Cetuximab Sarotalocan Sodium (Genetical Recombination)

摘要 抗体-药物偶联物(ADC)兼具单克隆抗体的精准靶向性和药物高效杀伤的优势，显示出巨大的临床治疗价值。ADC药物的有效载荷是决定ADC药物疗效的关键因素，受到了业界的高度重视。理想的ADC有效载荷应具有足够的毒性、低免疫原性、高稳定性、功能基团可修饰等特点。常见的ADC有效载荷包括微管蛋白抑制剂和DNA损伤剂，其中微管蛋白抑制剂占临床开发中的ADC药物的一半以上。但由于传统ADC有效载荷在临床上存在疗效不足、易产生获得性耐药等局限性，因此，靶点多样、副作用小、高效新型有效载荷正在被开发。本文综述了近年来传统和新型 ADC 有效载荷的研究进展，主要集中在构效关系研究、共晶结构和设计策略等方面，并进一步探讨了 ADC 有效载荷的未来研究方向，旨在为开发高效、低毒、稳定、不易产生耐药性的新型 ADC 有效载荷提供有价值的参考和未来发展方向。 1. 背景 尽管免疫疗法和细胞疗法最近取得了进展，但化疗仍然是癌症治疗中最常用的策略。然而，由于治疗指数低，传统化疗药物尽管对癌细胞表现出强大的细胞毒性，但往往对健康组织表现出毒性作用，这大大限制了它们的临床疗效。因此，开发高效、系统毒性有限的癌症治疗药物输送系统可能是解决该问题的有效策略。因此，一个新概念——抗体-药物偶联物 (ADC)已被构想和开发 (图1)。ADC通常由针对肿瘤特异性抗原或相关抗原的抗体和若干个有效载荷通过适当的连接子组成，ADC兼具单克隆抗体(mAb)的高靶向性和有效载荷在肿瘤组织中的高效性。由于ADC副作用较小、治疗应用范围较广、治疗指数较高，近年来已成为肿瘤学领域发展最快的药物之一。 图1. ADC的关键结构和作用机制。 (A) ADC的一般作用机制；(B) DNA抑制剂作为ADC有效载荷的作用机制；(C) 剪接抑制剂作为ADC有效载荷的作用机制；(D) 微管蛋白抑制剂作为ADC有效载荷的作用机制；(E) PROTAC分子作为ADC有效载荷的作用机制；(F) Bcl-xL抑制剂和蛋白酶体抑制剂作为ADC有效载荷的作用机制；(G) NAMPT抑制剂作为ADC有效载荷的作用机制；(H) NIR-PIT ADC的作用机制。 ADC药物的概念最早由德国诺贝尔奖获得者保罗·埃尔利希于1913年提出，但直到1975年，杂交瘤技术的发展开始用于生产单克隆抗体，才真正开启了ADC药物的开发时代。在日益成熟的技术推动下，ADC药物经历了三代创新(图 2)：第一代ADC药物主要以传统化疗药物如甲氨蝶呤、长春花碱、阿霉素等作为细胞毒性有效载荷，但由于对癌细胞的细胞毒性不足、肿瘤选择性不强、靶细胞蓄积率低，这些第一代ADC药物的疗效甚至比其母体有效载荷更差，导致临床失败。随后，新型高细胞毒性化合物引起了人们的浓厚兴趣，这些化合物的药效比第一代 ADC中使用的传统化疗药物高出 100-1000 倍。当它们作为单一药物用于杀死肿瘤时，它们往往具有难以忍受的副作用。例如，微管蛋白抑制剂美登素对肿瘤细胞表现出极强的抗增殖活性。然而，它的毒副作用，如神经毒性和胃肠道反应，也很严重。因此，它未被批准作为单一药物用于癌症治疗。有趣的是，这些高细胞毒性化合物是 ADC 的理想有效载荷。细胞骨架的主要成分由α-和β-微管蛋白组成，微管蛋白抑制剂可以通过破坏细胞骨架结构和干扰有丝分裂来杀死肿瘤细胞。因此，与正常细胞相比，分裂速度更快的肿瘤细胞对微管蛋白抑制剂更敏感。大多数第二代 ADC 使用明显更有效的微管蛋白抑制剂作为有效载荷。不幸的是，虽然微管蛋白抑制剂对活跃分裂的肿瘤细胞非常有效，但对静止的癌细胞效果要差得多。为了潜在地克服这一限制，大多数第三代 ADC 选择了可以靶向整个细胞周期的 DNA 损伤剂作为细胞毒性载荷，DNA 损伤剂可以通过双链断裂、烷基化、嵌合和交联来破坏 DNA 结构，从而杀死肿瘤细胞，代表性的 DNA 损伤载荷包括烯二炔、拓扑异构酶 I 抑制剂和吡咯并苯二氮卓类 (PBD)。目前，已有 15 种 ADC药物获批，大量 ADC 药物正在临床试验中(表1)，其有效载荷主要来源于天然物质，其中微管蛋白抑制剂占一半以上。 图 2. ADC 有效载荷开发过程中的里程碑。 尽管 ADC 已经历经三代，但当前的有效载荷仍然存在临床局限性，例如严重的副作用和耐药性的产生。开发更有效的 ADC 有效载荷(最好具有更好的治疗指数)的医疗需求仍然强烈未得到满足，因此，正在设计其他新型 ADC有效载荷，包括 RNA 抑制剂、Bcl-xL 抑制剂、NAMPT 抑制剂和卡马菲星(carmaphycins)。此外，使用免疫调节剂作为有效载荷的免疫 ADC 因其在肿瘤免疫治疗中的关键作用而引起了广泛关注。除了使用单个简单分子作为有效载荷外，还出现了几种使用更复杂有效载荷设计 ADC 的新策略，例如，PROTAC 或光敏剂已被用作 ADC 有效载荷，并且还开发了将多个有效载荷(每个有效载荷具有不同的靶标)整合到单个抗体中的方法，这些突破性的策略可以带来下一代 ADC。 本文从 ADC 有效载荷的重要性和主要特性出发，从晶体结构、ADC 有效载荷与靶标之间的结构-活性关系(structureeactivity relationships, SAR)等方面，综述了各种传统 ADC 有效载荷的发现和主要结构改造。此外，本文还将总结各种基于新药物靶标和创新设计策略的新型 ADC 有效载荷。最后，针对当前有效载荷的局限性，讨论了未来 ADC 有效载荷的主要研究方向，以期为未来设计具有理想特性的新型 ADC 有效载荷提供参考。 2. ADC有效载荷的重要性和特点 ADC药物进入血液循环后，与肿瘤细胞表面的靶抗原受体结合，新形成的ADC-抗原复合物内化后被溶酶体降解，释放出有效载荷，诱导肿瘤细胞死亡(图1)。因此，有效载荷是ADC设计的重要组成部分，有效载荷的活性和理化性质对ADC药物的抗肿瘤疗效有直接的影响，有效载荷的作用机制是决定ADC性能的重要因素(如不良反应)。此外，ADC有效载荷的其他一些特性，如细胞毒性、免疫原性、制备和流通过程中的储存稳定性、水溶性、可改性性等也很重要。 理想的有效载荷应具备以下特点： 第一，它们应该具有足够高的细胞毒性。肿瘤特异性抗原非常有限，尤其是在实体肿瘤中。此外，由于单克隆抗体的渗透性低、内化活性差，能够通过抗体抗原结合内吞到肿瘤细胞中的 ADC 有效载荷数量非常少； 第二，ADC药物要具有足够低的免疫原性。蛋白质药物存在诱导免疫原性的风险，这可能会对ADC疗效产生负面影响，甚至导致接受治疗的患者死亡。虽然目前ADC多采用人源或人源化单克隆抗体和小分子药物，但与治疗性单克隆抗体相比，仍有可能增加免疫原性的风险。为了解决这个问题，一些毒性很大的药物是从植物、动物或微生物中提取的，确保药物在人体内的免疫原性小到可以忽略不计，使用分子较小的药物也是降低免疫原性风险的一种方法； 第三，ADC药物要具有较高的稳定性。由于抗体在循环中的半衰期较长，ADC 应在血液循环中保持稳定，避免释放或分解。有效载荷还应在细胞质和溶酶体中保持稳定，在低 pH 条件下不会发生明显降解； 第四，ADC 有效载荷应具有可修改的功能基团，而不会显著影响其效力。有效载荷必须具有可修改的功能基团或可与单克隆抗体结合的位点，必须仔细选择修改的位点以保留母体药物的效力。更重要的是，当使用不可切割的连接子时，即使在抗体降解后，有效载荷也必须保持其效力； 第五，ADC 有效载荷应具有旁观者杀伤效应。一些 ADC 药物被内化并释放出小的、不带电的、可渗透的膜疏水性分子，这些分子通过细胞膜扩散并杀死邻近抗原表达阴性的肿瘤细胞。这一过程被称为“旁观者杀伤效应”，对抗原表达不均匀的肿瘤细胞具有重要意义。一般而言，促进癌细胞旁观者杀伤效应的有效载荷更适合于靶抗原表达较低或异质性的癌症。要构建具有旁观者效应的ADC药物，其结构必须满足连接子可被切割，以及有效载荷可穿透细胞膜的条件。膜穿透性好的疏水性分子具有很强的旁观者杀伤效应，但这也可能使得药物容易被健康组织吸收，导致严重的全身毒性。因此，两者之间的平衡对于ADC的研发非常重要； 第六，ADC有效载荷应具有适当的水溶性。有效载荷必须具有适当的水溶性以有利于与抗体偶联，并确保偶联物在生理条件下具有足够的溶解性。当过多的疏水性有效载荷与抗体结合时，产生的 ADC 往往会聚集并变得不稳定。此外，有效载荷的亲水性会影响母体 ADC 或其代谢物的细胞膜通透性，从而影响其旁观者杀伤活性。 第七，有效载荷的靶点应该是细胞内的，因为大多数 ADC 需要进入肿瘤细胞才能释放其有效载荷。许多来自微生物、植物和动物的有效载荷具有膜靶向性，例如那些主要通过阻断离子通道或破坏凝血起作用的神经元上的有效载荷，不适合用作 ADC 有效载荷的亲水性会影响亲本 ADC 或其代谢物的细胞膜通透性，从而影响其旁观者杀伤活性。 上述 7 种 ADC 有效载荷特性中，高效力、低免疫原性、药物制剂和血液循环中的稳定性、可修饰的功能基团是 ADC 有效载荷选择时必须考虑的重要因素，而适当的水溶性或旁观者杀伤效应等特性虽然一般不是那么重要，但对 ADC 的有效性也有着重要影响。基于这些特性，总结了现有 ADC有效载荷的有效性，包括靶向微管蛋白/DNA/RNA 的有效载荷、免疫 ADC 有效载荷、新型的潜在 ADC 有效载荷以及在各种新策略指导下用于 ADC 药物设计有效载荷。通过分析各种有效载荷与蛋白的结合方式及其相应的 SAR，希望阐明结构如何决定其生物活性和特性，并为未来产生更多新型ADC有效载荷提供有价值的参考。 3. ADC 的各种有效载荷 3.1. 微管靶向有效载荷 微管是真核细胞中细胞骨架的重要组成部分，是由平行于圆柱轴的α、β微管蛋白异二聚体组成的动态极性聚合物。微管在维持细胞形态、信号转导、细胞器运输、细胞运动、细胞分裂、有丝分裂等多种细胞功能中起着重要作用，是肿瘤治疗的重要靶点。微管蛋白是微管的组成成分，微管蛋白抑制剂通过与微管蛋白结合，干扰微管的动态结合，使细胞停滞在细胞周期的G2/M期，最终导致细胞凋亡。由于微管蛋白抑制剂能破坏有丝分裂纺锤体，起到抗有丝分裂的作用，因此对快速分裂的癌细胞的毒性比大多数生长缓慢的正常细胞更强，成为广受欢迎的 ADC 有效载荷。其中，微管蛋白聚合促进剂，如奥瑞他汀化合物 MMAE 和MMAF，作用于α、β蛋白的β亚基微管蛋白二聚体不能与微管蛋白聚合酶结合，导致微管生长不受调控。而微管蛋白聚合抑制剂，如美登素化合物DM1和DM4，则通过抑制成熟微管的形成，阻止微管蛋白二聚体的聚合，该类微管蛋白抑制剂是目前临床上许多ADC药物中最为常见的第二代有效载荷，并已被多个团队作为先导化合物进行结构改造，进一步改善该类ADC有效载荷的理化性质，使其更适合ADC药物的开发。 3.1.1. 美登素类化合物(Maytansinoids) 美登素(Maytansine) (1) (图 3A)最初从非洲灌木Maytenus ovatus的树皮中分离得到，是一类苯并安息香酸内酯类抗生素，能与微管蛋白结合，抑制微管的组装。在体外细胞活性测定中，其IC50落入皮摩尔(pM)范围，显示出其强大的抑制肿瘤细胞增殖能力，在其他实验中也表现出良好的稳定性和溶解性。但由于其治疗窗口较窄，且由于缺乏选择性而产生神经毒性和胃肠道反应等毒副作用，临床上已禁止直接用于人类治疗。然而，美登素的高细胞毒性完全符合 ADC 有效载荷的要求，使美登素成为 ADC 有效载荷的有力候选者。由于美登素没有反应性官能团，因此它不能与抗体结合。美登素类化合物的结构-活性研究已确定 C3 N-酰基-N-甲基-l-丙氨酰酯侧链、C4–C5 环氧部分、C9 甲醇官能团以及共轭 C11 和 C13 双键的位置是活性的关键要素，这使得苯环和N-酰基成为可化学修饰的实体。用3-甲基二硫丙基取代美登素中的N-乙酰基，可以得到含二硫键的美登素衍生物DM1 (2)(图3A)。DM4 (3)是在DM1二硫键周围加两个甲基得到的。衍生的 DM1 和 DM4带有甲硫基丙酰基，可以通过二硫键与连接子偶联。DM1 和 DM4 是临床实际应用中最常用的两种美登素类 ADC 有效载荷，例如Trastuzumab-SMCC-DM1 就是第一个获批上市的基于美登素衍生物的 ADC 药物。目前，20% 在开发的 ADC 使用美登素衍生物作为有效载荷。 图 3. 美登木素化合物的设计和 SAR 分析。 (A) 美登木素化合物1- 5的化学结构；(B) 美登木素 (1) 与微管蛋白复合的结合模式；(C) 化合物5与微管蛋白复合的结合模式。 2014年，Michel O. Steinmetz 团队研究了美登素及其与微管的作用，发现在β-微管蛋白上，美登素类与微管蛋白有三个关键的相互作用点(图 3B)，包括美登素 1 位羰基与β -微管蛋白残基Asn102 和 Lys105 之间的氢键；1 位羟基/羰基氧与β -微管蛋白 Val181 之间的氢键；以及配体 6a 位甲基与β -微管蛋白残基 Asn101、Asn102、Val182、Phe404 和 Tyr408 形成的口袋之间的疏水相互作用-微管蛋白，这些保守的微管蛋白相互作用点构成了共同的药效团。美登素是最常用的ADC有效载荷，但其合成、中间非对映体产物的分离纯化都很困难。同时，它是多药耐药蛋白1(MDR1)的底物，MDR1是一种转运蛋白，可以降低一些抗体-美登素样偶联物的效力。因此杨金良团队探索了L-DM1-SMe(C3位甲基-L构型DM1)、D-DM1-SMe(C3位甲基-D构型DM1)和β微管蛋白，发现L-DM1-SMe酯基中的羰基氧原子和C3侧链尾部的硫甲基分别与9位羟基和苯环形成较强的分子内相互作用，有助于结合亲和力的增强；而D-DM1-SMe的C3侧链则向相反方向摆动，无法形成分子内相互作用，解释了C3位甲基手性影响抗癌活性的详细机制。该研究为设计下一代具有新型骨架的美登素结合位点抑制剂，改善合成策略，降低MDR1介导的耐药性提供了基础。 美登醇(4)(图3A)最初是通过化学去除疣状Putterlickia verrucose提取物C3位置羟基上的酰基得到的。其对微管蛋白聚合的抑制活性弱于美坦辛，说明美坦辛和美坦素的C3位酯部分对生物活性和细胞通透性起重要作用。酯部分的羰基氧原子与9位的羟基形成强烈的分子内相互作用，固定了生物活性构象。美丹辛醇被认为是一种有价值的先导化合物，通过C3位羟基的酰化，可以很容易地制备出具有不同酯侧链的各种天然和半合成的美坦素类化合物。Daniele Passarella研究组通过对美登醇(4) 进行酰化反应，得到了一个新的美登素化合物5，该化合物具有较强的抑制微管组装能力，对A549 细胞的 IC50为 0.07-1.2 nmol/L，晶体结构 (图 3C) 表明美登素的结合对微管蛋白的整体构象没有影响，美登素化合物在 C1–O 和 Val181 的主链氮原子之间以及 C24-O 和 Lys105 和 Asn102 的侧链之间形成氢键。此外，美登素化合物5通过它们的C9-OH基团与Gly100的主链羰基形成氢键。在所研究的美登木素类化合物中，在 C3 位置引入的所有修饰都指向溶剂，不会干扰美登木素位点的封闭环境。因此，酰化增强了美登木素的全部生物活性，并且在 C3 位置引入的修饰不会干扰化合物与微管蛋白二聚体的结合状态、亲和力或有效性。Regeneron 的团队通过改变环上侧链的长度以及由一级胺和二级胺连接的连接子，研究了N -甲基丙氨酸中氮取代的影响，使用美登素化合物6作为有效载荷获得了 EGFRvIII 靶向 ADC，IC50对于 HEK293、U251 和 MMT 细胞系，浓度为 0.3-0.4 nmol/L，在 U251/EGFRvIII 和 MMT/EGFRvIII 小鼠模型中实现肿瘤消退。 3.1.2. 奥瑞他汀(Auristatin) 多拉司他汀10 (Dolastatin 10) (7) 于1987 年从Dolabella auricularia中分离得到，对多种癌细胞有较强的抗增殖活性，能强烈抑制微管组装，导致细胞周期停滞和细胞凋亡，是一种很有前途的抗癌药物(图 4-1A)。其水溶性合成类似物称为奥瑞他汀，其中应用最广泛的是单甲基奥瑞他汀E(MMAE)(8)和单甲基奥瑞他汀F(MMAF)(9)。它们各自含有一个功能性手柄，能够进行后续结合，进一步提高体内疗效。MMAE由4种氨基酸组成：单甲基缬氨酸(MeVal)、缬氨酸(Val)、多拉索林(Dil)和多拉普罗林(Dap)，以及羧基端胺基去甲麻黄碱。在MMAF中，单甲基缬氨酸的C端被苯丙氨酸取代，其细胞活性显著降低。Andrea E. Prota团队发现与 MMAE 相比，MMAF 对游离微管蛋白的结合亲和力增加了近 5 倍，这主要是由于β1 微管蛋白亚基上的关键 Arg278 残基通过有序水分子暴露于 MMAF。研究还表明，将长春花结构域延伸到肽位的详细结构相互作用不仅在功能上因抑制核苷酸交换而不同，而且还表明肽位抗有丝分裂剂如何比长春花生物碱具有更高的效力，该分析可能为 MMAF 的细胞活性降低的原因提供结构解释。 图 4-1.奥瑞他汀类似物的设计和 SAR 分析。 ( A)奥瑞他汀类似物  7-10、21-24 的化学结构；( B )化合物10与微管蛋白的复合物结合模式。 杨金良团队通过对长春花结构域中MMAE与微管蛋白结合域的结构研究，定义了一个必需的药效基团，该药效基团由两个疏水区I和II以及两个与Asp179β和Asn329α相互作用的氢键区域组成，为合理设计高特异性、强亲和力、高效的ADC有效载荷奠定了基础。2020年，Christopher J. O Donnell 团队设计合成了一个具有N端修饰的奥瑞他汀类似物10 (IC50 =0.2 nmol/L)，并首次通过更高分辨率的奥瑞他汀晶体结构实现了对其结合模式的详细研究，晶体结构显示化合物10的N端二甲基很好地贴合在受体口袋中，并不影响分子的整体结合亲和力(图 4-1B)。此外，还鉴定出关键的极性相互作用，包括末端质子化氨基与位于 T5 环上的Asp β 197 和 Phe α 351 氨基羰基之间的氢键网络、N-2 缬氨酸与 Asn α 329 之间的双焦点相互作用以及化合物10中 Tyr β 224 主链酰胺与 Dap 和 Doe 末端羰基之间的关键氢键相互作用。后者氢键网络使 Tyr β 224中的芳香环与 GDP 的核碱基发生π堆积相互作用，从而防止其从β-微管蛋白，GDP 的捕获被认为是奥瑞他汀发挥其干扰微管蛋白作用的关键机制。此外，所有分析的类似物在其功能相关的微管蛋白结合状态下在 Val-Dil 酰胺键处均具有顺式构型，而在溶液中该键仅处于反式构型。这揭示了奥瑞他汀的首选结合模式，并为基于结构的药物设计提供了有价值的工具。 图4-2. 奥瑞他汀类似物的化学结构11-20。 大多数奥瑞他汀类似物研究都集中在 C 端或 N 端修饰上： ·在 C 端修饰中，Doronina 等人描述了 MMAF 类似物11和12，其中苯丙氨酸的羧酸被四唑和膦酸酯取代。化合物11对H3396 细胞的IC50为 6.0 nmol/L，化合物12对 HCT116 细胞的IC50为 0.09 nmol/L。化合物11和12(游离酸类型)都已用于通过VC-linker与抗 CD70 的 H1F6 抗体结合形成活性ADC，其效力与 MMAF 作为有效载荷的效力相似(IC50=4-10 nmol/L)(图4-2B)。Pettit 等设计了C 端芳香族磷酸酯和喹啉修饰的奥瑞他汀类似物13-15 ，对 MCF-7 细胞的 IC50分别为0.81、0.19 和 6.35 nmol/L。其中，化合物13具有良好的水溶性(>236 mg/mL)，两个喹啉类似物14和15表现出良好的活性，化合物14 的活性明显高于其他类似物(图 4-2A)。Lerchen 等进一步说明了奥瑞他汀C 端结合域允许的修饰程度，通过在 C 端添加取代基，获得了对 768O 细胞有效的奥瑞他汀类似物16-18，IC50分别为 0.5、1.2 和 1.2 nmol/L(图 4-2B)。 ·对于 N 端修饰，Satomaa 等证明，丙醇和叠氮化物衍生物19和20尽管存在亲水侧链，但仍保持了相当大的细胞效力，19和20对 SKOV3 细胞的 IC50分别为 1.0 nmol/L 和 <1.0 nmol/L 。它们的叠氮化物和炔烃可用于后续的环化反应，形成更复杂的亲水“糖交联剂”，能够与各种抗体(赖氨酸、半胱氨酸、聚糖和转谷氨酰胺酶结合物)结合。在此基础上，制备了曲妥珠单抗和 EGFR1 ADC，其体内表现良好，效力为 1.5-10 mg/kg (DAR = 3)(图4-2A)；Doronina通过将对氨基苯甲酸取代N端氨基酸而获得奥瑞他汀类似物21 ，在 Karpas 299 细胞中显示 IC50为0.12 nmol/L，含有有效载荷21的 ADC在剂量为 1 mg/kg 时缩小了 Karpas 299 人 ALCL 异种移植模型中的肿瘤体积。然而，这种 ADC 不如相关的 VC-MMAE ADC 有效(图 4-1A)；2020 年，Svetlana O. Doronina 团队设计了一系列烷基-MMAF 类似物，以研究开发具有可调膜通透性、活性和对外排泵抗性的奥瑞他汀的可能性。MMAF 在 N 端耐受大量取代基的能力提供了一种方便的方法来调节游离药物的疏水性，而不会显着影响细胞活性，他们选择了 C1 至 C12的支链和非支链脂肪族基团作为取代基，并生成了 MMAF N-烷基衍生物22，该系列衍生物的细胞毒性随烷基链长的增加而增大，取代基的空间体积和疏水性的增加均不导致活性的下降。 新型类似物结合了MMAE和MMAF的特点：高效、旁观者活性、克服MDR，这些发现进一步拓展了奥瑞他汀作为ADC载荷的作用。Agensys最近将叠氮基引入P2和P4亚基，得到化合物23 ，在MOLM13细胞中的IC50为0.057 nmol/L，由于P2或P4位点作为ADC药物的结合位点，这为下一代奥瑞他汀衍生物提供了新的方向。Luke R. Odell教授团队开发出一种奥瑞他汀衍生物阿扎他汀(azastatin) (24)，其细胞毒性(IC50=0.13-3.0 nmol/L)高于 MMAE(IC50=0.47–6.5 nmol/L)，这表明 N-二甲胺基团增加了化合物的效力。此外，该衍生物含有中心胺侧链抗体结合位点，适合用于 ADC 开发。 3.1.3. 艾日布林(Eribulin) 聚醚大环内酯类天然产物 Halichondrin B (25) 最初从 Halichondraria Okadai 等分离得到，已被证明具有良好的抗增殖活性 (图 5A)。其结构简化的新型非紫杉烷全合成类似物甲磺酸艾日布林 (26) 是一种具有抗有丝分裂作用的微管动力学抑制剂，已于 2010 年获批用于治疗局部晚期和转移性乳腺癌 (MBC)患者。Michel O. Steinmetz 团队通过晶体结构发现艾日布林与微管蛋白的结合位点是由 β-微管蛋白的螺旋 H1、H6、H7、环 H6–H7、S3–H3 (T3) 和 S5–H5 (T5) 的疏水和极性残基形成的(图 5B)。此外，艾日布林的“笼状”结构与鸟苷酸的核糖部分接触。在微管蛋白-艾日布林复合物中，配体缠绕在Tyr224的侧链上。当艾日布林与微管中两个纵向排列的微管蛋白二聚体结合时，相邻微管蛋白二聚体的α-微管蛋白的S9链、H10螺旋和T7环将与艾日布林分子主体发生碰撞。这些结果表明，艾日布林在高浓度下可将微管蛋白二聚体隔离到组装不完全的微管蛋白-艾日布林复合物中，在低浓度下干扰微管末端原丝的延伸，从而破坏微管稳定性或抑制微管动力学。 图 5. 艾日布林类似物的设计和 SAR 分析。 (A) 艾日布林类似物25-27的化学结构；(B) 艾日布林26与微管蛋白复合的结合模式。 艾日布林在肿瘤生物学中具有很强的抗有丝分裂活性，因此有望作为ADC载荷。Earl F. Albone团队通过在C-35伯胺基团上添加连接子，设计了一种以艾日布林为载荷的ADC，对卵巢癌细胞IGBOV1有很强的作用(IC50为20 pmol/L)。在非小细胞肺癌细胞NCI-H2110异种移植模型中，5 mg/kg ADC剂量可诱导肿瘤完全消除，提示微管靶向药物艾日布林可作为ADC载荷。此外，早在2011年，Sridhar Narayan实验室合成并评价了几种具有中性C32侧链的第二代艾日布林类似物，这些侧链修饰的艾日布林类似物对U-251和SF-295细胞的抑制作用明显强于艾日布林。通过在C32侧链引入低碱性胺或增加艾日布林的亲脂性，得到的化合物27在体内外对多种异种移植肿瘤有抑制作用，具有口服生物利用价值，可增加在脑脊液中的暴露量，可能为治疗脑肿瘤等更多种人类癌症提供候选药物(图 5B)。 3.1.4. 微管溶素(Tubulysins) Tubulysins (28) 是 Hofle 等从粘菌培养基中分离出的一种天然抗有丝分裂肽(图 6)，它是一种由N-甲基-D-哌可酸(Mep)、利索莱恩(L-Ile)、微管蛋白(Tuv)和微管丙氨酸(Tup)组成的线性四肽，又称微管溶素Tut(Tut)，能抑制微管蛋白的聚合，诱导细胞凋亡，对癌细胞包括耐多药KB-V1细胞有较强的抗增殖活性(IC50 = 0.08 nmol/L)，在抗癌药物研发中具有良好的前景。2018年，KC Nicolaou团队合成了高效微管溶素类似物29和30，IC50对于HEK293T 细胞，浓度分别为 6 和 3 pmol/L。2021 年，该团队使用 T2R-TTL 对化合物30进行了晶体学研究，发现化合物30与 Vinca 结构域结合，在核苷酸结合位点附近的β和α微管蛋白分子界面口袋内形成细长的构象，其中分子的苯基氨基甲酸酯部分位于α2-微管蛋白亚基氨基酸残基 L248 的疏水袋上(图 6B)。根据该组合模式，设计了一种血浆稳定性好、对NCI-N87小鼠肿瘤模型疗效显著的ADC，在肿瘤靶向治疗研究中具有潜力。 图 6. 微管溶菌素类似物的设计和 SAR 分析。 (A) 微管溶菌素类似物28-34的化学结构；(B) 化合物30与微管蛋白的复合物的结合模式。 对微管溶素的 SAR 研究证明了微管溶素中关键残基修饰的可行性： ·在 N 端，Mep 残基的 6 元环可以有效地被 5 元无环残基N-甲基-D-脯氨酸、N -甲基肌氨酸和N, N-二甲基-D-丙氨酸取代，在大多数情况下活性损失最小； ·Tuv 部分的C11-乙酰基修饰会对活性产生显著影响：乙酰基水解成二级醇将导致活性损失高达 1000 倍，但它可以容忍各种各样的变化，尤其是对N、O-缩醛发生改变； ·相反，Tup 残基是常见的可修饰给药结合位点； ·C13 上的取代基不耐受变化，将异丙基替换为环己基或芳基(苯基和对甲氧基苯基)将导致活性丧失； ·羧酸端是常见的结合位点，因此经常被修饰。 