制剂技术的影响较大，并能达到如高靶向性、高载荷、低毒副作用等效果。本文将重点针对脂质体的定义分类、临床应用、市场情况进行分析。 脂质体的定义与分类 脂质体结构最初由英国血液学家 AlecD Bangham 于 1961 年描述。 从结构上看，脂质体是由膜状脂质双分子层包围着水体积的同心漂流囊泡。双层脂膜通常由磷脂组成，磷脂含有疏水的尾部和亲水的头部。通过调整加入脂质种类可以调整脂质体的性能。脂质体可装载亲水性药物于内部水环境中，也可将疏水性药物嵌入脂质膜之间或吸附在脂质体表面。 脂质体分类标准众多，包括结构特征、结构参数和尺寸、合成方法、组成成分和载药量等。 脂质体作为药物递送载体的临床应用 脂质体作为基于胆固醇和天然无毒磷脂的球形囊泡，因其生物相容性、适当的尺寸以及其具有可载药的疏水层和亲水层等特性，目前已被认为是高度通用的纳米颗粒，可用于生物医学中多个领域，特别是对于药物递送。 我国脂质体注射剂获批情况 根据药融云数据库，目前我国在使用状态的脂质体注射剂批文共有15条。对应6个活性成分，其中盐酸多柔比星脂质体获批批文最多，共有8条，分别来自于浙江海正药业、上海复旦张江生物医药、浙江智达药业、常州金远药业、石药集团欧意药业等5家制药企业。 根据药融云数据库，截至2022年，有相关销售信息的活性物质共有4个，分别为盐酸多柔比星、盐酸米托蒽醌、两性霉素B及紫杉醇。2015-2020年间，我国脂质体市场保持快速增长，年复合增长率为18%；2020年后销售额逐年降低。 目前市场主要由盐酸多柔比星及紫杉醇占据，为抗肿瘤药。石药集团近年在我国脂质体市场中份额来增长迅速，至2022年，其约占一半我国脂质体市场份额。石药集团近年在我国脂质体市场中份额来增长迅速，至2022年，其约占一半我国脂质体市场份额。 经典改良型脂质体注射剂分析一多柔比星 多柔比星属于细胞周期非特异性药物，直接作用于DNA，抑制DNA合成，干扰RNA转录，以此抑制肿瘤细胞。但该方式不能选择性区分肿瘤和正常细胞，且通过半醒代谢物损害心肌细胞，将给人体带来严重剂量依赖性以及心脏毒性。 聚乙二醇修饰（PEG化）脂质体能够免遭单核巨噬细胞系统(MPS)鉴别和清除，增加药物在血液循环系统中的保留时间，利用肿瘤的EPR效应，以自身长循环特性增加药物在肿部位的蓄积，使肿瘤组织内药物浓度超出正常组织药物浓度20倍，部分甚至达到60倍，从而实现被动靶向肿瘤的目的。显著增强抗肿瘤活性的同时也大大降低了对正常组织的毒性，包括心脏毒性、脱发及骨髓抑制。 国外已上市脂质体:D0XIL/Caelyx(长循环)、Myocet(非PEG化)、Lipo-dox Doxil VS Myocet:与Doxil相比，Myocet进入体内后的循环时间较短、释放速度较快。但Myocet的包装中分为三个小瓶，临床使用前，将空白脂质体混悬液注射到碳酸钠缓冲液中，脂质体外水相的pH值调节至7~8，再与DOX的生理盐水溶液混合。使用较麻烦。 Lipo-dox是Doxil的仿制药，活性成分、剂型、给药途径均一致，辅料加了少数无水乙醇，并以DSPC取代了原研中的HSPC。 国内上市情况:2003年，强生旗下西安杨森将盐酸多柔比星脂质体注射液(商品名为楷菜/Caelyx)引入中国市场，2015年注册证号到期后未进行再注册。在此期间，中国市场上相继出现三家仿制药，分别为上海复旦张江的“里葆多”(2008)、石药欧意的“多美素”(2011)以及常州金远的“立幸”(2012) 更多脂质体注射液案例分析（布比卡因、米托蒽醌、紫杉醇、伊立替康等）详见完整性版报告。

摘要：人类诺如病毒（HuNoV）是全球急性胃肠炎的主要原因，特别是在发展中国家。它的全球流行率强调了在儿童（<5岁）和老年人中更为严重的发病率和一些死亡率。迄今为止，尚无针对HuNoV的许可疫苗或批准的治疗方法，主要是因为可用的细胞培养系统和小鼠模型有限。最近描述的细胞培养系统不是理想的HuNoV疫苗开发基质，因为它们不是克隆的或只支持单一菌株。在这项研究中，我们展示了基于Vero细胞的两种流行性GII.4 HuNoV菌株和一种GII.3菌株的复制，并确认了Vero细胞中介导的HuNoV感染。最后，我们展示了向病毒培养中添加胰蛋白酶或破坏Vero细胞宿主基因可以适度增加HuNoV的复制。这些数据为Vero细胞作为HuNoV的细胞培养模型提供了支持。 1.引言 HuNoV 是 Caliciviridae 家族的成员，是一种非包膜的、正义、单链 RNA 病毒 。HuNoVs 拥有 7.5–7.7 kb 的基因组，包含三个开放阅读框（ORFs）。ORF1 编码六个非结构蛋白，从 N 端到 C 端依次为：p48，核苷三磷酸酶（NTPase），p22，VPg，3C 类似蛋白酶（3CLpro），以及 RNA 依赖的 RNA 聚合酶（RdRp）。含有 ORFs 2 和 3 的亚基因组 RNA 编码主要和次要结构蛋白，VP1 和 VP2。诺如病毒（NoVs）根据 VP1 的序列同源性被细分为十个基因组（GI-GX）。GI、GII 以及较少程度的 GIV、GVIII 和 GIX 病毒会感染人类。这些基因组进一步被划分为基因型：GI（n = 9）、GII（n = 27）、GIV（n = 2）、GVIII（n = 1）和 GIX（n = 1）。GII.4 HuNoV 菌株约占 HuNoV 感染的 ~70% 。GII.4 HuNoV 已引起大流行，现在是主要的流行菌株 。