Aceneuramic acid

首个单克隆抗体疗法Muromonab-CD3用于治疗肾脏排斥反应，于1986年在美国和欧洲获批使用，标志着制药行业从以小分子药物为主向抗体类治疗药物的重大转变。如今，市场上已有超过100种获批的抗体类治疗药物，约有60种处于临床后期审查阶段，还有数百种处于1期和2期临床研究中。与小分子药物不同，抗体治疗药物是大型、复杂、异质且动态的蛋白质，需要复杂的分析策略来全面表征它们，并确保良好的质量控制和患者安全。液相色谱与质谱联用（LC-MS）是一项强大的技术，是表征抗体类治疗药物的许多分析方法的核心。凭借少量的材料和最少的样品制备，LC-MS可以生成关于多种抗体特征的详细信息，这些信息涉及其纯度、异质性、功能和稳定性。很少有其他技术能在灵敏度、特异性和通量方面与LC-MS相媲美。更少的技术具有LC-MS的灵活性，使其能够跟上新型生物治疗模式的快速发展。抗体类治疗药物的LC-MS表征涵盖了广泛的分析方法，包括分子量测定、氨基酸测序、修饰的鉴定、宿主细胞蛋白分析、抗体-药物偶联物分析、稳定性测试、药代动力学/药效学（PK/PD）研究以及高阶结构分析（图1.1）。 每年都有数百篇研究文章发表，描述了通过LC-MS表征抗体类治疗药物的新应用和技术进步。这种持续的发展是由不断增长的生物制药行业的需求推动的，该行业一直在开发更有效、更安全的抗体类治疗药物。随着LC-MS在生物制药界和监管机构中获得更广泛的认可，以及新的应用领域不断被探索，这种趋势可能会持续一段时间。 本章将涵盖基于LC-MS的抗体类治疗药物的生物物理表征的当前应用和最新进展。第1节将简要描述该领域中一些较为成熟的LC-MS技术，第2节将重点介绍特定属性的LC-MS分析，包括不太为人所知的翻译后修饰（PTMs）和药物偶联物。最后，第3节将探讨最近的创新和趋势，这些创新和趋势可能会显著影响未来抗体类治疗药物的分析方式。第1节 常用于抗体类治疗药物表征的液相色谱-质谱技术在本节中，将简要概述用于抗体类治疗药物表征的更为成熟的液相色谱-质谱（LC-MS）技术。完整抗体的分析完整质量分析是一种简单、快速的质谱技术，用于测定抗体的质量，几乎不需要样品制备。它可以作为高通量检测方法，用于监测重组抗体类治疗药物的身份、纯度和翻译后修饰（PTMs）。电喷雾离子化质谱（ESI-MS）非常适合用于分析抗体等大蛋白，因为它可以产生多电荷离子，这些离子可以通过扫描范围相对有限但能够产生高分辨率质谱的质谱仪进行分析，例如Orbitrap和四极杆飞行时间（Q-TOF）质谱仪。ESI-MS可以与分离技术（如反相液相色谱（RPLC））联用，以去除干扰离子化和检测的盐和其他缓冲成分，并且可以自动化运行，无需人工值守。尽管已经实现了完整抗体的单位质量分辨率，但由于超高分辨率会导致信号强度显著下降且几乎没有额外益处，完整质量分析通常在较低分辨率下进行。即使在单位质量分辨率下，抗体也太大，单同位素质子峰在当前质谱仪的动态范围内太小而无法被观察到。因此，完整质量分析测量的是抗体的平均质量，而不是单同位素质子质量。 通过观察到的分子量，可以快速区分抗体的不同“蛋白形式”。 “蛋白形式”是由Top-Down蛋白质组学联盟提出的术语，指的是“单个基因的蛋白质产物可以存在的所有不同分子形式，包括由于遗传变异、选择性剪接的RNA转录本和翻译后修饰而产生的变化”。通常可以从观察到的质量推断出每种蛋白形式的氨基酸序列和修饰。完整质量分析存在局限性：它无法检测导致质量零变化的修饰（例如，二硫键重排、天冬氨酸异构化）并且在区分导致质量变化较小的修饰（例如，脱酰胺和氧化）时可能会有困难，尤其是当这些修饰的含量较低时。高度异质的蛋白质通过完整质量LC-MS进行分析可能会有挑战，因为复杂的质谱通常难以解析和解释。然而，通常可以在完整质量分析之前去除常见的异质性来源，如N-糖基化或C末端赖氨酸，以便更容易检测到其他更相关或低水平的特征，如糖化、药物偶联或双特异性抗体的异二聚体/同二聚体比例。中间分析在典型的“中间”分析工作流程中，抗体在进行质谱分析之前被选择性地切割和/或还原为“较大”（通常>7 kDa——参见Lermyte等人关于术语的讨论）的多肽片段。抗体通常在铰链附近被酶切，并且链间二硫键被化学还原。例如，进行抗体“中间”分析的最常见准备方法是使用酶IdeS在铰链下方进行切割，然后用二硫苏糖醇（DTT）处理还原二硫键，从而得到一个重链Fc/2片段、一个重链Fd片段和轻链。通过完整质量LC-MS分析测量每个片段的质量，通常在色谱分离后进行。由于片段较小，因此获得的片段质量分辨率高于完整抗体的质量分辨率。此外，片段的分子量轮廓通常较为简单，易于解释。“中间”分析有助于确定修饰或序列错误的区域位置，并区分和表征Fc和Fab糖基化。随着更多用于铰链处特异性切割的酶的商业化，这种技术在过去10年中得到了广泛应用。第3节提供了用于抗体铰链区特异性切割的酶及其应用的详细描述。底物分析“底物”分析涉及使用一种或多种蛋白酶将抗体切割成小肽（通常<3 kDa），并在质谱和MS/MS分析之前通过色谱法（通常为RPLC）分离这些肽。可以使用特定的蛋白酶，如胰蛋白酶（最常见）、LysC、AspN或GluC（也称为金黄色葡萄球菌蛋白酶V8），或非特异性蛋白酶，如胃蛋白酶。蛋白酶切割可以在溶液中的自由抗体或固定在凝胶或固定相上的抗体上进行，从而释放肽进入溶液。“底物”LC-MS用于抗体表征，以确认氨基酸序列，识别和定位修饰，并确定每个位点的相对丰度，并在样本之间进行详细比较。通过气相碎裂技术（如碰撞诱导解离（CID））产生的肽离子的MS/MS谱可以与预期的抗体氨基酸序列匹配，使用数据库搜索和序列匹配算法来确认身份。如果失败，未识别的MS/MS谱可以手动解释，以确定新的氨基酸序列或修饰的存在。最后，通过“底物”分析未还原的抗体消化物可以提供有关二硫键连接的信息。 “扩展底物”一词用于描述LC-MS分析中等大小的肽，这些肽介于通常用于“底物”或“中间”分析的肽之间。在扩展底物分析中，抗体在微酸性pH下与非特异性蛋白酶分泌的天冬氨酸蛋白酶9（Sap9）孵育有限时间，以产生平均大小约为3.5 kDa的肽。使用标准“底物”LC-MS条件，但用C8柱代替标准的C18 RPLC柱，以补偿较大肽的增加的疏水性。扩展底物的优势在于提高了序列覆盖率，并且更有信心识别IgG，特别是当区分相似的IgG时，因为识别的肽长度增加，识别独特肽的可能性增加。通过质谱分析的高阶结构分析高阶结构质谱（HOS-MS）分析用于研究抗体-抗原相互作用，并探测由于在不同缓冲液中配方、降解过程、翻译后修饰或药物偶联而导致的抗体类治疗药物三维结构的变化。