Influenza vaccine, quadrivalent(CSL Ltd.)

在过去十年中，疫苗发现和开发的新方法改变了该领域。COVID-19 大流行期间的进展使得人们能够使用信使 RNA 和病毒载体等新平台每年生产数十亿剂疫苗。分析工具箱、设备和生物工艺技术的改进使得疫苗开发速度和疫苗生产规模都达到了前所未有的水平。大分子结构功能表征技术与改进的建模以及数据分析相结合，能够以单粒子分辨率定量评估疫苗配方，并指导疫苗药物底物和药物产品的设计。这些进步在精确评估新平台提供的疫苗的关键质量属性方面发挥了重要作用。无标记和免疫分析技术的创新有助于表征抗原位点和开发强大的体外效力分析。这些方法与下一代测序等分子技术一起，将加速所有平台提供的疫苗的表征和放行。用于实时监控和优化工艺步骤的过程分析技术可以实施质量源于设计的原则并更快地放行疫苗产品。未来十年，疫苗研发领域将继续进步，汇集新技术、方法和平台，改善人类健康。 引言 2012 年，《生物技术与生物工程》发表了一篇评论“疫苗工艺技术” ，重点介绍了用于预防人类各种传染病的疫苗生产的各种技术。在过去十年中，该领域取得了长足进步，部分原因是用于开发安全有效的 COVID-19 疫苗的资源大幅增加。这项艰苦工作的结果是，与使用蛋白质抗原作为疫苗等更传统的方法相比，引入并优先考虑了新的疫苗平台，特别是信使 RNA (mRNA) 和复制缺陷型腺病毒。 在过去 10 年中，含 DNA 和 RNA 的疫苗取得了巨大进步，这些疫苗本身并不含有目标抗原，而是携带指示接种者自身细胞产生抗原的指令。病毒载体和 mRNA 脂质纳米颗粒 (LNP) 疫苗属于这一类。自 2012 年以来，已有十种新的病毒载体疫苗和两种 mRNA-LNP 疫苗获得批准（表 1，译者注：原文数据如此）。自 2012 年的总结以来，许多其它重要疫苗也获得批准。Flucelvax® 是首个使用细胞培养技术生产的季节性流感疫苗，于 2012 年引入美国（诺华，现为 Seqiris）。Flucelvax 工艺使用悬浮 MDCK 细胞培养作为病毒繁殖的底物，而不是鸡蛋。该疫苗于 2007 年首次在欧洲获批，名称为 OptaFlu。一年后，美国食品药品监督管理局（FDA）批准了 Flublok®，这是一种使用杆状病毒表达系统生产的昆虫培养重组流感疫苗（Protein Sciences Corporation，2017 年被赛诺菲收购）。该疫苗于 2016 年从三价改为四价，并于 2020 年获得欧洲药品管理局（EMA）批准。Flublok® 利用重组表达与所选毒株精确匹配的血凝素 (HA) 蛋白，避免了病毒适应鸡蛋或细胞培养而导致抗原漂移的潜在问题。 表1. 病毒载体疫苗。 2017 年，FDA 批准葛兰素史克公司生产的带状疱疹 (HZ，shingles) 疫苗Shingrix，供 50 岁及以上的成年人使用。该疫苗是一种重组糖蛋白抗原，在中国仓鼠卵巢 (CHO) 细胞中生产并冻干，使用单独的 AS01B 佐剂悬液小瓶进行复溶。疫苗悬液含有 50 μg 重组水痘带状疱疹病毒 (VZV) 糖蛋白 E，其免疫原性增强，由两种佐剂组成：基于脂质体的 AS01B 佐剂系统，含有 50 μg 3-O-脱酰基-4′-单磷酰脂质 A (MPL) 和 50 μg Quillaja saponaria Molina，fraction 21。此外，2017 年，FDA批准了Dynavax 的Heplisav-B 乙肝疫苗，该疫苗含有新型胞嘧啶磷酸鸟苷 (CpG) 1018® 佐剂和重组蛋白亚单位抗原。该产品于 2019 年在欧洲获得批准。CpG 1018® 佐剂是一种修饰骨架寡核苷酸，可模仿细菌和病毒 DNA 来刺激先天免疫系统。2019 年，FDA 批准了 JYNNEOS® (Bavarian Nordic A/S)，一种天花和猴痘疫苗，适用于 18 岁及以上被确定为感染风险高的成年人。JYNNEOS® 是一种由 MVA-BN 毒株（一种减毒、非复制性正痘病毒）生产的活疫苗。MVA-BN 在悬浮于不含任何直接动物来源物质的无血清培养基中的原代 CEF 细胞中生长，然后通过包括核酸酶消化在内的多个切向流过滤 (TFF) 步骤收获、纯化和浓缩。为了增加疫苗供应，FDA 于 2022 年 8 月批准了 JYNNEOS® 的紧急使用授权 (EUA)，用于向 18 岁以下的个人皮下 (sc) 给药(0.5 mL) 和向 18 岁及以上的个人皮内 (id) 给药 (0.1 mL)。 2020 年，世界卫生组织 (WHO) 批准了 nOPV2 的紧急使用清单 (EUL)，作为全球根除脊髓灰质炎的不断发展的战略的一部分。该疫苗使用在源自非洲绿猴肾脏的 Vero 细胞中制备的改良 Sabin 株 (nOPV2 株 S2/cre5/S15domV/rec1/hifi3) 的减毒活脊髓灰质炎病毒 2 型。为了降低疫苗源性脊髓灰质炎的发病率，该疫苗通过对亲本基因组进行5处修改，影响域 V、cre 元件和 RNA 依赖性 RNA 聚合酶，提高了遗传稳定性并降低了重组率。同样在 2020 年，WHO 对首个 Sabin 灭活脊髓灰质炎疫苗 (sIPV，注射剂，LG Chem) 进行了预审批。该疫苗采用基于微载体的 Vero 细胞生产，生产不使用野生型病毒，降低了逆转录突变的风险。此外，细胞生长培养基从含血清培养基改为无动物源性成分 (ACF) 培养基，在病毒灭活前增加了洗滤步骤，并使用重组胰蛋白酶。 2020 年初 COVID-19 疫情爆发后不久，全球 200 多种候选疫苗中的首批进入临床试验。到同年 12 月，监管机构授予了首批 EUA。到 2023 年 3 月，已接种超过 130 亿剂 COVID-19 疫苗。据估计，仅在 2021 年，新疫苗就挽救了 1400 多万人的生命。许多因素促成了疫苗研发的加速，包括对新模式（mRNA 和复制缺陷型腺病毒）的预先投资以及政府对临床研究的大量资助。约 40% 的剂量为之前确定的全病毒灭活类型，其余剂量则平均分为两种类型：mRNA-LNP 和腺病毒载体。从化学、生产和控制 (CMC) 的角度来看，为应对疫情，疫苗生产和分析也取得了重大进展，缩短了从证明有效性到广泛提供疫苗的时间线，支持将生产规模从每年数百万剂扩大到数十亿剂。生产规模和效率的变化需要复杂的分析表征能力。 表2.十大 COVID-19 疫苗。 在本综述中，我们描述过去 10 年中取得的技术进步，这些进步使得开发和生产用于预防各种人类传染病的新型疫苗成为可能。其中一些进步，特别是在 mRNA 和病毒载体递送方面的进步，也适用于新兴的治疗性肿瘤疫苗领域。本综述的范围涵盖整个疫苗生产过程，从细胞培养和无细胞系统到制剂、纯化、稳定性、分析和监管环境的变化。 细胞培养 细胞培养越来越多地用于表达疫苗生产所需的抗原（图 1）。病毒表达可以在贴壁细胞系或悬浮驯化细胞系中实现。 图1. 基于细胞的病毒疫苗生产概要示意图。 贴壁细胞系 历史上，出于对安全问题的担忧，用于疫苗生产的细胞系的选择一直受到限制。随着时间的推移，出现了更多的选择，尤其是使用连续细胞系。基于贴壁细胞系的疫苗的一个例子是基于重组水泡性口炎病毒 (rVSV) 的埃博拉疫苗 rVSVΔG-ZEBOV-GP (V920，商品名 ERVEBO®)，其最初被构建并被描述为抗生物恐怖主义药物。