目前，一种重组的 GII.4 悉尼大流行株（GII.P16-GII.4 悉尼）是大多数感染的原因，使其成为疫苗开发最合适的菌株。HuNoVs 通过粪口途径传播，引起急性、自限性感染，以呕吐和腹泻为特征。即使在症状消退后，粪便中也会排出相当数量的病毒，持续数周。病毒衣壳的稳定性和低感染剂量有助于人与人之间的传播。HuNoVs 每年导致约 7 亿感染和约 21.9 万人死亡 。HuNoV 感染在发展中国家尤其使人虚弱，那里的年轻人（<5 岁）、老年人和免疫功能低下者最容易感染。目前，尚无针对 HuNoV 的许可疫苗或批准的治疗方法。这与缺乏表征和可重复的哺乳动物细胞基质、缺乏模拟感染和疾病的小鼠模型，以及缺乏适当评估疫苗效力或保护的方法有关。最先进的 HuNoV 疫苗候选物是由病毒样颗粒（VLPs）产生的亚单位疫苗。尽管 VLP 疫苗看起来很有前景，但需要一个良好表征的哺乳动物细胞培养基质来开发灭活或减毒的 HuNoV 疫苗。组织血型抗原（HBGAs），作为脂质或蛋白连接的糖链末端的碳水化合物，是 HuNoV 的附着因子。然而，已经表明 HBGA 表达并不使细胞对 HuNoV 感染具有许可性。CD300ld/CD300lf 已被确定为小鼠 NoV 受体，是已知的唯一功能性 NoV 受体。最近，HuNoVs 已在人类肠道类器官（HIEs）和人类 Burkitt 淋巴瘤 B 细胞（BJAB）细胞系中增殖 。这些发现令人鼓舞，但由于 HIEs 不是一个稳定或克隆的细胞系，并且寿命有限，HIEs 不符合疫苗生产的要求。此外，BJAB 细胞系据报道只支持一种 HuNoV 菌株，需要 HBGA 细胞培养补充，并且存在可重复性问题，使这些细胞不适合疫苗生产。相比之下，Vero 细胞是从非洲绿猴细胞系衍生的连续哺乳动物细胞系，由于偶然的基因缺失，缺乏干扰素-α（IFNα）和 -β（IFNβ）。这一特性使 Vero 细胞成为脊髓灰质炎病毒、狂犬病病毒、流感病毒和轮状病毒疫苗增殖的领先细胞系 。然而，过去在 Vero 细胞中增殖 HuNoVs 的尝试一直无效，可能是因为早期研究使用了不充分的病毒孵化时间。相比之下，这项研究表明 Vero 细胞可以作为 HuNoV 的哺乳动物细胞基质。具体来说，这项研究表明，通过间接酶联免疫吸附试验（ELISA）和定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）终点测定，HuNoV 在 Vero 细胞中适度复制。我们通过 qRT-PCR 检测了两种流行性 GII.4 菌株和一种 GII.3 菌株的 HuNoV 基因组复制，并使用间接 ELISA、流式细胞术和免疫荧光显示结构和非结构 HuNoV 蛋白水平都有所增加。此外，我们展示了 Vero 细胞中介导的 HuNoV 感染，就像之前对轮状病毒和 NoVs 报告的那样。Vero 细胞对广泛的 MOI 范围的过滤和未过滤的临床粪便样本都具有许可性。我们还探索了增加 HuNoV 复制的方法，并表明通过向细胞培养基中添加胰蛋白酶，或通过 Vero 细胞特定宿主基因的敲除（KD）或敲除（KO），可以将 HuNoV 复制提高约 1.5 倍。这些发现为使用 Vero 细胞作为 HuNoV 复制的细胞培养模型提供了支持。 2.材料和方法 2.1. 细胞 Vero 细胞（非洲绿猴肾）从美国类型培养物收藏（ATCC; CCL81.4; 批号 #738812; 马纳萨斯，VA，美国）获得，并在 37 ℃/5% CO2 的条件下低代培养在杜氏改良鹰氏培养基（DMEM; GIBCO, 盖瑟斯堡，MD，美国）中，有无 5% 热灭活胎牛血清（FBS; HyClone, 洛根，UT，美国）。Caco-2 细胞（HTB-37; ATCC）使用含有 20% FBS 的 DMEM 培养。创建了主细胞系库，以确保所有实验都使用低代细胞。 2.2. 病毒 含有 GII.3、GII.4 悉尼或 GII.4 Yerseke HuNoVs 的粪便样本，或 HuNoV 阴性样本，分别从默多克儿童研究所（MCRI; 墨尔本维多利亚，澳大利亚）或疾病控制和预防中心（CDC, 亚特兰大，GA，美国）的病毒性胃肠炎科（DVD）获得，并在收到后存储在 -80 ℃。使用 TaqMan Array 确认粪便样本仅含有 GII HuNoV，该方法评估了 53 种肠道病原体的物种和亚种，并通过 BLAST 分析进行了测序。粪便样本在冰上解冻后，用无菌磷酸盐缓冲液（PBS; Hyclone）制备成 10%（w/v）的稀释液。所有样本在 4 ℃ 下以 1500×g 离心 2×10 分钟，然后以 5000×g 离心 10 分钟。粪便稀释液通过 100 µm 和 40 µm 细胞筛过滤，过滤后的样本通过 0.45 µm 或 0.20 µm 滤器（GE Healthcare, 芝加哥，IL，美国）过滤，然后分装并存储在 -80 ℃，直到使用。 2.3. 通过 qRT-PCR 定量 HuNoV 基因组等价物（g.e.） 处理过的粪便样本用 RNAzol（分子研究中心公司，辛辛那提，OH，美国）处理，根据制造商的说明制备总 RNA，用于 qRT-PCR 的扩增和检测。