为了克服微管溶素 C-11 乙酸酯水解引起的不稳定性，Patrick J. Burke63设计了一种 C-11 烷氧基类似物31，它表现出与微管溶素 M 相似的生物活性，且显著提高了血浆稳定性(图 6A)。Chakrapani Subramanyam鉴定出一种有效的微管溶素类似物32，该类似物含有α-甲基叔胺，所得ADC在体内和体外均表现出良好的药效。程恒制备了一种含氨基甲酸酯的微管溶素类似物33，其氨基甲酸酯基团在体内稳定，对OVCAR3和N87细胞的IC50分别为0.20和0.23 nmol/L，化合物33与抗meso抗体偶联形成的ADC，0.01 μmol/L可诱导肿瘤生长明显延缓。微管溶素衍生物34含有不可水解的 N 取代基的 tubuvaline (Tuv)，在 HT-29 细胞中的 IC50 < 0.28 nmol/L，也具有作为 ADC 有效载荷的潜力。 3.1.5. 隐藻素(Cryptophycin) Cryptophycin 是由蓝藻产生的天然大环多肽，具有 16 元环，它含有两个羟基酸(A 和 D 单元)和两个氨基酸(B 和 C 单元)。Cryptophycin 不可逆地抑制有丝分裂期间的β-微管蛋白聚合，这可导致细胞周期阻滞在 G2/M 期并激活凋亡途径，从而在体外产生皮摩尔(pM)抗增殖能力。第一个合成并评估的 cryptophycin 类似物 cryptophycin-1 (35) 对 KB 细胞的 IC50为 4.58 pmol/L，对 LoVo 细胞的 IC50 为 7.63 pmol/L (图 7)，但由于大环内酯类化合物在血液循环中不稳定，其体内抗肿瘤活性并不显著。经过进一步的结构修饰，得到了C单元β-丙氨酸的α位上比cryptophycin-1多一个甲基的cryptophycin-52 (36)，增加了空间位阻，明显提高了体内稳定性。极低浓度的cryptophycin-52 (36)在有丝分裂过程中抑制细胞增殖(IC50=11 pmol/L)，而微管长度和质量没有明显变化。cryptophycin-52 (36)与微管蛋白的结合非常紧密，cryptophycin-52 (36)-微管蛋白复合物对微管的结合率非常高 (Kd=47 nmol/L)。虽然 cryptophycin-52 有效，但由于剂量依赖性毒性，它在 II 期临床试验中被终止，使用该化合物作为 ADC 的有效载荷可能会降低其毒性。最近，Paul T. Wingfield 团队在微管蛋白二聚体界面上确定了 cryptophycin-52 (36)及其母体化合物 cryptophycin-1 (35)的结合位点，该位点与美登素部分重叠 (图 7B)，α-微管蛋白和β-微管蛋白的构象均发生了变化，尤其是在螺旋H8和H10中。α、β单体之间以及cryptophycin-52(36)结合和cryptophycin-1结合微管蛋白之间存在显著差异。然后，分析了cryptophycin上合适的位点：在单元A中，对位取代的苯基比邻位取代或间位取代的类似物更有效，对位取代的苯基可作为偶联位点；单元B对细微的修饰比较敏感，比如苯环上的5-氟取代；单元C中，C6位的苄基或异丙基等大取代基会大大降低其活性；而单元D修饰后活性变化不大，单元D中的异丁基可作为偶联位点，单元D的异丁基共轭位点可能优于单元A。该分析为后续以cryptophycin为载荷的ADC设计寻找合适的共轭位点提供了参考。 图 7. 隐藻素类似物的设计和 SAR 分析。 (A)隐藻素类似物35-40的化学结构；(B)隐藻素-52 ( 36 ) 与微管蛋白复合的结合模式。 cryptophycin-52 (36)的类似物37 (IC50 = 33 pmol/L) 是一种非常有前途的临床候选药物，已由 Eli Lilly 公司获得专利(图 7A)。 隐藻素-52 中单元 A 的芳香环可以在不显著影响其生物活性的情况下进行原位修饰，这些修饰被 Sanofi-Aventis 用作抗体偶联的偶联位点。隐藻素-52-氯醇化合物，如隐藻素-55 (38)，在体内的生物活性提高了 100-1000 倍。隐藻素-55 甘氨酸 (39)在体外表现出最高的细胞活性，隐藻素-55 甘氨酸通过可切割的连接子与靶向 HER2 受体的曲妥珠单抗偶联，所得 ADC 对 SK-BR3 细胞表现出纳摩尔活性。 基因泰克将隐藻素-52 中的苯转化为苄胺，获得化合物40，适合通过氨基甲酸酯键连接。杨金良团队将 cryptophycin-52 的前体药物 CR55(在生理条件下可转化为 cryptophycin-52)与曲妥珠单抗偶联，在 HER2 阳性肿瘤细胞株中其 IC50为低纳摩尔水平(0.58-1.19 nmol/L)，10 mg/kg 相应的 ADC 在卵巢癌(SKOV3)和胃癌(NCIeN87)异种移植模型中表现出明显的抗肿瘤活性，为基于 cryptophycin-55 和 cryptophycin-52 的 ADC 抗肿瘤药物的开发提供了思路。 3.1.6. EG5抑制剂 驱动蛋白(Kinesin) (KSP/EG5/KIF11) 是一种 ATP依赖性蛋白，参与细胞周期 G2/M 期着丝粒的分离和双极纺锤体的产生，在有丝分裂中起重要作用。EG5 在血液肿瘤(例如AML 母细胞和弥漫性大 B 细胞淋巴瘤 (DLBCL))和实体肿瘤(例如乳腺癌、膀胱癌和胰腺癌)中的高表达与其预后不良有关，使其成为一个有吸引力的癌症治疗靶点。几种 EG5抑制剂，如 SB-715992 (Ispinesib) (41) 和 Filanesib (ARRY-520) (42)，已在临床试验中(图 8A)。然而，EG5 抑制剂最常见的副作用，如中性粒细胞减少症、粘膜炎和口腔炎，以及其狭窄的治疗窗口，限制了它们的治疗效果。然而，通过利用 ADC，可以保护健康组织免受细胞毒性化合物的侵害，从而可能降低其总体毒性副作用并扩大化合物的治疗窗口。Dimitrios A. Skoufias 的团队将Eg5 Arry-520 复合物的结构与 Eg5 ispinesib 复合物的结构进行了比较 (图 8B)，两种复合物的叠加表明ispinesib的喹唑啉酮与Arry-520的二氟苯环占据相似的位置，并具有相似的相互作用。在ispinesib中，两个芳香族取代基对甲苯和苄基相互堆叠，与Glu118，Arg119以及Arg119，Trp127和Asp130侧链进一步堆叠来稳定骨架。然而，在Eg5 Arry-520复合物中，这种骨架堆叠要弱得多。此外，对于Arry-520，二氟苯基和异丁基侧链残基之间存在直接的疏水堆叠相互作用，而在ispinesib复合物中，侧链移动2 Å以容纳苄基和对甲苯和苄基-甲苯，从而完全削弱或失去这种相互作用。Arry-520与ispinesib通过Gly117的伯胺与主链氧和Glu116的侧链之间形成氢键相互作用，Arry-520中甲氧基的氧可能与Tyr211(3.63 Å)的羟基发生微弱的相互作用。另外，苯环上的一个氟与Gly217的主链NH(3.03 Å)相互作用，与Arg221(3.69 Å)的侧链发生微弱的相互作用。总的来说，Arry-520的紧密结合是通过一系列与抑制剂结合袋中氨基酸侧链的强或弱的氢键相互作用和疏水相互作用实现的。此外，Eg5变构结合位点的D130A和L214A突变均可使Array-520产生耐药性，而ispinesib对L214A突变体仍然敏感。 图 8. EG5 抑制剂的设计和 SAR 分析。 (A) EG5抑制剂41–45的化学结构；(B) ispinesib (41) 与 EG5复合的结合模式。 诺华公司开发了 EG5 抑制剂43、44，作为有效载荷与抗体结合，使用不可切割的连接子靶向 HER2 (图 8A)。在 HER2 表达的小鼠异种移植模型 (SK-OV-3ip) 中，单剂量静脉 ADC (5 mg/kg) 可使肿瘤生长停止 3 周，效果优于 Kadcyla (5 mg/kg)。使用非细胞渗透性 EG5 吡啶抑制剂作为有效载荷，Anette Sommer开发了一种新型 IL3RA 靶向 ADC，该 ADC 显示出有效和选择性的抗增殖作用。Carsten Terjung研究了一种新的EG5 吡咯亚类抑制剂45作为 ADC 新型有效载荷的适用性，在尿路上皮细胞癌 (UCC) 异种移植模型中，这种 ADC 显示出高效，可完全根除肿瘤。 微管破坏可诱导细胞周期停滞在 G2/M 期，这使得微管成为药物发现的一个有吸引力的靶点。在许多情况下，治疗窗口狭窄和缺乏肿瘤特异性可能导致强效微管蛋白抑制剂单独作为抗癌剂失败。然而，使用 ADC 作为靶向疗法可能是解决微管蛋白抑制剂单一疗法局限性的一种有前途的方法。目前处于临床开发阶段的 ADC 中有一半以上以微管蛋白抑制剂(auristatins和 maytansinoids)作为有效载荷。虽然微管蛋白抑制剂作为 ADC 有效载荷取得了一些商业成功，但它们受到开发过程中各种缺点的限制，例如，它只能靶向处于分裂期的肿瘤细胞，而不能靶向处于非分裂期和静止期的细胞。此外，肿瘤细胞中的微管蛋白抑制剂靶点较多，这意味着需要更大剂量的药物才能阻止微管蛋白的激活，因此这些以微管蛋白抑制剂为有效载荷的ADC药物还远未达到理想的靶向治疗理念。 3.2. DNA 靶向有效载荷 相比于微管蛋白抑制剂，DNA抑制剂能够通过双链断裂、烷基化、嵌合、交联等方式破坏DNA，作用于整个细胞周期，产生细胞毒作用，对实体肿瘤有良好的治疗效果。此外，DNA抑制剂的靶点远少于微管蛋白抑制剂，当ADC携带相同数量的载荷进入细胞时，DNA抑制剂能够表现出更好的杀伤效果。此外，以DNA抑制剂为载荷的ADC可以靶向抗原表达较低的肿瘤细胞，这也是为什么在许多下一代ADC中都选择DNA抑制剂作为载荷的原因。 3.2.1. 烯二炔(Enediyne) 从细菌来源分离的烯二炔是迄今为止发现的最具细胞毒性的天然产物之一，其摄取会通过破坏活细胞中的单链或双链DNA而导致细胞死亡，同时它还对各种细菌和肿瘤细胞具有极强的活性。烯二炔可分为两个亚家族：钙样烯二炔和蒽醌融合烯二炔。剧毒的烯二炔化合物并不适合直接用作抗癌剂，但这些抗肿瘤抗生素的效力和作用机制使它们成为有吸引力的ADC有效载荷。天然烯二炔产物最常用的ADC有效载荷是来自 Cal烯二炔类的钙血霉素(Calicheamicin)γI1(46)和蒽醌稠合烯二炔 Uncialamycin (47) (图 9A)。 图 9. 烯二炔的设计和 SAR 分析。 (A) 烯二炔46-52的化学结构；(B) 卡奇霉素γI1(46) 与 DNA 复合物的结合模式。 Calicheamicin靶向与 DNA 结合的小沟，特异性诱导 DNA 双链断裂，导致细胞凋亡。尽管最初的实验显示出很强的活性，但Calicheamicin对正常细胞 DNA 的破坏阻碍了其临床进展。尽管如此，高细胞毒性、小分子大小和明确的作用机制使Calicheamicin成为有吸引力的 ADC 有效载荷，Calicheamicin γI1(46) 是目前研究最多的Calicheamicin。Dinshaw J. Patel 和他的团队研究了Calicheamicin γI1的高分辨率结构-DNA 双链复合物，并发现Calicheamicin的芳基四糖在以寡嘧啶寡嘌呤束为中心的小沟深处的定向排列，反过来又使附着的烯二炔环定向跨越双链的两条链，在复合物的强度精细结构中(图 9B)。相对于螺旋轴倾斜的烯二炔环在小沟深处取向，允许DNA糖磷酸骨架质子被暴露的三硫键触发物和环芳构化激活后被提取，最终导致DNA链断裂。药物与DNA小沟之间的界面具有紧密的互补性，该界面跨越复合物精细结构中的整个结合位点。该研究提供了一个数据库来解决与Calicheamicin类DNA的鉴定和切割相关的两个问题。Calicheamicin γI1(46)具有强大的细胞作用，以Mylotarg为代表的ADC的出现很大程度上依赖于Calicheamicin γI1(46)的发现，其N-乙酰基衍生物成为Mylotarg的有效载荷。Nicolaou等合成了Calicheamicin γI1的类似物Calicheamicin θI1 (48)，其对多种肿瘤细胞的IC50值<1 pmol/L，也适合作为ADC有效载荷。此外， FDA批准的Inotuzumab Ozogamicin(Besponsa)也是以Calicheamicin作为有效载荷。 Uncialamycin 是从地衣中分离出来的天然烯二炔产物，能引起 DNA 切割，表现出很强的细胞活性。Uncialamycin 强效类似物的共同结构特征之一是 A 环上存在一级或二级苯胺基团，如果将胺转化为相应的苯甲酰胺，并引入末端芳胺，则可以解决不稳定性问题，同时保持活性。Sanjeev Gangwar采用苯酚烷基化法，设计了一种高效且化学稳定的 Uncialamycin 类似物49 (图 9A)。所得 ADC 通过将有效载荷与抗间皮素 (meso) 抗体结合，在 H226 细胞中的IC50为 0.2 nmol/L，在耐受剂量下表现出特异性和持久的肿瘤生长抑制作用。Julia Gavrilyuk 等选择甲胺类似物50作为 uncialamycin ADC 有效载荷，靶向 TL 和 CD46 的 ADC 在 HEK293T 细胞中表现出低皮摩尔效力。Emmanuel N. Pitsinos修饰uncialamycin，从分子的芳香部分去除一个碳，得到化合物51(待测细胞系：IC50 (H226 细胞) = 28 pmol/L； IC50 (N87 细胞) = 11 pmol/L； IC50 (OVCAR3 细胞) = 316 pmol/L； IC50 (Adr 细胞) = 20 pmol/L)。Sanjeev Gangwar将uncialamycin 类似物52与抗间皮素 (meso)抗体结合，所得 ADC 在 H226 肺癌细胞中的 IC50值为 0.98 nmol/L，IC50值为 0.88 nmol/L。 3.2.2. 拓扑异构酶 I 抑制剂(Topoisomerase I inhibitors) 拓扑异构酶 I (TOPO-I) 是一种重要的核酶，对基因组稳定性和 DNA 结构保存至关重要，已成为 ADC 的热门靶点。TOPO-I 抑制剂与先天性和适应性免疫反应有关，这表明针对 TOPO-I 的 ADC 也可能有助于抗肿瘤免疫治疗。Lance Stewart 等报道了 TOPO-I 与双链 DNA 共价连接并与临床批准的抗癌药物拓扑替康(topotecan) (53)联合使用的 X 射线晶体结构(图 10A)，拓扑替康 (53)和人类 TOPO I-DNA 共价复合物表明，拓扑替康是一种非竞争性抑制剂，通过在酶诱导的缺口处在两条 DNA 链之间插入碱基来与酶-底物复合物结合。拓扑替康的结合模式是与 DNA 的堆积相互作用、与 Asp-533 接触的氢键以及与磷酸酪氨酸和 Asn-722 之间的活性位点的水桥接触。天然五环产物喜树碱 (camptothecin, CPT) (54) (图 10B)是拓扑替康 (53)的类似物，是一类特别有吸引力的 ADC 有效载荷，它通过与 TOPO-I 和 DNA 结合形成稳定的复合物，诱导 S 期细胞中的双链 DNA 断裂，从而导致细胞凋亡。然而，喜树碱的溶解度极低，阻碍了其作为癌症治疗药物的广泛使用。SN-38 (56) 是伊立替康(irinotecan) CPT-11 (55)的有效成分，是一种半合成喜树碱，尽管 SN-38 具有所需的效力，但由于其高度疏水性和可用的结合位点数量有限，活性结合物的制备具有挑战性。尽管如此，SN-38 已与针对滋养层细胞表面抗原 2 (Trop-2) 的人源化抗体结合，从而产生 ADC sacituzumab govitecan，该药物正在临床研究中。甲磺酸依沙替康 (DX-8951f) (57) 是一种水溶性 CPT 衍生物，与其他 CPT 类似物相比，具有更强的 TOPO-I 抑制和抗肿瘤活性。DXd (DX-8951 衍生物) (58) 是一种新型、高度膜通透性的拓扑异构酶 I 抑制剂，细胞 IC50为2.05-17.88 nmol/L，可克服P-糖蛋白介导的多药耐药性，对各种肿瘤移植模型有更强的疗效，包括体内CPT-11耐药肿瘤。 图 10. 拓扑异构酶 I 抑制剂的设计和 SAR 分析。 (A) 拓扑替康 (53) 与 TOPO I-DNA复合物的结合模式； (B) 拓扑异构酶 I 抑制剂53-60的化学结构。 DXd (58) 有一个包含第二个手性中心的 F 环，使其合成和衍生化变得复杂。为了简化其结构，Wayne C. Widdison 的SAR 研究表明，C11 位氟取代通常会使细胞毒性增加数倍，而 C20 中心必须处于S构型才能使分子保持活性，依沙替康内酯稳定性的提高归因于 C11 氟取代基和 F 环的作用。衍生自喜树碱衍生物58和59 的ADC能有效释放部分含硫化物或硫醇的喜树碱代谢物，这些代谢物对靶向的抗原阳性细胞有较强的抑制作用，在HSC-2和H1703 EGFR+异种移植模型中均表现出相似的剂量依赖性抗肿瘤活性。有效载荷59中没有F环，但其结合物在体外和体内的药效与含DXd的结合物相似，这种简化使喜树碱A环和B环的衍生化更易于用于构效关系研究和有效载荷优化。余东科通过将DXd与曲妥珠单抗偶联，获得了一种新型的HER2靶向ADC DS-8201a。SAR显示C-10的羟基取代可以增强CPT的抗肿瘤活性，而C-7和C-10的脱取代可以稳定内酯环并提高分子生物学活性。DXd在C-7和C-9位点环化，从而增加了抑制活性。DS-8201a避免了耐药性，并且通过旁观者杀伤效应在治疗异质性肿瘤方面非常有效。Scott C. Jeffrey开发了一种新型亲水性和蛋白酶溶解性谷氨酸三肽配体，使用具有高细胞毒性的7-氨基甲基-10, 11-亚甲基二氧CPT类似物60作为有效载荷，缀合的ADC在CD30高表达菌株和MDR阳性的786-O肾细胞癌裸鼠中均表现出有效的抗肿瘤活性。 3.2.3. PBD 链霉菌中发现的吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮卓类 (PBD) (61)是一类具有抗肿瘤活性的天然产物(图 11)，该类化合物由一个芳香族A环、一个1-4-二氮杂-5-1B环和一个吡咯烷C环组成，其作用方式是在DNA小沟内选择性烷基化，鸟嘌呤的N2与PBD的亲电性N10/C11亚胺形成共价键，DNA链间交联造成持续的DNA损伤，导致细胞周期停滞在G2/M期，引起细胞凋亡，从而表现出强大的细胞毒作用。Klaus Weisz团队的NMR结构数据证实了PBD杂合子与DNA双链小沟的强结合，PBD部分与外环鸟嘌呤氨基之间形成共价键。 图 11. PBD 类似物的设计和 SAR 分析61-72。 PBD二聚体具有作为ADC载荷的潜力，例如以PBD为载荷设计的靶向ROR1的ADC CS5001，在多种表达ROR1的肿瘤细胞系中表现出很强的选择性，并在血液和实体瘤异种移植小鼠模型中表现出显著的体内抗肿瘤活性，目前正在进行临床试验。为了进一步扩展更多PBD类化合物作为ADC载荷，Rahman等对PBD的C8位置进行了修饰，得到化合物62，其偶联物具有临床前活性。基于化合物62，Khondaker Miraz. Rahman合成了PBD核心，并利用苯并呋喃和N-甲基吡咯的组合构建了C8杂化物63(图 11)。随后，通过系统地缩短含有吡咯苯并呋喃结构域的C8连接单体，获得了一系列化合物(例如，化合物64的C8连接单体通过去除酰胺而缩短)。研究发现，PBD在C8位置的相对较短的侧链足以赋予细胞毒性，因此缩短的PBD单体可以用作新的ADC有效载荷。二氢苯并呋喃化合物64在原发性CLL细胞中毒性较大，而打开呋喃环在原发性CLL细胞和JN-3细胞系中也保持较低的纳摩尔活性。苯并呋喃中苯元素的变化对细胞毒性影响更显著，去除环的芳香性后细胞毒性明显降低。Jagath R. Junutula鉴定出一种异喹啉苯并二氮卓类 (IQB) 有效载荷65，其 (S, S) 立体化学在 C6a 位对于最佳 IQB 活性至关重要，这是一类新的 PBD二聚体 DNA 损伤有效载荷，在 HEPG2 A704 细胞系中表现出高活性，细胞毒性吡咯并苯二氮卓 (PBD)-二聚体分子经常用作 ADC 的有效载荷。为了进一步探索这种 ADC 有效载荷类别，Peter S. Dragovich通过系统地将酸性和碱性部分引入其化学结构中来修改其物理化学性质，结果表明，含有酸性官能团(包括高度可电离的部分，例如化合物66中存在的磺酸)的PBD-二聚体有效载荷) 能够在抗体介导的递送后有效地从细胞溶酶体转运到细胞质和/或细胞核。修饰的 PBD 二聚体化合物66与 CD22 抗体偶联，得到针对 BJAB 细胞的 IC50为 12 nmol/L 的 ADC，显著提高了未偶联 PBD 二聚体的抗增殖活性。PBD 二聚体有效载荷66将有助于设计出具有更高治疗潜力的新型ADC。Peter S. Dragovich探索了含二硫键前药的PBD二聚体作为抗体-药物偶联物的有效载荷，发现许多含二硫键前药的PBD单体对细胞内GSH水平相对较高的细胞(如KPL-4细胞)表现出较强的抗增殖活性。多种二硫键前体在生理浓度的Cys下稳定，但在肿瘤细胞中存在GSH的情况下不稳定。增加化合物67和68的端隙体积可显著提高其稳定性，例如，得到的化合物69和70含有两个甲基的 PBD 二聚体对 GSH 和 Cys 都具有高度稳定性，噻吩衍生的二硫化物在体内的稳定性得到了改善。在这些常见的 PBD 有效载荷中，PBD 二聚体上的结合位点分为两类：C2 和 N10。C2 结合的一个例子是有效载荷71，它包含一个连接到 PBD C2 位的苯环。靶向 CD19 的 ADCT-402 的有效载荷 SG3199 (72) 通过其 N10 位点进行结合，由于 PBD B 环上的 N10 位点参与与 DNA 的共价结合，因此连接子与 N10 位点的结合比与 C2 位点的结合更安全。在PBD载荷的后续工作中，其共轭位点也可作为影响修饰方向的一个因素。 3.2.4. 多卡米星(Duocarmycin) Duocarmycin A (73) 是从链霉菌中分离出来的一种强效 DNA 烷基化剂，由 DNA 烷基化部分和结合部分组成 (图 12A)。第一个发现的天然多卡米星成员 CC-1065 (74) 通过其高活性的丙烷环与 DNA 微沟结合，并在 N3 位烷基化腺嘌呤，最终导致细胞死亡。尽管 CC-1065 (74)在体外具有很强的效力，但在动物模型中仅显示出中等体内活性和不可逆的肝毒性。为了改善这些化合物的生物学特性，将它们用于 ADC 可能是一个可行的选择。Walter J. Chazin 等描述了 duocarmycin SA 的非天然对映体和 DNA 加合物的结构，发现 duocarmycin SA 的两种对映体可以在 AATTA 双链上共享相同的结合位点和相同的结合方向，但烷基化不同的位点(图 12B)。两种对映体对互补链的烷基化发生在相同的结合方向，但非天然对映体偏移一个碱基对。这种差异对两种加合物的结构具有重要意义，因此会影响它们的相对烷基化效率。对这种与相同 AATTA 双链结合的新结构的分析解释了天然和天然 DNA 位点选择性的相似性和差异性非天然对映体。在duocarmycin/CC-1065 家族的 DNA 加合物的所有结构中都观察到了亚基间扭曲，由于 DNA 具有左手螺旋扭曲，因此 DSA 的三甲氧基吲哚亚基在小沟中结合时相对于烷基化亚基自然倾向于以逆时针方式扭曲。因此，DNA 分子本身的手性对 (+) 对映体药剂施加了重要的限制，而 (-) 对映体药剂则不存在这种限制。两种 DSA 对映体的庞大 C24 甲氧基位于小沟底部的大致相同位置，位于 A16 和 T17 碱基之间的裂缝中。这项研究为控制这些化合物的DNA烷基化率的因素以及DNA结合诱导的烷基化反应激活的重要性提供了新的认识。 图 12. 多卡米星类似物的设计和 SAR 分析。 (A)多卡米星类似物73-80的化学结构； (B) 多卡米星 A (73) 与 DNA 复合物的结合模式。 Patrick H. Beusker开发了一种基于多卡米星的用于还原链间二硫键的新型有效载荷，它与抗 HER2 抗体曲妥珠单抗结合，产生具有良好体内和体外特性的 ADC SYD985。多卡米星 DUBA (75) 具有咪唑 [1, 2-a] 吡啶基，以其无活性的前药形式seco-DIBA (76)掺入结合药物中(75通过76的自发螺环化形成) (图 12A)。化合物76含有两个羟基，每个羟基都可以通过连接子与抗体偶联。Moana Tercel 采用 Pd 催化胺化法将seco-CBI(seco-1,2,9,9a-四氢环丙[c]苯并[e]吲哚-4-酮，一种合成的duocarmycin 天然产物烷基化亚基的类似物)从苯酚转化为氨基形式，然后得到苯酚 CBI 类似物77, 78和氨基 CBI 类似物79, 80。化合物77对6种人类肿瘤细胞系的IC50在 0.1-2 pmol/L 范围内，更换化合物77或78苯酚 CBI 与相应的化合物79和80氨基 CBI 结合可显著降低药效，且对 P-gp 过度表达的敏感性更高。尽管如此，化合物79在大多数测试细胞系中保持了显著较低的皮摩尔细胞毒性，并且与化合物77、78和80一样，在足够高的浓度下完全抑制了所有细胞系的增殖。 ADC领域的一个明显趋势是治疗靶点从血液肿瘤转向实体肿瘤，这一趋势可能将有效载荷的选择从微管靶向抑制剂转向DNA损伤剂，DNA损伤剂通常表现出更高的效力，并符合新一代有效载荷要求比当前有效载荷具有更高治疗指数的标准。此外，使用DNA损伤剂作为有效载荷可以靶向相对低表达水平的肿瘤特异性/相关表面受体。DNA损伤剂作为ADC的有效载荷的使用已经很成熟，但由于DNA损伤难以修复，这可能导致潜在的毒副作用，目前仅有一款以PDB为有效载荷的ADC在临床上使用，因此其安全性/耐药性问题仍需进一步研究，未来还需要研制更多新一代ADC有效载荷。 3.3. RNA 靶向有效载荷 仍有许多肿瘤对 ADC 不产生反应或产生耐药性，生长缓慢的肿瘤细胞通常不像快速分裂细胞那样依赖微管蛋白介导的细胞过程。因此，为了进一步扩大 ADC 有效载荷的范围并识别出对快速和慢速增殖细胞均有效且可以逃避 MDR 介导的耐药性的其他类型 ADC 有效载荷，人们将注意力转向了靶向 RNA 的小分子有效载荷。靶向 RNA 的小分子抑制剂可以杀死分裂和休眠的肿瘤细胞，用作 ADC 有效载荷有望解决无效肿瘤休眠细胞引起的肿瘤耐药性和肿瘤复发和扩散问题。