Galeterone

研究背景目前，第二代竞争性AR配体结合结构域（LBD）靶向拮抗剂主要用于CRPC的临床治疗，包括恩扎卢胺和阿帕鲁胺。尽管这些药物最初有效，耐药性不可避免地产生，已成为抗前列腺癌治疗的挑战。多种可能导致耐药的机制被发现，包括AR的扩增和过表达、AR LBD点突变和AR剪接变异体（AR-Vs）。特别是AR-V7是最广泛表征的AR-Vs之一，缺乏LBD，并被确定为在CRPC中促进AR转录的一个关键雄激素非依赖驱动因子。相应地，目前批准的所有AR LBD靶向药物都被认为在表达AR-V7的CRPC中表现出有限的疗效。最初作为CYP17A1抑制剂开发的Galeterone后来被发现具有诱导AR/AR-V7降解的能力，但遗憾的是，其特异性有限，降解活性较弱。鉴于甾体配体有可能与其他核激素受体发生交叉反应，在进一步开发Galeterone衍生物时应严格考虑脱靶效应。此前，Miller的小组报告称，通过用在比卡鲁胺中发现的芳基丙酰胺部分取代类固醇核心，鉴定了一系列口服生物可利用的非甾体AR/AR-V7降解剂，其在体外和体内对各种恩扎鲁胺耐药细胞显示出前所未有的活性。代表性化合物UT-34，尽管来源于LBD靶向拮抗剂比卡鲁胺，但可以与AR N-末端结构域（AR-NTD）结合。从结构上讲，目前报道的大多数AR/AR-V7降解调节剂由亲脂性支架组成，该支架与降解活性所必需的关键N杂环降解子相连。鉴于目前缺乏基于AR/ARV7降解的获批药物，因此需要开发新的候选药物分子。图1研究内容在本工作中，中国药科大学向华研究团队首先设计并合成了在UT系列的设计中广泛使用的含有吡唑或吲哚基的化合物19a−19k。用恩扎鲁胺、UT-34、EPI002（AR-NTD靶向拮抗剂）、ARV110和Galeterone作为对照筛选AR/AR-V7阳性22RV1细胞的抗增殖活性。如表1所示，所有测试的化合物（22a−22d，IC50值范围为2.0至40μM）都显示出比恩扎鲁胺（IC50=46.3μM）更好的抗增殖活性。其中，化合物19c、19d和19e的IC50值分别为3.7、2.0和3.9μM，它们比Galeterone更有效，支持了作者的设计理念。表1随后引入吡啶作为由乙酰胺连接体连接的杂环，通常会降低抗增殖活性，大多数化合物的IC50值超过20μM（表2）。其中，苯基A环上带有氰基的化合物（21e−22g）的抗增殖活性优于带有硝基的化合物（20a−20d）。表2为了进一步扩展杂环的类型并考察连接体类型对生物活性的影响，制备了一系列含喹啉的化合物。如表3所示，当R3位置的乙酰胺链被乙胺链取代时（22b−22e vs 24c−24f），抗增殖活性显示出显著提高。然而，那些被较长的丙胺链取代的化合物（25a−25e）的效力相对较低，这表明乙基链是最佳的连接体。其中，化合物24d（5位连接，IC50=1.3μM）和24f（7位连接，IC50=2.2μM）表现出最有潜力的活性。值得注意的是，当喹啉环被萘环取代时，活性显著降低甚至丧失（23a IC50＞50μM；23b＝19.5μM），表明含氮杂环是活性的必需基团。此外，在乙胺连接的化合物中，喹啉环取代的化合物（24c−24f）表现出比含有单环的化合物（24h−24l）更高的抗增殖活性（表3）。表3与24c−24f相比，乙胺末端氮上具有双取代杂环的26a−26e表现出较弱的活性，这表明氮上的单取代更具潜力（表4）。   表4为了进一步增强其抗增殖活性，设计并合成了27a−27g，以研究不同取代基和位置对24d喹啉环的影响（表5）。其中，喹啉环8位F原子取代的化合物27c表现出最强的抗增殖活性，IC50值为0.9±0.4μM。此外，大多数化合物对AR阴性PCa细胞（DU145）的抗增殖活性测试的IC50值均大于50μM，表明这些化合物对AR阳性PCa细胞具有良好的选择性（表5）。表5    随后作者就对化合物进行了活性测定。考虑到它们有希望的抗增殖活性，选择化合物24f、24j、24k、27a、27b和27c，通过Western Blot分析评估它们在22RV1细胞中的AR/AR-V7降解活性。如图2A所示，在超过10μM浓度化合物处理后，AR/AR-V7蛋白水平显著降低，而恩扎鲁胺没有表现出降解活性。