Integrated DNA Technologies (IDT; Coralville, IA, 美国) 合成了 GII NoV 特异性 DNA 引物和探针，与 AgPath-ID One-Step RT-PCR 试剂盒（Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, 美国）一起使用。引物：NK2P2F (+) 5 0 –ATGTTCAGATGGATGAGATTCTC 和 NKP2R (−) 50 –TCGACGCCATCTTCATTCAC 用于扩增 HuNoV RdRp 的一段，在最终反应浓度 [300 nM] 下进行。基于探针的扩增通过 RING2-TP 50 –FAM–TGGGAGGGCGATCGCAATCT–BHQ 检测，在最终反应浓度 [120 nM] 下进行。每个 RNA 样本使用 4.25 µL，在最终反应体积 12.5 µL 中。逆转录和 PCR 扩增使用 Mx3005P qPCR 系统（Agilent, Santa Clara, CA, 美国）在以下循环条件下进行：45 ℃ 10 分钟，95 ℃ 10 分钟，然后是 40 个循环，每个循环 95 ℃ 15 秒，50 ℃ 30 秒，60 ℃ 30 秒。所得的 RdRp qRT-PCR 水平被认为是基因组等价物（g.e.），因为在每个完整基因组中扩增位点只出现一次。实验时间点的 g.e. RNA 水平除以输入时间点（即，0 小时）的平均 g.e. RNA 水平，以计算倍数增加，将输入时间点的倍数变化标准化为 1。 2.4. ORF1–2 结合部 RT-PCR 从 HuNoV 感染的 Vero 细胞中提取的总 RNA 在 0 小时和 72 小时间点被逆转录和 PCR 扩增，使用 AgPath-ID One-Step RT-PCR 试剂盒和 NK2P2F (+) 和 Cap C (−) 50 –CCTTYCCAKWTCCCAYGG [1 µM] 引物，扩增 RdRp 和 VP1 基因序列之间的基因组片段，跨越 ORF1–2 结合部 [50]。PCR 扩增产物在 1% 琼脂糖凝胶上运行，并在 FluorChem E 系统（Bio-Techne, Minneapolis, MN, 美国）上使用乙溴化物进行可视化。 2.5. qRT-PCR 标准曲线和对照 通过合成包含引物和扩增位点的 100 bp 序列（IDT），生成了 HuNoV dsDNA 标准品。在每次 qRT-PCR 检测中，分别含有 10^1、10^2、10^3、10^4、10^5、10^6 和 10^7 拷贝/孔的扩增序列标准品均进行三次重复实验。在实验感染 qRT-PCR 中，每个标准品中加入 100 ng 的 Vero 细胞 RNA。此外，每个实验都包括无模板对照（仅 Vero 细胞 RNA）和无逆转录/聚合酶对照，每种对照也进行三次重复。含有未知量 HuNoV 的孔与标准曲线对比，以确定它们的基因组等价物（g.e.）。MOI 通过输入的 g.e. 与细胞数量的比值来计算。 2.6. HuNoV qRT-PCR Vero 细胞在无血清 DMEM（SF-DMEM）中被模拟感染或感染（MOI = 1.0）HuNoV，然后在 37 ℃/5% CO2 的条件下孵育 1 小时或 6 小时。除了病毒输入对照孔外，所有孔中的病毒都被移除，然后细胞用 PBS 洗涤两次。使用 RNAzol 从细胞部分提取 RNA，如上所述。通过将细胞部分的 g.e. 除以三个实验和对照孔中的总病毒输入对照，确定细胞内 HuNoV 的水平。 2.7. H-抗原 ELISA 分别在含有 5% 或 20% FBS 的 DMEM 中培养 Vero 细胞或 Caco-2 细胞。Caco-2 细胞在进行 ELISA 前分化 21 天。倒掉培养基，向每个孔中加入冷的 4% 甲醛，并在室温（RT）下孵育 30 分钟。固定后，用 PBS 洗涤细胞一次，然后通过添加含 5% BSA 的 PBS 来阻断非特异性结合，孵育 1 小时。孵育后，向细胞中加入稀释至 1:1000 的小鼠 IgM 抗血型 H-抗原抗体（Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, CA, 美国）在含 5% BSA 的 PBS 中过夜，4 ℃。倒掉溶液，用 KPL 洗涤缓冲液（Seracare, Milford, MA, 美国）洗涤细胞三次。然后向细胞中加入稀释至 1:2000 的辣根过氧化物酶（HRP）偶联的山羊抗小鼠 IgM 抗体（Thermo Fisher Scientific）在含 5% BSA 的 PBS 中孵育 1 小时。倒掉溶液，用 KPL 洗涤缓冲液洗涤三次，然后使用一步 TMB ELISA 底物溶液（Thermo Fisher Scientific）进行比色可视化，然后在 Epoch 微孔板分光光度计（Biotek, Winooski, VT, 美国）上测定 450 nm 处的吸光度（OD）。 2.8. CD300ld/CD300lf ELISA 和免疫荧光测定（IFA） 使用 H-抗原 ELISA 协议，但进行了以下修改：(1) 使用稀释至 1:100 的多克隆兔抗 CD300lf 抗体（Lifespan Biosciences, Seattle, WA, 美国）作为一级抗体；(2) 使用稀释至 1:1000 的山羊抗兔 IgG 抗体偶联至 HRP（Thermo Fisher Scientific）或山羊抗兔 IgG（H + L）抗体偶联至 Alexa Fluor 488（Thermo Fisher Scientific）作为二级抗体。