Dolastatin 10

前言有效载荷（payload）是ADC发挥肿瘤杀伤作用的重要武器，其作用机制很大程度上决定了ADC药物的性能，而其活性和理化性质对抗肿瘤疗效也有直接影响，因此其重要性不言而喻。在日趋成熟的技术驱动下，有效载荷已经历了三代创新，从第一代ADC使用的细胞毒性载荷如甲氨蝶呤（Methotrexate）、长春花碱（Vinblastine）和阿霉素（Doxorubicin），发展到以微管蛋白抑制剂（Maytansine）为主的第二代新型高效有效载荷，以及以DNA损伤剂为代表的第三代有效载荷。当前，基于不同的作用机制和功能需求，有更多的新型载荷在探索和开发中（如图1所示）。本文从有效载荷的理想特征、多样性、作用机制等方面认识和探索其未来的创新之路。图1 ADC有效载荷的发展之路理想的有效载荷理想的有效载荷应具备以下几点：有足够强的细胞毒性有较低的免疫原性在循环系统有较高的稳定性有可修饰的功能结构提供偶联位点且不影响效力有旁观者杀伤效应有适当的水溶性作用靶点在胞内有效载荷的多样性目前，已获批ADC所使用的有效载荷包括了3种DNA损伤剂（2个calicheamicin, 1个pyrolobenzodiazepine dimer (PBD)和2个拓扑异构酶抑制剂），2种微管抑制剂（4个aurisatins和2个maytansinoids）和1种细菌毒素，前两者是现在临床试验中最常选择的有效载荷，但其他类型的有效载荷也在开发中。根据作用机制可大致分为如下几类：靶向微管的有效载荷、靶向DNA的有效载荷、靶向RNA的有效载荷、免疫类ADC有效载荷和其他新型潜力有效载荷（如图2所示）。图2 有效载荷的种类1. 靶向微管的有效载荷微管是真核细胞骨架的重要组成部分，参与多种细胞功能，包括维持细胞形态、信号转导、细胞器运输、细胞运动、细胞有丝分裂等，从而成为肿瘤治疗的重要靶点。靶向微管蛋白的抑制剂通过与微管蛋白结合，干扰微管的动态结合，使细胞生长停滞于细胞周期的G2/M期，最终导致细胞凋亡。其中，微管蛋白聚合增强剂，如奥瑞他汀类化合物MMAE和MMAF，作用于α,β微管蛋白二聚体的β亚基，使微管的生长不受调节。与之相反，微管蛋白聚合抑制剂，如美登素类化合物DM1和DM4，通过抑制微管的成熟，阻断微管蛋白二聚体的聚合。美登素类化合物（Maytansinoids）美登素最初是从非洲灌木卵圆梅藤（Maytenus ovatus）的树皮中分离出来的，是一类与微管蛋白结合并抑制微管组装的安莎类抗生素。在体外试验中，其皮摩尔级的IC50值表明美登素有很强的抑制肿瘤增殖分化的能力，同时具备很好的稳定性和水溶性使其成为ADC理想的候选有效载荷。由于天然美登素缺少反应功能结构，无法与抗体偶联，因此需要进行化学修饰。例如，将美登素C3侧链的N-乙酰基团替代为3-（甲硫基）丙醛基团，得到美登素衍生物DM1（如图3A-2），接着在DM1二硫键旁增加两个甲基基团即得到DM4（如图3A-3）。DM1和DM4通过二硫键与连接子偶联，并成为ADC药物开发中广泛使用的一类有效载荷。因为C3位点引入的修饰不会干扰药物的结合状态、亲和力和药效，因此更多针对C3位点的化学修饰研究正在开展。例如，酰化反应（如图3A-5）能进一步优化美登素衍生物的合成策略并降低多重耐药蛋白1（MDR1）介导的耐药性。图3 Maytansinoids类化合物结构示意图奥瑞他汀类化合物（Auristatins）海兔毒素（Dolastatin 10）于1987年从印度洋软体动物Dolabella auricularia中分离出来，有很强的的抗肿瘤细胞增殖作用，在纳摩尔浓度下可有效诱导肺癌细胞和其他肿瘤细胞凋亡。其水溶性合成类似物-奥瑞他汀（Auristatin），包括使用最广泛的MMAE和MMAF。