化合物27c有效诱导AR/AR-V7蛋白对22RV1细胞的进一步剂量曲线研究显示，27c在20μM时诱导AR和AR-V7几乎完全降解，对AR和AR-V7的DC50值分别为2.67和2.64μM（图2C）。鉴于其显著的抗增殖活性和AR/AR-V7降解能力，因此选择最有效的化合物27c作为后续体外和体内研究的候选化合物。图2为了进一步探索27c对其他PCa细胞的影响，进行了27c在AR阳性LNCaP细胞中的降解和抗增殖活性。如图3A 27c所示，以剂量依赖的方式显著诱导AR降解。时间进程研究显示，27c诱导AR降解具有时间依赖性，6小时后观察到AR显著降低（图3B）。值得注意的是，如图3D所示，恩扎鲁胺和27c对正常人肝L02细胞均无抑制活性，IC50值超过100μM，对于LNCaP有比Galeterone更优的活性，这意味着AR降解有助于27c对AR阳性细胞系的抗增殖活性。   图3为了进一步研究27c降解AR/AR-V7的机制，对用核糖体抑制剂环己酰亚胺（CHX）处理的22RV1细胞中的AR/AR-V7.的蛋白质印迹分析表明，27c加速了AR和AR-V7的降解（图4A，B）。图4虽然AR-V7不具有LBD区域，作者想知道27c是否也能与AR的其他区域结合，然后诱导AR-V7降解。由于NTD被认为是AR的另一个重要分子靶区。先前，进行表面等离子体共振（SPR）来测量AR-NTD和27c的相互作用。将AR-NTD蛋白（重组6His，MET1-GLN556）和27c添加到Biacore芯片中，并测量SPR。可以清楚地看到，当芯片负载AR-NTD蛋白时，27c使光谱发生了偏移（图5）。这一结果证实了27c与AR-NTD的相互作用。   图5为了验证27c诱导的降解是否与泛素-蛋白酶体途径有关，作者用硼替佐米（一种蛋白酶体抑制剂）处理22RV1细胞。如图6所示，用硼替佐米联合处理显著逆转了27c诱导的22RV1细胞中AR和AR-V7的降解，表明27c可以通过蛋白酶体途径诱导降解。图6作为核受体超家族的一员，AR与其他类固醇受体具有高度序列同源性。为了检查靶点选择性，在用不同剂量的27c处理24小时的22RV1细胞中检测到ER或MR的蛋白质水平。如图7所示，即使在20μM的高剂量下，ER和MR的蛋白质含量也几乎没有变化。总之，这些数据有力地证实了27c以蛋白酶体依赖的方式选择性降解AR/AR-V7。   图7先前的一项研究表明，Galeterone通过E3连接酶MDM2诱导AR/AR-V7的降解，据报道，众所周知的MDM2/p53相互作用拮抗剂Nutlin3可以上调MDM2蛋白的表达。因此，为了确定27c和E3连接酶MDM2之间的相关性，用Nutlin3处理22RV1细胞，这加剧了AR/AR-V7的降解（图8）。分子对接进一步表明，27c主要通过与氨基酸GLN55和LYS90的相互作用，很好地适应MDM2的表面（图8）。这些结果表明，E3连接酶MDM2可能在27c诱导的AR/AR-V7降解中协同作用。图8当AR被内源性配体激活时，它二聚化并易位到细胞核，在那里它与DNA结合并调节相关靶基因的表达。免疫荧光测定显示，27c处理后，细胞核定位以及AR和AR-V7的表达都显著降低（图9）。   图9对AR信号通路转录活性的影响。为了检测对AR信号通路转录活性的影响，作者通过RNA测序分析评估了27c对22RV1细胞转录组的影响。显然，一系列AR激活的基因被抑制了（图10）。图10作者还基于用10μM27c处理的22RV1细胞的转录谱进行了GSEA。GSEA显示，AR信号通路的基因和调节基因被27c抑制（图11）。接下来，作者通过定量实时聚合酶链式反应（qRT-PCR）检测了三个典型的AR下游调控基因（KLK3、TMPRSS2和KLK2）。一致地，27c剂量依赖性地抑制这些基因的mRNA表达水平（图11）。所有这些数据都表明27c可以抑制AR信号通路。此外，用5或10μM 27c处理22RV1细胞12h。作者发现27c不影响AR和AR-V7的mRNA表达。   图11为了评估27c对CRPC细胞克隆活性的影响，作者将22RV1细胞暴露于恩扎鲁胺或27c中2周。实验证明27c以剂量依赖性方式显著降低22RV1细胞集落数量（图12）。随后，使用流式细胞术研究了27c对22RV1细胞周期分布的影响。如图12所示，用27c处理的G0/G1期22RV1细胞的数量分别增加。