一级抗体与 CD300lf 和 CD300ld 的外细胞域反应，因为它们的氨基酸序列高度保守 ，这意味着 ELISA 和 IFA 可能同时检测这两种蛋白。 2.9. HuNoV 感染 使用粪便样本的无细胞上清液，无论是过滤的还是未过滤的，进行感染。通过使用 SF-DMEM 标准化每种感染条件下过滤或未过滤 HuNoV 的体积，生成病毒主混合物。倒掉 Vero 细胞的培养基，然后用 MOI = 1.0 HuNoV g.e. 进行感染，除非另有说明。感染前轻轻摇动板子，然后在 37 ℃/5% CO2 下孵育。在每个实验时间点，如上所述评估 HuNoV g.e。尽管每个实验都包括未感染对照，但为了提高图表数据的清晰度，并且因为这些样本中没有观察到变化，所以未将其绘制在图表上。对于包括胰蛋白酶的 HuNoV 感染，将 0.25% 胰蛋白酶（Gibo by Life Technologies; Thermo Fisher Scientific）加入病毒中，最终感染浓度为 1% [8.8 BAEE 单位]，在 37 ℃/5% CO2 下孵育 30 分钟，然后进行感染。对于包括胆汁酸的 HuNoV 感染，在感染时添加猪胆汁提取物（0.015–0.045%）（MilliporeSigma, Burlington, MA, 美国），或甘氨去氧胆酸（100 µM–1 mM）（MilliporeSigma）。对于 HuNoV 传代实验，使用原生粪便以 MOI = 1.0 感染 Vero 细胞，在指定时间点冻融 2 次，然后将冻融上清液转移到新鲜的 Vero 细胞中孵育 72 小时。 2.10. HuNoV 灭活 使用 Spectronics（西伯里，纽约，美国）的 UV 辐照对 HuNoV 进行 1 小时的室温处理。对照组包括用箔纸覆盖以防止灭活的 HuNoV，将其放置在 UV 灯旁 1 小时。 2.11. HuNoV 复制 ELISA 感染 HuNoV 的 Vero 细胞经过两次冻融，然后将上清液转移到高结合 ELISA 板（Corning，纽约，美国）中，并在 4 ℃ 下过夜孵育。在用 PBS 清洗 3 次后，用 SuperBlock（Thermo Fisher Scientific）封闭 2 次，每次 15 分钟。孵育后，向孔中加入稀释至 1:1000 的多克隆兔 IgG 抗 VP1 抗体（Abcam，剑桥，英国）或多克隆兔 IgG 抗 p48 抗体（Christiane Wobus 赠送）在 SuperBlock 中，37 ℃ 下孵育 1 小时。去除溶液后，用 KPL 洗涤缓冲液清洗孔 3 次，然后加入稀释至 1:1000 的辣根过氧化物酶（HRP）偶联的山羊抗兔 IgG 抗体（Thermo Fisher Scientific）在 SuperBlock 中，37 ℃ 下孵育 1 小时。倒掉溶液，用 KPL 洗涤缓冲液清洗 3 次，然后加入 TMB ELISA 底物溶液（Thermo Fisher Scientific）进行比色可视化。使用 Epoch 微孔板分光光度计（Biotek）读取 OD450。 2.12. 流式细胞术和免疫荧光测定（IFA） 在 24 孔板中，将 10^5 Vero 细胞感染或模拟感染 72 小时，倒掉培养基，用 PBS 清洗 1 次，然后在 37 ℃ /5% CO2 下加入 0.05% 胰蛋白酶处理 10 分钟。加入 DMEM + 5% FBS，轻轻离心 200×g 5 分钟。倒掉上清液，将细胞在 4 ℃ 的 Cytofix（Thermo Fisher Scientific）中悬浮 10 分钟。再次离心 200×g 5 分钟，然后用 PBS + 5% BSA 清洗。清洗后，将细胞在 −20 ℃ 的甲醇中悬浮并在 4 ℃ 下孵育 30 分钟。透化后，用 PBS + 5% BSA 清洗，用 PBS + 5% BSA 封闭 20 分钟。单克隆小鼠 IgG 抗 VP1（Abcam）和多克隆兔 IgG 抗 p48（Christiane Wobus 赠送）抗体在 PBS + 5% BSA 中稀释至 1:500，室温下孵育 30 分钟。去除一级抗体，清洗 3 次，然后在 PBS + 5% BSA 中悬浮在多克隆 PE 偶联的山羊抗小鼠 IgG（BD Biosciences，新泽西州富兰克林湖，美国）和 Alexa Fluor 488 偶联的山羊抗兔 IgG（Thermo Fisher Scientific）中，室温下孵育 30 分钟。清洗 3 次，在 PBS + 5% BSA 中悬浮，然后在 LSR II 流式细胞仪（Thermo Fisher Scientific）上分析。使用 FlowJo 进行数据分析，每个条件分析 10,000 个细胞。对于 IFA，使用流式细胞术协议，但进行了以下修改：(1) 细胞不使用胰蛋白酶处理，(2) 细胞用丙酮：甲醇（60:40）固定/透化，(3) 在二级抗体孵育后，用 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）（1 µg/mL）（Thermo Fisher Scientific）在室温下染色 15 分钟，(4) 在 EVOS FL 成像系统（Thermo Fisher Scientific）上以 40 倍放大获取荧光图像。 