HOS-MS可以评估相同生物治疗药物批次之间的结构相似性或生物类似药与原研药物之间的结构相似性。HOS-MS的优势在于能够以中到高的分辨率检测抗体结构变化。因此，它补充了其他HOS分析技术，如圆二色光谱、X射线晶体学和核磁共振（NMR）光谱。 在典型的HOS-MS实验中，处于天然状态的抗体或抗体-抗原对在溶剂暴露的残基处被标记，然后被消化成肽段，并通过LC-MS进行分析。通过标记导致的质量增加来识别含有暴露残基的肽段。将标记的肽段映射到抗体的三维模型（通常是同源模型）上，以确定实验条件如何影响结构。例如，在抗原结合时，结合位点的标记会减少，由于变构效应，周围位点的标记可能会增加或减少。最流行的HOS-MS分析是氢/氘交换质谱（HDX-MS，也称为HX-MS），其中溶剂暴露的主链酰胺氢与缓冲液中的氘交换。该技术能够检测并确定蛋白质主链方向的动态变化位置。在共价标记质谱（CL-MS）中，特定氨基酸侧链与化学标记物共价修饰。这种方法具有检测侧链方向变化的优势（在某些情况下，这可能比蛋白质主链的变化对功能更相关），并且产生永久标记，可以更容易地通过成熟的“底物”分析进行识别和定量。最后，交联质谱（XL-MS）使用多功能试剂在空间上接近的氨基酸侧链之间形成共价键，从而确定两个相互作用蛋白之间的距离或同一蛋白的两个残基之间的距离。宿主细胞蛋白分析宿主细胞蛋白（HCPs）来自用于表达治疗性抗体的细胞系，并通过分泌或细胞裂解释放到培养基中。通过LC-MS/MS研究已经鉴定了培养基中存在数千种HCPs。下游纯化工艺会去除许多HCPs，但要完全去除所有HCPs可能是一个挑战。许多因素影响纯化抗体产品中HCP杂质的组成和丰度，包括细胞培养基中HCP的初始丰度以及它们在纯化过程中与治疗蛋白共洗脱或非共价结合的趋势。即使经过多步纯化，HCPs在蛋白质药物中的浓度仍可能高达100 ppm。因此，为所有生物治疗药物设定并实现最终产品中HCP污染的可接受限度是一个重要要求。 通常使用针对宿主细胞蛋白的多克隆抗体的酶联免疫吸附试验（ELISA）来监测HCP丰度。ELISA是一种简单、定量的总HCP含量测量方法，但无法提供存在的HCP的身份信息，并且依赖于HCP与所用多克隆抗体的反应性。另一方面，LC-MS可以识别和定量单个HCPs，并且不依赖于免疫原性。对于基于LC-MS的分析方法的挑战在于，HCPs通常比生物治疗产品低几个数量级。大多数用于HCP分析的LC-MS策略利用二维色谱（2D-LC）的出色分离能力，在进行MS分析之前分离抗体/HCP消化物。大多数采用高pH RPLC作为第一维LC，低pH RPLC作为第二维。使用MS/MS或MSe分析结合数据库搜索进行HCP鉴定。离子迁移质谱（IM-MS）可以增加一个分离维度，以帮助检测。可以通过MRM使用同位素标记肽内标、在Q-TOF仪器上使用Hi3片段离子策略或在数据非依赖采集模式下通过光谱计数来实现HCP定量。据报道，在NISTmAb参考材料（见第3节）中检测和定量HCPs的浓度低至1 ppm。 基于MS的HCP检测和定量方法正在不断发展，但目前仍然存在分析时间长和实验室间重复性差的问题。然而，正在探索创新技术，如使用样本串联，以缩短2D-LC-MS分析时间。ELISA可能会在一段时间内仍然是HCP监测和产品放行的主要分析方法，但理想情况下，将ELISA和LC-MS结合起来使用将更有效地进行HCP监测和控制。第2节 抗体类治疗药物的液相色谱-质谱表征抗体类治疗药物在生产、纯化和储存过程中可能会发生多种修饰。在本节中，我们将描述其中一些修饰以及检测和定量它们的可能方法。某些修饰通常只存在于少数抗体蛋白上，但可能仍然具有功能意义。表1.1列出了已知发生在抗体和抗体类治疗药物上的翻译后修饰的质量差异和位置。确认一级序列及检测切割液相色谱-质谱（LC-MS）通常用于确认抗体类治疗药物的身份。全面确认氨基酸序列的工作流程包括完整质量LC-MS分析以及对肽段消化物进行“底物”LC-MS/MS测序。通过中等至高分辨率质谱仪观察到的抗体质量应与预测氨基酸序列（加上已知的翻译后修饰，如二硫键或糖基化）的理论平均质量在±20 ppm以内[3]。观察到的质量与计算质量之间的差异可能表明氨基酸序列错误、蛋白酶切割、二硫键形成不良或意外的翻译后修饰。 “底物”LC-MS/MS是确认氨基酸序列的首选方法，通常的做法是使用两种或三种不同的蛋白酶进行多次LC-MS/MS实验，以实现整个序列的LC-MS/MS覆盖。如果怀疑序列错误，“中间”分析通常用于缩小质量差异的位置，以便通过“底物”LC-MS/MS识别氨基酸变化。 抗体可能会发生意外切割，特别是在N-和C-末端附近、连接β-折叠的溶剂暴露的柔性环或铰链区。毛细管电泳-十二烷基硫酸钠（CE-SDS）或十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）可以检测广泛的切割，但LC-MS在检测仅丢失几个氨基酸的切割方面更具优势。某些情况下，只有在还原或变性条件下才能检测到蛋白的切割，因为切割后的蛋白部分通过二硫键或非共价相互作用保持在一起。靠近末端的轻微切割可能不会影响抗体活性（尽管丢失标签可能会导致纯化问题），但会增加抗体的异质性，并且可能是长期稳定性问题的征兆。C末端赖氨酸的部分丢失是一种非常常见的切割。其他常见切割包括末端甘氨酸（N-或C-末端）的丢失以及从组氨酸标签上丢失一个或多个组氨酸。切割通常由某些氨基酸侧链催化，并受pH（抗体通常在pH 5-7时最稳定）、温度、金属离子（尤其是Cu²⁺）的存在以及蛋白结构的影响。特别容易发生非酶促断裂的肽键包括Xaa-Ser（其中Xaa是任何氨基酸）、Asp-Xaa（在pH < 5时，尤其是Asp-Pro）、Asn-Xaa和Gly-Gly。二硫键的β-消除可能导致Xaa-Cys处的切割。如果β-消除产生的脱氢丙氨酸发生水解（图1.2C），则将在前半胱氨酸的N末端发生切割（β-消除的另一种最终产物是硫醚键）。在IgG1的铰链区，主要的切割位点是Asp-Lys（在pH < 5时）和Ser-Cys（由于在pH > 7时发生β-消除）。切割也可能是由宿主细胞蛋白酶引起的酶促反应。宿主细胞蛋白酶的共纯化可能只有在稳定性压力测试期间才会显现出来。通常可以通过使用蛋白酶抑制剂来抑制酶促切割，但改进生产工艺和纯化过程中去除蛋白酶的协议更为理想。半胱氨酸修饰确保正确形成二硫键是表征重组抗体的重要步骤。典型的IgG在每个12个结构域中各有1个链内二硫键，2个二硫键连接轻链和重链，以及2到11个（亚型依赖）铰链二硫键连接两个重链。