rVSV Indiana 株包括了VSV 囊膜糖蛋白的缺失，被Zaire埃博拉病毒 (ZEBOV) Kikwit 1995 株表面糖蛋白取代，并且它在 Vero 细胞中生产。最近的创新还包括开发各种单位体积表面积非常大的一次性生物反应器 (SUB)；例如，Dohogne 及其同事描述的生物反应器。Drugmand 等人在2020 年描述的固定床反应器结合了强化连续和自动化一次性生物工艺方法。脊髓灰质炎疫苗的案例将上游工艺、下游工艺以及灭活联系在一起。 悬浮培养 多种疫苗细胞培养应用涉及悬浮培养。为了生产蛋白质，已成功使用杆状病毒表达的昆虫细胞培养 (Sf9)；例如，用于大规模生产 FDA 许可的流感疫苗的 HA 蛋白。或者，用于病毒生产的宿主细胞，例如 Vero 细胞或 PER.C6 细胞，可以驯化后悬浮培养。如果可以适应细胞培养，通常可以使用成熟的方法在经典的搅拌罐生物反应器中培养细胞。为生产抗体而开发的许多 CHO 细胞培养技术改进可以应用于疫苗生产。最近，行业已从 10,000–20,000 L 规模的不锈钢生物反应器过渡到约 3000 L 规模的SUB。Watterson 等人描述了一种使用 CHO 细胞表达的 SARS-CoV-2 Sclamp 候选疫苗，该疫苗适用于大规模商业生产，在2–8°C 下稳定。当与 MF59 佐剂配制时，它会引发中和抗体和 T 细胞反应，并在动物模型中提供保护。在 CHO 细胞中表达的 VZV 截短糖蛋白 E 是极为有效的Shingrix 疫苗的基础。用于疫苗的细胞培养技术与用于大规模生产抗体的技术非常相似。 在 COVID-19 大流行期间，牛津大学的研究人员领导了开发有效疫苗的工作，他们使用基于复制缺陷型腺病毒的平台来递送刺突蛋白。2022 年的 ECI 会议上介绍了该平台的规模放大。该平台涉及使用悬浮细胞培养表达复制缺陷型腺病毒以递送冠状病毒刺突蛋白，该平台可放大并由阿斯利康成功转移到多个生产基地，从而能够在约 18 个月内供应超过 10 亿剂COVID-19 疫苗。 微生物生产 传统上，微生物发酵平台被用于生产主要类别的疫苗，它们仍然至关重要。人乳头瘤病毒 (HPV) 的表面 L1 蛋白由酿酒酵母表达，并组装成病毒样颗粒 (VLP)，以产生Gardasil疫苗 。乙肝病毒 (HBV) 表面抗原由酿酒酵母或毕赤酵母表达。基于 DNA 质粒的候选疫苗通常由大肠杆菌细菌发酵制成。肺炎球菌结合疫苗由特定肺炎链球菌菌株表达的荚膜表面多糖 (CSP) 与白喉 CRM197 蛋白结合而成。一些重要的疫苗最初是减毒活病毒 (LAV) 疫苗，最终被带有佐剂系统的单一重组 VZV 糖蛋白所取代。过去十年，在开发能够实现高产量的替代培养物方面取得了进展，例如基于Thermothelomyces heterothallica真菌培养物(称为 C1) 的 Dyadic 平台。基于C1 的系统可以在数周内开发出表达免疫活性抗原的稳定菌株；总体而言，与其它成熟的系统相比，产量更高。基于 C1 的系统可以轻松扩展到工业规模，并且具有成本效益，其使用标准的微生物发酵罐和廉价的培养基。一种使用 C1 表达技术生产刺突蛋白关键受体结合域 (RBD) 成分的 COVID-19 候选疫苗目前正在临床中进行评估。麻省理工学院的研究人员开发了一个基于毕赤酵母的平台，该平台完全自动化，可用于生产包括疫苗抗原在内的多种蛋白质。之所以选择这种酵母，是因为它可以快速生长到高细胞密度，并具有可接受的蛋白质表达。目前正在使用具有端到端功能的高度自动化生物反应器系统，将类似技术应用于轮状病毒的三价候选疫苗的生产。 对于蛋白质抗原，技术挑战通常在于可重复地生产暴露关键表位的疫苗，以便它们被免疫系统识别。对于基于 VLP 的疫苗（例如 HPV 疫苗）尤其如此，复杂的分析能力对于成功至关重要。对于 mRNA 疫苗，大肠杆菌发酵仍然是生产体外转录 (IVT) 为 mRNA 所需质粒 DNA (pDNA) 模板的主要方法，例如辉瑞-BioNTech 的 SARS-CoV-2 mRNA 疫苗 Comirnaty® 和 Moderna 的 Spikevax®。pDNA 的无细胞合成正在取得长足进步，但由于酶和核苷酸/核苷成本高昂，其成本效益仍然不如微生物生产。pDNA 是 IVT 反应的原材料，所需的总量明显少于 DNA 疫苗，因为可以从单个线性化的 pDNA 模板制作许多 mRNA 拷贝。用于 IVT 的 pDNA 序列通常需要大量重复元素（例如 poly(A) 尾），这可以为大肠杆菌细胞菌株的选择提供参考。许多业界主力菌株最初针对高 pDNA 产量而不是 pDNA 保真度进行了优化，但现在已有多种菌株能够正确复制具有重复元素的较大质粒。最近描述了一种在大肠杆菌中生产结合疫苗的新方法，即通过将关键酶插入细菌中。这种方法避免了分别生产蛋白质和多糖，然后进行纯化、化学结合和重复纯化的要求。 自从在不锈钢压力容器中实现500–5000 L 规模的发酵以来，发酵设备进行了多项创新，其自动化、清洁、验证和操作变得越来越复杂。由于建设成本高，在很多地区只有有限数量的大型生产基地。过去十年，微生物和细胞培养的一个重大进步是向一次性生物反应器（SUB）的过渡。人们对一次性生物反应器进行了大量投资，通过省去清洁和灭菌步骤并提高灵活性，可以生产小规模的微生物培养物。许多微生物培养中常见的工艺条件，例如压力、高空气流速、溶剂和严格的温度控制，将用于疫苗生产的 SUB 的上限规模限制在 3000 L 左右。 对于纯化，已经针对整个工作流程建立了一次性选项 - 从深层过滤、用于浓缩和洗滤的切向流，到用于层析的一次性层析柱。疫苗生产商正在努力建立一次性系统的第二来源供应商，以避免供应链问题。行业举措，正在建立灵活的一次性系统，该系统具有标准化、与独立于供应商的组件和连接。最终用户和技术提供商也在共同努力，为一次性组件提供可持续的回收和循环经济战略。 无细胞合成 疫苗的“体外”生产，包括蛋白质、RNA疫苗和 VLP，已成为一种简单而优雅的方法，可加速疫苗工艺开发和生产。无细胞 IVT 始于线性化的 DNA 模板，用于在 T7 RNA 聚合酶的控制下转录复制子 RNA（图2）。IVT 反应在几个小时内完成，生成 3-5 mg/mL 的产品，例如 RNA。对于 RNA 疫苗，可以通过在IVT 反应中补充 m7GppG 帽结构类似物并保持帽分子相对于 RNA 序列第一个核苷酸（GTP）的高摩尔比来对 RNA 复制子的 5′ 端 进行加帽（图 3）。加帽已经通过使用 CleanCap 试剂的共转录加帽商业化。或者，可以在第二个酶促反应中使用加帽酶 (VCC) 和甲基供体作为底物对 mRNA 进行加帽。与加帽类似物的 60%–80% 相比，VCC 加帽效率更高 (100%)，但共转录加帽是一个更快的过程，因为它不需要第二个酶促反应步骤。在 IVT结束时，加入 DNAase I 酶以降解 DNA 模板，然后加入 EDTA 以抑制 DNAase 活性、稳定 RNA 产物并减轻 RNA 沉淀。去除包括酶、残留 NTP、DNA 模板和异常 mRNA（双链 [ds] RNA 和截短的 RNA 片段）在内的杂质至关重要，因为 RNA 纯度已被证明会影响翻译效率并改变疫苗在体内的免疫刺激反应。