2.13. 粪便衍生的外泌体 使用 Exoquick（System Biosciences，帕洛阿尔托，加利福尼亚，美国）根据制造商的说明处理 HuNoV 阳性粪便样本。通过 qRT-PCR 计算与外泌体相关的 HuNoV 的 g.e. 含量。使用 NS300 NanoSight（Spectris，英国埃格姆）对外泌体样本进行 10 次测试，以确定囊泡的浓度和大小。 2.14. siRNA 基因敲减（KD） 使用针对人类基因的 ON-TARGETplus siRNA（Dharmacon，拉斐特，科罗拉多，美国）在 Vero 细胞中 KD 基因表达。这些 siRNA 之前已验证可特异性靶向并在 Vero 细胞中敲减宿主基因。将针对不同基因特异性种子区域的四个 siRNA 双链合并，并同时转染以增强基因表达 KD。通过与非靶向对照（NTC）siRNA 处理相比，使用 qPCR 确认每个宿主基因的 siRNA KD。将 siRNA [最终浓度 50 nM] 预先板载在 96 孔板中，然后在室温下与 0.35 µL 的 Dharmafect 4（Dharmacon）稀释在汉克平衡盐溶液（HBSS; Hyclone）中孵育 30 分钟。孵育后，将 8 ×103 Vero 细胞反向转染在 SF-DMEM 中，并在 37 ℃/5% CO2 下过夜孵育。转染后 16 小时，将转染培养基更换为 DMEM + 5% FBS。转染后 48 小时，孔中感染 HuNoV 72 小时。 2.15. CRISPR-Cas9 基因编辑 在 Vero 细胞中进行了单质粒 CRISPR 基因编辑（MilliporeSigma）。将 9 × 10^5 的 Vero 细胞在 37 ℃/5% CO2 的条件下，用含有 5% FBS 的 DMEM 培养在 6 孔板中。12.5 µL 的 Lipofectamine LTX（Thermo Fisher Scientific）和 3.75 µg 的 CRISPR DNA 分别稀释至最终体积 100 µL 的 OPTI-MEM（Thermo Fisher Scientific）中。混合后，Lipofectamine 和 CRISPR DNA 结合并在室温下孵育 30 分钟。与此同时，用 HBSS 清洗细胞一次，然后加入含有 5% FBS 的 DMEM。加入 200 µL 的 Lipofectamine 和 CRISPR DNA 混合物后，培养板在 37 ℃ /5% CO2 的条件下孵育 6 小时，然后加入另外 1 mL 的含有 5% FBS 的 DMEM。转染后 24 小时，培养基更换为含有 10% FBS 的 DMEM，100 单位/mL 的青霉素，100 µg/mL 的链霉素，以及 250 ng/mL 的两性霉素 B（Thermo Fisher Scientific）。基于 GFP 表达，使用 MoFlo Astrios EQ（Beckman Coulter, Brea, CA, 美国）对单细胞克隆进行 48 小时后的转染，并将其排序到 96 孔板中。同时，将 96 孔板格式的克隆扩展到 6 孔板格式，以便进行基因型（qRT-PCR 后跟 Sanger 测序和下一代测序）和表型（HuNoV 感染）验证。通过 bp 缺失导致 ORF 破坏来确认基因 KO。此外，包含插入基因的克隆被排除在分析之外。 2.16. 统计分析 使用 GraphPad Prism 执行了不配对的双尾 t 检验和单向 ANOVA 以及 Dunnett 的事后检验，置信区间为 95%。p 值小于 0.05 被认为是显著的：* p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001，和 **** p < 0.0001。除非另有说明，每个条件/实验的 n = 3 孔/来自 n ≥ 3 个独立实验的数据。误差条代表 ± 标准误差（SEM）。 3.结果  尽管其他人未能在 Vero 细胞中扩增 HuNoV，我们的研究表明，低代 Vero 细胞可以用作 HuNoV 的细胞基质。我们之前在几种病毒的疫苗基质开发中使用了低代 Vero 细胞 。为了开始评估 HuNoV 感染，我们展示了通过 qRT-PCR 在 Vero 细胞中检测到 HuNoV RNA（图 1A）。HuNoV 使用 HBGAs，如 H-抗原，作为附着因子；然而，它们不是 HuNoV 感染的要求 。我们检查了 Vero 细胞或 Caco-2 细胞上的 H-抗原表达水平，并表明 Vero 细胞通过 ELISA 不表达 H-抗原（图 1B）。此外，我们展示了 Vero 细胞表达小鼠 NoV 受体，CD300ld/CD300lf（图 1C,D）。 图 1. (A) 通过 qRT-PCR 检测 GII.4 HuNoV。从 HuNoV 感染的 Vero 细胞中提取 RNA 进行 qRT-PCR 分析。数据表示 n = 3 + SEM。* p < 0.05。(B) Vero 细胞不表达可检测的 H 抗原。使用间接 ELISA 在 Vero 细胞和 Caco-2 细胞的细胞表面检测 H 抗原。二级抗体对照组（2°）未观察到信号。数据表示 n = 4（Vero 细胞 H 抗原 ELISA）或 n = 1（Caco-2 细胞 H 抗原 ELISA）+ SEM。** p < 0.01。(C) Vero 细胞表达 CD300ld/CD300lf。