这些二硫键的重排、还原或修饰可能会对生物治疗药物产生负面影响。例如，抗体二硫键还原为游离硫醇已被观察到会降低抗原亲和力，增加聚集倾向，和/或降低热稳定性。一些常见的半胱氨酸残基修饰如图1.2所示。 在重组表达的抗体和从血清中提取的抗体中都观察到了游离硫醇（图1.2B）。可以通过Ellman试剂法或游离硫醇反应性荧光标记光谱法测量蛋白质的游离硫醇丰度，但这些方法可能存在灵敏度和精度较差的问题，并且无法提供有关游离硫醇的位置或分布的信息。如果用马来酰亚胺衍生物（如马来酰亚胺-PEG2-生物素）标记游离硫醇，则可以通过完整质量LC-MS轻松且灵敏地检测到游离硫醇，因为游离硫醇的存在会观察到显著的质量变化。Robotham和Kelly通过首先用d0-NEM标记游离硫醇，然后在还原后用d5-NEM标记剩余的半胱氨酸来确定抗体中游离硫醇的位置。在温和酸性条件下进行蛋白酶消化以防止标记丢失和重排，并使用LC-MS/MS根据其高d0/d5-NEM比值识别含有游离硫醇的肽段。当游离硫醇暴露于溶剂中时，它可能会发生半胱氨酸化和谷胱甘肽化，分别导致特征性的质量变化+119 Da和+305 Da（图1.2F）。 IgG1中连接轻链与重链的二硫键容易形成硫醚键（图1.2D），尤其是在暴露于高温或碱性条件下时。硫醚键的形成会使完整抗体的质量减少32 Da（硫的质量）。硫醚键是通过β-消除二硫键形成的脱氢丙氨酸和半胱氨酸发生反应，通过迈克尔加成形成共价键。由于这种键不可还原，因此在“底物”或“中间”LC-MS分析的还原条件下观察到硫醚连接的轻链-重链对。硫醚键的形成会降低Fab的灵活性，可能会影响双价结合。重链-轻链二硫键以及铰链链间二硫键也容易形成三硫键，其中在二硫键中插入一个硫原子（图1.2E）。人们认为三硫键是在发酵过程中由于二硫键与硫化氢的反应而形成的。Gu等人通过使用LysC在pH 6.5下消化未还原的蛋白质，然后进行“底物”LC-MS分析，确定了天然和重组抗体中三硫键的位置和相对丰度。三硫键连接的肽段比预测的二硫键连接肽段质量大32 Da。尽管它们增加了生物治疗药物的异质性，但没有证据表明三硫键会影响抗体结合或活性，并且大多数三硫键在体内会迅速转化为二硫键。二硫键重排可能会发生在任何抗体类生物治疗药物中，但对于IgG2和IgG4亚型来说是一个特别值得关注的问题。IgG2可以存在三种不同的二硫键排列异构体：IgG2-A、IgG2-B和IgG2-A/B（图1.3）。这些异构体在高阶结构方面有所不同，这会影响热稳定性和结合效率。IgG4也容易发生二硫键重排，铰链半胱氨酸在链间和链内二硫键之间切换。因此，IgG4的重链和轻链可能通过非共价相互作用结合，并且在体内观察到IgG4抗体的Fab臂交换。可以通过对未还原抗体消化物进行“底物”LC-MS/MS分析来确定不同二硫键异构体的相对丰度。电子转移解离（ETD）或电子捕获解离（ECD）质谱/质谱碎裂技术可以选择性地断裂二硫键以释放连接的肽段，而碰撞诱导解离（CID）则会导致肽段主链的优先断裂。这些技术可以按顺序使用（即ETD后跟CID），以更有信心地识别二硫键连接的肽段。N-糖基化N-糖基化是抗体的常见翻译后修饰。几乎所有抗体都在Fc区的单一天冬酰胺残基（Asn-Ser-Thr）处发生N-糖基化，较小比例的抗体在重链或轻链上的其他天冬酰胺上发生N-糖基化（例如西妥昔单抗）。N-糖基化序列（Asn-X-Ser、Asn-X-Thr或偶尔的Asn-X-Cys，其中X是任何非脯氨酸氨基酸）是N-糖基化的先决条件，但并非保证。可以通过完整质量分析确定抗体的整体糖基化水平，“中间”分析可以区分Fc和Fab区的N-糖基化，“底物”分析可以确定每个N-糖基化位点的糖基化。标准反相液相色谱（RPLC）通常用于“底物”分析，但也可以使用亲水相互作用色谱（HILIC）和其他糖肽富集色谱来分离糖肽和非糖基化肽。也可以通过PNGaseF处理从蛋白上释放N-糖链，然后进行标记，并通过基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）或HILIC-荧光进行分析。 一般来说，用于蛋白表达的流行细胞系，如中国仓鼠卵巢（CHO）或人类胚胎肾293（HEK293），表达的抗体具有明确定义的N-糖链，由一组有限的糖基组成（即N-乙酰葡糖胺（GlcNAc）、N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）、甘露糖（Man）、葡萄糖（Glc）、半乳糖（Gal）、岩藻糖（Fuc）以及小鼠细胞系中的N-乙酰神经氨酸（NeuAc），以及N-羟乙酰神经氨酸（NeuGc））。因此，通常可以通过质量加和单独推断出存在的N-糖链的数量和一般组成。质谱无法区分糖的异构体；“HexNAc”用于表示糖是GlcNAc或GalNAc，“Hex”用于表示Man、Glc或Gal。占据Fc N-糖基化位点的糖链通常是无唾液酸的、双天线型复杂糖链，而占据Fab位点的糖链则倾向于更加异质化并且有唾液酸化。通常，每个N-连接位点都被多种糖链物种占据，导致糖基化抗体具有异质化的质量轮廓。在LC-MS之前，通常使用PNGaseF去除N-糖链，或使用外糖苷酶将其修剪至共同核心，以便于表征其他抗体特征。通过完整质量或“中间”LC-MS进行糖基化分析可能会因O-糖基化或糖化存在而变得复杂，必须小心区分这些修饰与N-糖基化。O-糖基化在一些通常不用于生产抗体类治疗药物的免疫球蛋白类别上观察到了O-糖基化：IgA1、IgD和IgG3以及小鼠IgG2b。在所有这些情况下，O-糖基化位于铰链区，并且由黏液素型糖链组成，如GalNAcGalNeuAc2（或在小鼠IgG2b的情况下为GalNAcGalNeuGc2）。在完整的IgG1上未报告O-糖基化，IgG1是重组抗体最常用的亚类。然而，在单独表达的IgG1 Fc片段上、缺少一个或两个轻链的抗体构建物上以及包含IgG1型Fc结构域的融合蛋白上观察到了O-糖基化（未发表结果）。当IgG1（利妥昔单抗）的Fc片段单独表达时，观察到了IgG1 Fc片段的O-糖基化（GalNAcGalNeuAc2），但在通过木瓜蛋白酶从完整利妥昔单抗中生成相同片段时则没有观察到。人们认为O-糖基化的位点位于铰链区附近，因为当IgG的Fab部分缺失时，对该区域的接触大大增加。其他团队在将肽融合到Fc结构域或抗体时发现了意外的O-糖基化，在某些情况下，O-糖基化对融合构建物的活性产生了负面影响。 