例如，用反相高效液相色谱 (RP-HPLC) 去除双链 RNA (dsRNA) 后，蛋白质表达量增加了 10 到 1000 倍。TFF 已被广泛用于 IVT 后的 RNA 纯化，纯度可达90%–99%，收率可达 90%–95%。如纯化部分所述，TFF 还可与层析法配合用于去除 dsRNA。对于 RNA，可通过一次性兼容无 RNAase 系统（如微孔板、试管以及包括波浪式运动或搅拌罐的生物反应器）实现放大，如图2所示 。 图2.用于 RNA 生产的无细胞 IVT 反应。典型的反应从 2–5 mL 开始，用于优化筛选（2–10 mg），然后是10–15 mL IVT 用于动物研究（25–50 mg），之后是5–20 L 用于临床研究（10–50 g），最多 50–200 L 用于商业生产（125–500 g）。 图3.通过体外转录 (IVT) 获得的 mRNA 结构。 简化的 RNA 生产工艺可以快速开发疫苗；例如，SARS-CoV-2 疫苗从 DNA 模板到首次人体试验仅用了 42 天。IVT RNA 候选疫苗的商业化上市时间也可以缩短至 2 年以内。商业设施可以小 2-3 个数量级，建设时间减半，前期资本成本仅为其二十分之一。10 亿剂疫苗可以在一个低成本的 2000 万美元设施中生产。通过使用封闭式工艺，可以在低级别洁净室设施中生产，从而进一步降低设施成本。虽然取消高级别洁净室要求可以节省能源和资本成本，但试剂成本在 IVT 工艺的经济性中占主导地位，占商品生产成本 (COG；表 3 ) 的 96%。良好生产规范(GMP) 材料和试剂供应是一个限制因素，尤其是在确保酶试剂为 ACF （无动物源性）和 GMP 级的情况下增加了复杂性。尽量减少试剂使用的方法非常重要；方法包括 IVT 后加帽和集成连续工艺，其中可以加快反应速度并实现试剂重复使用。自动化 RNA 生产系统也正在开发中，其中 IVT 反应与机器人操作下的纯化步骤集成在一个封闭系统中。同样，微流控系统用于将 RNA 制备整合到 LNP 生产中，用于个性化疫苗方法（图 4）。如今，台式系统可用于简化发现构建工作流程，因为寡聚体可以以 10 µg 的规模组装成全长 DNA 或 mRNA 序列，而无需pDNA 模板。未来，台式核苷酸生产系统可能会成为现实。 表 3. mRNA IVT 生产 10 亿剂的技术经济评估。 缩写：COG，商品成本；IVT，体外转录；mRNA，信使RNA；sa-mRNA，自扩增mRNA。 a 假设：一个生物反应器的反应产出量为 5 g/L RNA IVT，收率为 65%，新设施利用率为 80%，活动持续时间为 12 个月。成本不包括封装。COG 显示的范围涵盖了加帽类型和酶采购供应方法。分析由 Biopharm Services Ltd Biosolve 工艺成本分析工具支持。 图4.脂质纳米颗粒组装工作流程。 虽然单链 RNA 的设计结构已经得到充分证实，但新的 RNA 治疗方式仍在不断扩展。自扩增 mRNA（sa-mRNA）具有高拷贝数和随后的高抗原表达，每剂含量比单链 RNA 低 60 倍。反式扩增 mRNA（taRNA）也已在动物研究中得到证实，其中一个 mRNA 模板编码复制酶，而单独的模板扩增多个目标 mRNA，同时编码不同的蛋白质。共价闭合环状 RNA（circRNA）已在动物模型中显示出连续翻译蛋白质的可行性。circRNA 由 IVT 线性RNA 生成，可通过多种方法环化，例如 T4 RNA 连接酶或内含子剪接。这种稳定的闭环结构可防止被核酸外切酶切割，不需要 5′ 加帽或 3′ poly(A) 尾巴，并且有可能在室温下保持稳定。预计，以机械建模和人工智能 (AI) 工具为指导的计算机分子设计将继续改进分子设计，以优化半衰期、稳定性和效力，还可以改善 CMC 属性，包括减少杂质。最近的研究表明，通过降低 IVT Mg 2+水平来减少 dsRNA、使用热稳定性 T7 RNA 聚合酶在 50°C 下进行更快的反应以及应用高盐转录策略，可以进一步提高产量和纯度。这些扩大工艺设计空间的努力可以通过扩展自动筛选工具来支持，从而实现具有 IVT、纯化和过程分析集成工作流程的实验统计设计。 除 RNA 外，各种疫苗类型的无细胞生产已被证明，包括亚单位、结合物、VLP 和膜增强疫苗。这些示例主要使用大肠杆菌的裂解物系统，尽管使用了多种来源，包括CHO、小麦胚芽和烟草。市售试剂盒提供了快速的方法来创建用于发现和工艺开发的材料，并且已经证明可以规模放大，以支持临床生产。最近的一项研究应用无细胞表达技术成功生产了与当前接种标准相当的下一代 24 价肺炎球菌结合疫苗。无细胞平台表达了增强的载体 CRM 蛋白序列，其中包含多种非天然氨基酸。它们位于主要 T 细胞表位的外部，因此可以进行位点特异性共价结合，并有可能提高血清型覆盖率。由于翻译后修饰、细菌来源系统的免疫原性问题、二硫键折叠复杂性以及规模放大所需的试剂成本等挑战，无细胞疫苗生产的广泛采用仍然受到限制。预计随着基于哺乳动物的裂解物系统和连续工艺系统的应用进展，这些情况将在未来 10 年内得到改善。 纯化 过去十年中，疫苗的纯化已从复杂的工作流程向更标准化、强化的方法转变。图 5总结了示例。重点是继续降低成本和剂量，同时提高产量和收率。如最近的评论所总结的那样，通过离心、深层过滤、细胞裂解和过滤对细胞收获进行了逐步改进。膜设计的改进促进了从离心到深层过滤的转变，或两者的结合。可用的更高 MWCO 膜的开发支持了较大病毒的浓缩、缓冲液置换和杂质降低（宿主细胞蛋白 [HCP]）。单程 TFF 的持续改进实现了强化和连续的工作流程。随着膜设计的进步，病毒产品的除菌过滤不断优化。 图5.疫苗生产流程。将包括传统工艺流程在内的工艺类型与强化/集成的未来方法进行比较。 亲和捕获层析选项的扩展为简化和标准化工作流程提供了关键优势。对于病毒工艺，亲和捕获的可用性在减少单元操作数量方面提供了显着优势，如图 5所示。工程化配基从头设计的进展为病毒疫苗带来了高特异性和可调节的亲和配基，并在温和的洗脱条件下，具有强大的杂质清除能力。商业上可获得的来源，例如源自骆驼单链结构域的来源，已经针对一系列腺相关病毒 (AAV) 血清型（例如 Capture select AAV9）建立了可用亲和策略。配基设计不断改进，例如使用组合化学方法的短碱基（5-15 个氨基酸）配基和分子印迹计算机设计聚合物可快速生成配基颗粒。对于 RNA，脱氧胸苷 (oligo dT) 配基已成为与 3′ poly(A) 尾结合的亲和捕获方法。通过结合 OligodT 和精制 IEX，可以有效去除包括 dsRNA 在内的杂质。亲和层析技术的进步使通过多柱工艺实现效率改进的策略得到更广泛地应用。例如，双柱逆流层析法结合尺寸排阻层析法 (SEC) 可将腺病毒的收率提高6倍，回收率分别达到 86%，DNA 和 HCP 清除率分别达到 90% 和 89%。Fischer 等人采用类似的强化方法纯化甲型流感病毒。季胺 (QA) 阴离子交换整体柱与模拟移动床层析法相结合，病毒收率达到 89%，DNA 清除率超过 98%。 从传统的基于树脂基球的分离到对流形式的膜和整体柱（图6 ）的转变继续得到更广泛的应用。树脂基球的扩散限制（其中较大的病毒颗粒难以进入基球内的配基）通过对流传输膜的较大孔径和更高流速的优势得到克服，包括微孔水凝胶纳米纤维和整体柱形式。