目前可用于ADC有效载荷的RNA抑制剂主要有两种：RNA剪接抑制剂(Thailanstatin及其类似物)和RNA聚合酶II抑制剂(Amatoxins)。 3.3.1. 泰兰他汀(Thailanstatin) RNA剪接主要通过切除负责将RNA转化为mRNA的复杂细胞机制的内含子和外显子来控制代谢、血管生成、癌细胞增殖和转移，它们还可以直接控制转录的起始、延长和终止，这是癌症抑制的生物学靶点。Abdel-Wahab等研究发现在RNA剪接调控药物的干扰下，肿瘤细胞可以产生新抗原，这些新抗原可以通过MHC I类分子以新抗原表位的形式呈递，从而激发抗肿瘤免疫，表明RNA剪接调控可以作为肿瘤抗原的潜在来源，具有应用于肿瘤免疫检查点治疗的潜力。剪接体抑制剂是强效的抗增殖药物，能够靶向活跃分裂和静止的细胞，因此RNA剪接体抑制剂是一类很有前途的ADC有效载荷。Thailanstatin是一种天然产物，最初从泰国布鲁氏菌msmb43中分离得到，通过与剪接体U2 snRNA亚复合物的SF3b亚基结合而被激活。Thailanstatin 家族通过抑制真核生物的 mRNA 剪接途径，对剪接体具有很强的结合和抑制作用，导致低纳摩尔 IC50 个值适用于多种癌细胞系，可用作 ADC的潜在有效载荷。 Yi-Qiang Cheng报道了从MSMB43 中分离得到的三种新的 thailanstatin 化合物：thailanstatin A (81)、thailanstatin B (82) 和 thailanstatin C (83) (图 13)。Thailanstatin A(81)是一种潜在的天然抗癌药物候选物，Thailanstatin药物整体结构与剪接体抑制剂候选物FR901464 (84)相似，不同之处在于Thailanstatin的C1位缺少一个不稳定的羟基，而C17位则多了一个羧基部分，因此Thailanstatin具有更好的稳定性。Thailanstatin A(81)和FR901464 (84) C3位的高活性环氧物对抑制前mRNA剪接和癌细胞增殖至关重要，通过卤化修饰Thailanstatin B(82)和Thailanstatin C(83)可降低化合物的生物活性) 对环氧物的作用，向 Thailanstatin C (83)添加甲基(与 Thailanstatin B (82)相比)对化合物的生物活性没有显著影响。Stephan Rigol合成了 Thailanstatin 类似物85和86，它们的 IC50值为皮摩尔。辉瑞首次探索了 RNA 剪接抑制剂作为抗体药物偶联物的有效载荷，将含羧酸的Thailanstatin 半合成类似物87直接与曲妥珠单抗表面赖氨酸偶联，得到非常有效的 Thailanstatin ADC。化合物87其对应的ADC在HER2高表达的胃癌细胞株N87和MDR1过表达的细胞株中均有效(化合物87在N87细胞中的IC50为1.8 nmol/L)，此外该ADC在胃癌异种移植模型中，低至1.5 mg/kg剂量暴露即可产生优异的药效，优于临床批准的ADC T-DM1。 图 13. 泰兰他汀类似物的设计和SAR分析81-87。 3.3.2. 鹅膏毒素(Amatoxins) 鹅膏毒素于1941年由Heinrich Wieland和Rudolf Hallermayer首次分离出来，鹅膏毒素是由核糖体合成的有毒双环八肽，是真核RNA聚合酶II的选择性抑制剂，可导致细胞凋亡。鹅膏毒素含有八个l构型氨基酸的大环，色氨酸和半胱氨酸残基通过亚砜部分连接，其三个侧链被羟基化，因此具有良好的水溶性。对鹅膏毒素研究最深入的是α-鹅膏毒素(88)，含有6-羟色氨酸(Htp)、反式-4-羟脯氨酸(Hyp)和(3R, 4R)-4,5-二羟基亮氨酸(Dhil)，是迄今为止已知的最有效、最特异的RNA聚合酶II抑制剂，具有突破耐药性或摧毁静息期肿瘤细胞的潜力，有效阻止肿瘤转移和复发(图 14A)。 Roger D. Kornberg团队分析了RNA聚合酶II- α-鹅膏蕈碱的晶体结构，发现抑制剂的位置与Bridge Helix相邻，而Trigger Loo在远离添加位点处主要处于稳定构象(图 14B)。α-鹅膏毒肽环肽骨架形成一个口袋，允许特定的互补氢键与Rpb1 His1085侧链咪唑环结合，为Trigger Loo形成一个约束点，α-鹅膏毒肽口袋对咪唑的特异性主要通过Gly7的酰胺NH与Rpb1 His1085 N(D1)的相互作用以及Asn1的羰基与Rpb1 His1085 NH(E2)的相互作用实现。研究表明，α-鹅膏毒肽通过直接干扰RNA聚合酶II的Trigger Loo来抑制RNA聚合酶II的延伸，并表现出缓慢降低的底物选择性。 图 14. 鹅膏毒肽的设计和 SAR 分析。 (A) 鹅膏毒肽 88、89 的化学结构； ( B ) α-鹅膏毒肽 (88) 与 RNA 复合物的结合模式。 鹅膏毒素引起的细胞凋亡、坏死等毒性阻碍了其临床应用，但由于其分子量小、在水溶液中溶解性好、能抑制RNA聚合酶Ⅱ，近年来作为抗体-药物偶联物的有效载荷在癌症研究中受到越来越多的关注。α-鹅膏毒素ADC很可能同时作用于增殖细胞和静止期肿瘤细胞，在ADC领域，使用鹅膏毒素作为有效载荷是一种比较新的方法。HDP-101，一种由海德堡制药公司开发的以鹅膏毒素为载荷的靶向B细胞成熟抗原(BCMA)的ADC，目前正处于I/IIa期临床试验，用于治疗复发/难治性多发性骨髓瘤，并于2022年2月15日完成首例患者给药。HDP-102是一种靶向CD37的ADC药物，靶向治疗非霍奇金淋巴瘤(NHL)。HDP-103靶向前列腺特异性膜抗原(PSMA)，靶向适应症为转移性去势抵抗性前列腺癌(mCRPC)。Steffen Goletz113将β-鹅膏毒肽(89)的羧基与IgG赖氨酸的氨基偶联，得到一种具有良好血浆稳定性和高细胞毒性的ADC(图 14A)。 以泰兰他汀(thailanstatin)和鹅膏毒素为载荷的ADC能够避免耐药性，有效对抗休眠肿瘤细胞，而现有的标准疗法很难达到这一效果，常常导致肿瘤复发和耐药。因此，除了微管蛋白抑制剂和DNA损伤剂作为载荷外，新一代RNA抑制剂作为ADC载荷也越来越受到关注。虽然目前还没有RNA载荷的ADC上市，但其巨大的潜力值得进一步挖掘。 3.4. 免疫 ADC 有效载荷 最初ADC 仅限于肿瘤学，然而它们的临床成功鼓励了 ADC 在其他治疗领域的应用，最引人注目的是免疫学。肿瘤免疫涉及 T 细胞、巨噬细胞、树突状细胞等，它们通过免疫调节将冷肿瘤转化为热肿瘤，最终增强免疫治疗的效果，免疫检查点抑制剂通过消除肿瘤对 T 细胞的抑制来增强 T 细胞的抗癌免疫反应。然而，对于没有自发性 T 细胞反应和肿瘤周围 T 细胞浸润的癌症患者(其肿瘤通常称为冷肿瘤)，免疫检查点抑制剂效果不佳。因此，免疫疗法研发的重点之一是开发能够刺激患者先天免疫反应并促进肿瘤特异性 T 细胞募集的抗癌疗法。与传统ADC不同，免疫刺激抗体偶联物(immune-stimulating antibody conjugates, ISAC)结合了抗体导航靶向的精准性和基于小分子调节先天和适应性免疫系统的强大功能。一方面，抗体偶联免疫激动剂类型的小分子，起到增强免疫反应的作用；另一方面，抗体的肿瘤靶向性降低了小分子免疫激动剂的毒性。在靶标选择方面，传统ADC由于载荷毒性必须严格限制肿瘤特异性抗原，而免疫调节ADC可以拓展更多的肿瘤相关抗原。在内吞作用方面，传统ADC是靶向抗原介导的内吞作用，直接杀死癌细胞，而免疫调节ADC通过免疫细胞表面的FcγR介导的内吞作用激活免疫细胞。目前，多种免疫调节ADC药物正在开发中，新的有效载荷主要包括Toll样受体(TLR)激动剂和干扰素基因刺激剂(STING)激动剂，该领域具有巨大的发展潜力。 3.4.1. Toll 样受体激动剂 Toll 样受体(Toll-like receptors, TLR)是一类重要的参与先天免疫的蛋白质分子，是机体抵抗感染性疾病的第一道屏障。TLR 受体的激活能够改善肿瘤微环境中树突状细胞和巨噬细胞的抗原呈递，促进 CD8+ T细胞。Toll样受体激动剂作为免疫增强剂，在肺癌、黑色素瘤、白血病、胶质瘤等肿瘤中直接或间接诱导增强的抗肿瘤免疫反应，从而有效抑制肿瘤生长。因此，将TLR激动剂应用于肿瘤免疫治疗，有望激活先天免疫反应，介导获得性免疫反应，使冷肿瘤变热，解决单一免疫检查点抑制剂应答率低的问题，提高免疫治疗的有效性，达到重塑肿瘤微环境的目的。目前，TLR已成为免疫治疗领域的研究热点之一，而在TLR家族成员中，研究者较多关注的是TLR7、TLR8、TLR9。TLR8激动剂(90) (91)激活DC细胞并增强T细胞对肿瘤细胞的杀伤(图 15)，然而免疫治疗往往伴随副作用，如细胞因子释放综合征，这是一种常见的引起全身炎症的疾病。TLR8激动剂的全身给药也存在相关的毒性，限制了患者可以服用的TLR8激动剂的数量。因此，将TLR8激动剂应用于ADC，可以同时结合抗体的靶向作用和TLR8的免疫调控作用，减少毒副作用。Toshiyuki Shimizu团队发现TLR7 TM螺旋与TLR7-TLR信号调节剂(UNC93B1) TM3和TM6螺旋及近膜区对齐，LRR-CT基序与UNC93B1 N末端六螺旋束的腔侧相互作用。TLR7–UNC93B1复合物的二聚化由TLR7-TLR7和UNC93B1-UNC93B1相互作用介导，它们分别发生在2：2复合物的顶部和底部区域。LRR11从TLR7 ECD中部区域突出的环区主要有助于TLR7的二聚化，而UNC93B1两个原体TM6和TM7连接区域的胞内螺旋以反向平行的方式相互作用，该研究阐明了TLR'的结构基础与 UNC93B1 的相互作用并促进了随后设计针对自身免疫疾病的化合物。 图 15. TLR激动剂的设计和SAR分析90-92。 Silverback 的 SBT6050是一种抗 HER2 抗体结合物，含有 TLR8 激动剂91作为其有效载荷，在体外以HER2依赖的方式驱动多种抗肿瘤免疫机制，并在小鼠肿瘤模型中表现出良好的抗肿瘤作用(图 15)。一类新的TLR7/8双重激动剂已被报道能促进肿瘤对免疫检查点抗体的反应，尤其在冷性肿瘤中。虽然该团队发现的小分子具有显著的抗肿瘤作用，且与PD-1和PD-L1抗体联合使用可观察到显著的协同作用，但与其他已报道的TLR激动剂类似，小分子在外周血中仍然过度暴露，导致更明显的免疫相关不良反应(immune-related adverse reactions, irAE)，如体重减轻和流感样症状。为了避免直接服用TLR7/8激动剂可能引起的不良反应，团队于2015年开始尝试抗体偶联药物策略，经过数年探索，成功构建了一类新型免疫调节抗体偶联药物HE-S2，其以TLR7激动剂 (92)为靶点为有效载荷，动物实验结果显示，HE-S2(150μg/小鼠)具有非常显著的抗肿瘤作用，给药后大部分结肠癌小鼠肿瘤基本消失，而在黑色素瘤模型中，HE-S2治疗效果也优于对照组。重要的是，HE-S2治疗组小鼠没有出现明显的体重下降。此外，给药后小鼠肿瘤虽然有所萎缩，但肿瘤微环境中肿瘤细胞表面及免疫细胞PD-L1表达明显增高，这可能有利于提高后续HE-S2给药的靶向性。新型ADC HE-S2不仅通过阻断PD-1/PD-L1相互作用、激活TLR7/8信号通路诱导强大的抗肿瘤免疫反应，而且还通过表观遗传调控和 IFN-γ，从而赋予 PD-1/PD-L1 阻断更高的敏感性。 Michael N. Alonso团队将 TLR7/8 激动剂与 HER2 抗体偶联，得到一种 ADC 药物，该药物通过识别 FcγR依赖的吞噬作用和 TLR 介导的肿瘤抗原激活，驱动髓系细胞肿瘤杀伤和随后的 T 细胞介导的抗肿瘤免疫，适合全身给药，安全有效。此外，越来越多的公司开始将 TLR激动剂用于抗体药物偶联： Bolt 公司的 BCC-1001，用于治疗 HER2+ 阳性实体瘤，源自 HER2 的 TLR7/8 激动剂偶联，已进入临床研究；Sutro 的 IADC 技术可用于将抗体与 TLR 激动剂偶联；Tallac 的 TRAAC 技术用于位点特异性抗体与 TLR9 激动剂的偶联；ALX Oncology 的 SIRP α与Tallac合作开发的抗体可与TLR9激动剂偶联，恒瑞医药采用TLR7激动剂，百济神州采用TLR7/8激动剂，信达生物引入Bolt技术，采用TLR7/8激动剂进行偶联，Silverback公司的ImmunoTAC技术选择TLR8激动剂作为有效载荷。这些研究提供了一种增强免疫检查点阻断疗法抗肿瘤免疫应答的新型ADC策略，同时该策略也为解决直接使用免疫激动剂导致药物质量不佳的问题提供了一种思路。 3.4.2. STING 激动剂 干扰素基因刺激因子(stimulator of interferon genes, STING)是天然免疫信号通路中的关键调控因子，具有启动机体天然免疫防御反应、促进T细胞形成适应性免疫的功能。STING介导的I型干扰素信号通路是天然免疫领域的重大发现，为肿瘤免疫治疗提供了新的靶点。激活STING通路可诱导I型干扰素及多种其他细胞因子的表达和分泌，激活天然免疫反应，促进抗肿瘤免疫反应，达到治疗肿瘤的目的。STING激动剂广泛应用于多种研究领域，除了诱导天然免疫反应外，还参与其他DNA或RNA传感信号通路、自噬、ER应激和细胞凋亡。STING激动剂凭借抗肿瘤和免疫原性的特点，也成为新型免疫治疗试验药物和疫苗佐剂。现有的临床研究数据初步证明STING激动剂与免疫检查点抑制剂联合使用可显著增强免疫治疗疗效，有望成为一种创新疗法。非核苷小分子STING激动剂具有良好的稳定性，可以在动物模型中口服或注射给药，并显示出良好的抗癌活性。但由于STING蛋白也存在于健康细胞中，因此系统性STING激动剂需要解决的问题之一是如何刺激抗肿瘤免疫反应，而不会引起健康细胞过度的炎症反应。如果这些激动剂能够进一步优化，它们有可能彻底改变免疫治疗领域。 考虑到游离型STING激动剂的全身给药可能受毒性限制，且广泛的生物分布可能并不理想，可以考虑通过ADC实现STING激动剂的肿瘤靶向递送，以降低毒性。环状二核苷酸(CDN)(93)作为STING蛋白的天然配体已被广泛研究(图 16A)。顾立川团队确定了猪STING复合物的CBD(CDN结合位点)，该复合物含有4种CDN：2, 3 cGAMP；3, 3 cGAMP；c-di-GMP和c-di-AMP。其中，不对称配体2, 3 cGAMP与STING的结合亲和力最高(图 16B)。对猪 STING CBD 2′, 3′-cGAMP复合物进行结构分析，发现不对称单元包含两个 STING CBD 分子(原体 A 和 B)，形成二聚体。各个原体通过 α1、α2、α3 和中心β-片层区域相互作用，形成深 U 形裂口。2′, 3′-cGAMP 配体位于裂口处，嘌呤向上，核糖环向下(与膜相关)，碱基、磷酸和核糖基团均有助于与 STING 结合；2′,3′-cGAMP 的嘌呤环与两个启动子的 Tyr167 和 Arg238 堆叠；2′,3′-cGAMP 的磷酸部分通过静电相互作用和氢键被 Arg238 识别，Arg238 还在核苷部分的 Hoogsteen 边缘形成氢键。除了堆叠相互作用外，腺苷和鸟苷部分与 STING 具有不同的相互作用模式。对于两者，相互作用都涉及它们的 Watson-Crick、Hoogsteen 和糖边缘，嘌呤中的所有氮原子(9 位氨基除外)和氧原子都直接或间接(水介导)与 STING 蛋白相互作用，这些广泛的相互作用与配体和猪 STING CBD 之间的高结合亲和力一致。猪 STING CBD-2′, 3′-cGAMP复合物的一个显著特征是两个原体采用不同的构象，从而形成不对称的配体结合口袋。因此，同样不对称的 2′, 3′-cGAMP 在配体结合口袋中保持一种明确的构象。这种独特的结合模式与之前涉及其他物种的 STING 蛋白的结构中看到的结合模式形成鲜明对比，其中 2′, 3′-cGAMP 以两种替代模式与对称 STING 二聚体结合，腺苷和鸟苷部分互换位置。总之，研究发现猪 STING 采用不对称构象与 CDN 结合，对这种不对称构象的分析揭示了 STING 的配体识别和识别机制。 图 16. STING 激动剂的设计和 SAR 分析。 (A) STING 激动剂93-96的化学结构；(B) CDN (93) 与 STING 复合的结合模式。 以CDN作为ADC有效载荷，CDN与抗体可以通过磷酸酯、糖环、碱基等偶联，SPEROVIE将CDN中的硫代磷酸酯或甲酸酯与PD-1或CTLA-4抗体偶联形成ADC药物；Immunesensor从CDN 3′位核糖上引出氨基或巯基，再通过氨基甲酸酯或二硫键与抗体偶联形成ADC药物；MIT和Millennium创新性地将磷脂分子偶联到CDN的磷酸酯上，所得缀合物还可进一步形成脂质体结构，提高其与细胞膜的融合能力。北京宣仪药将TLR9激动剂CpG-DNA与CDN连接形成融合分子，可同时激活TLR和STING免疫信号通路，增强免疫活性。然而，CDN结构中的二磷酸酯会导致药物的生物利用度降低。因此，随着苯并咪唑类化合物的发现，非核酸结构的STING激动剂的研究已经开始。基于二聚苯并咪唑的ADC药物也被设计和合成。Mersana使用STING激动剂94作为有效载荷获得的ADC候选药物XMT-2056已经进入临床前研究阶段(图16A)，其目的是通过刺激肿瘤组织免疫细胞和肿瘤细胞中的STING信号来激活先天免疫系统。与STING激动剂相比，XMT-2056的效力增加了100倍以上。在临床前模型中，XMT-2056在HER2高表达和低表达的模型中均显示出强大的抗肿瘤活性，当与多种批准的药物(包括曲妥珠单抗、帕妥珠单抗、抗PD-1 mAb或DS-8201)联合使用时，其疗效得到增强。临床前数据表明，XMT-2056具有实现免疫记忆以延长抗肿瘤活性的潜力。今年5月，美国食品和药物管理局授予该药物治疗胃癌的孤儿药称号。Mersana计划在今年晚些时候启动XMT-2056的I期临床试验，以研究其在一系列HER2阳性肿瘤(如乳腺癌、胃癌和非小细胞肺癌)中的治疗潜力；日本小野制药开发了一种非核酸STING激动剂95作为有效载荷，通过药物结构中的吡唑环与连接剂偶联，RYVU是基于公司开发的一类与抗体形成ADC药物的硝基杂环胺STING激动剂96。 3.4.3. 糖皮质激素受体调节剂(GRM) 糖皮质激素受体调节剂 (Glucocorticoid receptor modulator, GRM) 通常用于治疗与各种疾病相关的炎症，有可能在保持 GR 逆转录效应(被认为是预期的抗炎作用的原因)的同时，将 GR 逆转录效应(被认为是不良副作用的原因)降至最低。然而，GRM 还会引起肌肉骨骼、内分泌和胃肠道副作用以及其他毒性，从而限制其治疗效果(尤其是长期使用时)。使用 GRM 作为免疫型 ADC 的有效载荷可能是一种理想的选择，因为靶向给药将最大限度地减少全身对 GRM 有效载荷的暴露，从而可以在不引起有害副作用的剂量下提供显着的疗效，并能够实现慢性给药。这种 ADC将结合单克隆抗体(针对炎症靶点)和选择性糖皮质激素受体调节剂的功效，糖皮质激素有效载荷含有胺基官能团，可用于结合溶酶体可切割抗体连接子。首次报道 GRM 作为 ADC有效载荷时使用了已知的地塞米松(dexamethasone) (97) (图 17A)，GRM ADC抗体组分选择了α-TNF，连接子则连接在地塞米松的C21羟基上。艾伯维正在开发的ABBV-3373也是由α-TNF和GRM组成的ADC药物，可以精准靶向调控活化免疫细胞，调节TNF介导的炎症信号通路，显著降低糖皮质激素相关的全身副作用，并有望治疗类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)。近期，Adrian D. Hobson启动了α-TNF-GRM ADC项目，并获得了α-TNF-GRM ADC (DAR=4)，使用马来酰亚胺-Gly-Ala-ALA 作为连接子。P1NP 和皮质酮生物标志物的分析表明，ADC 在疗效和不良反应之间具有足够的治疗窗口。在慢性小鼠关节炎模型中，α-TNF-GRM ADC 比具有相同 GRM 有效载荷的α-TNF 单克隆抗体和同型对照更有效。 图 17. 糖皮质激素受体调节剂 (GRM)的设计和 SAR 分析。 (A) GRM 97-102的化学结构； (B) 化合物97与 GR 复合的结合模式； (C) 化合物98与 GR 复合的结合模式。 Victor Gualla研究小组确定了 GR 与地塞米松(97) 和98 (前体药物环索奈德的活性代谢物) 的晶体结构，GR 和地塞米松(97) 的结构采用开放构象，GR 在 H6–H7 区域表现出较高的突变频率。对 PDB 共晶体结构进行评估，其中配体在 GR 的配体结合域 (残基 500–777) 中复合，揭示了与 GR 复合的去异丁酰环索奈德的结构 (图 17B 和 C)。Peter S. Dragovich合成测试了多种含有不同胺取代缩醛基团的类似物，其中哌嗪化合物99表现出与地塞米松 (97)和化合物98 (GRE 细胞，+ mTNF，IC50 = 33 nmol/L) 相似的细胞活性。然而，化合物99的渗透性较差，这可能是由于化学结构中存在碱性胺，从而削弱了其细胞功效。化合物99使用二肽基蛋白酶 (Ala-Ala) 可切割连接子与抗 TNF mAb 结合，所得结合物在基于细胞的评估中活性较弱 (IC50 = 8.1 μmol/L)。进一步研究发现含苯胺的化合物100比化合物99更有效，且其 GR 结合和细胞活性与地塞米松 (97)和化合物98 (GRE 细胞，+ mTNF，IC50 =4.0 nmol/L) 相似或更好。随后，通过将化合物100通过含有蛋白酶可切割的二肽部分但缺少氨基苄氧羰基间隔基的连接子与抗 TNF 单克隆抗体结合，所得结合物在含有膜结合 TNF 的细胞中表现出强的 GR 活性，而在外部缺乏该蛋白质的细胞中表现出最小的活性(GRE 细胞，+ mTNF，IC50 = 0.44 μmol/L；GRE细胞，mTNF，IC50>50 μmol/L)。在胶原诱导性关节炎 (CIA) 模型中，以 1、3 和 10 mg/kg 的剂量对小鼠进行腹膜内注射，在 21 天内爪肿胀程度呈剂量依赖性下降。重要的是，这种结合物具有较低的毒副作用。因此，通过抗体结合物靶向递送糖皮质激素可以最大限度地减少不良副作用，同时提高未结合化合物的抗炎活性。 William Olson团队描述了新的糖皮质激素类药物，他们开发 GC 结合物 (GC-ADC) 的策略是确定布地奈德(budesonide)中可以进行修改的区域，以提高结合物对新游离有效载荷的稳定性和滴度。然后评估了两种布地奈德的修饰方法：首先，用胺或苯胺取代 C21 羟基，其次，用氟取代 C9 和 C6 氢。含有胺和苯胺的有效载荷可以通过氨基甲酸酯键与抗体结合，氨基甲酸酯键比羟基提供的碳酸酯或磷酸酯键更稳定。该团队获得了两种先导化合物101和102，通过对布地奈德分子的SAR分析和分子模拟。化合物101、102的功效测试发现，这两种化合物对糖皮质激素受体(GR)的选择性高于其他核激素受体，在细胞试验中具有与布地奈德更好或相同的效力，在hERG中没有心脏毒性，在Ames中没有遗传毒性，并在体内促炎小鼠模型中表现出效力。在脂多糖(LPS)刺激的小鼠中，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的释放) 显著降低。随后通过组氨酸蛋白酶可切割连接子获得的 GC-ADC 在血浆中高度稳定，并特异性地在抗原阳性细胞中释放 GC，这表明这些新型 GC 可以作为 ADC 有效载荷来治疗自身免疫和炎症疾病。 免疫激动剂全身给药时会激活非特异性免疫反应，严重时可引发致命的细胞因子风暴。将免疫激动剂与肿瘤靶向抗体偶联，可将免疫激动剂递送至肿瘤微环境并局部释放，缓解免疫刺激剂全身给药的严重毒性，有助于避免抗肿瘤治疗中的全身副作用。然而，虽然通过诱导免疫机制发挥抗肿瘤作用的免疫刺激ADC药物思路非常清晰，临床前数据也相对较好，但在临床试验中剂量依赖性毒性问题却难以解决。激动剂疗效提升的同时，毒性也会随之提升，难以确保疗效提升的方式能够安全可靠，例如在小鼠肿瘤模型中展现出良好抗肿瘤效果的SBT6050，目前因毒性问题，在临床研究中效果不佳，因此后续研究最重要的考量就是毒性与疗效的平衡，重新设计以减弱毒性、改善给药窗口也是非常有利的。 3.5. 新型潜在 ADC 有效载荷 3.5.1. Bcl-xL 抑制剂 Bcl-xL是一种抗凋亡蛋白，在肿瘤形成、转移和耐药性中起重要作用，理论上，阻断 Bcl-xL 上 BH3 结合域的药物可以引发癌细胞凋亡。然而，Bcl-xL 对血小板存活至关重要，而 Bcl-xL 的泛抑制剂可能会产生血小板毒性。将 Bcl-xL 视为 ADC 药物有效载荷的靶点，可以保留 Bcl-xL 抑制剂的活性，同时降低其对血小板的毒性。Tomoyasu Ishikawa 对 Bcl-xL 抑制剂 ABT-737 (103) 与 Bcl-xL 共结晶，结果表明，化合物的联苯部分(单元 W)在由 Phe146、Leu130、Leu108 和 Phe105 组成的口袋中形成亲脂性相互作用(西部区域；h1 H2)，而化合物的烷基磺酰胺部分(单元 E)在由 Phe97、Tyr195 和 Tyr101 组成的另一个口袋中形成亲脂性相互作用(东部区域；h4)(图 18)。单元E中三个芳香环形成分子内π-π相互作用，形成独特的刚性U型构象，该构象可能增强ABT-737(103)与Bcl-xL的分子间结合。此外，研究了一系列小分子抑制剂的构效关系，发现单元E对Bcl-xL的抑制作用比单元W更重要，尤其是B环。晶体结构和构效关系分析将为设计更有效的抑制剂进行ADC载荷鉴定提供基础。 2017年，AbbVie首次将Bcl-xL抑制剂104与Bcl-xL偶联，作为有效载荷以 ADC 的形式传递给抗 B7H3 抗体，得到针对 EGFR 的 ABBV-155，该药物仍处于临床试验阶段(WO2017214301A1、WO2017214282Al)。 图 18. Bcl-xL 抑制剂的设计和 SAR 分析。 (A) Bcl-xL 抑制剂103、104 的化学结构；( B) ABT-737 (103) 与 Bcl-xL复合的结合模式。 3.5.2. NAMPT 抑制剂 烟酰胺磷酸核糖转移酶 (Niacinamide phosphate ribose transferase, NAMPT) 可将烟酰胺转化为烟酰胺单核苷酸，是一种控制细胞内 NAD+ 浓度的限速酶。