可以通过完整质量LC-MS分析检测到具有O-糖基化特征质量变化（例如，HexNAcHexNeuAc为+656 Da，HexNAcHexNeuAc2为+947 Da）的抗体。如果首先使用PNGaseF去除N-糖链，将更容易通过LC-MS检测到O-糖基化。由于除了O-糖基化发生在丝氨酸和苏氨酸残基上之外，没有O-糖基化的共识序列，因此识别O-糖基化位点比识别N-糖基化位点更具挑战性。“自上而下”LC-MS分析已用于识别O-糖基化位点，但目前“底物”LC-MS/MS是首选方法。使用HILIC富集可以有助于检测低丰度的O-糖肽。CID MS/MS谱通常由糖氧鎓离子（例如204 Da、366 Da、292 Da）主导，并且从完整糖肽中中性丢失糖残基，没有关于连接位点的证据。电子捕获解离（ECD）或电子转移解离（ETD）碎裂方法更适合于确定连接氨基酸，因为这些碎裂方法倾向于保留O-糖基化等微妙修饰。糖化N-末端或赖氨酸残基侧链的非酶促糖化是重组和内源性单克隆抗体的常见翻译后修饰。重组抗体的糖化通常发生在发酵过程中，当时表达的蛋白暴露于细胞培养基中的高浓度还原糖（如葡萄糖）。如果抗体在储存过程中暴露于还原糖，或者在高温和酸性pH下暴露于蔗糖（一种常见的配方缓冲液成分），也可能发生糖化。甚至在冻干的单克隆抗体上也观察到了糖化。糖化是不受欢迎的，因为它增加了生物治疗药物的异质性，并且可能还有其他负面影响。最近的一项研究发现，互补决定区（CDR）中的糖化干扰了抗原结合，并且关于糖化是否增加单克隆抗体聚集的证据尚不一致。还有担忧认为，当在体内暴露于高氧化条件下时，糖化的生物治疗药物可能会进一步降解为晚期糖化终产品（AGEs），并触发AGEs特异性受体的表达和不良免疫反应。AGEs还与重组抗体产品的变色有关。鉴于安全方面的担忧，糖化是一个必须监测和控制的属性。 通过完整质量LC-MS分析检测到糖化，表现为特征性的162 Da质量变化。如果首先对蛋白进行脱糖基化，糖化更容易被检测到，因为许多N-糖型之间仅相差一个己糖（162 Da）。尽管罕见，但162 Da的增加也可能由于O-糖基化和岩藻糖基化导致，即一个葡萄糖或甘露糖连接到丝氨酸残基上。此外，两个磷酸化/硫酸化也具有与糖化相似的质量（+160 Da）。可以通过使用“底物”LC-MS确定修饰位点来区分糖化与其他修饰。由于糖化丰度通常较低（<10%），并且分布在多个位点上，除了溶剂可及的伯胺之外没有糖化的共识序列，并且胰蛋白酶和LysC不会在糖化的赖氨酸残基处切割，因此检测可能会有挑战。一般来说，CIDMS/MS谱中的糖化肽倾向于表现出简单的己糖残基失水，并且几乎没有信息丰富的肽段碎片离子。可以通过多种方式克服这些挑战。例如，可以使用硼酸亲和高效液相色谱（BAC-HPLC）富集糖化蛋白，并且BAC-HPLC-UV已用于确定整体糖化丰度。BAC-HPLC基于糖化糖的顺式-1,2-二醇阵列与硼酸配体的相互作用分离糖化和非糖化形式。用硼氢化钠或氰基硼氢化钠处理糖化肽可以稳定糖化，并因此产生更高质量的CID MS/MS谱。此外，替代的MS/MS碎裂技术如电子转移解离（ETD）可以产生比CID更优越的序列信息，因为修饰在碎裂过程中不会丢失，从而可以确认糖化的位点。天冬酰胺脱酰胺和天冬氨酸异构化天冬酰胺的脱酰胺和天冬氨酸异构化为异天冬氨酸可能会影响抗体类治疗药物的结构、功能和稳定性。如果这些修饰发生在互补决定区（CDR），则会影响抗原结合，并且可能导致免疫原性问题。天冬酰胺脱酰胺会使抗体增加一个负电荷，可以通过等电聚焦电泳（cIEF）或离子交换色谱（IEX）等基于电荷的检测方法进行监测。“底物”LC-MS可用于确认脱酰胺位点。每个天冬酰胺脱酰胺会使肽段质量增加1 Da。相反，天冬氨酸和异天冬氨酸是同分异构体，仅通过质谱单独区分更具挑战性。然而，天冬氨酸异构化为异天冬氨酸可能导致肽段更亲水，并且通过反相液相色谱（RPLC）的保留时间更短。通过结合RPLC和MS提供的信息，可以识别脱酰胺和天冬氨酸异构化的位点（图1.4）。在“底物”LC-MS样本制备过程中必须特别小心，因为典型的蛋白酶消化条件本身可能会导致脱酰胺和天冬氨酸异构化。Kori等人发现，在20 mM Tris缓冲液（pH 7.8）中进行消化，含有10%乙腈，可以显著减少天冬酰胺脱酰胺和异天冬氨酸伪影。在20 mM碳酸氢铵中过夜消化的模型胰蛋白酶肽段，天冬氨酸异构化为33.8%，而在20 mM Tris 10%乙腈中仅为4.5%。通常，确定哪些残基最容易发生脱酰胺可能比确定样本中当前的脱酰胺水平更重要，因为体内可能会发生额外的脱酰胺。 琥珀亚胺是天冬酰胺脱酰胺和天冬氨酸异构化的关键中间体，本身也是抗体类治疗药物的重要修饰（图1.5）。由于在“底物”LC-MS样本制备中常用的中性和碱性条件下琥珀亚胺不稳定，因此常常被忽视。Cao等人开发了一种LC-MS方法，用于检测和定量琥珀亚胺，该方法在pH 5.4-5.8下进行还原、烷基化和蛋白酶消化。热应激抗体上琥珀亚胺的含量随时间增加，但在pH 7.6下几乎完全转化为脱酰胺产物。此外，还可以通过疏水相互作用色谱结合紫外检测（HIC-UV）区分未修饰、脱酰胺和琥珀亚胺形式的抗体，结果与在低pH条件下制备的消化物的LC-MS肽段图谱结果非常吻合。氧化氧化会影响抗体类治疗药物的功能和稳定性。氧化可以通过热、光或生产与储存过程中产生的活性化学杂质（如活性氧）诱导产生。蛋氨酸残基最容易被氧化。不太为人所知的是，其他氨基酸残基也容易被氧化，尤其是色氨酸。色氨酸的氧化降解产物具有发色团，会使降解后的抗体溶液呈现颜色。色氨酸残基在CDR中的氧化会对抗原亲和力产生重大影响。鉴于CDR环的溶剂可及性和相对灵活性，CDR中的色氨酸可能更容易被氧化，尽管侧链取向和相邻残基的性质等因素也会影响其氧化的易感性。使用2,2'-偶氮双(2-氨基丙烷)（AAPH）在游离蛋氨酸存在下进行强制氧化，可以选择性地氧化色氨酸残基，从而识别出易被氧化的色氨酸残基。Pavon等人将该技术与“自下而上”的液相色谱-质谱（LC-MS）结合，证明了两种单克隆抗体（mAbs）CDR3区域中的单个色氨酸易被氧化。LC-MS鉴定出多种氧化产物，展示了色氨酸氧化降解途径的复杂性（见图1.6）。 药物偶联 抗体可以通过与细胞毒性药物有意结合来制备抗体药物偶联物（ADCs），这是一种主要用于癌症治疗的高度特异性和强效治疗药物。ADCs可以通过多种不同的方式使用各种连接子和药物载荷来合成。药物通常通过连接子与抗体的赖氨酸氨基、游离巯基或修饰后的糖链糖结合。不出所料，这些独特的生物治疗药物在表征方面具有挑战性，然而，大量的文献表明，液相色谱-质谱（LC-MS）非常适合完成这项任务。 