这些已成功应用于一系列疫苗产品，典型的回收率为 60%–90% 且杂质结合最小化，包括99% 的 HCP 和残留 DNA（resDNA）去除以及 5-log 内毒素降低。去除的杂质包括病毒、VLP、噬菌体、细胞外囊泡、pDNA和RNA。最近证明了整体柱的工艺效率，IEX 整体柱纯化风疹病毒悬液仅需 1 小时，而使用填料基球层析柱则需要 10 小时以上。 图6. 层析的扩展形式。（左图）树脂基球。功能配基内化在树脂介质的孔内；这种形式以缓慢的扩散传质为主，从而产生缓慢或分辨率较低的工艺，对大分子具有显著的尺寸排阻效应。湍流发生在具有涡流的树脂与剪切应力升高且产量较低的区域之间。（中间图）膜技术，其功能基团固定在膜表面。宽孔径允许高流速并最大限度地减少尺寸排阻效应。（右图）整体柱形式支持具有功能化大孔或大孔和中孔的互连通道。大直径通道提供对流传质并实现支持快速工艺处理的、独立于液流的分辨率和载量。层流为生物制剂和疫苗提供低剪切应力和更高的收率。 对强化工艺和提高上游表达滴度的追求重新引发了人们对沉淀、双水相萃取 (ATPE) 和结晶等非层析方法的兴趣。无层析的工艺有可能将 COG 降低 20% 到 30%，并且更适合连续工艺。使用统计实验设计减少了优化条件的复杂负担，可以通过 pH、温度、电导率和混合物组成最大限度地提高目标稳定性和完整性。典型的聚乙二醇(PEG) 沉淀的例子包括使用 5% PEG 和 0.5 M NaCl 实现 85% 的甲型肝炎病毒回收率和 65% 的 HCP 减少率。然后用核酸酶处理裂解物，以防止核酸/病毒聚集体的共沉淀。mRNA 沉淀已与 TFF 相结合，以捕获通过洗滤去除的沉淀和杂质，然后重新溶解。预计可以使用塞流或盘管流反转反应器实现连续疫苗沉淀。ATPE 的强化和上游滴度的提高涉及混合两种聚合物和亲液盐（磷酸盐柠檬酸盐、硫酸盐）溶液，并且可以克服传统上过度稀释提取系统的大体积限制。最近的许多例子表明，使用 PEG/盐组合物在提取的上相中分离一系列疫苗产品（包括病毒、VLP 和细胞外囊泡）是可行的，从粗裂解物中实现 70%–99% 的回收率。Turpeinen等人表明，使用简单的螺旋混合器以连续模式使用 45% PEG 和 30% 柠檬酸盐混合物可以回收 99% 的 HIV VLP 并去除 73% 的DNA，这种方法可以减少大体积缓冲液的使用和工艺时间。 尽管疫苗结晶作为一种纯化工具还处于起步阶段，但最近的一些进展已经显示出令人信服的机会。例如，已经证明了非复制性轮状病毒疫苗候选物（与破伤风毒素的 P2 表位融合的 VP8 亚基蛋白）的结晶。在悬滴蒸汽扩散系统中评估了筛选晶体条件，然后使用蒸发技术进行了放大。发现随后的抗体结合曲线与结晶前相似。该技术还放大到通过连续段塞流结晶实现可调晶体尺寸控制。这些技术为通过疫苗结晶进行连续生产提供了可能性。看看技术发展能在多大程度上推动目标分子中的杂质清除，或者结晶是否需要与层析法或沉淀以及两相萃取相结合，这将是一件有趣的事情。 预计在未来 10 年内，工艺将进一步强化并集成到更小的占地面积中，从而提供更低成本的工艺，更易于全球部署。改进的技术可以实现一步层析法和连续工艺，其结合单程切向流过滤以及对昂贵试剂的可持续回收，这对 RNA 生产尤为重要。支持非层析工艺（包括结晶）的技术预计将进入临床前开发阶段。所有这些活动都将得到 AI 指导的机械建模和支持自主操作的先进控制策略的支持。 药物产品（DP）工艺 大多数获批的疫苗通过肌肉注射(IM)、皮下注射或皮内注射给药，也有少数获批的口服和鼻腔疫苗。此外，正在开发通过吸入输送到肺部和使用微针贴片输送到皮内的疫苗。无菌注射 DP 生产包括制剂 (配方)、除菌过滤（大多数情况下）、灌装小瓶或预灌装注射器、目视检查、贴标和包装 (即灌装-完成)。一些疫苗在灌装后在最终容器中冷冻干燥 (冻干)。结合疫苗需要将抗原与载体蛋白结合。最后，某些疫苗可能需要经过工艺步骤来加入佐剂。许多注射疫苗，例如含有减毒活病毒或铝凝胶佐剂的疫苗，不适合除菌过滤，因此上游步骤需在无菌条件下进行以确保无菌。 许多为 COVID-19 开发的疫苗都包含 DP 生产方面的创新。其中最关键的是辉瑞-BioNTech 的 Comirnaty® 和 Moderna 的 Spikevax® 中使用了 mRNA-LNP。需要建立一个全球性的灌装-完成站点网络，并构建具备 LNP 制备和 TFF 等新单元操作的能力。LNP 的制备需要将水性 mRNA 溶液和4种脂质的乙醇溶液受控地泵入微混合装置，如图 4所示。刚形成的含 mRNA 的LNP 具有非常有限的物理稳定性，因此 LNP 形成步骤之后立即进行溶剂和缓冲液置换，使用 TFF 去除乙醇并调节 pH 值。 尽管 COVID-19 mRNA-LNP 疫苗表现出显著的有效性，但它的一个主要限制是需要冷冻储存和运输，这增加了成本和复杂性，并阻碍了更广泛的分发。辉瑞-BioNTech 疫苗目前的保质期为 18 个月，但必须保持在 −90°C 至 −60°C，而Moderna 疫苗的保质期为 9 个月，保存温度为−50°C 至 −15°C。最近的一篇评论总结了提高mRNA-LNP 疫苗稳定性的重点领域，包括优化构成纳米颗粒的脂质、缩短 mRNA 链长、增加 GC 含量以及使用冻干等干燥技术等。 mRNA-LNP 疫苗的冻干是可行的，并且可以提高热稳定性。虽然未来的 mRNA-LNP 产品可能会被冻干，但目前的 mRNA-LNP COVID-19 疫苗却不能，因为冻干产能有限，在疫情期间没有足够的产能生产数十亿剂。喷雾冷冻干燥和无菌喷雾干燥等新兴技术在未来可能会成为可行的选择。在某些条件下，单个喷雾冷冻干燥机或喷雾干燥机可以匹配许多冻干机的产出量。 应对 COVID-19 的举措还包括重组病毒载体疫苗的重大进展，例如阿斯利康的 Vaxzevria®（由印度血清研究所生产，商品名 Covishield®）、国药集团的 Covilo®、杨森的 Ad26.COV 2-S、Gamaleya 的 Sputnik V 和康希诺的 Convidecia。在过去 10 年中，有4种病毒载体疫苗获批用于治疗埃博拉病毒，一种用于治疗登革热病毒。病毒载体疫苗采用传统的灌装技术，包括混合冷藏液体、冷冻至 −20°C 和冻干。 许多新型疫苗 DP 制剂和给药方法正在开发中。有些将需要新的 GMP 生产步骤，例如微针和多种类型的纳米颗粒。 重组人白蛋白 在生产或配方中使用任何动物源成分都需要采取广泛的预防措施，以防止被病原体污染。白蛋白和明胶长期以来一直被用作制剂成分来稳定某些疫苗。多年来，白蛋白的来源是人类志愿者捐献的混合血浆。2006 年，默克获得批准，使用在酿酒酵母中表达的 Recombumin® 重组人白蛋白进行 MMR®II 的上游生产。 2019 年，默克使用重组人白蛋白作为 DP 配方辅料的 ERBEVO® Zaire埃博拉病毒疫苗获得 EMA（欧盟委员会，2020 年）和 FDA（美国食品药品监督管理局，2019 年）批准。白蛋白是 InVitria 公司从大米中提取的 Exbumin®。疫苗需要在 −80°C 至 −60°C 下储存和运输，在 2–8°C 下最多可保存 14 天。预计重组白蛋白将在未来用于更多疫苗。 佐剂 佐剂对于含有佐剂的疫苗的有效性至关重要，并且是其开发和生产的专业领域。