图12然后，通过Annexin V-FITC/PI染色测定检测用化合物27c处理后22RV1细胞的凋亡诱导。用化合物27c处理后，22RV1细胞的凋亡率分别增加（图13）。此外，作者还使用蛋白质印迹分析来研究27c诱导22RV1细胞凋亡的能力。如图13所Bcl-2和Bcl-xL的蛋白质水平以浓度依赖性的方式降低。此外，RNA测序数据的GSEA显示，内源性凋亡信号传导的基因被27c上调（图13）。这些结果表明，化合物27c以剂量依赖的方式诱导了22RV1细胞的显著G0/G1细胞周期停滞和凋亡。   图13为了评估27c的药代动力学特性，对27c的体外和体内药代动力学研究进行了研究，结果分别如图14和表5所示。在体外稳定性研究中，27c在小鼠血浆中表现出良好的稳定性，孵育60分钟后保留率没有显著变化。如图14和表6所示，大鼠单剂量静脉注射5mg/kg后，27c表现出可接受的稳态分布体积（2.51L/kg）和中等半衰期值（1.39 h）的合理暴露。此外，在大鼠单剂量口服50mg/kg后，27c也表现出良好的血浆浓度曲线，并伴有中等半衰期值（2.16h）的合理暴露。这些结果表明，27c具有中等的药代动力学特性，适合进一步研究。图14表6为了评估27c在体内的PCa抑制活性，作者建立了22RV1细胞皮下异种移植到NSG小鼠中的肿瘤模型。当肿瘤体积达到平均大小时，对小鼠进行阉割。在肿瘤显示出再生趋势后，给小鼠施用载体对照、30mg/kg恩扎鲁胺、30mg/kg阿比特龙或30mg/kg 27c，持续21天，每天一次。与对照组相比，恩扎鲁胺组和阿比特龙组在体重、肿瘤体积和生长率方面没有显著差异。然而，27c组的肿瘤体积和生长率显著降低（图15）。此外，当小鼠用10 mg/kg 27c给药3天时，肿瘤组织中AR和AR-V7的蛋白质水平降低，凋亡细胞数量显著增加（图15）。图15与对照组相比，27c组的肿瘤生长抑制率达到63%，表明27c可以抑制去势后22RV1前列腺肿瘤的生长。此外，治疗组的心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏的HE染色在组织学检查中没有显示任何大体器官异常（图16）。所有这些数据提供了27c可以在体内克服mCRPC中存在的AR拮抗剂耐药性。   图16研究结论作者开发了新一代单价AR/AR-V7双降解剂，将Galeterone的类固醇核心替换为源自恩杂鲁胺的配体部分。对55种N-杂环取代化合物的系统SAR研究确定了最有前景的27c，其在LNCaP和22RV1细胞中显示出优异的抗增殖活性和有效的AR/AR-V7降解活性。作者研究了27c可能与MDM2相互作用并通过泛素-蛋白酶体系统降解AR/AR-V7的降解机制，并有效抑制AR/AR-V7.核转位和AR信号通路相关基因的表达。27c对22RV1细胞的ER和MR没有降解作用，表明27c对核受体具有良好的选择性。此外，27c在体外和体内都具有可接受的药代动力学特性，并在恩扎鲁胺耐药的22RV1异种移植物模型中表现出显著的肿瘤消退。治疗组的心、肝、脾、肺和肾的HE染色在组织学检查中没有显示任何大体器官异常。这些发现表明了了27c作为单价AR/AR-V7双降解剂在表达AR剪接变异体的晚期前列腺癌中克服耐药性的潜在效用。作者：郑一榕校审：周金明编辑：郑一榕时间：2024年4月22日参考文献Maoxu Xiao et al, Hua Xiang. Structure–Activity Relationship (SAR) Studies of Novel Monovalent AR/AR-V7 Dual Degraders with Potent Efficacy against Advanced Prostate Cancer Maoxu Journal of Medicinal Chemistry 2024 67 (7), 5567-5590. DOI: 10.1021/acs.jmedchem.3c02177声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！长按关注本公众号   粉丝群/投稿/授权/广告等请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