ADCs的一个关键质量属性是它们的药物与抗体比率（DAR）。定量紫外（UV）分析通常用于确定ADC的平均DAR，但溶液中游离药物的存在可能会导致偏差。测量ADC群体中药物分布（即具有0、1、2、3等DAR的抗体分子的比例）更具挑战性。疏水相互作用色谱与紫外检测（HIC-UV）常用于确定具有明确结合位点的ADCs的DAR分布，但对于使用随机结合策略（即赖氨酸结合）制备的ADCs则面临挑战。另一方面，完整质量LC-MS分析几乎可以用于测量所有ADCs的DAR分布，无论其性质和制造方法如何。此外，LC-MS还可以识别不寻常的ADC物种（例如带有连接子但未附着药物的抗体），这些物种通常无法通过其他方法检测到。 “自下而上” LC-MS是识别药物结合位点的首选方法；然而，确定每个位置的结合程度可能具有挑战性，因为未结合药物和药物结合肽段在ADC消化液中的LC-MS行为不同。Hill等人能够在通过串联质谱标签修饰NISTmAb参考材料制备的替代ADC上，测量98%的可用伯胺的结合位点。他们证明，尽管许多赖氨酸在一定程度上被修饰，但轻链上的N端以及赖氨酸187特别易于结合。LC-MS还可以用于测量ADC制剂中游离（未结合）药物的量。例如，Birdsall等人开发了一种二维液相色谱-质谱（2D-LC-MS）方法，该方法在第一维度使用固相萃取（SPE）陷阱，在第二维度使用反相液相色谱（RPLC）。未结合药物的药物-连接子产物在SPE陷阱上积累，而ADC则通过。通过这种方式，他们能够测量ADC制剂中低至个位数ppm水平的游离药物，比同等紫外方法灵敏度高出两个数量级。 ADCs的体内稳定性尤为重要，因为药物在与靶点结合之前过早释放可能会产生不希望的毒性副作用，并缩小治疗窗口。通过从血清中免疫富集ADCs，然后进行完整质量LC-MS分析，已被用于测量DAR并监测ADC的体内稳定性。例如，Xu等人将生物素化的靶抗原固定在顺磁性链霉亲和素珠子上，并用其从给药猴的血浆中捕获赖氨酸和半胱氨酸结合的ADCs。对免疫分离的ADCs进行完整质量LC-MS分析，揭示了DAR随时间逐渐降低，表明药物在血液循环中的损失（见图1.7）。Excoffier等人开发了一种更具通用性的免疫捕获方案，该方案针对ADCs的Fc部分，并证明它可以用于从血清中富集具有可切割和不可切割连接子的ADCs。从血清中以足够纯度和浓度富集ADCs，以便能够确定DAR分布，仍然是ADC分析的一个挑战。 抗体和其他抗体融合蛋白的其他修饰 酪氨酸硫酸化是一种罕见的抗体修饰。硫酸化和磷酸化都会增加大约80 Da的质量（分别为79.9568 Da和79.9663 Da），可以使用具有非常高质量和分辨率的质谱仪进行区分。或者，可以通过其在MS/MS中的CID碎片化模式来区分硫酸化和磷酸化；硫酸化表现出80 Da的中性损失，而磷酸化具有特征性的98 Da中性损失。Zhao等人观察到，他们通过CHO细胞生产的部分人IgG与阴离子交换树脂结合，并存在+80 Da的质量差异。通过“自下而上”分析，他们确认修饰为硫酸化。随后使用ETD碎片化将硫酸化定位到一个酪氨酸残基上。酪氨酸硫酸化对抗体的影响尚不清楚，但对于许多其他蛋白质，酪氨酸硫酸化识别是蛋白质-蛋白质相互作用的重要驱动力。Chumsae等人报告了几种抗体的N端通过柠檬酸发生共价修饰，导致质量增加174 Da或156 Da。柠檬酸是一种常用的生物治疗制剂缓冲剂，用于维持pH在3到6之间，并且在下游处理过程中经常用于从亲和树脂上洗脱抗体。推测这些修饰是柠檬酸酐与N端氨基发生反应的结果，导致+174 Da的酰胺修饰和两种不同的+156 Da环状酰亚胺修饰。观察到几种不同的N端残基发生了修饰，但未观察到赖氨酸侧链氨基发生类似的修饰。Chumsae等人推测，其他具有两个或更多相邻羧基的缓冲剂，如己二酸、苹果酸、琥珀酸或酒石酸，也可能形成类似的N端修饰。 抗体融合蛋白中常用的富含甘氨酸的连接肽（如（GGGGS）n或（GGGGP）n）容易发生修饰，如磷酸化、O-木糖基化、基于木糖的糖链（如Xyl-Gal-Neu5Ac和Xyl-Gal-Gal-GlcA）以及羟脯氨酸形成。这些修饰可以通过其特征性的质量变化在完整质量分析或“自下而上”分析中被检测到（见表1.1）。可能需要MS2或MS3与CID、HCD和/或ETD结合，以确认修饰的确切位置。由于这些连接肽修饰通常远离结合区域，因此这些修饰不太可能干扰抗体结合，但可能会引发潜在的免疫原性问题。 第3节 LC-MS 基础抗体表征的使能技术及未来发展方向 新的参考材料 2016年，NISTmAb参考材料8671（由美国国家标准与技术研究院生产的单克隆IgG1k）首次向研究人员公开，首次提供了一个高度表征的重组单克隆抗体，用于方法开发、系统适用性测试和实验室间比较研究。在2016年之前，虽然也有一些重组单克隆抗体商业可用（例如Waters的Intact mAb Mass Check Standard和Sigma的SILuLite SigmaMAb Universal Antibody Standard），但这些抗体并未得到充分表征，且使用并不广泛。许多实验室开发了自己内部的参考抗体用于方法开发，这使得不同实验室开发的方法难以进行比较。NISTmAb通过一个多实验室、国际化的努力得到了充分表征，使用多种方法评估了其身份、纯度、聚集、稳定性、糖基化、翻译后修饰和高阶结构。这些研究的结果发表在《治疗性单克隆抗体表征的最新进展和新兴技术》三卷本系列书籍和后续论文中。NISTmAb并不能取代在开发新的抗体类治疗药物或生物类似药时对产品特定标准的需求，但它作为一个有用的外部标准，可用于比较不同实验室开发的方法。 使能酶 在过去10年中，由Genovis等公司商业化的新型抗体蛋白酶为特异性抗体切割和“中间向上”/“中间向下”分析提供了新的选择。以前，抗体的部分切割是使用木瓜蛋白酶和胃蛋白酶进行的。木瓜蛋白酶在IgG的铰链上方切割，生成Fc和Fab片段。胃蛋白酶在铰链下方切割，生成F(ab')2片段，而Fc片段则发生广泛的蛋白水解。胃蛋白酶和木瓜蛋白酶的协议需要针对每种单克隆IgG进行仔细优化，以避免过度消化，且所需片段的产率通常为45e55%。IgG特异性半胱氨酸蛋白酶IdeS（Genovis以“FabRICATOR”品牌名推出）的引入，使得人类IgG1能够以一种简单、完整且可重复的方式特异性地切割成F(ab')2和Fc/2片段。IdeS在铰链下方的一个特定位置切割人类IgG（见图1.8），其特异性和效率远高于胃蛋白酶，且该协议无需针对个别抗体进行优化。IdeS现在是用于IgG亚单位“中间向上”/“中间向下”表征中最常用的酶。 