目前使用的许多佐剂都被视为知识产权 (IP)。例如默克铝佐剂、葛兰素史克佐剂系统、MF59® (Novartis)、Matrix-M (Novavax) 以及位于西雅图的 Access to Advanced Health Institute 拥有的几种佐剂。 目前 FDA 和 EMA 批准的疫苗中最常见的佐剂类型是不溶性铝盐悬液（无定形羟基磷酸铝硫酸盐、氢氧化铝、磷酸铝和硫酸铝钾）。此类佐剂已使用了近 100 年。它们的基本粒径为几十纳米，形成松散连接的网络，根据测量方法和剪切条件的不同，其尺寸为 1-20 µm。含有铝佐剂的疫苗无需冷冻，因为这会导致佐剂粒径增加；但是，如果有足够的稳定剂（如蔗糖）和/或冷冻速度足够快，这些疫苗可以冻干或喷雾冷冻干燥，以提高稳定性。另一个问题是铝颗粒可能会形成难以悬浮的沉淀物。 商业疫苗中的其它佐剂包括明尼苏达沙门氏菌（Salmonella minnesota）脂多糖 (MPL、MPLA)的化学改性脂质部分、含有 CpG 基序以模拟细菌 DNA 的合成寡核苷酸（例如 CpG 1018®）、角鲨烯和皂苷。这些佐剂以各种组合使用，在某些情况下吸附到氢氧化铝上或作为乳液或纳米颗粒的一部分。所有佐剂的共同主题是粒径，这是一种具有免疫学后果的属性，可能很难通过生产和质量控制进行管理。 稳定 在产品制剂和工艺开发过程中，需要确定降解途径，以评估生产工艺和产品成分变化对稳定性的影响。生物制品最重要的化学降解途径之一是水解，这通常会导致肽键打开。其它化学降解途径包括脱水和氧化。物理变化包括亚基或疫苗主要形态的聚集和变性（或蛋白质的错误折叠）。这些分子变化会导致产品质量变化，从而导致功能丧失、脱靶免疫原性或其它不良影响。分子的单一变化可能会使其完全失效，具体取决于结构受到影响的位置。另一方面，有些变化不会产生任何影响，因为它们不在与产品活性相关的领域。由于疫苗产品中使用的抗原和佐剂的复杂性，很难理解或预测所有可能的变化及其影响；一般来说，尽量减少所有降解非常重要。 疫苗产品中必须控制和监测影响或加速降解的因素。这些因素包括产品 pH 值、氧气水平和水活性（例如固态制剂），这些因素会导致水解和氧化。高温通常会加速所有途径的降解。某些缓冲液、离子强度和微量金属会影响产品的稳定性。最后，暴露于光线、冻融和暴露于剪切或搅拌会导致气-液或固-液界面发生转换，从而导致产品发生变化。 通过添加在制剂研究过程中确定的不同类型的稳定剂，可以确保产品的稳定性。最终的成分取决于产品的类型、降解风险和给药途径。稳定剂包括冷冻保护剂、除氧剂和蛋白质；例如明胶、PEG 和用于控制 pH 值的特定缓冲液。根据目前对降解的潜在机制的理解，可以确定特定稳定剂的具体类型和数量。 一旦确定了产品成分，就需要在整个生产和分发过程中进行环境控制。降低温度（无论是冷藏还是冷冻）都可以保护产品质量。由于可以通过减少水和氧气的存在来限制许多降解途径，因此可以通过冷冻干燥（冻干）或喷雾干燥并将惰性气体引入顶部空间来干燥产品。从历史上看，冻干一直是稳定疫苗产品的主要途径，与其它形式的干燥方法一样，对未来的疫苗产品也很重要。 表 4总结了疫苗产品的不同平台和所用形式类型以及长期储存条件。一些液体产品不能冷冻，否则会影响产品质量；这对于含有铝佐剂的疫苗产品尤其重要。冷冻条件可以保护原本以溶液/液体为基础的产品，但会导致复杂的生产和供应链挑战。干燥产品可以在更高的温度下储存，从而最大限度地降低质量风险，但除非最终剂型是固态，否则需要进行复溶步骤和/或生产稀释剂。 表4. 疫苗产品形式和储存条件。 干燥趋势 干燥疫苗产品包装在各种容器中，这决定了最终干燥产品加工所选择的操作。大多数干燥疫苗产品使用小瓶商业化，这增加了全球产能。灌装机非常快，可灵活适应不同尺寸的小瓶，并在全球范围内安装。此外，小瓶灌装设备可在几种液体产品之间共享，从而提高利用率，并为无菌灌装设施的高资本投资带来经济回报。冻干设备旨在优化玻璃小瓶中单剂量或多剂量单位的生产。然而，对于冻干产品，可能需要定制稀释剂，这会使灌装要求翻倍。对额外组件和二次生产操作的需求增加了成本。在患者给药时，两组材料会引入额外的步骤，并增加临床出错的风险。已经开发了双室产品选项，以方便复溶。虽然这些产品消除了临床中的给药步骤，但需要额外的生产步骤，在一个室中冻干并在第二个室中灌装稀释剂。 疫苗通常通过胃肠外途径给药，因此生产的最后阶段必须在无菌条件下进行。容器必须在线清洗和灭菌，或购买即用型容器（成本增加）。液体和冻干产品都需要灌装和封塞。待冻干的产品仅需部分封塞，然后无菌运输到冷冻柜中，在冷冻柜中进行冷冻、干燥、气体覆盖和完全封塞（图 7）。系统设计为允许从灌装线直接转移到冷冻柜，同时保持无菌条件。对于双室注射器，工艺差异需要专用设备。图 8说明了完成产品生产所需的操作。由于该设备专用于此类产品，因此利用率可能更难管理。双室产品的成本因组件数量、步骤数量以及设备容量减少而增加。 图7. 液体和冻干产品的加工操作。 图8..双室系统的工艺操作。 先进的产品干燥技术 干燥疫苗产品生产技术的进步必须包括上述新型疫苗形式的功能，同时注重提高生产率和改善质量保证。减少干燥操作的持续时间为提高生产率提供了重要的机会。干燥循环时间的主要限制是水分去除率，通常必须降低该值，以保持较低的产品温度，以防止“回熔”（melt-back）或“塌陷”（collapse）。塌陷是一种产品缺陷，产品饼的结构会丢失，会影响稳定性和产品活性。必须控制热量和质量传递，以确保最终产品质量。目前的冻干柜使用在搁板内流动的传热流体来冷冻产品并驱动汽化。对于冷冻和加热，能量必须通过玻璃瓶底部穿过搁板传递并到达产品的整个体积，这可能是低效的。由于壁、搁板之间和搁板上的瓶子位置的热量和质量传递差异，整个柜子不均匀，进一步导致效率低下。 传热方面的改进可以显著缩短循环时间。或者，水分压非常低的干燥环境可以驱动产品中水分的蒸发，而无需直接加热产品。连续生产系统通过提高设备利用率来提高生产率。此原理可应用于所有产品类型的干燥，包括小瓶和双室装置。其中一些技术允许原位干燥，而另一些技术则会生成干燥产品，必须将其以适当的剂量分装到容器中。批量干燥产品的生产为开发不限于典型小瓶的新型形式提供了机会，并且稳定性更高。利用现有原理和小瓶灌装能力的小瓶产品连续冻干方法是最容易实施的。 喷雾干燥可产生球形颗粒的干粉产品，是许多先进干燥工艺的重点。对于批量干燥技术，灌装到单位剂量容器中需要进行粉末灌装，这对于无定形粉末来说可能具有挑战性。除了提高喷雾干燥产品的流动性之外，还降低了产生细颗粒和污染小瓶外部表面的风险。虽然无菌操作的顺序是相反的，但工艺步骤的数量保持不变（图 9）。 图9.传统冻干技术与批量干燥工艺的比较。 任何工艺改进都必须满足无菌要求，以提供适当的产品质量。设备必须经过灭菌并在高度受控的环境中运行，以保持最高水平的无菌保证；目前新的趋势包括尽可能实施封闭系统。所有输入都必须在使用时通过除菌过滤进行灭菌，或以预灭菌材料的形式进行无菌引入。房间分类是根据设备设计和所需的干预措施确定的。 原位干燥工艺替代方案 目前，商业产品最常见的方法是在最终容器（例如小瓶和双室注射器）中进行原位干燥。人们已经研究了传统冻干工艺的所有步骤的改进。冷冻步骤对于形成适当的多孔宏观结构和增强蒸汽去除的传质至关重要。