当 NAMPT 受到抑制时，NAD+ 水平会降至代谢所需的水平以下，从而导致能量危机并最终导致细胞死亡。尽管 NAMPT 抑制剂是有效的细胞毒性分子，但由于其毒性，它们在癌症治疗中用作化疗药物受到阻碍。几种NAMPT 抑制剂，如 FK-866 (105) (图 19A)因剂量依赖性毒性而停止临床试验。但 NAMPT 抑制剂结构简单、药效强，且其激活机制不同于目前的 ADC 有效载荷，因此 NAMPT 抑制剂可作为具有良好活性和耐受性的 ADC 有效载荷，有望改善 NAMPT 抑制剂的治疗窗口，进而应用于临床环境。Chris Tse 及其团队发现了新型非底物 NAMPT 抑制剂，它们具有强大的临床前疗效和药代动力学特性，可实现口服给药，该系列的先导分子A-1293201 (106)，含有异吲哚啉“头部基团”，可有效抑制重组人 NAMPT。通过 X 射线晶体学检查 A-1293201 与 NAMPT 之间的相互作用，发现了几个不同的协同相互作用位点(图 19B)。这些位点包括 PRPP 结合亚位点 A，其本质上是亲水性的，未被烟酰胺占据；烟酰胺结合亚位点 B，在此与烟酰胺进行重要的 pi 堆积和氢键相互作用；系链亚位点 C，其狭窄、亲脂性，未被结合烟酰胺占据；以及远端开口亚位点 D，其加宽并提供多个结合水分子和疏水表面。与 FK866 类似，A-1293201 的异吲哚啉脲部分参与亚位点 B 中的重要 pi 堆积相互作用以及亚位点 C 中的氢键和疏水相互作用。与 FK866 以及最近的第二代 NAMPT 抑制剂相比，异吲哚啉脲化合物是第一种已知的强效非磷酸核糖基化 NAMPT 抑制剂。Carl Uli Bialucha设计的新型 NAMPT 抑制剂107在 nmol/L 范围内对 NCI-H526、MDA-MB453 和 NCI-N87 等多种细胞系有效，构效关系表明吡啶氮可被 NAMPT 酶磷酸化，是药效团的重要组成部分。此外，整个 3-吡啶 (S, S) 环丙基甲酰胺基团对于高水平的细胞活性至关重要。R3 区域可以容忍多种取代基，乙基取代基化合物108是通过替换更刚性的未取代苯环获得的，其对 A2780 和 CORL23 细胞系的作用与化合物107相似。苯环可进一步衍生化，以提供最佳的连接载体，在苯环对位添加哌嗪取代基是耐受性良好的化合物109，哌嗪基团上的游离二级胺可作为连接子的结合点与抗体结合。R3处的苯基哌嗪取代以及R1和R2分别被F和H取代，得到略有改善的类似物110 ，其在nmol/L浓度下对C-Kit和HER2表达细胞系有效。使用不可切割连接子与有效载荷110获得的抗c-Kit缀合物不仅具有低聚集性，而且具有最佳的抗CKIT活性(IC50分别为 9 和 40 pmol/L)，并被证明是 c-Kit 阳性胃肠道间质瘤 GIST-T1 异种移植模型的靶向药物。ADC 的有效载荷需要包含活性杂原子才能结合可切割的连接子，而 FK-866 缺乏氨基、羟基或巯基官能团。为了获得易于集成并保持效力的有效载荷，Peter D. Senter制备了一系列 FK-866 类似物，在芳香尾部的不同位置进行苯胺取代。进一步评估了这些化合物对 L540cy、A549 和 HepG2 细胞系的细胞毒性。化合物111在两种测定中都表现出与 FK-866 相似的效力，NAMPT 和化合物111的晶体结果表明，新加入的苯胺基团通过氢键与 Glu376 的主链酰胺相互作用，可能抵消了添加极性官能团所导致的任何去溶剂化损失。用吡啶基氰基胍基团中发现的强效抑制剂 chs-828 制备的化合物112和用吡啶基方酰胺基团制备的化合物113保留了与NAMPT 的强结合力并具有强细胞毒性，这些化合物已作为 ADC 药物有效载荷进入评估阶段。在耐受性良好的剂量下，在几种肿瘤模型中显示出显著的活性水平。 图 19. NAMPT 抑制剂的设计和 SAR 分析。 (A)NAMPT抑制剂105-113的化学结构；(B)A-1293201(106)与 NAMPT 复合的结合模式。 3.5.3. 卡马霉素(Carmaphycins) 蛋白酶体活性抑制剂是一类新兴的抗癌药物，对某些癌细胞具有超强的细胞毒性，环氧酮蛋白酶体抑制剂carmaphycins就是此类的代表。从海洋蓝藻Symploca sp.中分离鉴定出的carmaphycins A(114)和B(115) ，其α，β-环氧酮直接与甲硫堇亚砜或甲硫堇砜结合，在低纳摩尔浓度下抑制蛋白酶体的β5亚基，对多种癌细胞系有效(图 20)。但由于其选择性较差，常常表现出毒副作用。使用剧毒的carmaphycins衍生物作为ADC有效载荷，既能保持所需的效力，又能获得更好的耐受性。carmaphycins可分为四个不同的部分(P1-P4)，William H. Gerwick通过替换6-氨基己酸链，合成了第一代类似物116，其P4末端带有胺基，这显著降低了对NCI-H460细胞的杀伤作用(IC50 = 860 nmol/L)。第二代carmaphycins类似物在P2处含有2-氨基乙基同型半胱氨酸残基，直链烷基链被芳香族苯基或吡啶环取代，得到类似物117，其对HCT116和NCI-H460的细胞杀伤作用低于carmaphycins B(115)，因为P2的脂肪胺在生理pH下呈碱性且带正电荷，降低了其细胞通透性。为了降低P2处的碱性，该团队将carmaphycin B(115)的P2甲基砜部分替换为4-硫代苯胺或4-磺酰基苯胺，得到化合物118或119。化合物119比118更有效，这意味着碱性胺的效力越少越好。此后，合成了在P1和P2处含有两个亮氨酸-环氧酮药物簇的类似物120，其IC50在HCT116和NCI-H460细胞系中的IC50 分别为0.2和5.4 nmol/L，P1处的环氧酮对化合物120的强效细胞毒活性至关重要。类似物121含有含苯胺的P3侧链，对SKBR3细胞的IC50为21 nmol/L。与化合物121相比，将苯胺官能团置于类似物122的P4位置可更有效地抑制细胞生长。类似物系列中的化合物119保持了较高的细胞效力，但与游离抗体相比，其目前的偶联ADC对所测试的癌细胞系并未表现出更优异的细胞杀伤能力。 图 20. 卡马霉素类似物114–122的设计。 3.6. 新型ADC有效载荷 3.6.1. 以PROTAC分子为有效载荷的ADC ADC 开发的主要挑战与剂量限制性毒性(dose-limiting toxicity, DLT) 有关，这表明很难平衡药物治疗的疗效和脱靶毒性。ADC 实际输送到肿瘤的药物剂量非常小，这意味着药物分子必须具有极强的细胞毒性，尽管这会导致毒性副作用。PROTAC 是一组双功能化合物，由靶向目标蛋白 (POI)的配体、E3 连接酶的配体和连接子组成。PROTAC 将 POI 和 E3 连接酶拉近，用泛素化标记 POI，然后将其由蛋白酶体降解。PROTAC 具有催化作用，因此可以在较低剂量下有效降解目标蛋白。PROTACs可能是ADC理想的有效载荷，将抗体与PROTAC分子偶联形成的抗体PROTAC偶联物可以在特定细胞中特异性降解靶蛋白，实现PROTAC技术在细胞或组织水平的选择性。抗体-PROTAC偶联物将PROTAC的催化特性与ADC的组织特异性相结合，从而克服了传统靶向降解剂和ADC的局限性，具有靶向新靶点的巨大潜力。 将靶向BRD4蛋白的PROTAC 123与HER2抗体连接，可形成分子量约为150kD的抗体PROTAC偶联物，平均每个抗体分子上有4个PROTAC分子(图 21)。抗体PROTAC偶联物能有效降解HER2高表达细胞SK-BR-3中的BRD4蛋白，而对HER2低表达细胞MCF-7中的BRD4蛋白无降解作用。BRD4抑制剂124通过基于马来酰亚胺的偶联反应与HER2靶向mAb的链间Cys残基偶联，得到可降低BT-474(HER2阳性)细胞系中BRD4水平的ADC偶联物。两种降解ERα的ADC最近也在专利文献中被描述，第一种是将基于VHL的PROTAC 125通过以下方式连接到HER2靶向mAb上碳酸盐部分；第二个 ADC 使用含酶可切割的焦磷酸连接子连接到同一 PROTAC 的 VHL 结合区。在 MCF7-neo/HER2 细胞中，两种结合物均表现出有效的抗原依赖性 ERα降解，并且两种结合物在小鼠稳定性和药代动力学试验中均表现出可接受的结果。PROTAC 126具有 CRBN 作为 E3 连接酶并靶向 TGF-β R2 蛋白，可通过不可切割的连接子与抗 HER2 抗体偶联。在转染 HER2 受体的 HEK293 细胞中，0.5 和 1.0 μmol/L 的 ADC 在 24 和 48 h后降解了 TGF-β R2 蛋白。此外，使用PROTAC 127单次静脉注射 1 mg/kg ADC，一种基于 VHL 的可降解 BRM 蛋白，作为有效载荷，在已知表达高 CD22 表面受体的 BJAB 淋巴瘤异种移植肿瘤中实现了 BRM 蛋白的强效、抗原依赖性还原。该结合物在体内表现出所需的生物活性，并进一步多样化了可通过 ADC 模式成功调节的靶蛋白，扩大了将 PROTAC 靶向表达该表面蛋白的细胞的可能性。 图 21. PROTAC 分子123–127的化学结构。 尽管抗体-PROTAC 偶联物领域仍处于起步阶段，但已经创建了一组多样化的此类实体，其成员随后已显示出有意义的体外和/或体内生物活性。与大多数已知的细胞毒性 ADC (DAR=2-4)相比，许多这些新实体采用了更高的有效载荷有效载荷(DAR=6)，但对于典型的抗体-PROTAC 偶联物应用，这种增加是否通常是必需的仍有待确定。在体内和体外都实现了抗原依赖性活性的多个例子抗体-PROTAC 结合物与所述结合物进行了比较，这些结果证明了抗体-PROTAC 结合物能够将其各自的 PROTAC 有效载荷递送至特定肿瘤和/或目标细胞。鉴于这些有希望的初步结果，抗体-PROTAC 结合物似乎为未来的发展和应用做好了准备，预计未来抗体-PROTAC 结合物将应用于组织或生物体，为药物治疗或生物学研究提供新思路。 3.6.2. 以NIR-PIT药物为有效载荷的ADC 近红外光免疫治疗(Near-infrared photoimmunotherapy, NIR-PIT)药物一般由靶向肿瘤的肿瘤特异性单克隆抗体和光激活化学物质通过连接子组成，本质上是ADC药物。NIR-PIT药物可以与照射红外光到肿瘤部位的装置一起，形成一个新的靶向抗癌平台。该平台使抗体介导的靶向递送达到高度的肿瘤特异性，同时利用红外光激活药物的生物物理机制，精准诱导癌细胞快速死亡，而不伤害周围的正常组织。NIR-PIT药物诱导的多克隆免疫反应可以消灭在NIR-PIT药物第一步中存活下来的肿瘤细胞，即使NIR-PIT药物不足、递送不均匀，或由于靶抗原表达不均匀导致剂量不足，因为后续的第二步多克隆免疫反应也会杀死残留的肿瘤细胞。此外，NIR-PIT 药物还可以作为先前存在的 PD-1 单克隆抗体、PD-L1 单克隆抗体或 CTLA-4 单克隆抗体的有益补充，增强其肿瘤免疫反应。NIR-PIT 药物中的有效载荷不是细胞毒性物质，而是水溶性酞菁衍生物(例如硅酞菁衍生物 IR700 (IRDye700DX)(128)(图 22A)。IR700是一种小的光活化分子，可被近红外光激发，无光毒性或生物毒性。当抗体与肿瘤表面抗原结合时，在近红外光的刺激下，IR700发生光诱导配体释放反应，释放亲水侧链，导致剩余部分的疏水性显著增加。这反过来会破坏细胞膜，引发针对癌细胞的快速、高选择性免疫原性细胞死亡(ICD)(图 22B)。NIR-PIT诱导的ICD在直接杀伤癌细胞的同时，可以导致癌细胞接近死亡的未成熟树突状细胞快速成熟，启动宿主的抗癌免疫反应，促进针对死亡癌细胞释放的抗原的CD8+ T细胞重新形成，进一步放大NIR-PIT的治疗效果。 图 22. IRDye700DX (128)的设计与分析。 (A) IRDye700DX (128) 的化学结构；(B) NIR-PIT ADC 的作用机理。 乐天医疗的西妥昔单抗沙罗他洛康于2020年以商品名Akalux获得PMDA加速批准，是一种由西妥昔单抗和水溶性硅酞菁衍生物IRDye700DX组成的抗体偶联药物，靶向表皮生长因子受体，用于治疗无法切除的局部晚期或局部复发性头颈癌，是全球首个获批的光免疫治疗药物。给药24h后，该药物可特异性聚集在EGFR阳性肿瘤细胞表面。使用690nm波长的近红外光照射肿瘤部位，诱导西妥昔单抗沙罗他洛康杀死癌细胞并激活免疫反应，在NIR-PIT药物研究中进展最快的是乐天医疗的ASP-1929(又名RM-1929)。ASP-1929是西妥昔单抗与IR700的结合药物，靶向表皮生长因子受体EGFR，可用于治疗无法切除的局部晚期或复发性头颈癌。除了ASP-1929，乐天医疗还有一款NIR-PIT药物，在临床前研究中与PD-1单克隆抗体联合在晚期肿瘤动物模型中表现出优异的抗肿瘤活性。其他一些NIR-PIT药物研究，包括131I(PcMAb)(CD38单克隆偶联NIR-PIT药物)、TROP-2-IR700、雷莫芦单抗-IR700、偶联物AvIR介导的PIT、抗TF抗体1849-ICG偶联物、MN-14-700DX、Avelumab-IR700等均以IR700为有效载荷。 作为ADC领域的“冷门赛道”，光免疫ADC的临床和市场前景尚需经过时间的考验，但基于相关原理开发新靶点和新型光激活效应分子或将成为ADC赛道新的突破点。 3.6.3. 双载荷ADC 随着 ADC 治疗耐药性的出现，将一种抗体与两种甚至多种不同的细胞毒性有效载荷结合为开发下一代 ADC 提供了一个有吸引力的选择。为了证明双有效载荷药物 ADC 的可能优势，Levengood 等在 2017 年制备了一类含有两种不同微管蛋白聚合抑制剂的 ADC，该团队将具有不同物理和化学性质的 MMAE 和 MMAF 与同一种抗 CD30 抗体结合，以发挥互补的抗癌活性。这项工作清楚地展示了一种构建强效双药 ADC 的潜在有效方法，以及如何递送多种细胞毒性有效载荷来提高 ADC 活性。后来，Kumar 等开发了一种异质三功能连接子，该连接子结合 MMAE 和 PBD二聚体有效载荷以产生双有效载荷药物 ADC。Nilchan 等使用双抗体结合方法，通过在工程硒化半胱氨酸和半胱氨酸残基位点特异性结合HER2 抗体，生成含有靶向微管蛋白有效载荷 MMAF 和 DNA 拓扑异构酶 II 抑制剂 PNU-159682 的双有效载荷 ADC。PNU-159682 由于其 DNA 损伤活性而导致 S 期细胞周期停滞，而 MMAF 同时抑制微管蛋白聚合并导致 G2/M 期细胞周期停滞。双药物 ADC 对 HER2 表达细胞系表现出选择性和强效细胞毒性，并表现出与所连接药物一致的双重作用机制。 ADC药物经常会遇到肿瘤内异质性的问题，例如乳腺癌通常由多种具有不同基因表达谱的细胞组成，其异质性是化疗后产生耐药、复发和转移的主要因素。为了解决这一问题，Kyoji Tsuchikama通过化学酶联法高效构建了一系列具有明确药物抗体比(DAR)的双有效载荷ADC(DAR组合分别为2+2、4+2和2+4)，并且DAR调节的灵活性有利于根据疾病靶点和有效载荷组合精细调节ADC的理化性质、疗效和毒性(图 23)，其中DAR为(4+2)的MMAE/MMAF双药ADC比DAR为4或6的MMAE单药ADC疗效更佳，且具有特异性的HER2细胞杀伤能力、理想的药代动力学性质、最小的炎症反应、治疗剂量下的边缘毒性。此外，在HER2异质性及T-DM1耐药性增加的JIMT-1/MDA-MB-231混合异种移植瘤小鼠模型中，双药有效载荷ADC比两种单药组合有更好的治疗效果和生存获益。原因可能是更强的MMAF分子杀死JIMT-1细胞，有助于结合的MMAE分子有效发挥对邻近的MDA-MB-231细胞的旁观者效应。重要的是，这种显著的疗效无法单独通过MMAF ADC和MMAE ADC的1：1组合来实现。双有效载荷 ADC 的增强疗效还在另一种乳腺癌的 hCC1954-TDR 异种移植小鼠模型中得到证实，这种乳腺癌具有低 HER2、肿瘤内异质性和 T-DM1 耐药性。结果凸显了双有效载荷 ADC 克服乳腺癌异质性和耐药性的潜力，表明同时递送两种具有不同药物特性的有效载荷是一种有希望的 ADC 治疗方法，可用于治疗具有异质性和耐药性的其他难治性癌症，这表明同时递送两种具有不同药物特性的有效载荷是一种有前途的方法。 剑桥大学的研究人员利用他们的Synthemer平台设计了一种双有效载荷ADC，它结合了MMAF羟丙基酰胺(AF-HPA)和DNA单烷基化剂(I-BiP)，表现出很强的细胞毒性，可以发挥两种作用机制。然而，虽然多有效载荷ADC药物可以提高疗效，降低耐药性的可能性，但它们治疗引起的副作用也值得考虑。例如，Mersana开发的靶向NaPi2b的新型ADC药物Upifitamab Rilsodotin(UpRi，XMT-1536)通过抗HER2单抗HT-19的切割连接子与MMAF结合(DAR=12)。XMT-1536具有极强的抗肿瘤活性，尤其是对HER2低表达的癌症，但卵巢癌中期I期临床数据显示，XMT-1536可引起严重的治疗相关副作用，发生率高达48% (47/97)，最常见的副作用为胃肠道梗阻(7%)，发热、肺炎、腹痛发生率为5%。虽然Mersana尝试降低剂量，但治疗窗选择范围较窄，前景不容乐观。因此，对于多有效载荷ADC，安全性控制是进行多类有效载荷组装时需要注意的重要问题，关键是找到并解决治疗窗口狭窄的原因，未来的研究也应继续朝着疗效和毒副作用之间的平衡方向发展。 图 23. 双有效载荷药物 ADC 的模式图(红色和绿色形状表示不同的有效载荷)。 3.6.4. PDC 的有效载荷 肽药物偶联物(Peptide drug conjugates, PDC)是一种新型靶向治疗方法，由连接子、归巢肽和细胞毒性有效载荷组成。与ADC药物相比，PDC药物具有分子量小、肿瘤穿透力强、免疫原性低、可采用固相合成大规模合成、生产成本低、药代动力学相对较好、批次产品相对均匀等优势，是继小分子靶向药物、单克隆抗体、ADC之后的新一代靶向抗肿瘤药物。但PDC作为治疗药物的应用也存在一定的局限性，如口服生物利用度低、半衰期短、部分有效载荷切割不完全导致生物活性与原型药物相比明显降低、靶向性可能不如ADC等。PDC的作用机制根据连接子和归巢肽的不同而不同，一种是PDC被内化并在细胞内释放有效载荷，另一种是在肿瘤微环境中PDC被切割，有效载荷被内化并发挥作用(图 24A)。大多数载荷不仅可以杀死靶标高表达的肿瘤细胞，还可以通过肿瘤微环境中的旁观者效应杀死周围靶标低表达或不表达的肿瘤细胞。多肽可影响PDC内化的效率，理想的PDC多肽应具有靶标结合亲和力强、稳定性高、免疫原性低、内化率高、血浆半衰期相对较长等特点。连接子的选择是PDC设计的关键因素之一，连接子需要平衡稳定性和释放效率，可切割的连接子释放效率较高，不可切割的连接子稳定性较高。载荷的毒性和理化性质可直接影响药物杀伤肿瘤的能力，从而影响其疗效，理想的载荷应具有细胞毒性高(通常IC50较低) 、免疫原性低、稳定性高、疏水性适宜、溶解性好等特点。 图 24. PDC 的关键结构和作用机制。 (A) PDC的一般作用机制；(B) 常见 PDC 有效载荷的化学结构。 PDC有效载荷可分为化学药物(图 24B)、蛋白质类药物、多肽类药物等，其中以化学药物和蛋白质类药物较为常见。常用的化学药物有DM1(2)、MMAE(8)、KSP抑制剂(45)、喜树碱(54)、阿霉素(129)、紫杉醇(130)、甲氨蝶呤(131)、柔红霉素(132)、吉西他滨(133)等；蛋白质类药物主要有干扰素和肿瘤坏死因子；放射性同位素也是PDC常用的有效载荷。PDCs用于癌症诊断时，可用正电子发射放射性同位素(氟-18(18F)、铜-64(64Cu)、镓-68(68Ga))标记，产生PET显像，通过与肿瘤细胞上的靶向受体结合，准确定位恶性组织；放射性同位素标记的PDC也可用于治疗。肽受体放射性核素治疗(PRRT)根据肿瘤细胞过表达的受体，对肿瘤细胞进行靶向和组织特异性放射，最常用的放射性同位素是铟-111(111In)、钇-90(90Y)和镥-177(177Lu)。 截至2023年4月，全球获批上市的PDC药物仅有两种，分别是Lutathera®和Pepaxto®。Lutathera®是诺华公司旗下Advanced Accelerator Applications SA开发的靶向生长激素抑制激素受体的PDC，进入细胞后释放放射性同位素177Lu，通过辐射损伤肿瘤细胞，于2017年9月首次获欧洲药品管理局(EMA)批准。在晚期神经内分泌肿瘤患者中，与高剂量长效奥曲肽相比，Lutathera®具有更长的无进展生存期和更高的反应率，于2018年1月26日获FDA批准。Pepaxto®是Oncopeptides公司开发的靶向氨基肽酶的PDC，由DNA烷化剂Melflufen(134)与氨基肽酶靶向肽共价连接。Melflufen 具有高亲脂性，可被骨髓瘤细胞快速吸收。一旦进入细胞，Melflufen 的结合肽立即被氨基肽酶切割，释放出亲水性烷化剂美法仑(Melphalan) (135)，造成肿瘤细胞DNA损伤，导致肿瘤细胞死亡。Pepaxto®于2021年2月首次获得FDA批准，与地塞米松联合使用，用于治疗成人复发或难治性多发性骨髓瘤。但同年10月，Oncopeptides公司宣布将Pepaxto®撤出美国市场，主要原因是验证性OCEAN研究中死亡率增加。2022年8月，Pepaxto®获得EMA批准。目前，全球共有17个PDC药物处于临床开发中，其中3个处于III期，9个处于II期，5个处于I期。PDC 是一种等效抗体-药物偶联物，克服了 ADC 的部分局限性，具有许多独特的优势。虽然目前上市的 PDC 药物较少，但曾出现过因严重安全性问题而退市的案例。但随着相关技术问题的解决和配套技术的突破，相信 PDC 药物也将成为未来十年拥挤赛道上研究和投资的热点。 4.结论 ADC药物开发前景广阔，因为它整合了特异性抗体以选择性靶向肿瘤细胞，结合了多种强效的细胞毒性有效载荷，并采用多样化的连接子技术来产生有效的癌症治疗药物。从技术角度来看，ADC药物至今已经历三代变革，在抗体、药物载体、连接子等方面均有突破，尤其是在有效载荷的使用上。 虽然新一代ADC载荷的特异性和细胞毒性比早期表现出了明显提升的特性，但目前的载荷仍然存在一些局限性： 首先，它们普遍对实体瘤的通透性和毒性有限，限制了它们在实体瘤中的应用。 其次，部分肿瘤对目前的ADC药物不敏感。 第三，载荷药代动力学的复杂性、肿瘤靶向性和释放不充分都会影响ADC药物的疗效。 第四，和其他抗肿瘤药物一样，ADC药物也会出现耐药性。 最后，早期的载荷选择往往是有毒但有效的药物，但它们较高的毒性限制了载荷的系统应用。 虽然抗体-药物偶联物在治疗中显示出有效性，与高毒性载荷的联用并不一定是极好的，因此其他类型的载荷如RNA抑制剂、免疫激动剂、促凋亡的Bcl-xL抑制剂等正在被开发。尤其是随着免疫检查点阻断疗法被FDA批准，肿瘤免疫治疗时代开始了。免疫激动剂ADC也被开发出来，其可以利用抗体将免疫激动剂运送到肿瘤微环境并局部释放，缓解免疫激动剂全身给药带来的严重毒性问题。免疫激动剂(如Toll样受体、STING激动剂等)作为新型载荷在ADC中也越来越受欢迎，免疫调节ADC有望进一步增强免疫检查点阻断疗法的抗肿瘤免疫应答。虽然免疫ADC尚处于发展初期，尚未取得满意的临床效果，但免疫调节ADC有可能大大拓宽ADC的治疗窗口，提高其抗肿瘤活性，并具有理想的安全性和有效性。相信通过免疫调节载荷修饰设计靶向肿瘤微环境的ADC仍是未来研究领域的热点，尤其是使用对细胞不直接有毒性的载荷(例如可以引导免疫系统攻击癌细胞的载荷)。此外，使用PROTAC分子作为ADC载荷，可以充分结合PROTAC的催化特性与ADC的组织特异性优势，并克服了传统靶向降解剂和ADC的局限性(如耐药性、毒副作用等)。鉴于其良好的效果，PROTAC-ADC是未来ADC药物开发的重要方向。抗体结合载荷还包括来自植物的蛋白衍生酶(例如皂苷、蓖麻毒素A链)或细菌毒素(PE、假单胞菌外毒素、DT、白喉毒素)，通过催化不可逆地抑制蛋白质合成来诱导细胞死亡。新型载荷类别还包括寡核苷酸、siRNA、蛋白质等。为了解决传统ADC载荷的不足，除了开发和修改传统和新型的潜在载荷外，ADC设计也出现了许多新策略。例如，通过将同一抗体与具有不相关机制的不同载荷相结合来设计ADC药物，可以通过最小化耐药性的可能性并同时针对不同的靶点实现协同效应，这为治疗具有异质性和耐药性的其他难治性癌症开辟了新途径，这对于实体瘤尤为重要。此外，在设计混合载荷时，应强调疗效和毒性之间的平衡。此外，通过使用抗体介导的靶向递送，由光激活化学物质作为载荷与特异性单克隆抗体组成的ADC可以实现较高的肿瘤特异性并能利用激光激活的生物物理机制精准诱导癌细胞快速死亡，避免对周围正常组织的伤害，实现精准治疗的要求，也是未来值得探索和期待的发展方向。 ADC虽然发展至今，但其可用的载荷骨架种类并未增加，大部分细胞毒性药物均为前核心骨架的衍生物，目前仅有有限数量的高细胞毒性天然化合物、衍生物或合成类似物有潜力作为ADC的载荷进入临床。虽然新颖的ADC载荷和指导ADC构建的新策略不断涌现，但这些还处于发展的初级阶段，未来的方向还需要通过更多的实验来验证。因此，在下一代ADC中，需要开发结构新颖的高效载荷(例如通过筛选天然产物库、化学合成、天然产物直接衍生化等方法提高活性和耐受性，有望获得结构简单、活性高、作用机制特殊的NAMPT抑制剂(具有多种作用机制、更高疗效和更少副作用的NAMPT抑制剂)。但新的骨架化合物的发现具有挑战性，需要在天然产物鉴定、高通量筛选或基于结构的药物设计等方面进行大量工作。相比之下，对已经获批或研究充分的有效载荷进行结构修改可以更快地识别新型有效载荷。在获得母核化合物后，应充分利用构效关系和晶体学技术，探索靶标与母核化合物的结合方式以及化合物的有效作用位点和有效功能团，才能高效地进行后续母核化合物的优化改造。在修饰有效载荷分子时，调整其理化性质，特别是极性，可以解决ADC制备和应用中的一些难题。连接过多的疏水性有效载荷分子会改变抗体的构象稳定性，增加其聚集沉淀的倾向，最终影响其最大DAR、血浆稳定性、旁观者效应等。疏水性有效载荷分子很容易穿透细胞膜，通过旁观者效应杀死周围的抗原阴性肿瘤细胞，而亲水性有效载荷分子从癌细胞中扩散出来的速度较慢。此外，大部分ADC面临的一大问题是毒副作用较大，其中载荷引起的毒副作用主要体现在对快速增殖的健康细胞的损伤，如淋巴细胞减少、胃肠道反应等。因此可以选择分子量小、组织穿透性好、半衰期短的载荷，释放后可以在靶位快速富集，快速发挥杀伤癌细胞的功能，同时在血液中药物分子可以被快速清除，有利于降低全身毒副作用。也可以对靶点的重要位点进行突变，进而修饰筛选出耐受性更好的化合物。 综上所述，新型ADC有效载荷与传统有效载荷存在一些区别： 1)传统ADC有效载荷多选择药理作用强但毒副作用也较大的小分子，例如PBD，而新型ADC有效载荷则倾向于选择药理作用中等、毒副作用较小的小分子，例如Dxd。 2)传统ADC有效载荷主要以微管抑制剂和DNA损伤剂为主，而新型ADC有效载荷相比传统有效载荷靶点类型更加丰富，选择更多，作用机制也不同，例如使用免疫刺激剂作为ADC有效载荷。 3)传统ADC小分子有效载荷结构一般复杂，合成难度大，新型ADC有效载荷倾向于选择结构简单、分子量较小的小分子，大大降低了合成难度，拓展了ADC有效载荷的应用市场。 4)传统ADC有效载荷一般采用单一类型的小分子化合物通过连接子直接连接抗体，而新型ADC可以组合不同类型的有效载荷，达到1+1>2的效果。除传统小分子化合物外，新型有效载荷还选取PROTAC、光活化分子等新型类型作为有效有效载荷。 虽然ADC药物发展至今，疗效也有了很大的提高，但仍然存在耐药性、不良反应、血液稳定性不够等问题亟待解决。有效载荷在ADC药物的疗效中占有重要的地位，因此结合相关的晶体结构和构效关系研究，对ADC小分子有效载荷及其未来趋势进行综述，旨在为ADC药物有效载荷的未来发展方向以及后续的优化改造提供更多新的参考，从而构建更多的ADC药物，提高其治疗效果，克服耐药性，减少不良反应，促进ADC药物研究的发展。 原文链接 Antibody–drug conjugates: Recent advances in payloads. Acta Pharm Sin B. 2023, 13(10): 4025-4059. doi: 10.1016/j.apsb.2023.06.015 免责声明：公众号推文基于已公开的资料信息撰写，用于传递最新热点资讯，在任何情况下，本文中信息或所表述意见均不构成对任何人的建议。如因版权等存在疑问，请于本文刊发30日内联系本公众号删除，更多精彩内容欢迎关注和分享公众号。 END 免责声明：本文仅作知识交流与分享及科普目的，不涉及商业宣传，不作为相关医疗指导或用药建议。文章如有侵权请联系删除。 OTC2024类器官前沿应用与3D细胞培养论坛圆满落幕，点击图片可查看会后报告，咨询OTC2025类器官论坛请联系：王晨 180 1628 8769