使用抗 CD300lf（外细胞域）间接 ELISA 检测经 24 小时 ± 8.8 BAEE 胰蛋白酶处理的 Vero 细胞。二级抗体对照组（2°）未观察到信号。数据表示 n = 3 + SEM。**** p < 0.0001。(D) 通过免疫荧光检测 Vero 细胞上的 CD300ld/CD300lf 表达。展示了 40 倍放大的代表性图像，来自 n = 3 的生物学重复。对于仅用二级抗体处理（2°）的细胞，未观察到 CD300ld/CD300lf 相关的荧光。插图显示了一个表达 CD300ld/CD300lf 的 Vero 细胞。 我们尝试使用抗 CD300ld/CD300lf 抗体阻断和使用 CD300ld/CD300lf 外细胞域肽饱和潜在的 CD300ld/CD300lf 结合位点来抑制 HuNoV 进入 Vero 细胞，但两种处理均未成功。这些发现与报告一致，即 CD300ld/CD300lf 不是 HuNoV 的受体。在研究了 HuNoV 绑定之后，通过 qRT-PCR 和 RT-PCR 检查了 Vero 细胞中 HuNoV 基因组的复制并进行了定量（图 2 和补充图 S1）。在这些研究中，GII.4 悉尼基因组复制在 48–72 hpi 之间达到峰值（图 2A），并且像预期的那样被 UV 辐照灭活（图 2B）。UV 灭活 HuNoV 孵育 72 小时后 fold-decrease 可能对应于 Vero 细胞对非复制性 HuNoV RNA 的降解（图 2B）。为了确定 GII.4 悉尼的发现是否特定于菌株，检查了 Vero 细胞扩增 GII.3 和 GII.4 Yerseke HuNoV 菌株的能力（图 2C,D）。 图 2. (A) Vero 细胞对 GII.4 悉尼 HuNoV 具有许可性。通过 qRT-PCR 检测了 5 天时间过程中的 HuNoV 水平，发现在 48-72 小时 pi 之间达到峰值。数据表示 n = 3 + SEM。* p < 0.05 和 **** p < 0.0001。(B) UV 抑制 HuNoV 复制。1 小时的 UV 光照处理使 HuNoV 失活，减少了 72 小时 pi 时的复制，通过 qRT-PCR 测量。数据表示 n = 3 + SEM。*** p < 0.001 和 **** p < 0.0001。Vero 细胞对 GII.3 (C) 和 GII.4 Yerseke (D) HuNoV 也具有许可性。在 3 天时间过程中通过 qRT-PCR 分析。数据表示 n = 3 + SEM。* p < 0.05，** p < 0.01，和 **** p < 0.0001。 值得注意的是，这三种 HuNoV 菌株在任何测试的 MOI 或时间点都没有产生可检测的细胞病变效应。为了支持复制，使用兔抗 VP1 抗体通过间接 ELISA 检查了 GII.4 悉尼（图 3A）和 GII.3（图 3B）HuNoV 的蛋白表达。在输入时间点（图 3A）观察到 VP1 的剂量依赖性显著（p < 0.0001）检测。此外，ELISA 显示 HuNoV 衣壳和 p48（一种非结构蛋白）的增加（图 3A,B 和补充图 S2）。选择 ELISA 而不是 Western blots 是因为它们是定量的，并且可以检测到低水平的蛋白质。我们还通过流式细胞术检查了 VP1 和 p48 在 HuNoV 感染的 Vero 细胞中的表达（图 3C），并表明这两种蛋白质在低百分比的细胞中表达，这一结果与免疫荧光测定（图 3D）观察到的结果相似。 图3. 通过酶联免疫吸附测定（ELISA）检测 GII.4 悉尼型（A）和 GII.3 型（B）人类杯状病毒（HuNoV）VP1。测量了 OD（450 纳米）值，并将与 HuNoV 阴性粪便输入值的倍数变化标准化后绘制成图表。数据代表 n = 3（A）或 n = 1（B）+ 标准误差均值（SEM）。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，和 ****p < 0.0001。（C）HuNoV 感染的 Vero 细胞中 VP1 和 p48 染色频率增加。HuNoV 接种后，检测单阳性（VP1+ 或 p48+）和双阳性（VP1+ p48+）Vero 细胞群体。柱状图是在荧光微珠补偿后生成的，细胞计数标准化到众数。数据代表来自 5 个生物学重复的 n = 1。（D）通过免疫荧光分析可视化 GII.4 悉尼型 VP1 和 p48 蛋白。代表性图像在 40 倍放大下显示，来自 n = 3 个生物学重复。对于仅用二抗（2°）处理的细胞，未观察到与 VP1 或 p48 相关的荧光。插图显示了一个 HuNoV 感染的 Vero 细胞。 HuNoV 被理解为以未包被的病毒粒子感染易感细胞，直到最近的报告显示含有小鼠 NoV 和 HuNoV 的外泌体对病毒感染和复制至关重要。因此，我们检查了来自 HuNoV 感染粪便样本的外泌体分离，并确认外泌体部分含有超过一半（约 55%）的所有 HuNoV g.e.（补充图 S3）。我们的发现表明，与未分离粪便样本中的 HuNoV 相比，Vero 细胞内化了相似水平的外泌体相关的 HuNoV ，并且外泌体相关的 GII.4 HuNoVs 在 Vero 细胞中具有复制能力（图 4）。这项研究还检查了来自过滤或未过滤粪便样本的 HuNoV 复制的时间和峰值。