发展的重点是改善成核控制和增加干燥步骤的表面积。通过关注能量输送可以改进初级和二级干燥步骤，在当前的冻干柜中，能量输送受到通过搁板到玻璃小瓶的热量传递、以驱动蒸发的限制。连续处理可以提高生产率和一致性。 泡沫干燥 泡沫干燥不需要冷冻，而是利用干燥过程中的蒸发冷却来维持产品温度。形成的气泡提供了膜状表面和高干燥表面积；工艺开发的重点是控制气泡的大小和膜的厚度，以确保快速高效的干燥过程。泡沫干燥技术已被证明可用于保存疫苗以及生物制药、微生物样本和农产品。 微波真空干燥（MVD） 微波能量可用于替代搁架中的加热流体，应用于传统的冻干柜中，可以继续使用现有设备。微波场中快速循环的水分子会导致分子水平或接近分子水平的加热和水的蒸发，而不会显著加热敏感产品。此外，能量会立即穿透整个系统，而不会产生传统冻干中观察到的局部热量和质量传递效应。微波场的频率控制为在单个产品工艺开发过程中优化系统提供了一种工具。 MVD 技术已被证明可用于疫苗和其它生物制药。Bhambhani 等人使用 EnWave 中试规模系统研究了 MVD，其中产品在小瓶中离线冷冻并转移到 FreezeREV® 干燥机（图 10a）。升华是由于干燥室中产生微波的磁控管提供的能量而发生的。干冰冷凝器用于冷凝水蒸气，并塞住产品小瓶。MVD 的循环时间比冻干短 87%。早期中试规模研究的结果显示，水分含量和活性与传统冻干法相当。 图10. 替代干燥工艺。（a）EnWave FreezeREV 中试规模系统示意图。（b）小瓶产品的连续冻干。WIPO PCT 专利号 WO 2018/204484 A1。（c）层流 PACE 系统。（d）IMA Life Lynfinity 连续喷雾冷冻干燥机。 连续处理 图10b显示了 Pisano 及其同事提出的连续原位干燥工艺。小瓶通过模块移动，每个步骤之间都需要专门设计的转移模块来保持适当的压力、温度和气体成分。该系统的设计旨在利用传统和熟悉的工艺操作快速连续地生产干燥产品。将每个小瓶移动到冻干阶段的操作非常复杂，因此人们将重点放在生产批量干粉上。 批量干燥工艺替代方案 虽然通常需要混合和研磨才能达到小分子或干粉可吸入产品的目标粒径，但这些额外的步骤对于注射剂来说并不常见。赋形剂被加入喷雾干燥机进料中，材料可以直接转移以进行粉末灌装。 如图 9所示，与原位干燥工艺相比，批量干燥工艺颠倒了灌装和干燥的顺序。这需要完全无菌的粉末或颗粒灌装能力（“干灌装”）。粉末灌装已经存在了一段时间，用于灌装无菌抗生素粉末，尽管具有挑战性，但该工艺是通过提高喷雾干燥材料的流动性来实现的。也可以使用各种粉末灌装设备来灌装颗粒。批量干燥的一个优点是，批量无菌粉末或颗粒可以灌装到几乎任何类型的容器中，包括传统的小瓶和双室注射器，以及不适合原位干燥的新型复溶注射系统。使用批量干燥和干粉灌装可以大大降低生产双室注射器的成本。已经开发了几种其它方法来解决干粉灌装的问题和挑战。 喷雾干燥 现在可以使用无菌喷雾干燥技术，并允许连续干燥和粉末生产。一个例子是 Aseptic SD™ 系统。在喷雾干燥中，含有产品的液体溶液流过喷嘴，将产品分散成细小颗粒。喷雾干燥的优点之一是能够通过调节喷嘴来控制粒度。必须提供无菌气体作为产品干燥的传热介质；可以使用惰性气体（例如 N2或 Ar）来限制氧化降解。在传统的喷雾干燥模式下，热气流过系统以驱动蒸发。气体温度可高达 120°C，这可能会导致敏感生物产品的降解。但是，系统中会迅速发生蒸发冷却以降低产品温度，并且受热时间非常短。这些系统已成功应用于生物生产。 另一种系统使用网状雾化器在干氮层流中形成球形液滴（图 10c）。此外，沿膜逆流提供干氮，以去除气体中的水分。该系统在环境温度下运行，以限制敏感产品受到的热应力。该技术的概念验证已在 mRNA-LNP 产品中得到证实，在保持包封效率、粒度和分布以及体外和体内 mRNA 活性方面取得了优异的效果。 喷雾冷冻干燥 喷雾冷冻干燥也称为“批量冷冻干燥”的一种形式，其需要在装有冷气的塔中对液滴进行冷冻，然后在干燥室中真空升华。目前，该领域有两个主要竞争对手，并已成为最近多篇评论的主题。第一种技术基于在塔中进行液滴冷冻，然后在独特的旋转滚筒中对冷冻颗粒进行真空干燥。该技术已成功扩大规模，产品收率高达 97%。第二种技术是连续喷雾冷冻干燥机，如图 10d所示。液滴从喷嘴产生，并在滴过液氮冷却柱时被冷冻，从而形成小直径的球形颗粒。冷冻球通过传送带在不同的压力和温度下移动，以获得低水分产品。最终产品直接装入适当的容器中，容器以无菌方式密封，用作粉末灌装系统的进料。 疫苗表征研究的进展 最近推出的新型疫苗技术平台（即mRNA和病毒载体疫苗）促进了分析技术的快速发展，以支持疫苗开发和质量分析。 生物物理和分析技术 现有生物物理和分析技术的分辨率和灵敏度不断创新性地提高，使得疫苗（包括灭活或减毒病毒、重组蛋白亚单位和 VLP 以及多糖结合物）的纯度和异质性表征更加严格。这些进步提高了疫苗关键质量属性(CQA) 定量评估的可靠性，提高了批次放行的可信度。 此前已综述了质谱 (MS) 在疫苗开发中的应用，并列举了重组蛋白抗原和糖结合物的具体应用实例。毛细管电泳 (CE) 结合飞行时间 (TOF)-MS 已用于表征结核分枝杆菌抗原及其糖结合物。电荷检测质谱 (CDMS) 可同时检测质量/电荷和电荷，已用于量化多种疫苗类别和多价疫苗的纯度和异质性。 mRNA 疫苗技术的巨大成功促使了分辨率和灵敏度的提高，以及毛细管凝胶电泳 (CGE) 和离子对 RP-HPLC (IP-RP-HPLC) 等分析方法的创新应用，以评估疫苗构建体的完整性和异质性。此外，以足够的分辨率分析多价疫苗变得更加可行。采用 IP-RP-HPLC 和 MS 组合来检测和表征 mRNA COVID-19 疫苗的 mRNA-LNP 制剂中脂质片段与 mRNA 核苷的加合物。研究表明，这些加合物的形成会降低疫苗效力，而储存时间和温度与此有关。 dsRNA 是 mRNA 产品中的反应原性杂质，其含量必须尽可能接近于零。虽然有分析和免疫化学检测方法，但提高灵敏度和通量将有助于工艺和产品监控。为此，开发了一种采用微流控技术的 CE 方法，该方法利用ssRNA 和dsRNA 两种不同荧光团的差异荧光强度。 动态和多角度光散射 (DLS 和 MALS) 技术的分辨率和数据分析能力不断提高，可以精确分析蛋白质抗原、病毒和病毒载体以及 LNP 的尺寸异质性和聚集性。mRNA-LNP 的尺寸分类使研究人员能够确定疫苗制剂体内免疫原性的粒径依赖性。一项最近的创新是基于光散射的质谱光度法技术，可以确定单个粒子的大小，从而确定粒子集合中的异质性。该技术已用于研究 SARS-CoV-2 刺突蛋白与 ACE2 受体之间的相互作用。 新的单粒子检测方法可以观察溶液中的配制疫苗产品（如 mRNA-LNP），并提供动态视图（而非静态电子显微镜 (EM) 图像）。溶液中单粒子成像的一项最新创新是凸透镜诱导限制或 CLIC。CLIC 是一种很有前途的技术，用于可视化和定量分析 mRNA-LNP 结构、大小和 mRNA 候选疫苗中 mRNA 负载的异质性。与传统的平均集合测量相比，光散射技术的同步进步使得单粒子尺寸分析成为可能。分辨率的提高以及基于模拟和机器学习 (ML) 的数据分析技术发挥了关键作用。 最近开发的可调电阻脉冲传感器(TRPS) 方法正用于生物纳米颗粒（如 LNP）的单颗粒分析，包括尺寸分布和 zeta 电位。