摘要：抗体-药物偶联物（ADCs）结合了单克隆抗体的精确靶向优势和药物载荷的有效杀伤能力，展现出巨大的临床治疗价值。ADCs的载荷在决定ADC药物的疗效方面起着关键作用，因此在该领域受到了极大的关注。理想的ADC载荷应具有足够的毒性、低免疫原性、高稳定性和可修饰的官能团。常见的ADC载荷包括微管抑制剂和DNA损伤剂，其中微管抑制剂在临床开发中的ADC药物中占比超过一半。然而，由于传统ADC载荷的临床局限性，如疗效不足和获得性耐药的发展，正在开发具有多样化靶点和减少副作用的新型高效载荷。本文综述了传统和新型ADC载荷的最新研究进展，主要关注结构-活性关系研究、共晶结构和设计策略，并进一步讨论了ADC载荷未来的研究方向。本综述还旨在为开发具有高疗效、低毒性、足够稳定性和克服药物抗性能力的新型ADC载荷提供有价值的参考和未来方向。 1.引言 尽管免疫疗法和细胞疗法近年来取得了进展，化疗仍然是癌症治疗中最常用的策略。然而，由于其较低的治疗指数，传统的化疗药物虽然对癌细胞表现出强烈的细胞毒性，但往往对健康组织也表现出毒性作用，这显著限制了它们的临床效果。因此，开发具有高效率和有限系统毒性的药物输送系统，用于癌症治疗可能是解决这一问题的有效策略。因此，一个新概念，抗体-药物偶联物（ADCs）被构想并发展起来（图1）。通常，ADC由针对肿瘤特异性抗原或相关抗原的抗体和通过适当连接子连接的多个载荷组成。ADC结合了单克隆抗体（mAb）的高靶向能力和肿瘤组织中载荷的高效性。近年来，ADC已成为肿瘤学中发展最快的药物类别之一，因为它们的副作用更低，治疗应用更广泛，治疗指数更高。 图 1 ADCs的关键结构和作用机制。(A) ADCs的一般作用机制；(B) 作为ADC载荷的DNA抑制剂的作用机制；(C) 作为ADC载荷的剪接抑制剂的作用机制；(D) 作为ADC载荷的微管抑制剂的作用机制；(E) 作为ADC载荷的PROTAC分子的作用机制；(F) 作为ADC载荷的Bcl-xL抑制剂和蛋白酶体抑制剂的作用机制；(G) 作为ADC载荷的NAMPT抑制剂的作用机制；(H) NIR-PIT ADC的作用机制。 ADC药物的概念最早由德国诺贝尔奖获得者保罗·埃尔利希在1903年提出。但直到1975年，杂交瘤技术的发展开始用于生产单克隆抗体，ADC药物的开发时代才真正开始。ADC药物经历了三代创新，技术日益成熟（图2）。在第一代ADC药物中，传统化疗药物如甲氨蝶呤、长春新碱和多柔比星被用作细胞毒性载荷。然而，由于它们对癌细胞的细胞毒性不足，缺乏肿瘤选择性，以及在目标细胞中的积累较低，这些第一代ADCs的疗效甚至比它们的原始载荷更差，导致它们在临床上失败。随后，比第一代ADCs中使用的传统化疗药物强100至1000倍的新型高细胞毒性化合物引起了强烈兴趣。它们通常在作为单一药物用于杀死肿瘤时具有难以承受的副作用。例如，微管抑制剂美登素对肿瘤细胞表现出极其强大的抗增殖活性。然而，其毒性副作用，如神经毒性和胃肠道反应，也非常严重。因此，它没有作为单一药物被批准用于癌症治疗。有趣的是，这些高细胞毒性化合物是ADCs的理想载荷。由α-和β-微管蛋白组成的微管是细胞骨架的主要成分。微管抑制剂可以通过破坏它们的细胞骨架结构和干扰有丝分裂来杀死肿瘤细胞。因此，与正常细胞相比，分裂更快的肿瘤细胞对微管抑制剂更敏感。大多数第二代ADCs使用了显著更强的微管抑制剂作为载荷。不幸的是，虽然微管抑制剂对活跃分裂的肿瘤细胞非常有效，但对静止的癌细胞效果较差。为了可能克服这一限制，能够针对整个细胞周期的DNA损伤剂被选为大多数第三代ADCs的细胞毒性载荷。DNA损伤剂可以通过双链断裂、烷基化、嵌合体和交联来破坏DNA结构，杀死肿瘤细胞。代表性的DNA损伤载荷包括烯二炔、拓扑异构酶I抑制剂和吡咯苯并二氮杂环（PBD）。目前，已有15种ADC药物获批，大量ADC药物正在进行临床试验（表1）。它们的载荷主要是天然来源，微管抑制剂占一半以上。尽管ADC经历了三代，但目前的载荷仍然存在临床局限性，如严重的副作用和药物抗性的发展。仍然有强烈的未满足的医疗需求，需要开发更强效的ADC载荷，理想情况下具有更好的治疗指数。因此，包括RNA抑制剂、Bcl-xL抑制剂、NAMPT抑制剂和卡马霉素在内的额外新型ADC载荷正在设计中。此外，使用免疫调节剂作为载荷的免疫ADCs因其在肿瘤免疫疗法中的关键作用而受到显著关注。不是使用单一简单分子作为它们的载荷，而是出现了几种使用更复杂载荷设计ADCs的新策略。例如，使用PROTACs或光敏剂作为ADC载荷，并且开发了将具有不同靶点的几种载荷结合到单一抗体中的方法。这些开创性策略可以引领下一代ADCs。 图 2 ADCs载荷开发中的里程碑。 表 1 FDA批准的ADC药物（截至2023年3月）。 基于ADC载荷的重要性和主要特征，本综述从它们的晶体结构和ADC载荷与其靶标之间的结构-活性关系（SAR）的角度，总结了各种传统ADC载荷的发现和主要结构修饰。此外，本综述还将总结基于新药靶和创新设计策略的各种新型ADC载荷。最后，鉴于当前载荷的限制，讨论了开发未来ADC载荷的主要研究方向，希望为未来具有理想特性的新型ADC载荷的设计提供参考。 2.ADC载荷的重要性和特征  ADC药物进入血液循环并与肿瘤细胞表面的靶抗原受体结合后，新形成的ADC-抗原复合物将在内化后被溶酶体降解，释放载荷并诱导肿瘤细胞死亡（图1）。因此，载荷是ADC设计的重要组成部分。载荷的活性和物理化学性质直接影响ADC药物的抗肿瘤效果。载荷的作用机制是决定ADC性能的重要因素（例如，不良反应）。此外，ADC载荷的某些其他特征，如细胞毒性、免疫原性、制备和循环过程中的稳定性、水溶性和可修饰性也很重要。 理想载荷应具备以下特性：首先，它们应具有足够高的细胞毒性。肿瘤特异性抗原非常有限，特别是在实体瘤中。此外，由于单克隆抗体的渗透性和内化活性较低，通过抗体-抗原结合进入肿瘤细胞的ADC载荷数量非常少。第二，ADC载荷应具有足够低的免疫原性。蛋白质药物有诱发免疫原性的风险，这可能对ADC的疗效产生负面影响，甚至导致接受治疗的患者死亡。尽管ADC目前使用人源或人源化单克隆抗体和小分子载荷，它们仍可能比治疗性单克隆抗体增加免疫原性的风险。为解决这个问题，一些高毒性载荷从植物、动物或微生物中提取，确保载荷在人体的免疫原性足够小，可以忽略不计。使用较小分子载荷也是减少免疫原性风险的一种方式。第三，ADC载荷应具有高稳定性。由于抗体在循环中的半衰期较长，ADC应保持在血液循环中稳定，避免释放或分解。载荷还应在细胞质和溶酶体中保持稳定，在低pH条件下没有显著降解。第四，ADC载荷应具有可修饰的官能团，而不影响其效力。载荷必须具有可修饰的官能团或可与单克隆抗体结合的位点。修饰位点必须仔细选择，以保持原始药物的效力。更重要的是，在使用不可切割的连接子时，载荷在抗体降解后必须保持其效力。第五，ADC载荷应具有旁观者杀伤效应。一些ADC药物被内化并释放小的、未带电的、可渗透的膜脂溶性分子，这些分子通过细胞膜扩散并杀死表达相邻抗原的肿瘤细胞。这个过程被称为“旁观者杀伤效应”，对抗原表达不均匀的肿瘤细胞具有重要意义。总的来说，促进癌细胞旁观者杀伤效应的载荷更适合于目标抗原表达低或异质的癌症。为了构建具有旁观者效应的ADC药物，它们的结构必须满足连接子可以被切割，载荷可以渗透细胞膜的条件。具有良好膜穿透性的脂溶性分子具有较强的旁观者杀伤效应，但这也可能使药物容易被健康组织吸收，导致严重的系统毒性。因此，两者之间的平衡对ADC的开发非常重要。第六，ADC载荷应具有适当的水溶性。载荷必须适当水溶，以便于与抗体结合，并确保在生理条件下结合物的溶解度足够。当过量的疏水载荷结合到抗体上时，产生的ADC倾向于聚集并变得不稳定。此外，载荷的亲水性影响原始ADC或其代谢物的细胞膜渗透性，从而影响其旁观者杀伤活性。最后，载荷的目标应该是细胞内的，因为大多数ADC需要进入肿瘤细胞才能释放它们的载荷。许多来自微生物、植物和动物的强大载荷具有膜靶向作用，例如主要通过阻断离子通道或破坏凝血来工作的神经元上的载荷，不适合用作ADC载荷。在上述ADC载荷的七个特性中，高效力、低免疫原性、药物制备和血液循环中的稳定性以及可修饰的官能团是在选择ADC载荷时必须考虑的重要因素。其他特性，包括适当的水溶性或旁观者杀伤效应，虽然通常不太重要，但对ADC的有效性仍有显著影响。基于这些特性，我们总结了现有ADC载荷的有效性，包括针对微管/DNA/RNA的载荷、免疫ADC载荷、新型潜在ADC载荷，以及在各种新策略指导下用于ADC药物设计的载荷。通过分析各种载荷与蛋白质之间的结合模式和相关的SAR，我们希望阐明结构如何决定它们的生物活性和特性，并为未来更多新型ADC载荷的产生提供有价值的参考。 3.ADC的多种载荷  3.1.靶向微管的载荷  微管是真核细胞细胞骨架的重要组成部分。它们是由α,β微管蛋白异二聚体沿圆柱轴平行排列形成的动态极性聚合物。微管在维持细胞形态、信号传导、细胞器运输、细胞运动、细胞分裂和有丝分裂等细胞功能中发挥重要作用，是肿瘤治疗的重要靶点。微管蛋白是微管的组成成分，微管蛋白抑制剂通过与微管蛋白结合干扰微管的动态组装，阻止细胞周期的G2/M期，最终导致细胞凋亡。由于微管蛋白抑制剂破坏有丝分裂纺锤体并发挥抗有丝分裂作用，它们对快速分裂的癌细胞比大多数生长缓慢的正常细胞具有更强的毒性，使它们成为流行的ADC载荷。其中，微管聚合增强剂，如auristatin化合物MMAE和MMAF，作用于α,β微管蛋白二聚体的β亚基，使微管的生长不受调控。相反，微管聚合抑制剂，如美登素化合物DM1和DM4，通过抑制成熟微管的形成来阻断微管蛋白二聚体的聚合。这些微管抑制剂是许多临床ADC药物中使用的最常见的第二代载荷，并且已被多个团队作为先导化合物进行结构修饰，以进一步提高这些ADC载荷的物理化学性质，使它们更适合ADC药物的开发。 3.1.1.美登素类 美登素（1）（图3A）最初是从非洲灌木Maytenus ovatus的树皮中分离出来的，是一类结合微管蛋白并抑制微管组装的苯并桑斯内酯类抗生素。在体外细胞活性测定中，其IC50值达到皮摩尔范围，显示出其强大的抑制肿瘤细胞增殖的能力。它在其他实验中也显示出良好的稳定性和溶解性。然而，由于其治疗窗口狭窄和由于缺乏选择性而导致的神经毒性和胃肠道反应等毒性副作用，它已被临床禁止直接用于人类治疗。然而，美登素的高细胞毒性完全符合ADC载荷的要求，使美登素成为ADC载荷的强大候选者。由于美登素没有反应性官能团，它不能与抗体结合。对美登素类的结构-活性研究确定了C3 N-乙酰基-N-甲基-L-丙氨酰酯侧链、C4eC5环氧基、C9醇基功能以及共轭的C11和C13双键的位置是活性的关键要素。这使得苯环和N-乙酰基团成为化学可修饰的实体。将美登素中N-乙酰基团替换为3-甲硫代丙酰基团，可以得到含有二硫键的美登素衍生物DM1（2）（图3A）。通过在DM1二硫键周围添加两个甲基，可以得到DM4（3）。衍生的DM1和DM4，带有甲硫代丙酰基团，可以通过二硫键与连接子结合。DM1和DM4是临床实际应用中使用最广泛的两种美登素类ADC载荷，例如Trastuzumab-SMCC-DM1，是首个基于美登素衍生物的ADC药物，已获准上市（ClinicalTrials.gov标识符：NCT04158947, NCT01983501, NCT02562378等）。目前，20%的在开发ADC使用美登素衍生物作为载荷。 图 3 迈坦辛类化合物的设计和SAR分析。(A) 迈坦辛类化合物1e5的化学结构；(B) 迈坦辛（1）与微管的结合模式（PDB代码4TV8）；(C) 化合物5与微管的结合模式（PDB代码5SBA）。 2014年，Michel O. Steinmetz团队35研究了美登素及其与微管的作用，并发现在β-微管蛋白上，美登素类有三个关键的与微管蛋白的相互作用点（图3B），包括美登素1位的羰基与β-微管蛋白的Asn102和Lys105残基之间的氢键；1位的羟基/羰基氧与β-微管蛋白的Val181之间的氢键；以及配体6a位的甲基与由Asn101、Asn102、Val182、Phe404和Tyr408残基形成的口袋之间的疏水相互作用。这些保守的微管相互作用点构成了一个共同的药效团。美登素是最常用的ADC载荷，但其合成、中间非对映异构体产物的分离和纯化困难。同时，它是多药耐药蛋白1（MDR1）的底物，这是一种降低某些抗体-美登素类偶联物效力的转运蛋白。因此，Jinliang Yang团队36探索了L-DM1-SMe（C3位甲基-L构型的DM1）、D-DM1-SMe（C3位甲基-D构型的DM1）和β-微管蛋白的晶体结构，并发现L-DM1-SMe酯基的羰基氧原子和C3侧链尾部的硫甲基与9位的羟基和苯环分别形成了强的分子内相互作用，这有助于提高结合亲和力。D-DM1-SMe的C3侧链向相反方向摆动，无法形成分子内相互作用，解释了C3位甲基的构性如何影响抗癌活性的详细机制。该研究为设计下一代具有新颖骨架的美登素结合位点抑制剂提供了基础，以改进合成策略并减少MDR1介导的抗性。 美登素醇（4）（图3A）最初是通过化学方法从Putterlickia verrucose提取物的C3位羟基上去除酰基得到的。它对微管蛋白聚合的抑制活性比美登素弱，暗示美登素和美登素类化合物C3位的酯基在生物活性和细胞渗透性中发挥重要作用。酯基的羰基氧原子与9位的羟基形成强的分子内相互作用，固定了生物活性构象。美登素醇被视为有价值的先导化合物。通过C3位羟基的酰化，可以容易地准备各种不同的天然和半合成美登素类化合物。Daniele Passarella团队通过美登素醇（4）的酰化获得了一种新的美登素类化合物5，它具有强大的抑制微管组装能力，在A549细胞上的IC50为0.07e1.2 nmol/L。晶体结构（图3C）显示，美登素类的结合对微管的整体构象没有影响，化合物在C1eO和Val181的主链氮原子之间以及C24eO和Lys105和Asn102的侧链之间形成氢键。此外，化合物5通过其C9eOH基团与Gly100的主链羰基建立了氢键。在研究的美登素类中，所有在C3位引入的修饰都指向溶剂，并且不干扰美登素位点的紧密环境。因此，酰化增强了美登素的全部生物活性，C3位引入的修饰不干扰化合物与微管蛋白二聚体的结合状态、亲和力或有效性。Regeneron团队研究了N-甲基丙氨酸中氮取代的影响，通过改变环上侧链的长度和通过伯胺和仲胺连接的连接体。使用化合物6作为载荷获得了靶向EGFRvIII的ADC，对HEK293、U251和MMT细胞系的IC50为0.3e0.4 nmol/L，并在U251/EGFRvIII和MMT/EGFRvIII小鼠模型中实现了肿瘤消退。 3.1.2. Auristatin Dolastatin 10（7），1987年从Dolabella auricularia中分离出来，对多种癌细胞具有强烈的抗增殖活性，并且可以强烈抑制微管组装，导致细胞周期停滞和凋亡，使其成为一种有前景的抗癌药物（图4-1A）。它的水溶性合成类似物被称为auristatin。其中，最广泛使用的是单甲基auristatin E（MMAE）（8）和单甲基auristatin F（MMAF）（9）。它们每个都包含一个功能手柄，能够进行后续的偶联，进一步提高体内效力。MMAE由四种氨基酸组成：单甲基缬氨酸（MeVal）、缬氨酸（Val）、dolasoleuine（Dil）和dolaproine（Dap），以及羧基末端胺norephedrine。在MMAF中，单甲基缬氨酸的C末端被苯丙氨酸取代，其细胞活性显著降低。Andrea E. Prota团队发现MMAF与游离微管蛋白的结合亲和力比MMAE增加了近5倍，主要是由于β1微管蛋白亚基上的关键Arg278残基，通过有序水分子对MMAF暴露。他们还表明，详细的结构相互作用将长春花域扩展到肽位点，不仅通过抑制核苷酸交换在功能上不同，而且还表明肽位点抗有丝分裂药物如何通过长春花生物碱获得增强的效力。分析可能为为什么MMAF的细胞活性降低提供结构解释。 Jinliang Yang团队通过MMAE与微管蛋白在长春花域的结合域的结构研究，定义了一个重要的药效团。药效团由两个疏水区域I和II和两个氢键区域组成，与Asp179b和Asn329a相互作用，为合理设计具有高特异性、强亲和力和高效率的ADC载荷奠定了基础。在2020年，Christopher J. O'Donnell团队设计并合成了一种N末端修饰的auristatin类似物10（IC50 Z 0.2 nmol/L），并首次通过具有更高分辨率的auristatin晶体结构对其结合模式进行了详细研究。晶体结构显示，化合物10的N末端二甲基在受体口袋中很好地契合，并不会影响分子的整体结合亲和力（图4-1B）。此外，关键的极性相互作用被识别出来，包括末端质子化氨基与位于T5环上的Asp b197和Phe a351氨基酸羰基之间的氢键网络，N-2缬氨酸与Asn a329之间的双焦相互作用，以及Tyr b224的主链酰胺与化合物10中Dap和Doe的末端羰基之间的关键氢键相互作用。后一个氢键网络将Tyr b224的芳香环排列在与GDP的核苷碱基发生π堆叠相互作用，防止其从β-微管蛋白解离。GDP的捕获被认为是auristatins发挥其干扰微管效应的关键机制。此外，所有分析的类似物在其功能相关的微管蛋白结合状态下的Val-Dil酰胺键都具有顺式构型，而在溶液中这个键完全是反式构型。这揭示了auristatin的首选结合模式，并为基于结构的药物设计提供了有价值的工具。 图 4-1 奥瑞司他汀类似物的设计和SAR分析。(A) 奥瑞司他汀类似物7e10, 21e24的化学结构；(B) 化合物10与微管复合物的结合模式（PDB代码4X1I）。 大多数auristatin类似物的研究都集中在C末端或N末端的修饰上。在C末端修饰中，Doronina等人描述了MMAF类似物11和12，其中苯丙氨酸的羧酸被四唑和膦酸盐替代。化合物11在H3396细胞上的IC50为6.0 nmol/L，化合物12在HCT116细胞上的IC50为0.09 nmol/L。11和12（游离酸型）都已经被用于通过VC-linker与针对CD70的H1F6抗体结合形成活性ADC，其效力与MMAF作为载荷相似（IC50：4e10 nmol/L）（图4-2B）。Pettit等人设计了C末端芳香磷酸和喹啉修饰的auristatin类似物13e15，它们在McF-7细胞上的IC50分别为0.81、0.19和6.35 nmol/L。其中，13具有极佳的水溶性（>236 mg/mL），两种喹啉类似物14和15显示出良好的活性，14的效力显著更高（图4-2A）。Lerchen等人进一步说明了在auristatin的C末端结合域允许的修饰程度。他们通过在C末端添加取代基获得了有效的auristatin类似物16e18，它们在768O细胞上的IC50分别为0.5、1.2和1.2 nmol/L（图4-2B）。对于N末端修饰，Satomaa等人证明了丙基醇和叠氮衍生物19和20尽管存在亲水侧链，但仍然保持了相当的细胞效力，分别为SKOV3细胞上的19和20的IC50为1.0 nmol/L和<1.0 nmol/L。它们的叠氮和炔烃可以用于后续的环化反应，形成更复杂的亲水"糖交联剂"，使其能够与各种抗体（赖氨酸、半胱氨酸、糖链和转谷氨酰胺酶偶联物）结合。基于此，制备了曲妥珠单抗和EGFR1 ADC，在体内表现良好，效力为1.5e10 mg/kg（DAR Z 3）（图4-2A）；Doronina通过将对氨基苯甲酸替代N末端氨基酸获得了auristatin类似物21，并在Karpas 299细胞上显示了0.12 nmol/L的IC50。载荷21的ADC在Karpas 299人类ALCL异种移植模型中以1 mg/kg的剂量减少了肿瘤体积。然而，这种ADC不如相关的VC-MMAE ADC有效（图4-1A）；在2020年，Svetlana O. Doronina团队设计了一系列烷基MMAF类似物，以探讨开发具有可调节膜渗透性、活性和抗泵出能力的auristatins的可能性。MMAF在N末端容忍相当大的取代基，提供了一种方便的方式来调节游离药物的疏水性，而不会显著影响细胞活性。他们选择了从C1到C12的支链和非支链脂肪族基团作为取代基，并生成了MMAF N末端烷基衍生物22。这一系列衍生物的细胞毒性随着烷基链长度的增加而增加，取代基的空间体积或疏水性的增加都没有导致活性降低。这些新型类似物结合了MMAE和MMAF的特点：高效、旁观者活性和克服MDR。这些发现进一步扩展了Auristatins作为ADC载荷的作用。Agensys最近将叠氮基团引入P2和P4亚基，产生了一种在MOLM13细胞上IC50为0.057 nmol/L的化合物23。由于P2或P4位点作为ADC药物的偶联位点，这为下一代auristatin衍生物提供了新的方向。Luke R. Odell教授团队开发了azastatin（24），一种auristatin衍生物，其细胞毒性（IC50：0.13e3.0 nmol/L）比MMAE（IC50：0.47e6.5 nmol/L）更高，表明N末端二甲胺基团增加了化合物的效力。此外，该衍生物包含一个中央胺侧链抗体结合位点，适合ADC开发。 图 4-2 奥瑞司他汀类似物11e20的化学结构。 3.1.3. Eribulin 聚醚大环内酯的天然产物Halichondrin B（25），最初从Halichondraria Okadai等人中分离出来[56]，已被证明具有良好的抗增殖活性[55]（图5A）。其结构简化的新型非紫杉醇全合成类似物eribulin mesylate（26），是一种具有抗有丝分裂效应的微管动力学抑制剂，已于2010年获批用于治疗局部晚期和转移性乳腺癌（MBC）患者。Michel O. Steinmetz团队通过晶体结构发现，eribulin与微管蛋白的结合位点由β-微管蛋白的螺旋H1、H6、H7、H6eH7环、S3eH3（T3）和S5eH5（T5）的疏水和极性残基形成（图5B）。此外，eribulin的“笼”结构与鸟嘌呤核苷酸的核糖部分接触。在微管蛋白-eribulin复合物中，配体环绕在Tyr224的侧链周围。当eribulin结合在微管中发现的两个纵向排列的微管蛋白二聚体的背景下时，来自邻近微管蛋白二聚体的α-微管蛋白的链S9、螺旋H10和环T7将与eribulin分子的主体发生碰撞。这些结果表明，eribulin可以在高浓度下将微管蛋白二聚体隔离成组装无能的微管蛋白-eribulin复合物，干扰微管末端原始线的生长，在低浓度下可以破坏微管蛋白或抑制微管蛋白动力学。 Eribulin在肿瘤生物学中的强烈抗有丝分裂活性使其作为ADC载荷具有前景。Earl F. Albone团队设计了一种以Eribulin为载荷的ADC，通过向C-35主要氨基添加连接子，对卵巢癌细胞IGBOV1有强烈效果（IC50为20 pmol/L）。在非小细胞肺癌细胞NCI-H2110异种移植模型中，5 mg/kg ADC剂量可诱导肿瘤完全消除，表明微管靶向剂eribulin可以用作ADC载荷。此外，早在2011年，Sridhar Narayan实验室合成并评估了几种具有中性C32侧链的第二代eribulin类似物。这些侧链修饰的eribulin类似物在U-251和SF-295细胞上的效果显著优于eribulin。通过在C32侧链引入低碱性胺或增加eribulin的亲脂活性，得到的化合物27对体外和体内的多种异种移植肿瘤具有抑制作用，具有口服生物利用价值。它可以增加脑脊液中的暴露量，可能为治疗脑瘤等更广泛的人类癌症提供药物候选（图5B）。 图 5 艾瑞布林类似物的设计和SAR分析。(A) 艾瑞布林类似物25e27的化学结构；(B) 艾瑞布林26与微管复合物的结合模式（PDB代码5JH7）。 3.1.4. Tubulysins Tubulysins（28）是Hofle等人从粘液菌培养液中分离出来的天然抗有丝分裂肽（图6A），是一种由N-甲基-D-哌啶酸（Mep）、Lisoleuine（L-Ile）、Tubuvaline（Tuv）和Tububealanine（Tup）或微管溶血素Tut（Tut）组成的线性四肽。