没有检测到实质性差异，表明粪便样本中的细菌或其他可过滤因子并未促进 HuNoV 复制 ，这与在 BJABs 中培养 HuNoVs 相反。此外，Vero 细胞中 HuNoV 复制的 MOI 范围很广（1.0–100）（补充图 S4）。 图 4. Vero 细胞对 GII.4 悉尼 HuNoV 相关外泌体具有容许性。为期 3 天的时间进程 qRT-PCR 分析。数据代表 n = 3 + SEM。** p < 0.01 和 *** p < 0.001 肠道病毒衣壳通过粪便-口腔途径主要传播，它们具有显著的耐用性，因为它们在保护病毒 RNA 方面发挥作用，特别是当病毒在宿主细胞外时。然而，这些衣壳通常需要蛋白酶解剪切才能激活病毒、结合、感染和复制。对 HuNoV 的蛋白酶解剪切已经进行了检查，但发现胰蛋白酶几乎没有效果，可能是因为完整的病毒粒子具有抵抗力。然而，HuNoV 衣壳蛋白的较小构象是可以被胰蛋白酶剪切的 。因此，我们检查了一系列（1.76-10,000 BAEE 单位）的胰蛋白酶处理，并确定使用较高的 MOI = 100 并在整个感染过程中与 8.8 BAEE 单位的胰蛋白酶共孵育时，HuNoV 滴度略有增加（约 1.5 倍）（补充图 S5A）。这种效果与胰蛋白酶可剪切衣壳构象的丰度一致。胰蛋白酶的添加也以依赖 MOI 的方式增加了外泌体相关的 HuNoV 复制（约 1.5 倍），但在较低的 MOI = 1.0 下（补充图 S5B）。选择性地将胰蛋白酶剪切的衣壳构象装入外泌体可能不会发生，这解释了在 MOI = 100 时增强 HuNoV 复制的不一致性。为了阐明一些修饰 HuNoV 复制的抗病毒 Vero 细胞基因，我们评估了先前被识别为对流感病毒、脊髓灰质炎病毒 和轮状病毒复制重要的宿主基因的 siRNA 敲减（KD）。在 Vero 细胞中，特别是空螺旋同源盒 2（EMX2）、成纤维细胞生长因子 2（FGF2）、神经氨酸酶 2（NEU2）、吡咯啉-5-羧酸还原酶 1（PYCR1）、RAD51 相关蛋白 1（RAD51AP1）和 Sec61 易位子 γ 亚基（SEC61G）的几种基因的 KD 增强了 Vero 细胞中的 HuNoV 复制（图 5 和补充表 S2）。当检查了几个典型的固有抗病毒基因的 siRNA KD 后，特别是干扰素调节因子 3（IRF3）、IRF7、干扰素诱导的螺旋酶 C 结构域 1（IFIH1; MDA5）、DExD/H-盒螺旋酶 58（DDX58; RIG-I）、Toll 样受体 2（TLR2）、TLR3 和 TLR7，结果显示这些基因影响 HuNoV 复制（图 5 和补充表 S2）。 图 5. 抗病毒宿主基因表达的抑制增加了 GII.4 悉尼型 HuNoV 的复制。感染前48小时使用混合基因特异性siRNAs [50 nM] 处理，与非靶向对照（NTC）siRNA处理的细胞相比，72小时后通过qRT-PCR检测到 HuNoV 滴度显著增加。数据代表 n = 3 + SEM。* p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001，和 **** p < 0.0001。 基于早期对流感病毒 、脊髓灰质炎病毒 和轮状病毒复制的病毒-宿主基因研究，我们生成了几种 CRISPR-Cas9 基因编辑的 Vero 细胞 KO 系，并将研究重点放在缺乏富含亮氨酸重复序列和鸟苷酸激酶结构域的（LRGUK）基因的 Vero 细胞上，因为它能够作为增强 GII.3 HuNoV 复制的基质（补充图 S6）。LRGUK 基因被筛选并验证为抗病毒基因，调节轮状病毒复制 ，有趣的是，只有 LRGUK KO Vero 细胞系，而不是 LRGUK KD 改善了 HuNoV 复制（补充表 S1 和 S2）。这可能是由于使用 siRNAs 进行基因 KD 的杂合性质或单细胞衍生群体的偏见，从而增强了复制 GII3 HuNoVs 的能力。总的来说，这些结果证明了三种 HuNoV 菌株在 Vero 细胞中的复制。这些数据提供了 HuNoV 附着、内化、基因组复制和病毒蛋白生产的证据。此外，通过胰蛋白酶或 siRNA KD 或 CRISPR-Cas9 基因编辑抗病毒宿主基因，可以适度增强 Vero 细胞中的复制。这些研究为进一步调查 Vero 细胞作为 HuNoV 研究的细胞培养模型提供了支持。 4.讨论  我们重新检查了 Vero 细胞中 HuNoV 的复制，以阐明 Vero 细胞是否可以用于 HuNoV 疫苗开发。我们发现所有测试的 HuNoV 菌株对 Vero 细胞的病毒附着都很低，范围在 2% 到 4% 之间，这一发现与先前的报告一致。Vero 细胞表面的 CD300ld/CD300lf 表达是出乎意料的，因为之前只在免疫细胞 上观察到，最近也在簇细胞上观察到，这是一种不常见的胃肠上皮细胞类型。我们尝试使用抗体阻断和使用 CD300ld/CD300lf 外细胞域肽饱和潜在的 CD300ld/CD300lf 结合位点来抑制 HuNoV 进入 Vero 细胞，但两种尝试都未成功。我们展示了 Vero 细胞中 HuNoV 复制的节奏与 HIE 细胞 、BJAB 细胞、无菌猪 和无菌牛犊  类似。我们证明了在 72 小时时间过程中，三个 Vero 细胞系克隆中的 HuNoV 复制（≥1.5 倍）。