通过测试不同大小的 mRNA-LNP 的体内免疫原性，已经证明了更高精度的尺寸分级的影响。与较大的（100-140 nm）mRNA-LNP 相比，较小的（<80 nm）mRNA-LNP 在小鼠中似乎引起的免疫原性较低，尽管其对人类免疫原性的影响尚不清楚。虽然 SEC-MALS 已成为一种成熟的技术，但场流分馏 (FFF)-MALS 提供了基于尺寸分离的优势，而无需与固体基质相互作用。该技术用于关联基于亚单位融合蛋白的呼吸道合胞病毒 (RSV) 候选疫苗和含有封装 mRNA 的 LNP 的聚集依赖性效力变化。 BioSAXS 是最近推出的技术，是小角度 X 射线散射 (SAXS) 和 SEC-HPLC 的组合。与 DLS 类似，SAXS 是一种溶液散射技术，用于对蛋白质和蛋白质复合物进行低分辨率结构表征和建模。BioSAXS 已用于确定 sa-mRNA 疫苗 (IMP-1) 的回转半径，与 DLS 确定的流体动力学半径高度一致。 冷冻电子显微镜分辨率的显著提高使得人们能够可视化充满 mRNA 的 LNP，并确定每个纳米颗粒携带的 mRNA 构建体的数量。这些测量揭示了 mRNA 载入到 LNP 中的异质性，以及给定群体中存在空的 LNP。此外，在一些 mRNA-LNP 颗粒中，观察到 mRNA 形成与脂质分离的泡状结构。高分辨率冷冻电子显微镜还被用于确定野生型和突变型 S 蛋白三聚体的结构，以支持亚单位 COVID-19 疫苗的开发。 无标记检测技术创新促进了疫苗开发的多个方面，从抗原选择到 DS 和制剂 DP 的功能表征。例如，生物层干涉法 (BLI) 比表面等离子体共振 (SPR) 具有更多优势，尽管这两种技术都可以实时测量大分子和配体之间的结合和解离动力学。BLI 用于评估 SARS-CoV-2 S 蛋白 RBD 三聚体与 ACE2 受体和中和人单克隆抗体的结合动力学和亲和力。 免疫分析 除了继续使用流行的酶联免疫吸附试验(ELISA) 技术外，还开发了一些其它技术，旨在提高检测灵敏度、精度、速度和通量。这些平台的例子包括AlphaLisa、VaxArray 和 Luminex，它们提供了相对容易的多路复用。据报道，对 ELISA 和 Luminex 免疫分析法在检测和定量 SARS-CoV-2 抗体方面进行了全面比较。多路复用的 VaxArray 已用于表征麻疹和风疹疫苗以及流感疫苗。VaxArray 最近已被用于同时快速检测和量化肺炎球菌疫苗中常见的 23 种多糖血清型。在基于抗原抗体的免疫分析法的创新变体中，VaxArray 已被用于识别和表征使用互补寡核苷酸作为捕获试剂的 mRNA 构建体。AlphaLisa 是一种基于化学发光的高通量免疫分析法，已用于检测SARS-CoV-2 核衣壳蛋白。这些免疫分析法可用于细胞培养，例如，用于评估用 mRNA 疫苗转染细胞后的蛋白质表达。由于 mRNA、pDNA 和病毒载体携带的转基因的疫苗功能取决于编码蛋白质抗原的细胞内表达，因此免疫分析也为这些类别的疫苗提供了有价值的定量表征。 上述较新的免疫分析技术越来越多地被用作检测病毒抗原诱导的血清抗体的诊断工具。它们还提供了一个平台，用于比较感染和未感染人群中预防性疫苗引起的免疫反应水平。与高量子产率荧光团结合的抗体有助于在基于细胞的检测（如流式细胞术）中灵敏地检测和可视化这些功能事件，流式细胞术利用激光诱导光散射和荧光检测的组合。荧光显微镜的进步也使得可视化 mRNA 序列翻译成其相应的蛋白质成为可能。 测序和 PCR 技术 过去十年，测序技术的进步在多个方面对疫苗质量检测产生了重大影响。新一代测序 (NGS) 的准确性明显高于Sanger测序，这使得 NGS 成为检测核酸疫苗身份和遗传稳定性的宝贵工具。NGS 被用作一种获批的 COVID-19 mRNA 疫苗的批签发身份检测。 疫苗批次放行的一项监管要求是不得含有外来病毒，但挑战在于这些病毒可能是未知的或新出现的。外来病毒的主要来源是生产中使用的细胞底物，包括哺乳动物、昆虫和细菌细胞系。应证明主细胞库和工作细胞库 (MCB、WCB) 不含此类外来病毒因子 (AVA)。从历史上看，体内（在5种动物中）和基于细胞的体外感染性测试已被使用和接受，以确保疫苗中的病毒安全性。然而，在过去十年中，用 NGS 取代体内测试的势头强劲。其中许多举措是由欧洲和美国的监管机构以及世卫组织与生物制药行业和专家顾问合作推动的。NGS 病毒检测灵敏度和广度的最新进展、生物信息学和参考数据库的改进、COVID-19 大流行凸显的快速放行疫苗批次的需求以及减少使用动物的努力共同推动了这一进展。世卫组织和美国食品药品监督管理局分别发布了用于验证 NGS 的参考标准病毒和稳定细胞系的推荐清单。 在过去十年中，在用 NGS 替代猴神经毒力测试方面取得了重大进展，该测试是减毒口服脊髓灰质炎病毒疫苗生产过程中所需的安全测试，也是针对脊髓灰质炎以外可能表现出神经毒力的病毒的测试。另一种体外方法，即通过 PCR 和限制性酶切 (MAPREC) 进行的突变分析，能够检测和量化主要导致神经毒力的回复突变体的频率。NGS 与 MAPREC 的比较分析产生了相同的结果。然而，NGS 的全基因组测序和低频突变检测能力使其成为确保 LAV 疫苗生产中病毒安全性和一致性的更具吸引力的工具。据报道，NGS 已验证为新型 2 型口服脊髓灰质炎疫苗的批签发安全测试。除了成本和时间优势外，NGS 还可以取代基于动物的传统测试，具有明显的伦理优势。 液滴数字 PCR（ddPCR）的引入是过去十年中 PCR 技术的一项非常重要的进步。ddPCR 是一种高通量定量方法，可用于准确确定 DNA 和 RNA 病毒和疫苗的基因组拷贝数。ddPCR 检测的另一个优点是不需要标准曲线或参考标准进行定量。该技术有望广泛应用于不同类别疫苗的身份和遗传稳定性测试，包括 pDNA、mRNA、病毒载体和 LAV疫苗。ddPCR 已被验证可用于在减毒活裂谷热（一种 RNA 病毒）疫苗的开发中定量 RNA 拷贝数并检测回复突变体。 虽然分析表征技术的进步已导致疫苗抗原的高纯度和结构完整性，但宿主依赖性生物因素往往使得难以预测所需的免疫反应是否会在体内引发。尽管如此，高分辨率结构分析，辅以免疫分析和突变扫描，已被用于识别对产生病毒中和抗体至关重要的抗原位点。当疫苗效力的主要机制是细胞介导免疫 (CMI) 时，这种相关性更具挑战性。然而，最近有报道称使用 MS 辅助识别 HLA 呈递的 T 细胞表位并设计CMI 引发的 mRNA 疫苗。 分析放行检测 分析方法是疫苗的关键基础，需要持续监测和更新，以提供最佳信息来指导这些产品的开发和生产。分析质量源于设计 (QbD) 概述了开发稳健分析方法的途径。分析 QbD 中编纂的概念基于指导文件，包括 ICH Q14，该文件描述了开发和生命周期维护稳健方法的增强方法。将这些指导文件中概述的方法应用于传统方法可以带来显著的收益，但将它们应用于旧技术时存在固有的局限性。 SARS-CoV-2 疫苗的开发和商业化速度对于未来的疫情应对来说是令人鼓舞的，但必须采取更多措施来缩短所有新型预防性疫苗的开发时间。疫苗生产过程难以控制，最终产品难以进行简单的定义和表征。投资新兴分析技术将有助于项目尽早生成关键信息，以避免在临床开发的后期阶段停滞不前，并将带来更好的产品和过程理解。