它可以抑制微管蛋白的聚合并诱导细胞凋亡，对包括多药耐药KB-V1细胞（IC50 Z 0.08 nmol/L）在内的癌细胞具有强烈的抗增殖活性，是开发抗癌药物的良好前景。2018年，K. C. Nicolaou团队合成了高效力的tubulysins类似物29和30，它们对HEK293T细胞的IC50分别为6和3 pmol/L。2021年，该团队对化合物30与T2R-TTL进行了晶体学研究，发现化合物30与Vinca域结合，在b-和a-微管蛋白分子界面附近的核苷酸结合位点处形成一个延长的构象，其中酚羰胺部分定位在a2-微管蛋白亚基的氨基酸残基L248的疏水袋中（图6B）。根据结合模式，他们设计了一个在血浆中稳定性良好且对NCI-N87小鼠肿瘤模型有显著效果的ADC，这在靶向癌症治疗研究中具有潜力。 对tubulysin的SAR研究表明了tubulysin关键残基修饰的可行性：在N末端，Mep残基的6元环可以有效地被5元和非环状残基N-甲基-D-脯氨酸、N-甲基肌氨酸和N,N-二甲基-D-丙氨酸替代，在大多数情况下活性损失很小；Tuv残基的C11-乙酰修饰对活性有显著影响：乙酰水解成二级醇会导致活性丧失高达1000倍，尽管它可以容忍广泛的改变，特别是对N,O-缩醛的改变；相比之下，Tup残基是通常被靶向的剂量偶联位点，可以被修饰；C13上的取代基不容忍变化，将异丙基团替换为环己基或芳基（苯基和对甲氧基苯基）会导致活性丧失；羧酸末端是常见的偶联位点，因此经常被修饰。为了克服由tubulysin C-11乙酰化引起的不稳定性，Patrick J. Burke设计了一个C-11烷氧基类似物31，其显示出与tubulysin M相似的生物活性，并显著提高了血浆稳定性（图6A）。Chakrapani Subramanyam鉴定了一种含有α-甲基叔胺的强效tubulysin类似物32。所得ADC在体内外均显示出良好的效力。Heng Cheng准备了一种含有氨基甲酸酯的tubulysin类似物33，其氨基甲酸酯基团在体内稳定。其在OVCAR3和N87细胞上的IC50分别为0.20和0.23 nmol/L，由化合物33和抗间皮细胞抗体偶联形成的ADC在0.01 mmol/L时可显著延迟肿瘤生长。含有非水解性N-取代基的Tuv（Tub）的衍生物34，在HT-29细胞上的IC50 < 0.28 nmol/L，也具有作为ADC载荷的潜力。 图 6 管芽菌素类似物的设计和SAR分析。(A) 管芽菌素类似物28e34的化学结构；(B) 化合物30与微管复合物的结合模式（PDB代码6Y4N）。 3.1.5. Cryptophycins Cryptophycin是一种由蓝藻产生的具有16个成员环的天然大环多肽。它包含两种羟酸（A和D单元）和两种氨基酸（B和C单元）。Cryptophycin在有丝分裂期间不可逆地抑制β-微管蛋白聚合，这可能导致G2/M阶段的细胞周期阻断并激活凋亡途径，从而在体外产生皮摩尔级的抗增殖能力。第一个合成和评估的cryptophycin类似物，cryptophycin-1（35），对KB细胞的IC50为4.58 pmol/L，对LoVo细胞为7.63 pmol/L（图7A）。然而，由于大环内酯在血液循环中的不稳定性，其体内抗肿瘤活性并不显著。经过进一步的结构修饰，得到了cryptophycin-52（36），它在C单元β-丙氨酸的α位上比cryptophycin-1多一个甲基，增加了空间位阻并显著提高了体内稳定性。非常低浓度的cryptophycin-52（36）在有丝分裂期间抑制细胞增殖（IC50 Z 11 pmol/L），微管长度或质量没有显著变化。Cryptophycin-52（36）与微管蛋白的结合非常紧密，cryptophycin-52（36）-微管蛋白复合物与微管的亲和力非常高（Kd Z 47 nmol/L）。尽管cryptophycin-52有效，但由于剂量依赖性毒性，在II期被终止。使用这种化合物作为ADC的有效载荷可能会降低其毒性。最近，Paul T. Wingfield团队确定了cryptophycin-52（36）及其亲本化合物cryptophycin-1（35）在微管蛋白二聚体界面上的结合位点，与美登素部分重叠（图7B）。α-微管蛋白和β-微管蛋白的构象都发生了变化，特别是在螺旋H8和H10上。α,β单体之间以及与cryptophycin-52（36）结合的、与cryptophycin-1结合的微管蛋白之间存在显著差异。然后，分析了cryptophycin上的合适位点：在单元A中，对位取代的苯环比邻位或间位取代的类似物更强大，对位取代的苯环可以用作偶联点；单元B对微小的修饰敏感，例如苯环上的5-氟取代。在单元C中，C6位置的苯甲基或异丙基等大取代基会大大减少其效力；然而，单元D上的修饰后活性只有轻微变化，单元D中的异丁基团可以用作偶联点。单元D的异丁基偶联位点可能比单元A的更好。这一分析为后续以cryptophycin作为有效载荷的ADC设计提供了参考，以找到合适的偶联位点。 Cryptophycin-52（36）的类似物37（IC50 Z 33 pmol/L）是一个非常有前景的临床药物候选物，已被Eli Lilly专利（图7A）。Cryptophycin-52中单元A的芳香环可以被替换修饰，而不影响其生物活性。这些修饰被Sanofi-Aventis用作抗体偶联的位点。Cryptophycin 52-chlorohydrin化合物，如cryptophycin-55（38），在体内生物活性提高了100-1000倍。Cryptophycin-55甘氨酸（39）在体外显示出最高的细胞活性。Cryptophycin-55甘氨酸与通过可切割连接子靶向HER2受体的曲妥珠单抗偶联，得到的ADC对SK-BR3细胞显示出纳摩尔级活性。Genentech将cryptophycin-52中的苯环转化为苄胺，以获得适合通过氨基甲酸酯键连接的载荷40。Jinliang Yang团队将cryptophycin-55，即cryptophycin-52的前药（CR55，在生理条件下可以转化为cryptophycin-52），与曲妥珠单抗偶联。其在HER2阳性肿瘤细胞系中的IC50为低纳摩尔级（0.58e1.19 nmol/L），相应的ADC在卵巢癌（SKOV3）和胃癌（NCIeN87）异种移植模型中以10 mg/kg剂量显示出显著的抗肿瘤活性。这为基于cryptophycin-55和cryptophycin-52的ADC抗肿瘤药物的开发提供了思路。 图 7 加密霉素类似物的设计和SAR分析。(A) 加密霉素类似物35e40的化学结构；(B) 加密霉素-52(36)与微管复合物的结合模式（PDB代码7M20）。 3.1.6. EG5抑制剂 驱动蛋白（KSP/EG5/KIF11）是一种依赖ATP的蛋白质，它参与细胞周期G2/M期中心体的分离和双极纺锤体的形成，对有丝分裂起着重要作用。EG5在血液肿瘤（例如，AML母细胞和弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL））和实体瘤（例如，乳腺癌、膀胱癌和胰腺癌）中的高表达与它们的不良预后相关，使其成为有吸引力的癌症治疗靶点71。几种EG5抑制剂，如SB-715992（Ispinesib）(41)和Filanesib（ARRY-520）(42)，已经在临床试验中（图8A）。然而，EG5抑制剂最常见的副作用，如中性粒细胞减少症、口腔炎和口腔溃疡，以及它们狭窄的治疗窗口，限制了它们的治疗效果。然而，通过利用ADCs，可以从细胞毒性化合物的暴露中保护健康组织，可能减少它们的整体毒性副作用，并扩大化合物的治疗窗口。Dimitrios A. Skoufias的团队72比较了Eg5 Arry-520复合物的结构与Eg5 ispinesib复合物（PDB ID:4AP0）的结构（图8B）。两个复合物的叠加显示，ispinesib的喹啉酮占据着与Arry-520的二氟苯环相似的位置，并具有相似的相互作用。在ispinesib中，两个芳香性取代基对甲苯和苄基相互堆叠，与Glu118、Arg119稳定骨架，并通过Arg119、Trp127和Asp130侧链的进一步堆叠。然而，在Eg5 Arry-520复合物中，这种骨架堆叠要弱得多。此外，对于Arry-520，二氟苯和异丁基侧链残基之间存在直接的疏水堆叠相互作用，而在ispinesib复合物中，侧链移动2埃以适应苄基和对甲苯，从而完全削弱或失去这种相互作用。Arry-520和ispinesib在Gly117的主链氧和Glu116的侧链之间形成氢键相互作用。Arry-520中甲氧基的氧可能与Tyr211的羟基（3.63埃）弱相互作用。此外，苯环中的一个氟与Gly217的主链NH（3.03埃）相互作用，并与Arg221的侧链弱相互作用（3.69埃）。总的来说，Arry-520的紧密结合是通过一系列强或弱的氢键相互作用和与抑制剂结合袋中的氨基酸侧链的疏水相互作用实现的。此外，Eg5的D130A和L214A突变在变构结合位点都可以使Array-520耐药，而ispinesib仍然对L214A突变敏感。基于此，后续的化合物修饰可能会考虑避免对某些突变的抗性，这些突变导致化合物抑制作用降低，产生能够克服这些潜在的临床相关问题的新抑制剂。诺华开发了EG5抑制剂43、44作为有效载荷，与抗体结合，使用不可裂解的连接子靶向HER2（图8A）。在表达HER2的小鼠异种移植模型（SK-OV-3ip）中，单次静脉注射ADC剂量（5 mg/kg）可以使肿瘤生长停止3周，优于Kadcyla（5 mg/kg）73。 图 8 EG5抑制剂的设计和SAR分析。(A) EG5抑制剂41e45的化学结构；(B) 伊斯匹尼布(41)与EG5复合物的结合模式（PDB代码4AP0）。 使用非细胞穿透性的EG5吡啶抑制剂作为有效载荷，Anette Sommer74开发了一种新型的IL3RA靶向ADC，显示出有效和选择性的抗增殖效果。Carsten Terjung75研究了一种新的EG5吡咯亚类抑制剂45作为ADC的新有效载荷的适用性。在尿路上皮癌（UCC）的异种移植模型中，这种ADC显示出高效能，导致肿瘤完全根除。微管的破坏可以诱导细胞周期在G2/M期停滞，这使得微管成为药物发现的有吸引力的靶点。在许多情况下，狭窄的治疗窗口和缺乏肿瘤特异性可能导致有效的微管抑制剂作为抗癌剂单独失败。然而，使用ADCs作为靶向治疗可能是解决微管抑制剂单药治疗限制的有希望的方法。目前在临床开发中的ADCs中有一半以上使用微管抑制剂（auristatins和maytansinoids）作为有效载荷。虽然微管抑制剂作为ADC有效载荷已经取得了一些商业成功，但它们在开发过程中受到各种缺点的限制。例如，它只能针对分裂期的肿瘤细胞，而不是非分裂期和静止期的细胞。此外，肿瘤细胞中的微管抑制剂有更多的靶点，这意味着需要更大的药物剂量来阻止微管。因此，这些以微管抑制剂为有效载荷的ADCs仍然远离理想的靶向治疗概念。 3.2. DNA靶向有效载荷 与微管抑制剂相比，DNA抑制剂可以通过双链断裂、烷基化、嵌合、交联等破坏DNA，对整个细胞周期起作用，引起细胞毒性效应，并对实体瘤76具有良好的治疗效果。此外，DNA抑制剂的靶点远少于微管抑制剂，当ADCs携带相同数量的有效载荷进入细胞时，DNA抑制剂可以显示出更好的杀伤效果。此外，以DNA抑制剂为有效载荷的ADCs可以针对抗原表达低的肿瘤细胞，这解释了为什么DNA抑制剂已经被选为许多下一代ADCs的有效载荷。 3.2.1. 烯二炔 从细菌来源分离的烯二炔是目前发现的最具细胞毒性的天然产物之一。其摄取会导致活细胞中DNA单链或双链断裂，从而导致细胞死亡，并且它对各种细菌和肿瘤细胞具有极强的活性。烯二炔可以分为两个亚家族：Cal类烯二炔和蒽醌融合烯二炔。这些高毒性的烯二炔化合物不适合直接作为抗癌剂使用，但这些抗肿瘤抗生素的效力和作用机制使它们成为吸引人的ADC有效载荷。最常用的天然烯二炔产品的ADC有效载荷是Cal烯二炔类的卡利霉素gI 1 (46)和蒽醌融合的烯二炔Uncialamycin (47)（图9A）。卡利霉素靶向与DNA结合的小沟，并特异性诱导DNA双链断裂，导致细胞凋亡。尽管最初的实验显示了强烈的活性，但卡利霉素对正常细胞DNA的破坏阻碍了它们的临床进展。尽管如此，高细胞毒性、小分子尺寸和明确的作用机制使卡利霉素成为吸引人的ADC有效载荷。卡利霉素gI 1 (46)是目前研究最多的卡利霉素。Dinshaw J. Patel及其团队研究了卡利霉素gI 1-DNA双链复合物的高分辨率结构，发现卡利霉素的芳基四糖深嵌入小沟中，以寡嘧啶寡嘌呤区为中心，反过来，连接的烯二炔环横跨双链，在复合物的强度细化结构中（图9B）占据两个链。烯二炔环相对于螺旋轴倾斜，采用深入小沟的方向，允许在暴露的三硫触发器激活和环芳香化后提取DNA糖-磷酸骨架质子，最终导致DNA链断裂。在药物与DNA小沟界面之间有密切的互补性，这在复合物的细化结构中横跨整个结合位点。该研究提供了一个数据库，以解决与卡利霉素类DNA的识别和切割相关的两个领域问题。 图 9 烯炔烃类药物的设计和SAR分析。(A) 烯炔烃类药物46e52的化学结构；(B) 卡利奇霉素gI 1 (46)与DNA复合物的结合模式（PDB代码2PIK）。 卡利霉素gI 1 (46)具有强烈的细胞效应，以Mylotarg为代表的ADC的出现在很大程度上依赖于卡利霉素gI 1 (46)的发现，其N-乙酰衍生物成为Mylotarg的有效载荷。Nicolaou等人合成了卡利霉素qI 1 (48)，这是卡利霉素gI 1的类似物，对各种肿瘤细胞的IC50值小于1 pmol/L，也适合用作ADC有效载荷。此外，FDA批准的Inotuzumab Ozogamicin (Besponsa)也将卡利霉素作为有效载荷。Uncialamycin是从地衣中分离出来的一种天然烯二炔产品，它可以引起DNA断裂，并显示出强烈的细胞活性。Uncialamycin的有效类似物的一个共同结构特征是在A环上存在一个初级或次级苯胺基团。如果将胺转化为相应的苯甲酰胺，并将末端苯胺引入，就可以解决不稳定性问题，并且活性保持。Sanjeev Gangwar使用酚烷基化方法设计了一个高度有效且化学稳定的Uncialamycin类似物49（图9A）。通过将有效载荷与抗间皮素（meso）抗体结合产生的ADC在H226细胞中的IC50为0.2 nmol/L，表现出在耐受剂量下具有特异性和持久的肿瘤生长抑制。Julia Gavrilyuk等人选择了甲胺类似物50作为Uncialamycin ADC的有效载荷，针对TL和CD46的ADC在HEK293T细胞中表现出低皮摩尔效力。Emmanuel N. Pitsinos修改了Uncialamycin，从分子的芳香部分去除一个碳原子，得到了化合物51（测试细胞系：IC50 (H226细胞) Z 28 pmol/L; IC50 (N87细胞) Z 11 pmol/L; IC50 (OVCAR3细胞) Z 316 pmol/L; IC50 (Adr细胞) Z 20 pmol/L)。Sanjeev Gangwar85将Uncialamycin类似物52与抗间皮素（meso）抗体结合。产生的ADC在H226肺癌细胞中的IC50值为0.98 nmol/L。 3.2.2. 拓扑异构酶I抑制剂 拓扑异构酶I（TOPO-I）是一种重要的核糖酶，对基因组稳定性和DNA结构的保持至关重要，已成为ADCs的热门靶点。TOPO-I抑制剂与先天和适应性免疫反应相关，表明靶向TOPO-I的ADCs也可能有助于抗肿瘤免疫治疗。Lance Stewart等人报道了与临床批准的抗癌药物托泊替康（53）结合的TOPO-I与双链DNA共价连接的X射线晶体结构（图10A）。托泊替康（53）和人类TOPO I-DNA共价复合物表明，托泊替康是一种非竞争性抑制剂，通过在酶诱导的切口处插入DNA两条链之间的碱基，与酶-底物复合物结合。托泊替康的结合模式是与DNA的堆叠相互作用，与Asp-533的氢键接触，以及活性位点之间通过磷酸酪氨酸和Asn-722的水桥接触。天然五环产物喜树碱（CPT）（54）（图10B），是托泊替康（53）的类似物，是一类特别吸引人的ADC有效载荷，通过与TOPO-I和DNA结合形成稳定复合物，在S期细胞中诱导双链DNA断裂，导致细胞凋亡。然而，喜树碱的极低溶解度限制了它作为癌症治疗药物的广泛使用。SN-38（56），是伊立替康CPT-11（55）的活性成分，是一种半合成喜树碱。尽管SN-38具有所需的效力，但由于其高度疏水性和可用的结合位点数量有限，制备活性缀合物具有挑战性。尽管如此，SN-38已与针对滋养层细胞表面抗原2（Trop-2）的人源化抗体结合，产生了正在临床研究中的ADC sacituzumab govitecan。Exatecan mesylate（DX-8951f）（57）是一种水溶性CPT衍生物，比其他CPT类似物具有更强的TOPO-I抑制和抗肿瘤活性。DXd（DX-8951衍生物）（58）是一种新型的高膜透性拓扑异构酶I抑制剂，细胞IC50为2.05e17。nmol/L，可以克服P-糖蛋白介导的多药耐药性，并对各种肿瘤移植模型具有更强的效力，包括体内对CPT-11耐药的肿瘤。DXd（58）具有一个包含第二个手性中心的F环，这使得它的合成和衍生化复杂化。为了简化其结构，Wayne C. Widdison的 SAR研究表明，C11位置的氟取代通常可以增加细胞毒性数倍，并且C20中心必须处于S构型才能保持分子活性。Exatecan内酯的改进稳定性归因于C11氟取代基和F环的作用。来自喜树碱衍生物58和59的ADC可以有效地释放部分含有硫醚或硫醇的喜树碱代谢物。这些代谢物对靶向Ag ++细胞具有强烈的抑制作用，并在HSC-2和H1703 EGFR ++异种移植模型中显示出相似的剂量依赖性抗肿瘤活性。有效载荷59中没有F环，但其缀合物在体外和体内的效力与含有DXd的缀合物相似。这种简化使得喜树碱A和B环的衍生化更容易用于结构-活性关系研究和有效载荷优化。Dongke Yu通过将DXd与曲妥珠单抗结合，获得了一种新型HER2靶向ADC DS-8201a。SAR表明，C-10的羟基取代可以增强CPT的抗肿瘤活性，C-7和C-10的二取代可以稳定内酯环并提高分子生物学活性。DXd在C-7和C-9位点上发生环化，从而增加抑制活性。DS-8201a避免了药物抗性，并通过旁观者杀伤效应非常有效地治疗异质性肿瘤。Scott C. Jeffrey开发了一种新型的亲水性和蛋白酶裂解性谷氨酸三肽配体，使用一种高度细胞毒性的7-氨基甲基-10,11-甲叉二氧基CPT类似物60作为有效载荷。结合的ADC在CD30高度表达的菌株和MDR阳性786-O肾细胞癌裸鼠中显示出有效的抗肿瘤活性。 图 10 拓扑异构酶I抑制剂的设计和SAR分析。(A) 拓扑替康(53)与TOPO I-DNA复合物的结合模式（PDB代码1K4T）；(B) 拓扑异构酶I抑制剂53e60的化学结构。 3.2.3. PBD 在链霉菌中发现的吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂卓(PBD)(61)是一类具有抗肿瘤活性的天然产物（图11）。这些化合物由一个芳香的A环、一个1-4-二氮-5-1 B环和一个吡咯烷C环组成。它们的作用机制是在DNA的小沟中选择性烷基化，其中鸟嘌呤的N2与PBD的亲电性N10/C11亚胺形成共价键。DNA链之间的交联导致持续的DNA损伤，这导致细胞周期在G2/M阶段停滞和细胞凋亡，从而表现出强大的细胞毒性。Klaus Weisz团队的NMR结构数据证实了PBD杂合体与DNA双链的小沟强烈结合，形成PBD部分与外环鸟嘌呤氨基组之间的共价键。PBD二聚体有潜力作为ADC有效载荷使用，例如以PBD作为有效载荷设计的针对ROR1的ADC CS5001，在多种表达ROR1的肿瘤细胞系中显示出强大的选择性，并在血液和实体瘤异种移植小鼠模型中显示出显著的体内抗肿瘤活性。目前正在进行临床试验。为了进一步扩展更多类似PBD的化合物作为ADC有效载荷，Rahman及其同事对PBD的C8位置进行了修饰，获得了化合物62，其缀合物具有临床前活性。基于化合物62，Khondaker Miraz Rahman合成了PBD核心并构建了使用苯并呋喃和N-甲基吡咯的组合的C8杂合63（图11）。随后，通过系统地缩短含有吡咯苯并呋喃基团的C8连接单体（例如，化合物64的C8连接单体通过去除酰胺被缩短）获得了一系列的化合物。研究发现，PBD的C8位置具有相对较短的侧链就足以赋予细胞毒性。因此，缩短的PBD单体可以用作新的ADC有效载荷。二氢苯并呋喃化合物64在原代CLL细胞中具有高度毒性，打开呋喃环也在原代CLL细胞和JN-3细胞系中保持了低纳摩尔活性。苯并呋喃中苯元素的变化对细胞毒性有更显著的影响，在去除环的芳香性后细胞毒性显著降低。Jagath R. Junutula鉴定了一种异喹啉苯并二氮杂卓(IQB)有效载荷65，其C6a位置的(S,S)立体化学对最佳IQB活性至关重要。这是一类新的PBD二聚体DNA损伤有效载荷，在HEPG2 A704细胞系中显示出高活性。细胞毒性的吡咯并苯并二氮杂卓(PBD)二聚体分子经常用作ADCs的有效载荷。为了进一步探索这一类ADC有效载荷，Peter S. Dragovich96通过系统地在其化学结构中引入酸性和碱性基团来修改它们的物理化学性质。结果表明，含有酸性功能团的PBD二聚体有效载荷（包括高度电离的基团，如化合物66中的磺酸）能够通过抗体介导的递送，有效地从细胞溶酶体运输到细胞质和/或细胞核。修饰后的PBD二聚体化合物66与CD22抗体结合，获得了对BJAB细胞的IC50为12纳摩尔/升的ADC，显著提高了未结合PBD二聚体的抗增殖活性。PBD二聚体有效载荷66将有助于设计具有更高治疗潜力的新ADCs。Peter S. Dragovich探索了含有二硫前药的PBD二聚体作为抗体-药物偶联物的有效载荷，并发现许多含有二硫前药的PBD单体对细胞（如KPL-4细胞）表现出强大的抗增殖活性，这些细胞具有相对较高的细胞内GSH水平。多个二硫前体在生理浓度的Cys中稳定，但在肿瘤细胞中GSH存在下不稳定。增加化合物67和68的末端空间体积可以显著提高它们的稳定性。例如，所得到的含有两个甲基的化合物69和70对GSH和Cys都具有很高的稳定性。噻吩衍生的二硫的稳定性在体内得到了提高。在这些常见的PBD有效载荷中，PBD二聚体上的结合位点分为两类：C2和N10。C2结合的一个例子是有效载荷71，它包含一个附着在PBD C2位置的苯环。针对CD19的ADC T-402的有效载荷SG3199(72)通过其N10位置结合。由于PBD B环上的N10位点参与与DNA的共价结合，与N10位点的连接比与C2位点的连接更安全。在PBD有效载荷的后续工作中，其结合位点也可以作为影响修改方向的一个因素。 图 11 PBD类似物61e72的设计和SAR分析。 3.2.4. 双环霉素 双环霉素A（73）是从链霉菌中分离出的一种强DNA烷基化剂，由DNA烷基化部分和结合部分组成（图12A）。最早发现的双环霉素天然成员CC-1065（74）通过其高度活性的丙烷环与DNA微沟结合，并在N3位置烷基化腺嘌呤，最终导致细胞死亡。尽管CC-1065（74）在体外具有高效性，但在动物模型中仅显示出中等的体内活性和不可逆的肝毒性。为了改善这些化合物的生物学特性，将其用于ADC可能是一个可行的选择。Walter J. Chazin等人描述了双环霉素SA的非天然对映体和DNA加成物的结构，发现双环霉素SA的两种对映体可以共享同一结合位点，并在AATTA双链上具有相同的结合方向，但烷基化不同的位点（图12B）。两种对映体对互补链的烷基化发生在相同的结合方向上，但对非天然对映体而言，偏移了一个碱基对。这种差异对两种加成物的结构有重要的影响，因此，将影响它们相对的烷基化效率。对这种新结构的分析，结合相同的AATTA双链，解释了天然对映体与非天然对映体在DNA位点选择性方面观察到的相似之处和差异。在双环霉素/CC-1065家族的所有DNA加成物结构中都观察到了亚基间的扭转。由于DNA具有左手螺旋扭转，DSA的三甲氧基吲哚亚基自然倾向于在结合到小沟时，相对于烷基化亚基逆时针方向扭转。因此，DNA分子本身的手性对(+)对映体剂施加了一个重要的限制，而(-)对映体剂则不存在。两种DSA对映体的笨重的C24甲氧基位于小沟底部的大致相同的位置，在A16和T17碱基之间的裂缝中。这项研究为控制这些化合物DNA烷基化速率的因素以及DNA结合诱导的烷基化反应激活的重要性提供了新的理解。Patrick H. Beusker开发了一种基于双环霉素的新型载荷，用于减少链间二硫键。它与针对HER2的抗体曲妥珠单抗结合，产生了在体外和体内具有良好特性的ADC SYD985。含有咪唑[1,2-a]吡啶基的双环霉素DUBA（75）以非活性前药形式sec-DIBA（76）（75，通过76的自发螺环化形成）（图12A）被纳入到偶联药物中。化合物76包含两个羟基，每个羟基都可以通过一个连接子与抗体结合。Moana-Tercel使用Pd催化的氨基化方法将sec-CBI（sec-1,2,9,9a-四氢环丙[c]苯[e]吲哚-4-酮），双环霉素天然产物烷基化亚基的合成类似物，从酚类转化为氨基形式。然后获得酚CBI类似物77、78和氨基CBI类似物79、80。化合物77对六种人类肿瘤细胞系的IC50在0.1e2皮摩尔/升范围内。用相应的氨基CBI化合物79和80替换化合物77或78的酚CBI，会导致效力显著降低，对P-gp过表达的敏感性增加。尽管如此，化合物79在大多数测试的细胞系中保持了显著的低皮摩尔细胞毒性，并且像化合物77、78和80一样，在足够高的浓度下完全抑制了所有细胞系的增殖。 图 12 双环霉素类似物的设计和SAR分析。(A) 双环霉素类似物73e80的化学结构；(B) 双环霉素A(73)与DNA复合物的结合模式（PDB代码1DSM）。 在ADC领域，一个明显的趋势是治疗靶点从血液肿瘤转移到实体肿瘤。这一趋势可能会将有效载荷的选择从针对微管的抑制剂转移到DNA损伤剂，后者通常表现出更高的效力，并满足新一代有效载荷比当前有效载荷需要更高的治疗指数的标准。此外，使用DNA损伤剂作为有效载荷可以针对相对低水平表达的肿瘤特异性/相关表面受体。将DNA损伤剂作为ADC的有效载荷已被广泛建立。然而，由于DNA损伤难以修复，这可能导致潜在的有毒副作用。目前，只有一种以PBD作为有效载荷的ADC在临床使用中。