最近，Genovis引入了在铰链上方一个特定位置切割IgG以形成Fab和Fc片段的酶。SpeB（2014年推出的FabULOUS）可以在还原条件下切割广泛的IgG范围，Kgp（2015年推出的GingisKHAN）在非常温和的还原条件下（2 mM半胱氨酸）切割人类IgG1，IgdE（2017年推出的FabALACTICA）在天然条件下切割人类IgG1的铰链上方。生成Fab片段特别感兴趣，因为这种抗体片段保留了重轻链配对信息。Kgp已被用于确定重轻链配对，并在双特异性抗体生成过程中检测轻链交换。具有交换轻链的异二聚体抗体与正确配对的抗体是同分异构的，但在Fab片段水平上，错误配对很容易被识别。此外，结合使用在铰链上方和下方切割的酶已被用于分离抗体的铰链区域，并识别还原的二硫键。 自上而下和中间向下分析 “自上而下”质谱在抗体类治疗药物表征方面的潜力越来越受到关注。在“自上而下”实验中，完整的抗体离子被选择并在质谱仪内进行碎片化，以获得氨基酸序列和翻译后修饰（PTM）信息。在“自上而下”实验中可以使用多种碎片化技术，包括紫外光解离（UVPD）、碰撞诱导解离（CID）、电子转移解离（ETD）、电子捕获解离（ECD）、高能碰撞解离（HCD）或ETD后接HCD（EThcD）。与完整质量分析一样，“自上而下”质谱需要最少的样品制备（主要是脱盐），因此可以避免样品处理过程中产生的修饰，如脱酰胺、氧化和S-硫醇化（即半胱氨酸化）。此外，在“自下而上” LC-MS/MS过程中容易丢失或重排的修饰在“自上而下”分析中通常会保留。与“自下而上”分析相比，“自上而下”方法为抗体提供了一个更全面的视图。例如，“自上而下”分析可以检测修饰之间的相关性，如糖基化与氧化易感性之间的相关性；这些信息在“自下而上”实验中丢失，因为在消化过程中不同的蛋白形式被重排。根据所使用的碎片化方法，二硫键可能仍然存在，分支碎片可能表明链配对。理论上，“自上而下”谱图中包含了整个蛋白质（包括所有修饰）的信息。然而，在实践中，“自上而下”质谱存在几个技术挑战。在MS/MS过程中，前体离子信号被分裂成大量的碎片离子信号。随着前体蛋白尺寸的增大，碎片离子的数量增加，而单个离子的信号强度降低。为了获得足够的信噪比以检测低丰度的碎片离子，必须平均许多次扫描，通常通过多次重复运行来实现。此外，碎片化方法倾向于在某些区域切割抗体，这通常由二硫键的存在介导。通过使用多种碎片化方法可以获得更好的序列覆盖度，但这导致了多个数据集需要分析和对齐。“自上而下”谱图非常复杂，因为存在规范的N端和C端碎片、内部碎片以及含有分支二硫键的碎片，所有这些碎片都可能存在于多个电荷态。需要复杂的软件来编译微扫描、解卷积数据、匹配碎片并区分假阳性。因此，抗体的“自上而下”分析的序列覆盖度明显落后于“自下而上”方法所能达到的水平。“中间向下”抗体分析比“自上而下”更有希望。“中间向下” LC-MS/MS的进行方式与“自上而下”相同，只是抗体首先被切割成较大的片段（通常是Fc/2、Fd和轻链，或Fab和Fc），然后分别通过LC-MS/MS进行分析（见图1.9）。由于切割后的片段明显小于完整的抗体，因此MS/MS谱图更简单，碎片离子信号也得到了改善。然而，碎片数据仍然复杂，完整的氨基酸序列覆盖仍然是一个问题。目前还不清楚，在未来几年内是否会克服与“自上而下”和“中间向下” MS相关的技术挑战，以及这些有前途的技术是否会得到更广泛的应用。 原生质谱 近年来，液相色谱-质谱（LC-MS）领域的一个令人兴奋的发展是原生质谱（native MS）的出现，它可以在非变性条件下对抗体类治疗药物进行表征。原生MS保留了在反相液相色谱-质谱（RPLC-MS）变性条件下通常会丢失的非共价相互作用和高阶结构，并可用于研究抗体-抗原和抗体-抗体相互作用。原生MS与完整质量LC-MS分析类似，只是样品在中性、接近生理pH条件下通过电喷雾进行电离，使用的简单溶液包含挥发性缓冲液，如醋酸铵。由此产生的蛋白质离子不会高度带电，其电荷态包络会转移到比在变性MS条件下产生的蛋白质离子更高的m/z范围内。因此，原生MS需要比传统仪器更高的质量范围（高达m/z 8,000e20,000）的质谱仪。原生MS特别适用于研究通过非共价键结合在一起的抗体、ADCs和双特异性抗体，例如基于半胱氨酸的ADCs，其中本应形成链间二硫键的半胱氨酸被用于药物偶联（见图1.10）。原生MS比变性MS更能反映抗体的真实状态。由于在原生MS的低电荷态下离子之间的分离度更大，因此与变性LC-MS相比，原生MS可以更好地分辨不同的蛋白形式。Wohlschlager等人利用这种改进的分离度，使用Exactive Plus EMR Orbitrap上的完整和“中间向上”原生MS，对含有6个N-连接和多达26个O-连接糖链的130 kDa Fc融合蛋白依那西普的复杂糖型进行了表征。原生MS充分分辨了完整Enbrel的众多复杂糖型，并实现了批次间的比较。 离子淌度质谱 在传统的质谱中，气态离子仅根据其质荷比（m/z）进行分离。在离子淌度质谱（IM-MS）中，不仅记录离子的m/z，还记录离子通过与质谱仪联用的漂移管（“漂移时间”）所需的时间。离子的漂移时间取决于其电荷和形状。IM-MS提供了另一个分离维度，可以增加LC-MS分析的选择性，并提供一种手段来探究离子的结构和构象稳定性。IM增强了“自下而上” LC-MS，通过根据漂移时间分离具有不同电荷态的重叠肽段离子，提高了弱离子的信噪比，并区分了同分异构离子的结构异构体。例如，离子淌度已与一维反相液相色谱-质谱（1D-RPLC-MS）联用，用于分析曲妥珠单抗单抗批次间的N-糖基化组成异质性，并与二维反相液相色谱-质谱（2D-RPLC-MS）联用，以鉴定原研和生物类似药单抗中的微量宿主细胞蛋白。 离子淌度与原生MS是天然的匹配，原生MS保持了蛋白质离子的天然形状，有许多出版物证明了原生-IM-MS用于研究抗体类治疗药物的结构和非共价相互作用。在最早的出版物之一中，Atmanene等人使用原生-IM-MS研究了人JAM-A（一种在肿瘤中表达的蛋白质）与抗JAM-A单抗之间的相互作用。IM-MS根据漂移时间分离了JAM-A胞外域中具有替代二硫键的离子群体。然而，通过原生-IM-MS分析抗体/JAM-A相互作用表明，胞外域二硫键的异质性对抗体亲和力或结合化学计量学没有显著影响。Bagal等人证明原生-IM-MS可以区分完整IgG2单抗的A和B二硫键异构体。B异构体的漂移时间略长，表明其相对于A异构体具有更大的截面积。