使用相似的方法试图在 Caco-2 细胞、HEp-2 细胞、HepG2 细胞、INT 407 细胞、RAW 264.7 细胞和 RAW 264.7+ Caco-2 共培养细胞中检测 HuNoV 复制，但未成功（补充表 S1）。我们发现与 BjAB 细胞（高达 25 倍）或 HIE 细胞（高达 1000 倍）相比，Vero 细胞中的 HuNoV 复制减少，可能是因为 Vero 细胞中的 HuNoV 复制可能限于单一复制周期。有趣的是，HuNoV 与 Vero 细胞的长时间孵育阻碍了它们在传代后的复制能力，在与 Vero 细胞孵育 24 小时后没有观察到复制（补充图 S7）。这可能表明，在病毒解包后，没有启动新的感染周期，但这一点尚未得到实验证实。值得注意的是，其他 HuNoV 复制子模型也报告了单一 HuNoV 复制周期 。在较晚的时间点（4-9 天 pi）评估时，类似的尝试感染 Vero 细胞没有观察到 g.e. 增加，可能错过了 HuNoV 复制的高峰（图 2A）。 HBGA 表达的细菌，包括大肠杆菌、克劳氏菌、气肠杆菌、艰难梭菌等，被认为可以改善 HuNoV 感染；然而，在我们的研究中，粪便样本的过滤并没有显著增加 Vero 细胞中 HuNoV 的复制，这与在 HIE 细胞中 HuNoV 复制的发现相似 。这些数据暗示，与 BJAB 细胞不同，Vero 细胞似乎不需要外源性 HBGAs 来帮助 HuNoV 复制。尽管胰蛋白酶需要用于影响某些肠道病毒的蛋白酶解剪切事件 ，但已知 HuNoV 衣壳对胰蛋白酶介导的剪切有抵抗力，因为胰蛋白酶不会影响结合或内化。HuNoV 衣壳含有大约 15 个胰蛋白酶剪切位点；然而，当处于感染形式时，每个位点对酶都是不可接近的。值得注意的是，已描述了一种可被胰蛋白酶剪切的 GII.3 诺如病毒粒子。在碱性条件下，例如在胃肠道中，HuNoV 衣壳的较小构象会形成，并且在接触胰蛋白酶时可以被剪切 。剪切后，这些衣壳构象可能在病毒复制周期中发挥作用 。在用原生粪便感染后，胰蛋白酶对 HuNoV 滴度的影响可能对应于含有增加数量的免疫调节胰蛋白酶剪切衣壳构象的高 MOI。胰蛋白酶增强外泌体相关的 HuNoV 可能在低 MOI 下发生，因为病毒在外泌体内的聚集，但这仍有待探索。 已证明添加胆汁酸的细胞培养基有助于猪肠道卡利西病毒、小鼠 NoV  和 HuNoV。认为胆汁酸有助于病毒从内体逃逸到细胞质 。此外，已显示胆汁酸可以以基因型或菌株特异性方式结合小鼠 NoV 和 HuNoVs。已知胆汁酸并不结合所有 HuNoV 菌株。我们使用胆汁或胆汁酸增强 Vero 细胞中 GII.4 悉尼复制的尝试未成功（补充表 S1）。 影响 HuNoV 复制的抗病毒宿主基因尚不清楚，但已知病毒利用宿主基因进行复制，并且已知宿主基因对病毒复制是必需的。我们利用了先前关于病毒-宿主基因相互作用的发现。基于对几种 RNA 病毒的全基因组 siRNA 筛选，我们检查了在 Vero 细胞中 KD 增强病毒容许性和复制的前六个基因。我们创建了 CRISPR-Cas9 基因编辑的 Vero 细胞系，以评估基于 siRNA KD 发现的 HuNoV 复制。鉴定的抗病毒宿主基因具有多种功能。已显示 EMX2 在 Wnt/β-连环蛋白途径中起作用，并且可能在细胞周期调控和凋亡中发挥作用 。EMX2 还显示与翻译因子 eIF4E 结合 。这种相互作用可能影响 HuNoV VPg 招募 eIF4E，调节 HuNoV 复制。FGF2 已被证明可以稳定基础表达的 RIG-I ，暗示其下调与减少病毒感应机制有关。NEU2 作为唾液酸酶发挥作用，剪切 Lewis X 碳水化合物。已显示 HuNoV VLPs 可以结合 Lewis X ，可以想象，NEU2 基因表达的减少与附着因子可用性的增加有关。PYCR1 导致细胞周期停滞。已显示小鼠 NoV VPg 有类似的机制。目前尚不清楚 VPg 是否通过 PYCR1 下调指导细胞周期停滞。RAD51AP1 促进宿主 DNA 的同源重组，而 SEC61G 参与膜蛋白的易位和整合到内质网中。HuNoV 与这些基因之间的相互作用是推测性的；然而，IRF3 、IRF7、MDA5、RIG-I 、TLR3  和 TLR7先前已涉及 NoV 反应。值得注意的是，TLR2 在检测到轮状病毒后增强细胞因子的产生。当两个基因同时 KD 时，没有观察到任何基因的附加或协同效应。我们还尝试通过微小 RNA（miR）调控来证实 HuNoV 复制所需的宿主基因，特别是 miR-let7（DDX58; RIG-I）、miR-18a（RAD51AP1）、miR-26b（TLR3）、miR-105（TLR2）、miR-223（TLR3）和 miR-512（TLR7），但未能将 miRs 与增加的 HuNoV 复制联系起来（补充表 S1）。可能是 miRs 对不同目标的混杂性质可能掩盖了任何效应。总之，Vero 细胞的感染可以发生，这些数据为使用 Vero 细胞作为细胞培养模型提供了初步支持。尽管 Vero 细胞中 HuNoVs 的复制很低，但随着 HuNoV 受体的即将发现，感染率和病毒复制有望大幅增加。在 Vero 细胞系中异位表达 HuNoV 受体将大大增强该模型中的 HuNoV 复制，提供一个更适用于工业 HuNoV 疫苗生产的稳健系统。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。