因此，它们的安全性/药物抗性问题仍需要进一步研究，未来需要开发更多的新一代ADC有效载荷。 3.3. 靶向RNA的有效载荷 仍有许多肿瘤对ADCs没有反应或对药物产生耐药性。生长缓慢的肿瘤细胞通常不像快速分裂的细胞那样依赖于微管介导的细胞过程。因此，为了进一步扩大ADC有效载荷的范围，并确定在快速和慢速增殖细胞中都有效并且能够逃避MDR介导的抗性的其他类型的ADC有效载荷，人们将注意力转向了靶向RNA的小分子有效载荷。靶向RNA的小分子抑制剂可以杀死分裂和休眠的肿瘤细胞，作为ADC有效载荷使用，预计将解决肿瘤药物抗性问题和由无效的肿瘤休眠细胞引起的肿瘤复发和转移问题。目前有两种主要类型的RNA抑制剂可供ADC有效载荷使用：RNA剪接抑制剂（Thailanstatin及其类似物）和RNA聚合酶II抑制剂（Amatoxins）。 3.3.1. 泰兰司他汀 RNA剪接通过剪接内含子和小段外显子来控制代谢、血管生成、癌细胞增殖和转移，这些是将RNA转化为mRNA的复杂细胞机制的关键。它们还可以直接控制转录的启动、延伸和终止，这是癌症抑制的生物靶标。Abdel-Wahab等人发现，在RNA剪接调节药物的干扰下，肿瘤细胞可以产生新抗原，这些新抗原可以通过MHC I呈现为新抗原表位，从而刺激抗肿瘤免疫。研究表明，RNA剪接调节可以作为肿瘤抗原的潜在来源，有潜力应用于肿瘤免疫检查点治疗。剪接体抑制剂是针对活跃分裂和静止细胞的强效抗增殖药物，因此是一类有前景的ADC有效载荷。泰兰司他汀是一种最初从布鲁氏菌泰国msmb43分离并通过与剪接体U2 snRNA亚复合物的SF3b亚基结合而激活的天然产物。泰兰司他汀家族通过抑制真核mRNA剪接途径，对剪接体有很强的结合和抑制作用，对多种癌细胞系的IC50值低至纳摩尔级，可以作为ADCs的潜在有效载荷。Yi-Qiang Cheng报告了从MSMB43分离出的三种新泰兰司他汀化合物：泰兰司他汀A（81）、泰兰司他汀B（82）和泰兰司他汀C（83）（图13）。泰兰司他汀A（81）是一种潜在的天然抗癌药物候选物。泰兰司他汀药物的整体结构与剪接体抑制剂候选物FR901464（84）相似，除了泰兰司他汀的C1位缺乏不稳定的羟基，而C17位有一个额外的羧基，因此泰兰司他汀具有更好的稳定性。泰兰司他汀A（81）和FR901464（84）C3位的高活性环氧化物在抑制前mRNA剪接和癌细胞增殖中至关重要。对环氧化物进行卤化修饰的泰兰司他汀B（82）和泰兰司他汀C（83）的化合物活性降低。与泰兰司他汀B（82）相比，泰兰司他汀C（83）甲基的添加对化合物的生物活性没有显著影响。Stephan Rigol合成了泰兰司他汀类似物85和86，其IC50值为皮摩尔级。辉瑞公司首次探索RNA剪接抑制剂作为抗体药物偶联物的有效载荷。含有羧基的泰兰司他汀半合成类似物87直接与曲妥珠单抗表面赖氨酸偶联，获得了非常有效的泰兰司他汀ADC。化合物87及其相应的ADCs在HER2高度表达的胃癌细胞系N87和MDR1过表达细胞系中都有效（化合物87在N87细胞中的IC50为1.8纳摩尔/升）。此外，ADCs的暴露量足以在低至1.5毫克/千克的剂量下在胃癌异种移植模型中实现极佳的效力，优于临床批准的ADC T-DM1。 图 13 他兰司他汀类似物81e87的设计和SAR分析。 3.3.2. 毒伞肽 毒伞肽最初由Heinrich Wieland和Rudolf Hallermayer在1941年分离。毒伞肽是由核糖体合成的有毒二环八肽，是真核RNA聚合酶II的选择性抑制剂，可导致细胞凋亡。毒伞肽包含一个由八个L型氨基酸构成的大环，通过亚砜基团在色氨酸和半胱氨酸残基之间连接，其三个侧链被羟基化，因此具有良好的水溶性。对毒伞肽最深入研究的是含有6-羟色氨酸（Htp）、反式-4-羟脯氨酸（Hyp）和(3R,4R)-4,5-二羟油酸（Dhil）的α-鹅膏肽（88），这是迄今为止已知的最有效和特异性的RNA聚合酶II抑制剂，有潜力突破药物抗性或破坏静默期肿瘤细胞，有效防止肿瘤转移和复发（图14A）。Roger D. Kornberg的团队分析了RNA聚合酶II-α-鹅膏肽的晶体结构，发现抑制剂的位置紧挨着桥螺旋和触发环，主要稳定在远离加成位点的构象（图14B）。α-鹅膏肽环肽主链形成一个口袋，允许与Rpb1 His1085侧链咪唑环形成特定的互补氢键，为触发环创造了一个约束点。α-鹅膏肽口袋对咪唑的特异性主要是通过Gly7的酰胺NH与Rpb1 His1085 N(D1)的相互作用，以及Asn1的羰基与Rpb1 His1085 NH(E2)的相互作用实现的。研究表明，α-鹅膏肽通过直接干扰RNA聚合酶II的触发环，抑制RNA聚合酶II的延伸，并表现出缓慢降低的底物选择性。毒伞肽引起的细胞凋亡和坏死等毒性阻碍了其临床应用。但由于其分子量小、在水溶液中溶解性好，以及对RNA聚合酶II的抑制作用，近年来作为抗体-药物偶联物有效载荷在癌症研究中越来越受到关注。α-鹅膏肽ADC极有可能对增殖和静止的肿瘤细胞都起作用。在ADC领域，使用鹅膏肽作为有效载荷是一种相对较新的方法。Heidelberg Pharma开发的以毒伞肽作为有效载荷的B细胞成熟抗原（BCMA）靶向ADC HDP-101（ClinicalTrials.gov标识符：NCT04879043），目前正在进行复发/难治性多发性骨髓瘤治疗的I/IIa期临床试验，并于2022年2月15日完成了首例患者给药。HDP-102是一种靶向CD37的ADC药物，针对非霍奇金淋巴瘤（NHL）。HDP-103靶向前列腺特异性膜抗原（PSMA），目标适应症为转移性去势抵抗性前列腺癌（mCRPC）。Steffen Goletz113将β-鹅膏肽（89）的羧基与IgG赖氨酸的氨基偶联，得到了一种具有良好的血浆稳定性和高细胞毒性的ADC（图14A）。以泰兰司他汀和毒伞肽作为有效载荷的ADCs能够避免治疗抗性，并对静止的肿瘤细胞有效，而现有的标准疗法很少达到这种效果，常常导致肿瘤复发和药物抗性。因此，在微管抑制剂和DNA损伤剂作为有效载荷之外，新一代RNA抑制剂作为ADCs的有效载荷越来越受到关注。尽管目前市场上还没有RNA有效载荷的ADCs，但它们的巨大潜力值得进一步探索。 图 14 毒伞肽的设计和SAR分析。(A) 毒伞肽88, 89的化学结构；(B) α-鹅膏肽(88)与RNA复合物的结合模式（PDB代码3CQZ）。 3.4. 免疫ADC有效载荷 最初，ADCs仅限于肿瘤学领域。然而，它们在临床上的成功鼓励了ADCs在其他治疗领域的应用，最引人注目的是免疫学。肿瘤免疫涉及T细胞、巨噬细胞、树突细胞等，通过免疫调节将冷肿瘤转变为热肿瘤，最终增强免疫疗法的效果。免疫检查点抑制剂通过消除肿瘤对T细胞的抑制，增强T细胞的抗癌免疫反应。然而，对于没有自发T细胞反应和肿瘤周围T细胞浸润的癌症患者（通常被称为冷肿瘤），免疫检查点抑制剂效果不佳。因此，免疫疗法研究和开发的一个重点方向是开发能够刺激患者先天免疫反应并促进肿瘤特异性T细胞招募的抗癌疗法。与传统ADCs不同，免疫刺激抗体偶联物（ISACs）结合了抗体导航靶向的精确性和基于小分子的先天和适应性免疫系统调节的强大力量。一方面，抗体将免疫激动剂类型的小分子偶联起来，增强免疫反应的作用。另一方面，抗体的肿瘤靶向减少了小分子免疫激动剂的毒性。在靶点选择方面，由于有效载荷的毒性，传统ADCs必须严格限制肿瘤特异性抗原，而免疫调节ADCs可以扩展更多的肿瘤相关抗原。在内吞作用方面，传统ADCs是靶向抗原介导的内吞作用，直接杀死癌细胞。免疫调节ADCs通过免疫细胞表面的FcgR介导的内吞作用激活免疫细胞。目前，有多种免疫调节ADC药物正在开发中，新的有效载荷主要包括Toll样受体（TLR）激动剂和干扰素基因刺激剂（STING）激动剂，该领域具有巨大的发展潜力。 3.4.1. Toll样受体激动剂 Toll样受体（TLRs）是参与先天免疫的重要蛋白质分子类别，是身体抵抗传染病的第一道屏障。TLR受体的激活能够改善肿瘤微环境中树突细胞和巨噬细胞的抗原呈递，并促进CD8+ T细胞的增殖。Toll样受体激动剂作为免疫增强剂，诱导肺癌、黑色素瘤、白血病和胶质瘤中增强的抗肿瘤免疫反应，直接或间接地有效抑制肿瘤生长。因此，TLR激动剂在肿瘤免疫疗法中的应用预计将激活先天免疫反应，介导获得性免疫反应，使冷肿瘤变热，解决单一免疫检查点抑制剂的低反应率问题，提高免疫疗法的有效性，并实现重塑肿瘤微环境的目的。目前，TLR已成为免疫疗法领域的研究热点之一，在TLR家族成员中，研究人员更关注TLR7、TLR8和TLR9。TLR8激动剂（90）（91）激活DC细胞，并通过T细胞增强对肿瘤细胞的杀伤（图15）。然而，免疫疗法通常伴随着副作用，如细胞因子释放综合征，这是一种常见的全身性炎症状况。TLR8激动剂的全身给药也存在相关的毒性，限制了患者可以承受的TLR8激动剂的量。因此，将TLR8激动剂应用于ADC可以同时结合抗体的靶向效应和TLR8的免疫调节效应，减少毒性和副作用。Toshiyuki Shimizu的团队发现TLR7 TM螺旋与TLR7-TLR信号调节器（UNC93B1）TM3和TM6螺旋以及膜近区对齐，LRR-CT基序与UNC93B1 N末端六螺旋束的腔面相互作用。TLR7eUNC93B1复合物的二聚化由TLR7‒TLR7和UNC93B1‒UNC93B1相互作用介导，分别发生在2:2复合物的顶部和底部区域。TLR7 ECD中间区域的LRR11突出环区主要有助于TLR7的二聚化，而来自UNC93B1两个原体的连接TM6和TM7的细胞内螺旋以反平行方式相互作用。这项研究阐明了TLR与UNC93B1相互作用的结构基础，并促进了针对自身免疫病的化合物的后续设计。Silverback的SBT6050是一种抗HER2抗体偶联物，其有效载荷为TLR8激动剂91（图15），它以HER2依赖性方式在体外驱动各种抗肿瘤免疫机制，并在小鼠肿瘤模型中显示出良好的抗肿瘤效果（图15）。一类新的TLR7/8双激动剂被报道可以促进肿瘤对免疫检查点抗体的反应，特别是在冷肿瘤中。尽管团队发现的小分子具有显著的抗肿瘤效果，并且与PD-1和PD-L1抗体联合使用时可以观察到显著的协同效应，但与其他报道的TLR激动剂一样，小分子在血液中仍然过度暴露，导致更明显的免疫相关不良事件（irAEs），如体重减轻和类似流感的症状。为了避免直接给药TLR7/8激动剂可能引起的不良反应，团队于2015年开始尝试抗体偶联药物策略。 图 15 TLR激动剂90e92的设计和SAR分析。 经过几年的探索，一类新的免疫调节抗体偶联药物HE-S2成功构建，其有效载荷为TLR7激动剂（92）。动物实验结果表明，HE-S2（每只小鼠150毫克）具有非常显著的抗肿瘤效果，大多数结肠癌细胞肿瘤在接受治疗后基本消失，在黑色素瘤模型中，HE-S2治疗效果也优于对照组。重要的是，HE-S2治疗组没有明显的体重减轻。此外，尽管小鼠的肿瘤在接受治疗后缩小，但肿瘤细胞表面和肿瘤微环境中的免疫细胞PD-L1的表达显著增加，这可能有助于提高后续HE-S2治疗的靶向性。新型ADC HE-S2不仅通过阻断PD-1/PD-L1相互作用和激活TLR7/8信号通路诱导强大的抗肿瘤免疫反应，而且还通过表观遗传调控和IFN-g诱导其靶向抗原PD-L1的上调，从而使PD-1/PD-L1阻断更具敏感性。Michael N. Alonso的团队将TLR7/8激动剂与HER2抗体偶联，形成了一种通过肿瘤抗原识别Fcg受体依赖性吞噬作用和TLR介导的激活的ADC药物，驱动髓样细胞肿瘤杀伤和随后的T细胞介导的抗肿瘤免疫，适用于系统给药，安全有效。此外，越来越多的公司开始使用TLR激动剂进行抗体药物偶联：Bolt的BCC-1001（ClinicalTrials.gov标识符：NCT04278144），用于治疗HER2阳性实体瘤，源自HER2的TLR7/8激动剂偶联已进入临床研究。Sutro的IADC技术可用于将TLR激动剂与抗体偶联。Tallac的TRAAC技术用于TLR9激动剂的位点特异性抗体偶联。与Tallac合作开发的ALX Oncology的SIRPa抗体可以与TLR9激动剂偶联。恒瑞药业使用TLR7激动剂，百济神州使用TLR7/8激动剂，信达生物引入Bolt技术并使用TLR7/8激动剂进行偶联。Silverback的ImmunoTAC技术选择TLR8激动剂作为有效载荷。这些研究提供了一种新的ADC策略，增强了免疫检查点阻断疗法的抗肿瘤免疫反应。同时，这种策略还为解决直接使用免疫激动剂时药物质量差的问题提供了思路。 3.4.2. STING激动剂 干扰素基因刺激因子(STING)是天然免疫信号通路中的关键调节因子，具有启动机体天然免疫防御反应和促进T细胞形成适应性免疫的功能。STING介导的I型干扰素信号通路是天然免疫领域的重大发现，为肿瘤免疫疗法提供了新靶点。激活STING通路可以诱导I型干扰素和其他多种细胞因子的表达和分泌，激活天然免疫反应，促进抗肿瘤免疫反应，实现治疗肿瘤的目的。STING激动剂在多个研究领域得到广泛应用。除了诱导天然免疫反应外，它们在其他DNA或RNA传感器信号通路、自噬、内质网应激和凋亡中也发挥作用。凭借其抗肿瘤和免疫原性特征，STING激动剂也已成为新的免疫疗法试验药物和疫苗佐剂。现有的临床研究数据初步证明了STING激动剂与免疫检查点抑制剂的组合可以显著提高免疫疗法的疗效，并有望成为创新疗法。非核苷类小分子STING激动剂具有良好的稳定性，可以在动物模型中通过口服或注射给药，并显示出有希望的抗癌活性。然而，由于STING蛋白也存在于健康细胞中，系统性STING激动剂需要解决的问题之一是如何在不引起健康细胞过度炎症反应的情况下刺激抗肿瘤免疫反应。如果这些激动剂可以进一步优化，它们有潜力革新免疫疗法领域。 鉴于游离STING激动剂的系统给药可能受到毒性限制，广泛生物分布可能不理想，可以考虑通过ADC实现STING激动剂的肿瘤靶向递送以减少毒性。环二核苷酸(CDNs)(93)作为STING蛋白的天然配体已得到广泛研究（图16A）。栗川谷团队确定了猪STING复合物的CBD（CDN结合位点）与四种CDN：2,3 cGAMP；3,3 cGAMP；c-di-GMP和c-di-AMP的结合。其中，不对称配体2,3 cGAMP与STING的结合亲和力最高（图16B）。对猪STING CBD 20,30-cGAMP复合物的结构分析发现，非对称单元包含两个STING CBD分子（原型A和B），它们形成二聚体。各个原型通过a1、a2、a3和中心β-折叠区广泛相互作用，形成一个深U形裂口。20,30-cGAMP配体位于裂口中，其嘌呤指向上方，核糖环位于下方（与膜相关）。碱基、磷酸和核糖基团都有助于与STING结合。20,30-cGAMP的嘌呤环与两个原型中的Tyr167和Arg238堆叠。20,30-cGAMP的磷酸基团通过静电相互作用和氢键被Arg238识别。Arg238还在核苷部分的Hoogsteen边缘形成氢键。除了堆叠相互作用外，腺苷和鸟苷部分与STING的相互作用模式不同。对于两者，相互作用涉及它们的Watson-Crick、Hoogsteen和糖边缘。所有氮原子（除位置9氨基外）和嘌呤中的氧原子直接或间接（通过水介导）与STING蛋白相互作用。这些广泛的相互作用与配体和猪STING CBD之间的高结合亲和力一致。猪STING CBD-20,30-cGAMP复合物的一个显著特点是，两个原型采用不同的构象，导致非对称的配体结合口袋。因此，非对称的20,30-cGAMP在配体结合口袋中以一种明确定义的构象被固定。这种独特的结合模式与之前涉及其他物种STING蛋白的结构形成鲜明对比，其中20,30-cGAMP以两种替代模式结合对称的STING二聚体，腺苷和鸟苷部分交换位置。总之，研究发现猪STING采用非对称构象结合CDN。对这种非对称构象的分析揭示了配体识别的机制，并鉴定了STING。 以CDN作为ADC有效载荷，CDN和抗体可以通过磷酸酯、糖环和碱基进行偶联。SPEROVIE（WO2021046426A1, 2021.03.11）通过将CDN中的硫代磷酸酯或甲酸盐酯与PD-1或CTLA-4抗体偶联，形成ADC药物；Immunesensor（WO2021016204A1, 2021.01.28）从CDN在30位的核糖处引出氨基或巯基，然后通过与抗体形成碳酸酯或二硫键，形成ADC药物；MIT和Millennium（WO2021216572A1, 2021.10.28）创新地将磷脂分子与CDN的磷酸酯偶联。所得的偶联物也可以进一步形成脂质体结构，以提高它们与细胞膜融合的能力。北京轩逸制药（WO2021178818A2, 2021.09.10）将TLR9激动剂CpG-DNA与CDN连接，形成融合分子，可激活TLR和STING免疫信号通路，增强免疫活性。然而，CDN结构中的二磷酸酯会导致药物的生物利用度低。因此，随着苯并咪唑化合物的发现，非核酸结构的STING激动剂研究已经开始。基于二聚苯并咪唑的ADC药物也已设计和合成。Mersana使用STING激动剂94作为有效载荷获得的ADC候选药物XMT-2056已经在临床前研究中（图16A）。它旨在通过刺激肿瘤组织免疫细胞和肿瘤细胞中的STING信号，激活先天免疫系统。与STING激动剂有效载荷相比，XMT-2056的效力提高了100多倍。在临床前模型中，XMT-2056在高和低HER2表达模型中均显示出强大的单药抗肿瘤活性，并且当与多种获批药物联合使用时，其疗效得到增强，包括曲妥珠单抗、帕妥珠单抗、抗PD-1 mAb或DS-8201。临床前数据表明，XMT-2056具有实现免疫记忆以延长抗肿瘤活性的潜力。5月，FDA授予该药物治疗胃癌的孤儿药认定。Mersana计划在今年晚些时候启动XMT-2056的I期临床试验，以研究其在一系列HER2阳性肿瘤中的治疗潜力，如乳腺癌、胃癌和非小细胞肺癌；日本Ono Pharmaceutical开发了一种非核酸STING激动剂95作为有效载荷，该激动剂通过药物结构中的吡唑环与连接子偶联。RYVU基于该公司开发的一类含硝杂环胺STING激动剂96，与抗体形成ADC药物。 图 16 STING激动剂的设计和SAR分析。(A) STING激动剂93e96的化学结构；(B) CDN(93)与STING复合物的结合模式（PDB代码6A05）。 3.4.3. 糖皮质激素受体调节剂 糖皮质激素受体调节剂（GRMs）通常用于治疗与各种疾病相关的炎症。在保持GR反向转录效应（被认为是预期抗炎效应的原因）的同时，可以最小化GR的反向转录效应（被认为是不良副作用的原因）。然而，GRM也可能引起肌肉骨骼、内分泌和胃肠道的副作用和其他毒性，限制了它们的治疗效果（特别是在长期使用中）。将GRM作为免疫型ADCs的有效载荷可能是一个理想的选择，因为靶向给药将最小化GRM载荷的系统暴露，可以在不引起有害副作用的剂量下提供显著的疗效，并实现慢性给药。这样的ADC将结合单克隆抗体的疗效（靶向炎症靶标）和选择性糖皮质激素受体调节剂。糖皮质激素载荷包含可以用于与溶酶体可切割抗体连接子结合的胺基功能团。首次将GRMs作为ADC载荷的报告使用了已知的地塞米松（97）（图17A），GRM ADC抗体组分选择了α-TNF，连接子与地塞米松的C21羟基相连。AbbVie正在开发的ABBV-3373也是由α-TNF和GRM组成的ADC药物，可以精确靶向激活的免疫细胞的调节，调节TNF介导的炎症信号通路，显著减少与糖皮质激素相关的系统性副作用，并有可能治疗风湿性关节炎（RA）。最近，Adrian D. Hobson启动了α-TNF-GRM ADC项目，并获得了一个DAR为4的α-TNF-GRM ADC，使用男巯基-甘-丙-ALA作为连接子。对P1NP和皮质醇生物标志物的分析表明，ADC在疗效和副作用之间有足够的治疗窗口。在慢性小鼠关节炎模型中，α-TNF-GRM ADC比具有相同GRM载荷的α-TNF单克隆抗体和同型对照更有效。 Victor Gualla团队确定了GR与地塞米松（97）和98（前药ciclesonide的活性代谢物）的晶体结构。GR和地塞米松（97）的结构使用了开放构象，GR在H6eH7区域表现出更高的突变频率。对PDB共晶结构的评估，其中配体与GR的配体结合域（残基500e777）复合，揭示了与GR复合的desisobutyrylciclesonide的结构（PDB代码4UDC, 4UDD）（图17B和C）。Peter S. Dragovich合成测试了多种含有不同胺基取代乙酸酯基团的类似物。其中，哌嗪化合物99显示出与地塞米松（97）和化合物98（GRE细胞，+ mTNF，IC50 Z 33纳摩尔/升）相似的细胞活性。然而，化合物99的渗透性差，这可能是由于化学结构中存在碱性胺基，从而减弱了其细胞效力。化合物99使用基于二肽的蛋白酶（Ala-Ala）可切割连接子与抗TNF mAb偶联，得到的偶联物在基于细胞的评估中活性较弱（IC50 Z 8.1毫摩尔/升）。进一步探索发现了含有苯胺基的化合物100，其效力比化合物99强，并且与地塞米松（97）和化合物98具有相似或更好的GR结合和细胞活性（GRE细胞，+ mTNF，IC50 Z 4.0纳摩尔/升）。随后，通过使用含有蛋白酶可切割二肽基团但缺乏氨基苄氧羰基间隔基团的连接子将化合物100与抗TNF单克隆抗体偶联，得到的偶联物在含有膜结合TNF的细胞中显示出强大的GR活性，而在外部缺乏这种蛋白的细胞中活性最小（GRE细胞，+ mTNF，IC50 Z 0.44毫摩尔/升；GRE细胞，mTNF，IC50 >50毫摩尔/升）。在胶原诱导的关节炎（CIA）模型中，以1, 3和10毫克/千克的剂量对小鼠进行腹腔注射，21天内爪子肿胀程度呈剂量依赖性降低。重要的是，这种偶联物具有较低的毒性副作用。因此，通过抗体偶联靶向递送糖皮质激素可以最小化不希望的副作用，同时提高未结合化合物的抗炎活性。 图 17 糖皮质激素受体调节剂(GRMs)的设计和SAR分析。(A) GRMs 97e102的化学结构；(B) 化合物97与GR复合物的结合模式（PDB代码4UDC）；(C) 化合物98与GR复合物的结合模式（PDB代码4UDD）。 William Olson的团队描述了新的糖皮质激素类药物。他们开发GC偶联物（GC‒ADCs）的策略是确定可以修改的布地奈德区域，以提高新游离载荷的偶联物稳定性和滴度。然后评估了布地奈德的两种修改方法：第一，用胺基或苯胺基团替代C21羟基；第二，用氟替代C9和C6的氢。含有胺基和苯胺基的有效载荷可以通过碳酸酯键与抗体偶联，这种键比羟基提供的碳酸酯或磷酸酯键更稳定。该团队通过对布地奈德分子的SAR分析和分子模拟，获得了两个领先化合物101和102。对化合物101、102的效力测试发现，这两种化合物比其他核激素受体更选择性地结合糖皮质激素受体（GR），在基于细胞的测定中具有与布地奈德相同或更好的效力，没有hERG的心脏毒性，没有Ames的基因毒性，并在体内促炎小鼠模型中显示出效力。在脂多糖（LPS）刺激的小鼠中，肿瘤坏死因子-a（TNF-a）的释放显著减少。随后通过组织蛋白酶可切割的连接子获得的GCeADC在血浆中非常稳定，并在抗原阳性细胞中特异性释放GCs，表明这些新型GC可以作为ADC有效载荷治疗自身免疫和炎症性疾病。 免疫激动剂在系统给药时激活非特异性免疫反应，严重时可能触发致命的细胞因子风暴。将免疫激动剂与肿瘤靶向抗体偶联可以将免疫激动剂递送到肿瘤微环境并在局部释放，减轻全身给药的严重毒性，并帮助避免抗肿瘤治疗中的系统性副作用。然而，尽管通过诱导免疫机制实现抗肿瘤效果的免疫刺激ADC药物的想法非常明确，并且临床前数据相对良好，但在临床试验中解决剂量依赖性毒性问题很困难。随着激动剂效力的增加，毒性也会增加，这使得很难确保可以安全可靠地提高疗效。例如，在小鼠肿瘤模型中显示出良好抗肿瘤效果的SBT6050，由于毒性问题目前在临床研究中表现不佳。因此，后续研究中最重要的考虑因素是毒性和效力之间的平衡。重新设计以减弱毒性并提高递送窗口也非常有利。 3.5. 新型潜在ADC有效载荷 3.5.1. Bcl-xL抑制剂 Bcl-xL是一种抗凋亡蛋白，在肿瘤形成、转移和药物抗性中发挥重要作用。理论上，通过药物阻断Bcl-xL上的BH3结合域可以触发癌细胞的凋亡。然而，Bcl-xL对血小板存活至关重要，Bcl-xL的泛抑制剂可能产生血小板毒性。将Bcl-xL作为ADC药物有效载荷的目标可能在减少对血小板的毒性的同时保持Bcl-xL抑制剂的活性。Tomoyasu Ishikawa对Bcl-xL抑制剂ABT-737（103）与Bcl-xL共晶的晶体结构分析，结果显示，该化合物的联苯基团（单元W）在由Phe146、Leu130、Leu108和Phe105（西部区域；h1 H2）组成的口袋中形成疏水相互作用，而化合物的烷基磺胺基团（单元E）在由Phe97、Tyr195和Tyr101（东部区域；h4）组成的另一个口袋中形成疏水相互作用（图18）。在单元E中，三个芳香环形成分子内π-π相互作用，形成独特的刚性U形构象。这种构象可能增强ABT-737（103）与Bcl-xL的分子间结合。此外，研究了一系列小分子抑制剂的结构-活性关系，发现单元E对Bcl-xL的抑制作用比单元W更重要，尤其是B环。晶体结构分析和结构-活性关系分析将为设计更有效的ADC有效载荷识别抑制剂提供基础。2017年，AbbVie首次将Bcl-xL抑制剂104作为有效载荷与抗B7H3抗体以ADC的形式共轭，获得针对EGFR的ABBV-155（ClinicalTrials.gov标识符：NCT03595059），仍在临床试验中（WO2017214301A1，WO2017214282Al）。 图 18 Bcl-xL抑制剂的设计和SAR分析。(A) Bcl-xL抑制剂103, 104的化学结构；(B) ABT-737 (103)与Bcl-xL复合物的结合模式（PDB代码2YXJ）。 3.5.2. NAMPT抑制剂 烟酰胺磷酸核糖转移酶（NAMPT）是将烟酰胺转化为烟酰胺单核苷酸的限速酶，控制细胞内NAD+的浓度。当NAMPT被抑制时，NAD+水平下降至低于代谢所需的水平，导致能量危机，最终导致细胞死亡。尽管NAMPT抑制剂是强大的细胞毒素分子，但由于其毒性，它们作为癌症治疗中的化疗药物受到限制。几种NAMPT抑制剂如FK-866（105）（图19A）因剂量依赖性毒性而中止了临床试验。然而，NAMPT抑制剂具有简单的结构和高效力，它们的激活机制与当前ADC有效载荷不同，因此NAMPT抑制剂可以作为具有良好活性和耐受性的ADC有效载荷，有望改善NAMPT抑制剂的治疗窗口，然后应用于临床环境。Chris Tse及其团队鉴定了具有强大临床前疗效和药代动力学特性的新型非底物NAMPT抑制剂，使其能够口服给药。