最近，原生-IM-MS已被纳入多管齐下的分析策略中，用于比较生物类似药与原研单抗。 原生-IM-MS可以与碰撞诱导展开（CIU）联用，以研究蛋白质的构象稳定性。在CIU实验中，蛋白质离子在气相中通过碰撞激活，然后进行IM。展开事件被检测为IM漂移时间的变化。原生-IM-MS CIU被用于比较CBW-03-06（一种具有药物偶联工程位点的ADC）与其亲本单抗。ADC比亲本单抗更不易展开，表明药物偶联实际上稳定了单抗的构象结构。原生-IM-MS与CIU也被用于研究IgG4抗体的Fab臂交换，这一过程可以被利用来创建双特异性抗体。原生-IM-MS单独无法区分不同的IgG4物种，但添加CIU为每种存在的抗体物种（包括天然和双特异性抗体）生成了独特的特征。最后，IM-MS与CIU最近已被用于加速稳定性研究。IM-MS与CIU检测到了应激抗体的展开变化。 用于抗体和ADC分析的替代色谱法 不同的色谱法可以与原生MS联用，以便在进行MS之前根据大小、电荷或亲和力分离蛋白形式。例如，Hengel等人将微尺度尺寸排阻色谱（SEC）柱与原生MS联用，用于从给药大鼠的血浆中免疫分离半胱氨酸偶联ADCs，然后进行DAR评估。SEC提供的改进分离使他们能够监测由于药物-连接子丢失而导致的DAR随时间的逐渐降低，并检测到去偶联半胱氨酸的半胱氨酸化。同样，Ehkirch等人展示了将SEC与原生MS和离子淌度-MS（SEC-native-MS/IM-MS）联用，用于增强抗体类治疗药物（包括ADCs）的表征。该团队还开发了一个四维HIC-SEC-native-IM-MS平台，并将其应用于比较半胱氨酸偶联ADCs的天然形式和强制降解后的形式。在第一维度添加HIC分离，使得所有ADC物种，特别是降解样本中的物种，得到了更好的分辨率。 由于存在改变电荷的修饰（如C末端赖氨酸、唾液酸和脱酰胺），蛋白形式的电荷可能会有所不同。Füssl等人描述了一种pH梯度阳离子交换色谱-原生质谱平台的开发和应用，用于基于电荷分离和鉴定抗体物种。使用低离子强度的挥发性缓冲液进行分离，以与原生MS兼容。这个新颖的LC-MS平台能够区分由于C末端赖氨酸、糖化、脱酰胺、异天冬氨酸以及可能的琥珀酰亚胺形成而产生的应激测试阿达木单抗的电荷异构体。最后，Chen等人证明了直接将HIC与电喷雾质谱联用是可能的。通常情况下，这是不可能的，因为流动相使用了相对较高浓度的非挥发性盐，这些盐与质谱不兼容。然而，通过用醋酸铵替换非挥发性盐，并使用更疏水的固定相，他们实现了抗体的良好HIC分离，并对多电荷抗体离子进行了“自上而下”的HIC-ECD-MS测序。 多属性方法 液相色谱-质谱（LC-MS）是最近开发的一种名为多属性方法（MAM）的技术的核心，该技术在生物制药行业引起了广泛关注。MAM利用“自下而上” LC-MS协议同时检测、定量和监测蛋白质生物制剂的多个特征，如N-和O-糖基化、氧化、脱酰胺、异天冬氨酸形成和蛋白酶切割。在传统的生物制造环境中，通常使用单独的分析方法来评估和监测每个重要特征，尤其是被认为是关键质量属性（CQAs）的那些。这些分析方法基于传统的、众所周知的分析技术，如CE-SDS、CEX-HPLC、cIEF和HILIC，通常与紫外和荧光检测器结合使用，产生简单且可定量的输出。MAM有潜力将许多这些传统分析方法整合到一个单一的LC-MS分析中。此外，MAM能够提供有关CQAs的额外信息，如个别修饰的位置和丰度。最近，一个由生物制药行业代表组成的小组发表了一篇白皮书，倡导增加采用MAM以识别和监测CQAs，改进生物制造的控制策略，并简化向监管机构的提交。该技术对行业的潜在影响是巨大的。仪器制造商已经注意到这一点，并正在开发更适合MAM的LC-MS平台，并创建符合监管期望的整个MAM工作流程（从仪器控制到数据分析）的自动化控制软件。新峰检测（NPD）是MAM控制和分析软件的一个关键组成部分，能够标记LC-MS/MS数据中新的和意外的特征。NPD降低了假阴性的风险，因此极大地提高了用户对技术的信心。然而，MAM在高度受监管的QA/QC实验室和GMP生产设施中的广泛应用仍然需要在未来一段时间内实现，并且需要在仪器设计、HPLC柱、酶和其他试剂的制造质量控制以及开发适合MAM的新参考材料方面不断改进。然而，似乎MAM，以及由此暗示的“自下而上” LC-MS，将在未来对生物治疗药物的制造和表征方式产生重大影响。 结论 在本章中，我们概述了液相色谱-质谱（LC-MS）在抗体类治疗药物的生物物理表征中的应用。LC-MS蛋白质表征是一个涵盖大量文献的广泛主题领域，不可能在单一章节中涵盖所有应用。相反，我们重点介绍了一些当前的LC-MS应用，特别是对不同翻译后修饰（PTMs）的表征，以及该领域的一些最新发展，这些发展展示了LC-MS在生物治疗药物分析中的范围和未来潜力。在这方面，我们省略了一些其他LC-MS在抗体类治疗药物研究中的应用，如用于药代动力学/药效学（PK/PD）研究的定量分析，尽管这些内容超出了本章的范围，但也严重依赖于LC-MS。 承认LC-MS能力对于任何组织来说都是一项巨大的投资，涉及前期资本成本、维护和专业人员。然而，LC-MS在特异性、灵敏度和灵活性方面无与伦比，比其他分析技术更能跟上生物制药领域内创新研发的步伐。LC-MS基础分析所提供的前所未有的细节水平可以改善生物治疗药物的设计和生产，从而产生更稳定、有效和均质的产品，最终带来更好的患者结果。目前，LC-MS基础分析越来越多地被纳入生物制药和生物制造领域，并被用于为关键质量属性设定更精确的规范以及监测生产过程。使用LC-MS进行多属性监测作为一种可行的、具有成本效益的传统分析方法替代品，正在获得认可。我们预计在未来不久，LC-MS将在抗体类治疗药物产品开发生命周期的所有阶段得到越来越广泛的应用。识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