开发和建立使用新技术的先例很重要，这将最大限度地降低风险并允许其广泛采用。在分析 QbD 方案中，在分析目标概况 (ATP) 的开发过程中，应认真考虑引入新技术。下面讨论独立于产品方法和特定于产品方法的分析技术的部分进展。 与产品无关的方法 疫苗制剂的安全性测试包括微生物学测试，例如无菌、生物负载、内毒素、支原体和外来因子测试；其中许多方法由药典当局详细描述。这些方法的优点是已经得到充分建立和理解，但可能非常费力且耗时，此外还引发了对使用动物的伦理担忧。最近的指导意见鼓励考虑替代传统方法。FDA 表示，“如果申请方提供有关测试特异性、敏感性和稳健性的充分信息，则 IND 下可以接受与 USP、FDA 指南或联邦法规(CFR) 中概述不同的分析程序。”同样，附件 1 指出，“生产商应考虑采用合适的替代监测系统（例如快速方法），以加快检测微生物污染问题并降低产品风险。” 新的快速微生物学方法的采用正在获得发展势头，部分原因是对 COVID-19 大流行的响应，以及对细胞和基因治疗产品的需求，其中许多产品的保质期很短。众所周知，传统的、基于生长的无菌评估方法由于样本量和生长条件而存在局限性。BacT/Alert 3D 系统已加入药典 14 天生长无菌测试，作为经过验证的无菌方法；其它测试（一些基于生长，一些则不是）正处于不同的开发阶段。基于 PCR 和 ELISA 的检测方法现在被广泛用于检测支原体，基于 NGS 的方法也正在开发中。 外来因子检测需要能够检测出各种可能污染物的方法。人们正在探索诸如激光力细胞学等新技术，以识别细胞病变效应并改进传统的、基于细胞的检测方法。NGS 技术不仅在检测微生物污染物方面具有重大前景，而且还有望取代目前用于检测 AVA 的体内、体外和 PCR 测试。 特定于产品的方法 除了药典放行检测外，疫苗还需要检测特定于所开发疫苗的 CQA，例如身份、强度、纯度和效力。传统上用于检测这些属性的方法存在局限性，而新兴技术在许多情况下可以缓解这些局限性。 疫苗效力分析方法种类繁多，以满足人们的期望，即它们将提供有关患者所需免疫反应的信息。体内效力分析充满了基于动物的分析所固有的变异性、不可重复性和较长的周转时间。出于这个原因，以及出于对动物福利和成本的考虑，体外分析的开发已成为疫苗表征和批签发的核心。了解疫苗的作用机制 (MOA) 仍然是开发最相关效力分析的关键，但开发科学家可用的工具比以往任何时候都多。在不了解保护性免疫反应的确切性质的情况下，新技术正在提供有关疫苗基本作用方式的更丰富、更精确的信息。在某些情况下，抗原与佐剂相互作用以产生所需的免疫反应仍然无法通过当前的方法和知识进行评估。 几十年来，噬斑分析一直是活病毒疫苗的病毒学主力方法，但近年来的科学技术进步可以用来增强和/或替代病毒定量方法，如传统噬斑和 TCID50 方法。荧光成像技术分辨率和定量准确性的提高促使自动病灶计数取代传统检测方法。细胞单层中斑块或细胞病变效应 (CPE) 的目视识别可以被 PCR、激光力细胞学和细胞电阻抗等替代。在佐剂的存在抑制这些技术的使用的情况下，微生理系统显示出作为将疫苗效力与体内功效关联起来的模型系统的前景。使用这些系统还可以提供一种评估旧疫苗和工艺变化的影响的方法，而无需使用临床前动物模型或临床试验。 蛋白质亚单位和 VLP 疫苗通常依靠抗原性分析来确定体外效力。与标准 ELISA 方法相比，基于 AlphaLisa、荧光能量转移 (FRET)、Luminex 和电化学发光等技术的分析在速度、灵敏度、动态范围、数据密度和多路复用能力方面具有优势。除了基于蛋白质的疫苗外，免疫分析还用于采用较新技术开发的疫苗，例如最终抗原是蛋白质的 mRNA。例子包括人类狂犬病疫苗，已为其开发了基于囊膜糖蛋白的 ELISA 和时间分辨免疫荧光，以及全细胞百日咳疫苗 ELISA，后者已被证明是目前使用的体内 Kendrick 测试的有希望的替代品。流式细胞术（可能使用荧光标记的抗刺突蛋白抗体）被用于对首个获批的 COVID-19 mRNA 疫苗进行效力分析。 在缺乏用于效力测量的特异性免疫分析法的情况下，可以开发与效力相关的结构和功能分析法作为替代方法。世卫组织生物标准化专家委员会于 2021 年分布的一份报告作为 mRNA 疫苗开发的指南，表明了监管部门对这一概念的开放态度。事实上，这种替代分析法已被接受用于表征双价 mRNA COVID-19 疫苗的疫苗效力。 作为纯度和完整性分析旧技术的进步的一个例子，CE 已发展成为 SDS-PAGE 和免疫印迹技术的更好替代方案，大大改善了工艺和产品理解。同样，MS 有望改进传统的、基于 ELISA 的 HCP 检测方法。 SARS-CoV-2 疫苗的开发和放行测试为未来的大流行疫苗铺平了道路，也提供了有望缩短预防疫苗开发时间的方法。 过程监控分析 最近的 COVID-19 疫情凸显了实时或快速放行疫苗批次的必要性，以最大限度地减少可预防的死亡和疾病。此外，如果在 DS 或 DP 的 GMP 生产结束时一批疫苗未能满足放行规范，则代价可能极其高昂。因此，通过入线或近线测试监控每一步工艺对于确保最终产品的高质量和快速放行非常重要。每种正在开发的新疫苗通常都有明确的目标产品质量概况 (QTPP)。已经描述了通过优化生物工艺以达到目标 QTPP 的概念，并支持 mRNA DS 工艺的分析数据。这一基本原则与在所有平台上为所有生物制药开发工艺实施QbD 原则相关。 应监测生产工艺步骤，以保留效力所需的抗原表位。在存在细胞底物的情况下测量效力的能力的提高在许多情况下使这成为可能，从而避免了工艺故障并实现了优化。例如，通过“流式病毒分析法”在线监测有缺陷的病毒颗粒，结合基于激光力细胞学的效力测量，已用于改进 LAV 疫苗生产工艺。结合电容工具和高内涵成像来实时监测细胞密度和峰值感染，这些过程分析技术 (PAT) 工具可以共同为 LAV 疫苗提供效力分析替代品。 最近，有文章回顾了将 PAT 整合到生物过程中的好处。拉曼、核磁共振 (NMR)、近红外和中红外 (IR) 光谱以及 DLS 越来越多地被用作 PAT 工具，因为这些生物物理测量提供了与功能相关的结构信息。NMR 光谱对于在针对肺炎链球菌的疫苗抗原的纯化工艺开发中优化荚膜多糖的质量非常有价值。NMR已被用于在开发针对流感嗜血杆菌和脑膜炎球菌 A 亚群的结合疫苗的过程中监测多糖的三级结构。 多年来，DLS 和其它光散射技术已用于监测亚单位和 VLP 疫苗的聚集和多分散性，并优化纯化和制剂条件，以防止聚集引起的效力丧失。最近，DLS已用于为 mRNA-LNP 疫苗选择相对单分散的最佳大小的LNP 群体。这些信息有助于在 mRNA DP 工艺的开发中控制微流控混合参数，尤其是流速。随着 QbD 驱动的 mRNA DS 和DP 连续生产工艺的进一步开发和优化，PAT 将继续发挥重要作用。 原文：B.Buckland, G.Sanyal, T.Ranheiim, et al., Vaccine process technology—A decade of progress. Biotechnology and Bioendineering, 2024. 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。