这一系列中的领先分子A-1293201（106），包含一个异吲哚啉“头基团”，可以有效地抑制重组人NAMPT。通过X射线晶体学检查A-1293201与NAMPT之间的相互作用，揭示了几个协同相互作用的不同位点（图19B）。位点包括PRPP结合亚位点A，其本质上是亲水性的，未被烟酰胺占据，烟酰胺结合亚位点B，与烟酰胺进行重要的π堆叠和氢键相互作用，连接亚位点C，其狭窄、疏水，未被结合的烟酰胺占据，以及远端开口亚位点D，其扩大并提供几个结合水分子和疏水表面。与FK866以及最近的第二代NAMPT抑制剂类似，A-1293201的异吲哚啉脲部分在亚位点B中参与重要的π堆叠相互作用以及亚位点C中的氢键和疏水相互作用。与FK866以及最近的第二代NAMPT抑制剂不同，异吲哚啉脲化合物是已知的第一种有效的非磷酸核糖化的NAMPT抑制剂。Carl Uli Bialucha设计的新型NAMPT抑制剂107在NCI-H526、MDA-MB453和NCI-N87等多个细胞系中均有效，范围在nmol/L级别。结构-活性关系表明，吡啶氮可以被NAMPT酶磷酸化，是药效团的重要组成部分。此外，整个3-吡啶（S,S）环丙基羧酰胺基团对高水平的细胞活性至关重要。R3区域可以容忍各种取代基，通过用更硬的未取代苯环替换得到的乙基取代化合物108，对A2780和CORL23细胞系与化合物107具有相似的效果。苯环可以进一步衍生以提供最佳的载体用于连接，对苯环的对位添加哌嗪取代基是可容忍的化合物109。哌嗪基团上的游离次级胺可以作为连接子的偶联点与抗体结合。R3位置上的苯基哌嗪取代和R1和R2分别替换为F和H，得到的类似物110在nmol/L浓度下对C-Kit和HER2表达的细胞系有效。使用载荷110通过不可裂解连接子获得的抗C-Kit偶联物不仅具有低聚集性，而且具有最佳的抗CKIT活性（IC50分别为9和40 pmol/L），并且在c-Kit阳性胃肠道间质肿瘤的GIST-T1异种移植模型中显示出靶向性。ADC的有效载荷需要包含活性杂原子以结合可裂解连接子，而FK-866缺乏氨基、羟基或巯基功能团。为了获得一个容易整合并保持效力的有效载荷，Peter D. Senter准备了一系列的FK-866类似物，在芳香尾部的不同位置具有苯胺取代。这些化合物进一步评估了对L540cy、A549和HepG2细胞系的细胞毒性。化合物111在两种测定中显示出与FK-866相似的效力。NAMPT和化合物111的晶体表明，新引入的苯胺基团通过氢键与Glu376的主链酰胺相互作用，可能抵消了添加极性功能团的任何去溶剂化惩罚。用含有强效抑制剂chs-828的吡啶基腈胍基团制备的化合物112和用吡啶基方形酰胺基团制备的化合物113保持了与NAMPT的强结合并具有强细胞毒性。这些化合物已进入评估作为ADC药物有效载荷。在可耐受的剂量下，在几个肿瘤模型中显示出显著的活性水平。 图 19 NAMPT抑制剂的设计和SAR分析。(A) NAMPT抑制剂105e113的化学结构；(B) A-1293201 (106)与NAMPT复合物的结合模式（PDB代码5U2M）。 3.5.3. 卡玛霉素 蛋白酶体活性抑制剂是一类新兴的抗癌药物，对某些癌细胞具有极强的细胞毒性，环氧化物蛋白酶体抑制剂卡玛霉素是这一类别的代表。从海洋蓝藻Symploca sp.分离并鉴定出的卡玛霉素A（114）和B（115），它们的a,b-环氧酮直接连接到甲硫氨酸亚砜或甲硫氨酸磺酮，以低纳摩尔浓度抑制蛋白酶体的b5亚基，有效对抗多种癌细胞系（图20）。然而，由于它们的选择性差，它们通常表现出毒性副作用。使用高毒性的卡玛霉素衍生物作为ADC有效载荷保持了所需的效力，并实现了更好的耐受性。卡玛霉素可以分为四个不同的部分（P1-P4）。William H. Gerwick合成了第一代衍生物116，在P4的远端引入了氨基，通过替代6-氨基己酸链，显著降低了对NCI-H460细胞的杀伤效果（IC50 Z 860纳摩尔/升）。第二代卡玛霉素衍生物在P2含有2-氨基乙基同型半胱氨酸残基。直链烷基链被芳香性的苯基或吡啶环替代，得到衍生物117，其对HCT116和NCI-H460的细胞杀伤效果低于卡玛霉素B（115），因为P2的脂肪胺在生理pH值下是碱性并带正电荷，降低了其细胞穿透性。为了减少P2的碱性，团队将卡玛霉素B（115）的P2甲硫氨酸亚磺酰基团替换为4-硫代苯胺或4-磺胺苯胺，得到化合物118或119。化合物119比118更有效，这意味着更少的碱性胺基团效力更好。之后，合成了含有两个亮氨酸-环氧酮药物簇的衍生物120，其在HCT116和NCI-H460细胞系中的IC50分别为0.2和5.4纳摩尔/升。P1的环氧酮对化合物120的强细胞毒性活性至关重要。衍生物121含有P3的含苯胺侧链，对SKBR3细胞的IC50为21纳摩尔/升。将苯胺功能团置于衍生物122的P4位置比化合物121更有效地抑制细胞生长。在衍生物系列中，化合物119保持了高细胞效力，但其目前偶联的ADC与游离抗体相比，并未显示出对测试的癌细胞系具有优越的细胞杀伤能力。 图 20 卡马霉素类似物114e122的设计。 3.6. 新策略指导的ADC载荷 3.6.1. 以PROTAC分子为载荷的ADC ADC开发的主要挑战与剂量限制毒性（DLT）有关，这表明在药物疗效与非靶标毒性之间平衡的困难。ADC实际输送到肿瘤的药物剂量非常小，这意味着药物分子必须极其细胞毒性，尽管这可能导致有毒的副作用。PROTAC是一类双功能化合物，由针对感兴趣蛋白（POI）的配体、E3泛素连接酶的配体和连接链组成。PROTAC将POI和E3泛素连接酶拉近，用泛素化标记POI，然后由蛋白酶体降解。PROTAC是催化性的，因此能够在较低剂量下有效降解感兴趣的蛋白。PROTAC可能是ADC的理想载荷。通过将抗体和PROTAC分子结合形成的抗体-PROTAC结合物可以在特定细胞中特异性降解靶蛋白，实现PROTAC技术在细胞或组织水平上的选择性。抗体-PROTAC结合物将PROTAC的催化特性与ADC的组织特异性相结合，从而克服了传统靶向降解剂和ADC的限制，具有靶向新靶标的极大潜力。将针对BRD4蛋白的PROTAC分子123连接到HER2抗体上，可以形成分子量约为150 kD的抗体-PROTAC结合物，每个抗体分子平均有4个PROTAC分子（图21）。抗体-PROTAC结合物可以在HER2高表达细胞SK-BR-3中有效降解BRD4蛋白，并且对HER2低表达细胞MCF-7中BRD4蛋白没有降解作用。将BRD4抑制剂124连接到针对HER2的mAb的链间Cys残基上，使用马来酰亚胺基团结合，得到的ADC结合物可以降低BT-474（HER2阳性）细胞系中的BRD4水平。最近在专利文献中也描述了两种降解ERa的ADC。第一种是通过碳酸盐部分将基于VHL的PROTAC分子125连接到针对HER2的mAb上；第二种ADC使用含有酶的可裂解焦磷酸盐连接链连接到同一PROTAC的VHL结合区域。在MCF7-neo/HER2细胞中，两种结合物都表现出有效的抗原依赖性ERa降解，并且在小鼠稳定性和药代动力学测试中都显示出可接受的结果。具有CRBN作为E3泛素连接酶并针对TGFbR2蛋白的PROTAC分子126，可以通过不可裂解的连接链连接到抗HER2抗体上。在转染HER2受体的HEK293细胞中，0.5和1.0 mmol/L的ADC在24和48小时后降解了TGFbR2蛋白。此外，使用以VHL基降解BRM蛋白的PROTAC分子127作为载荷的ADC，通过单次静脉注射1 mg/kg，在已知表达高CD22表面受体的BJAB淋巴瘤异种移植肿瘤中实现了BRM蛋白的强烈抗原依赖性降低。这种结合物在体内表现出所需的生物活性，并进一步扩展了可以通过ADC模式成功调节的目标蛋白的范围，扩大了将PROTAC靶向到表达这种表面蛋白的细胞的可能性。 图 21 PROTAC分子123e127的化学结构。 尽管抗体-PROTAC结合物领域仍处于起步阶段，但已经创建了这样一群多样化的实体，其成员随后已经显示出在体外和/或体内具有有意义的生物活性。这些新实体中的许多使用了较高的载荷载荷（DAR值为六），相对于已知的大多数细胞毒性ADC（DAR为二到四），但是否通常需要这种增加还有待确定。使用描述的结合物在体内和体外都实现了抗原依赖性活性的多个例子，这些结果证明了抗体-PROTAC结合物模态将各自的PROTAC载荷传递到特定的肿瘤和/或感兴趣的细胞的能力。鉴于这些有希望的初步结果，抗体-PROTAC结合物似乎为未来的增长和应用做好了准备。预计未来，抗体-PROTAC结合物将应用于组织或生物体，为药物治疗或生物研究提供新的思路。 3.6.2. 以NIR-PIT药物为载荷的ADC 近红外光免疫疗法（NIR-PIT）药物通常由针对肿瘤的肿瘤特异性单克隆抗体和通过连接链连接的光激活化学物质组成，本质上是ADC药物。NIR-PIT药物可以与照射肿瘤部位的红外光设备形成新的靶向抗癌平台。该平台实现了抗体介导的靶向输送，实现了高度的肿瘤特异性，同时使用红外光激活药物的生物物理机制，准确诱导癌细胞的快速死亡，而不损害周围正常组织。NIR-PIT药物诱导的多克隆免疫反应可以消除NIR-PIT药物第一步后存活的肿瘤细胞，即使NIR-PIT药物不足、输送不均匀或剂量不足，由于目标抗原的不均匀表达，作为随后的第二步多克隆免疫反应也会杀死残留的肿瘤细胞。此外，NIR-PIT药物也可以作为现有的PD-1单克隆抗体、PD-L1单克隆抗体或CTLA-4单克隆抗体的有用补充，增强它们的肿瘤免疫反应。NIR-PIT药物中的载荷不是细胞毒性物质，而是水溶性的酞菁衍生物（例如，硅酞菁衍生物IR700（IRDye700DX）(128))（图22A）。IR700是一个小的、可被近红外光激发的光激活分子，没有光毒性或生物毒性。当抗体结合到肿瘤表面抗原时，在近红外光的刺激下，IR700经历光诱导的配体释放反应，释放亲水侧链，导致剩余部分的疏水性显著增加。这反过来破坏细胞膜，触发针对癌细胞的快速和高度选择性的免疫原性细胞死亡（ICD）（图22B）。在直接杀死癌细胞的同时，NIR-PIT诱导的ICD可以导致接近死亡的未成熟树突状细胞的快速成熟，启动宿主的抗癌免疫反应，促进对死亡癌细胞释放的抗原的CD8阳性T细胞的重新形成，并进一步放大NIR-PIT的治疗效果。 图 22 IRDye700DX (128)的设计和分析。(A) IRDye700DX (128)的化学结构；(B) NIR-PIT ADC的作用机制。 2020年，以商品名Akalux获得PMDA加速批准的Rakuten Medical的Cetuximab Sarotalocan是一种由西妥昔单抗和水溶性硅酞菁衍生物IRDye700DX组成的抗体-结合药物，针对表皮生长因子受体，用于治疗不可切除的局部晚期或局部复发性头颈部癌症，使其成为世界上第一个批准的光免疫疗法药物。给药后24小时，药物可以特异性地聚集在EGFR阳性肿瘤细胞表面。使用690纳米波长的近红外光照射肿瘤部位，诱导Cetuximab sarotalocan杀死癌细胞并激活免疫反应。在NIR-PIT药物研究中进展最快的是Rakuten Medical的ASP-1929（也称为RM-1929）。ASP-1929是一种西妥昔单抗和IR700的结合药物，针对表皮生长因子受体EGFR，可用于治疗不可切除的局部晚期或复发性头颈部癌症。除了ASP-1929，Rakuten Medical还有几种NIR-PIT药物在与PD-1单克隆抗体联合应用的晚期肿瘤动物模型的临床前研究中表现出了出色的抗肿瘤活性。其他一些NIR-PIT药物研究，包括131I（PcMAb）（CD38单克隆结合的NIR-PIT药物）、TROP-2-IR700、ramucirumab-IR700、结合物AvIR介导的PIT、抗TF抗体1849-ICG结合物、MN-14-700DX、Avelumab-IR700等都是以IR700作为载荷。作为ADC领域中的“非主流轨道”，光免疫ADC的临床和市场前景仍需经受时间的考验。然而，基于相关原理开发新靶标和新的光激活效应分子可能成为ADC轨道上的新突破点。 3.6.3. 双载荷ADC 随着ADC治疗耐药性的出现，将一种抗体与两种甚至更多不同的细胞毒性载荷结合提供了开发下一代ADC的有吸引力的选择。为了展示双载荷药物ADC可能的好处，Levengood等人在2017年制备了一类含有两种不同微管聚合抑制剂的ADC。该团队将具有不同物理和化学性质的MMAE和MMAF连接到同一抗CD30抗体上，以执行互补的抗癌活动。这项工作清楚地展示了构建有效的双药ADC的潜在有效方法，以及输送多种细胞毒性载荷如何提高ADC活性。后来，Kumar等人开发了一种异质三功能连接链，将MMAE和PBD二聚体载荷结合到产生双载荷药物ADC。Nilchan等人使用双抗体结合方法生成了一种含有目标微管载荷MMAF和DNA拓扑异构酶II抑制剂PNU-159682的双载荷ADC，通过在工程硒代半胱氨酸和半胱氨酸残基位点特异性结合HER2抗体。PNU-159682由于其DNA损伤活性导致S期细胞周期停滞，而MMAF同时抑制微管聚合并导致G2/M期细胞周期停滞。双药ADC对表达HER2的细胞系显示出选择性和强大的细胞毒性，并表现出与所附药物一致的双重作用机制。ADC药物经常遇到与肿瘤异质性相关的问题。例如，乳腺癌通常由具有不同基因表达谱的多种细胞组成，其异质性是化疗后药物抗性、复发和转移的主要因素。为了解决这个问题，Kyoji Tsuchikama通过化学酶连接方法有效地构建了一系列具有明确药物-抗体比率（DAR）的双载荷ADC（分别为2+2、4+2和2+4的DAR组合），DAR调整的灵活性有利于根据疾病目标和载荷组合对ADC的物理化学性质、效力和毒性进行微调（图23）。其中，DAR为(4+2)的MMAE/MMAF双载荷ADC比DAR为4或6的MMAE单药ADC更有效，具有特异性的HER2细胞杀伤能力，理想的药代动力学特性，最小的炎症反应，以及治疗剂量下的边缘毒性。此外，在具有HER2异质性和对TDM1增加抗性的JIMT-1/MDA-MB-231混合异种移植小鼠模型中，双载荷ADC比两种单一药物组合具有更大的治疗效果和生存益处。 图 23 双载荷药物ADC的模式图（红色和绿色形状代表不同的载荷）。 原因可能是更强的MMAF分子杀死了JIMT-1细胞，帮助结合的MMAE分子对邻近的MDA-MB-231细胞有效地发挥旁观者效应。重要的是，这种显著的疗效不能通过单独的1:1组合的MMAF ADC和MMAE ADC实现。双载荷ADC的增强疗效也在另一种具有低HER2、肿瘤内异质性和T-DM1抗性的乳腺癌hCC1954-TDR异种移植小鼠模型中得到证明。结果突出了双载荷ADC克服乳腺癌异质性和药物抗性的潜力，表明同时输送具有不同药物特性的两种载荷是ADC基于治疗其他具有异质性和药物抗性的难治性癌症的有前途的方法。使用他们的Synthemer平台，剑桥研究人员设计了一种结合了auristatin F羟丙酰胺（AF-HPA）和DNA单烷基化剂（I-BiP）的双载荷ADC，表现出强大的细胞毒性，并且可以发挥两种作用机制。然而，虽然多载荷ADC药物可以提高疗效并降低药物抗性的可能性，但它们治疗引起的副作用也值得考虑。例如，Mersana开发的针对NaPi2b的新型ADC药物Upifitamab Rilsodotin（UpRi，XMT-1536）通过抗HER2单克隆抗体HT-19的可裂解连接链与auristatin F羟丙酰胺细胞毒性药物结合，DAR为12。XMT-1536具有极强的抗肿瘤活性，特别是对HER2表达低的癌症。然而，卵巢癌的中期1期临床数据显示，XMT-1536可能导致严重的与治疗相关的副作用，发生率高达48%（47/97）。最常见的副作用是胃肠道梗阻（7%），发热、肺炎和腹痛的发生率是5%。尽管Mersana试图降低剂量，但治疗窗口选项的范围狭窄，前景不容乐观。因此，对于多载荷ADC，安全性控制在进行多类载荷组装时是一个需要关注的重要问题。关键是找到并处理治疗窗口狭窄的原因。未来的研究也应该继续朝着在疗效和毒副作用之间取得平衡的方向努力。 3.6.4. PDC的载荷 肽药物偶联物（PDCs）是一种新型靶向疗法，由连接链、定位肽和细胞毒性载荷组成。与ADC药物相比，PDC药物具有分子量小、肿瘤穿透力强、免疫原性低、可通过固相合成大规模合成、生产成本低、药代动力学相对良好以及批间产品相对一致等优点。它们是在小分子靶向药物、单克隆抗体和ADC之后的下一代靶向抗肿瘤药物。然而，PDC作为治疗药物的应用也存在一定的局限性，例如口服生物利用度低、半衰期短、一些载荷的不完全裂解导致与原型药物相比生物活性显著降低，以及可能比ADCs的靶向性差。PDC的作用机制取决于连接链和定位肽。一种是PDC被内化并在细胞内释放载荷。另一种是PDC在肿瘤微环境中裂解，载荷被内化以发挥其作用（图24A）。大多数载荷不仅可以杀死高表达目标的肿瘤细胞，还可以通过肿瘤微环境中的旁观者效应杀死周围表达低或不表达目标的肿瘤细胞。肽可以影响PDC内化的效率。理想的PDC肽应具有强大的目标结合亲和力、高稳定性、低免疫原性、高内化率和相对长的血浆半衰期。连接链的选择是PDC设计的关键因素之一。连接链需要平衡稳定性和释放效率。可裂解连接链具有更高的释放效率，而不可裂解连接链更稳定。载荷的毒性和物理化学性质可以直接影响药物杀死肿瘤的能力，从而影响其疗效。理想的载荷应具有高细胞毒性（通常IC50低）、低免疫原性、高稳定性、适当的疏水性和良好的溶解性。PDC载荷可分为化学药物（图24B）、蛋白质药物和肽药物。其中，以DM1(2)、MMAE(8)、KSP抑制剂(45)、喜树碱(54)、多柔比星(129)、紫杉醇(130)、甲氨蝶呤(131)、柔红霉素(132)和吉西他滨(133)为代表的化学药物较为常见。蛋白质药物主要包括干扰素和肿瘤坏死因子。放射性同位素也常作为PDCs的载荷。当PDCs用于癌症诊断时，它们可以被标记为正电子发射放射性同位素（氟-18(18F)、铜-64(64Cu)和镓-68(68Ga)）以产生PET成像。通过结合肿瘤细胞上的靶向受体，可以准确定位恶性组织。放射性同位素标记的PDCs也可以用于治疗。肽受体放射性核素治疗(PRTT)基于其过度表达的受体对肿瘤细胞进行靶向和组织特异性辐射。最常用的放射性同位素是铟-111(111In)、钇-90(90Y)和镥-177(177Lu)。 图 24 PDCs的关键结构和作用机制。(A) PDCs的一般作用机制；(B) 常见的PDC载荷的化学结构。 截至2023年4月，全球只有两种PDC药物获批上市，分别是Lutathera和Pepaxto 。Lutathera是由诺华子公司Advanced Accelerator Applications S.A.开发的靶向生长抑素受体的PDC。进入细胞后，它释放放射性同位素177Lu，通过辐射损伤肿瘤细胞。它于2017年9月首次获得欧洲药品管理局(EMA)批准。在晚期神经内分泌肿瘤患者中，Lutathera与高剂量长效奥曲肽相比，具有更长的无进展生存期和更高的反应率。它于2018年1月26日获得FDA批准。Pepaxto是由Oncopeptides开发的靶向氨肽酶的PDC，由DNA烷基化剂Melflufen(134)与靶向氨肽酶的肽共价连接而成。Melflufen具有高脂溶性，可以被骨髓瘤细胞迅速吸收。一旦进入细胞，Melflufen的偶联肽立即被氨肽酶裂解，释放出亲水性烷基化剂美法仑(135)，对肿瘤细胞的DNA造成损伤，导致肿瘤细胞死亡。Pepaxto于2021年2月首次获得FDA批准，与地塞米松联合用于治疗成人复发或难治性多发性骨髓瘤。然而，在同年10月，Oncopeptides宣布主要由于确证性OCEAN研究中死亡率增加，将Pepaxto从美国市场撤回。2022年8月，Pepaxto获得EMA批准。目前，全球共有17种PDC药物处于临床开发阶段，其中3种处于III期，9种处于II期，5种处于I期。主要靶标是微管和CA9，MMAE(8)是主要载荷。PDC是一种克服了ADC一些限制的等效抗体-药物偶联物，具有许多独特优势。尽管目前市场上PDC药物较少，也有因严重安全问题而撤回的案例。然而，随着相关技术问题的解决和支持技术的突破，相信PDC药物也将在未来十年拥挤的赛道上成为研究和投资的热点。 4.结论 ADC药物开发前景广阔，因为它们整合了针对选择性肿瘤细胞靶向的特异性抗体、结合了广泛的强效细胞毒性载荷，并运用了多样化的连接链技术，以产生有效的癌症治疗药物。从技术角度来看，ADC药物迄今为止已经经历了三代的变化，在抗体、药物载体、连接链等方面取得了突破，尤其是在载荷的使用上。尽管新一代ADC载荷的特异性和细胞毒性与早期阶段相比表现出显著改善的特性，但目前的载荷仍有一些限制。首先，它们通常对实体瘤的渗透性和毒性有限，这限制了它们在实体瘤中的应用。其次，一些肿瘤对当前ADC药物不敏感。第三，载荷药代动力学的复杂性、肿瘤靶向和释放不足都可能影响ADC药物的疗效。第四，与其他抗肿瘤药物一样，ADC药物也可能产生耐药性。最后，早期的载荷选择倾向于毒性大但有效的药物，但其较高的毒性限制了载荷的系统应用。尽管抗体-药物偶联物在治疗中显示出有效性，但与高毒性载荷的结合并不一定是出色的。因此，正在开发其他类型的载荷，如RNA抑制剂、免疫激动剂和促进凋亡的Bcl-xL抑制剂。特别是随着FDA批准免疫检查点阻断疗法，肿瘤免疫疗法时代开始了。免疫激动剂ADC也已经开发出来，它们可以使用抗体将免疫激动剂输送到肿瘤微环境并在局部释放，缓解了免疫激动剂系统给药的严重毒性问题。免疫激动剂（如Toll样受体、STING激动剂等）也越来越多地作为新载荷在ADCs中流行，免疫调节ADCs有望进一步提高免疫检查点阻断疗法的抗肿瘤免疫反应。尽管免疫ADC仍处于开发初期，尚未取得令人满意的临床结果，但免疫调节ADC有潜力大大拓宽ADC的治疗窗口，提高其抗肿瘤活性，并具有理想的安全性和有效性。相信通过免疫调节载荷修改针对肿瘤微环境的ADC设计仍然是未来研究领域的热点，特别是使用不直接对细胞有毒的载荷（例如可以引导免疫系统攻击癌细胞的载荷）。此外，使用PROTAC分子作为ADC载荷可以充分发挥PROTAC的催化特性和ADC的组织特异性优势，并克服靶向降解剂和ADC的传统限制（如药物抗性、毒性副作用等）。鉴于有希望的结果，PROTAC-ADC是未来ADC药物开发的重要方向。抗体结合载荷还包括来自植物（例如皂苷、蓖麻毒素A链）或细菌毒素（PE、假单胞菌外毒素、DT、白喉毒素）的蛋白质衍生酶，这些酶通过催化不可逆地抑制蛋白质合成诱导细胞死亡。新型载荷类别还包括寡核苷酸、siRNA、蛋白质等。为了解决传统ADC载荷的缺点，除了开发和修改传统和新型潜在载荷外，还出现了许多新的ADC设计策略。例如，通过将具有不相关机制的不同载荷与同一抗体结合的ADC药物设计，可以通过最小化耐药性的可能性来实现协同效应，并同时靶向不同的靶标，为其他具有异质性和药物抗性的难治性癌症的治疗开辟了新的途径，这对于实体瘤尤为重要。同时，在设计混合载荷时，应强调疗效和毒性之间的平衡。此外，通过抗体介导的靶向输送，由光激活化学物质作为载荷和特异性单克隆抗体组成的ADC可以实现高度的肿瘤特异性，并通过使用激光激活的生物物理机制精确诱导癌细胞的快速死亡，避免伤害周围正常组织，并实现精准治疗的要求，这也是未来值得探索和期待的发展方向。尽管ADC已经发展至今，但它们可用的载荷骨架类型并未增加，大多数细胞毒性药物都是precore主干的衍生物。目前只有少数具有高度细胞毒性的天然化合物、衍生物或合成类似物具有作为ADCs载荷并进入临床的潜力。尽管新型ADC载荷和指导ADCs构建的新策略不断出现，但这些仍然处于开发初期，未来的方向需要更多实验来验证。因此，在下一代ADCs中，需要通过筛选天然产物库、化学合成和天然产物的直接衍生化，开发具有多种作用机制、更高疗效和更少副作用的结构新颖的高效载荷（例如具有简单结构、高活性和特殊作用机制的NAMPT抑制剂），以提高活性及其耐受性。然而，新骨架的发现是具有挑战性的，需要在天然产物鉴定、高通量筛选或基于结构的药物设计等领域进行大量工作。相比之下，对批准或研究充分的载荷进行结构修改可以更快地识别新型载荷。获得母核化合物后，应充分利用构效关系和晶体学技术来探索母核化合物与靶标的结合方式，以及化合物的有效作用位点和有效功能团。只有这样，才能有效地进行母核化合物的后续优化和转化。在修改载荷时，调整其物理化学性质，特别是其极性，可以克服ADCs的制备和应用中面临的一些问题。连接太多疏水性载荷可以改变抗体的构象稳定性，增加其聚集和沉淀的趋势，并最终影响其最大DAR、血浆稳定性、旁观者效应等。疏水性载荷可以轻易穿透细胞膜，并通过旁观者效应杀死周围抗原阴性的肿瘤细胞，而亲水性载荷从癌细胞中扩散出去的速度较慢。此外，大多数ADCs面临的一个主要问题是大的毒性副作用，其中由载荷引起的毒性副作用主要体现在对快速增殖的健康细胞的损害，如淋巴细胞减少和胃肠道反应。因此，可以选择具有小分子量、良好的组织穿透力和短半衰期的载荷，这些载荷可以在释放后迅速富集在目标位置并快速执行杀死癌细胞的功能。同时，血液中的药物分子可以迅速清除，有利于减少系统性毒性副作用。也可以突变靶标的重要位点，然后修改和筛选出更耐受的化合物。总之，新型ADC载荷与传统载荷之间存在一些差异：1）传统的ADC载荷大多选择药理作用强但毒性副作用也较大的小分子，如PBD，而新型载荷倾向于选择药理作用和毒性副作用适中的小分子，如Dxd。2）传统的ADC载荷主要由微管抑制剂和DNA损伤剂组成，而新型ADC载荷具有更丰富的靶标类型、更多的选择和与传统载荷不同的机制。例如，使用免疫刺激剂作为ADC载荷。3）传统ADC小分子载荷的结构通常复杂且难以合成。新型ADC载荷倾向于选择结构简单、分子量低的小分子，大大降低了合成难度并扩大了ADC载荷的应用市场。4）传统的ADC载荷通常使用通过连接链直接与抗体连接的单一类型的小分子化合物，而新型ADC可以将不同类型的载荷结合起来，实现1+1>2的效果。除了传统的小分子化合物外，新型载荷还选择如PROTAC和光激活分子等新型有效载荷。尽管ADC药物已经发展至今，其疗效已大大改善，但仍存在一些问题，如药物抗性、不良反应和血浆中稳定性不足等需要解决。载荷在ADC药物的疗效中占据重要地位，因此我们结合相关的晶体结构和构效关系研究，总结了ADC小分子载荷及其未来趋势，以期为ADC药物载荷的未来发展和随后的优化转化提供更多新的参考，以构建更多的ADC药物，提高其治疗效果，克服药物抗性，减少不良反应，并促进ADC药物研究的发展。