高甘露糖型（High-Mannose，HM）是抗体的关键质量属性（CQA）之一，其水平过高可能会缩短抗体半衰期（血浆清除加速）并可能引发免疫原性。本文从细胞株筛选、培养模式优化、工艺参数调整及培养基添加剂四大工业常用策略切入，系统性解析降低HM的调控路径，助力提升抗体药物质量。01高甘露糖的形成路径高甘露糖型糖链主要在内质网完成初步加工，进入高尔基体后，若甘露糖苷转移酶对前体寡糖的修剪受阻或N-乙酰基葡萄糖胺转移酶I （GnTI）活性异常，则无法进一步修饰为复杂糖型，导致HM残留（图1）。行业一般将甘露糖型Man5控制在≤10%，通常控制≤5%（依产品特性调整），Biosimilar需与原研品HM含量偏差≤±1.5%。图1：N-糖基化修饰途径02常见的降低HM的策略策略1：细胞株与克隆筛选细胞株工程改造过表达GnTI基因或者克隆筛选阶段选择蛋白表达量高且GnTI活性较高（即Man5水平低）的细胞株。文献分享如文献Scientific Reports，2024表明GnTI活性与HM水平呈负相关，当GnTI基因被敲除时（如CHO-gmt4细胞），细胞主要产生高甘露糖型链Man5（Man5GlcNAc2），如图2所示。这是因为GnTI负责将N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）添加到核心糖链的α-1,3-连接的甘露糖上，从而启动从高甘露糖型向复杂型糖链的转化。当GnTI缺失时，这一转化过程受阻，导致高甘露糖型糖链在细胞中积累。图2：CHO-K1和CHO-gmt4（GnTI KO）细胞株在曲妥珠单抗上的Man5水平对比策略2：强化培养工艺IPC/IFB模式：改变细胞培养模式，例如选用IPC（Intensified Perfusion Culture）或IFB（Intensified Fed Batch）工艺，通过高换液率维持营养稳态，减少代谢副产物（如NH4+）积累，有效降低HM水平。专利分享上海智享生物专利案例（CN116590371B）：本案例采用浓缩补料灌流培养工艺，并通过降低pH和排出细胞代谢副产物乳酸和NH4+，有利于高尔基体对抗体的翻译后修饰，从而降低抗体的高甘露糖基化。进一步添加糖型调节剂N-乙酰葡萄糖胺、Mn2+、尿嘧啶、半乳糖，能够有效促进高甘露糖型抗体的进一步修饰，合成更加完善的双天线糖型结构。P-5结果中Man5的含量从FB-1的18.9%降低至4.4%，满足了抗体药物生产中Man5含量低于5%的要求，详细数据示例如下表1。FB代表Fed-batch补料批培养工艺，P代表浓缩补料灌流培养工艺。表1：专利CN116590371B降低Man5的方案汇总策略3：工艺参数调整工艺参数对HM的影响： 1 pH：低pH环境（如控制pH在6.7-6.8范围内），可增强高尔基体糖基转移酶活性，促进HM向复杂型糖链转化。 2 降温：在培养后期降温至31°C ± 0.5°C，可延缓细胞代谢副产物（如NH4⁺）积累，减少对糖基化酶的抑制。 3 培养周期：优化补料策略（如浓缩补料工艺）将周期缩短至10-12天，降低渗透压和NH4⁺浓度，减少对GnTI活性的抑制。 4 渗透压：高渗透压（> 400 mOsm/kg）会抑制N-乙酰葡萄糖胺转移酶（GnTI）活性，导致甘露糖残基无法被进一步加工为复杂型糖链。文献分享文献Efren Pacis , 2011等的研究表明，Man5和培养时间及渗透压成正相关，如图3。 1 Man5随着培养时间持续增加，Man5从D7 5%升高至D22 15-28%。 2 补料渗透压从750 mOsm/kg到1250 mOsm/kg，Man5水平从D12 15%大幅提升至23%-27%，可能是高渗透压导致代谢副产物如NH4+的积累，进而影响高尔基体内pH，抑制GnTI等酶的活性。图3：Cell line A在各种基础渗透压（300、330、360和400 mOsm）和补料渗透压（750和1250 mOsm）组合下Titer和Man5的水平策略4：培养基组分和添加剂的调控从培养基组分添加剂上降低HM水平，常选择N-乙酰葡萄糖胺、尿嘧啶、半乳糖、2FP（岩藻糖类似物）、微量元素Mn2+，Cu+等物质。专利分享上海药明生物专利案例（CN116121170A）: 该专利是一种通过向培养基中添加 N-乙酰基-D-甘露糖胺（ManNAc）来降低哺乳动物细胞表达系统所产糖蛋白中高甘露糖型糖基化水平的方法。该方法包括在传代培养基或生产培养基中添加ManNAc，添加浓度20-100 mM, Man5水平可降低44%-65%，而且对蛋白产量、细胞生长代谢、蛋白纯度、酸碱峰等其他质量指标均无明显负面影响，作用机制可能是因为ManNAc其作为N‑乙酰神经氨酸/唾液酸(Neu5Ac)的前体，添加后，促进糖型往成熟方向合成，从而降低了Man5水平，详细数据示例，如下表2。表2：专利CN116121170A降低Man5的方案汇总文献分享文献Efren Pacis , 2011等的研究表明，通过在培养阶段添加一定量Mn2+，可以加速GnTI的周转率，从而降低高甘露糖型。如图4，向高渗透压的培养基中加不同浓度的MnCl2, Man5显著地从25%降到14%。相似的，向常规培养基中加1.0 uM的 MnCl2 , Man5从12%降低到5%。图4：摇瓶中添加MnCl2对Man5的影响03降低高甘露糖的方案汇总在实际的调控策略中，常通过培养基筛选和成分优化（如不同浓度UGM+GlacNAc的摸索），进一步优化培养条件（如温度，渗透压等工艺参数），达到控制HM的目的。常见的降低HM的参数、作用机制及推荐范围如下表3。表3：HM的参数、作用机制及推荐范围文末彩蛋定制化培养基开发服务2025年3月，Cytiva中国细胞培养基开发基地已在上海张江正式启用！该基地依托全球HyClone品牌资源，遵循统一的质量标准和生产工艺，整合全球资源及超6000种培养基原型库，为国内客户提供定制化培养基开发服务！无论是产品质量调控，还是细胞代谢优化，专注客户的开发需求，帮助客户实现从研究开发到生产应用，一站式解决抗体药开发痛点、难点。欢迎扫描下方二维码留下您的信息Cytiva专家团队将在近期与您联系参考文献：1.细胞培养过程对单克隆抗体糖基化修饰的影响和调控，2019，江一帆等2.Haryadi, R. et al. Generating and characterizing a comprehensive panel of CHO cells glycosylation mutants for advancing glycobiology and biotechnology research. Sci Rep, 23068 (2024).3.Efren Pacis., et al.  Effects of cell culture conditions on antibody N-linked glycosylation--what affects high mannose 5 glycoform. Biotechnology, 20114.CN116590371B, 一种降低中华仓鼠卵巢细胞中抗体高甘露糖型的细胞培养方法, 20235.CN116121170A,一种降低哺乳动物细胞表达系统所产高甘露糖型糖蛋白水平的方法及其应用, 2023