MMAE由四个氨基酸构成，包括单甲基缬氨酸（MeVal）、缬氨酸（Val）、dolaisoleuine (Dil)和dolaproine (Dap)，以及C端的氨基去甲黄麻碱。把C端的氨基去甲黄麻碱替换为苯丙氨酸即得到MMAF，其结合亲和力增强，药效降低。目前，对于auristatin类似物的研究主要集中在C端或N端的化学修饰，以增强效力、提高膜渗透性、以及抑制膜外排泵作用等。例如将MMAF C端苯丙氨酸的羧酸替换成四唑或磷酸盐，其效价与MMAF作为有效载荷的效价相似。将海兔毒素N端用丙醇或叠氮化物修饰，细胞试验也显示出其不错的效力。此外，偶联位点（P2、P4）的化学修饰（如叠氮化修饰等）也为下一代auristatin衍生物的开发提供了新方向。图4 Auristatin类化合物结构示意图艾瑞布林（Eribulin）Halichondrin B是一种聚醚大环内酯类天然产物，其人工合成的新型紫杉烷类似物-甲磺酸艾瑞布林（Eribulin）于2010年被批准用于局部晚期和转移性乳腺癌患者治疗。Eribulin通过与β微管蛋白疏水和极性残基结合，抑制细胞有丝分裂。在不同的体外模型中，ADC- Eribulin对肿瘤细胞高效的清除使得eribulin成为有潜力的有效载荷。目前，第二代eribulin类似物的改造主要集中在C32侧链（如图5）。例如在C32引入低碱性胺或提高eribulin的亲脂性可以获得更好的抗肿瘤活性或扩展药物治疗的肿瘤类型。图5 Eribulin类化合物结构示意图微管蛋白抑素（Tubulysins）微管蛋白抑素（Tubulysins）是从黏菌培养基中分离出来的一种天然抗有丝分裂的线性四肽，由Mep、L-Ile、Tuv和Tup/Tut组成（如图6）。Tubulysins的化学修饰多位于Mep、Tuv和含有偶联位点的Tup。例如用五环取代N端Mep的六环对药物活性影响很小；而将Tuv残基的C11进行乙酰化修饰则会显著降低活性。图6 Tubulysins类化合物结构示意图驱动蛋白抑制剂（EG5 inhibitors）EG5在血液瘤和实体瘤中高表达，且与预后不良有关，因此成为有吸引力的癌症治疗靶点。多个EG5抑制剂如SB-715992（Ispinesib）和Filanesib（ARRY-520）都已用于临床研究中。作为ADC有效载荷，EG5抑制剂可以减少其单独使用带来的副反应，如嗜中性白血球减少症、粘膜炎、胃炎以及治疗窗口窄等。2. 靶向DNA的有效载荷与微管蛋白抑制剂相比，DNA抑制剂通过使双链DNA断裂、烷基化、嵌合、交联等，作用于整个细胞周期，引起细胞毒性作用，对实体瘤有良好的治疗效果。此外，DNA抑制剂的靶点远少于微管蛋白抑制剂，当ADC携带相同数量的有效载荷进入细胞时，DNA抑制剂可以显示出更好的杀伤效果。而且以DNA抑制剂为有效载荷的ADC可以靶向低抗原表达的肿瘤细胞。烯二炔类（Enediyne）从细菌中分离出的烯二炔是迄今为止发现的最具细胞毒性的天然产物之一，通过破坏细胞单链或双链DNA，导致细胞死亡，因此成为常用的ADC有效载荷。其中，开发最成功的卡奇霉素（Calicheamicins）是已上市ADC药物Mylotarg和Besponsa的有效载荷。卡奇霉素通过靶向与DNA结合的小沟，特异性诱导DNA双链断裂，引发自噬。虽然卡奇霉素对正常细胞的杀伤阻碍了其在临床应用中的进展，但高细胞毒性、小分子量和明确的作用机制使其成为有吸引力的有效载荷。拓扑异构酶I抑制剂（Topoisomerase I inhibitors）拓扑异构酶I（TOPO-I）是一种重要的稳定基因组和保护DNA结构的核酶，已成为ADC的热门靶点。晶体结构研究发现临床批准的抗癌药物-拓扑替康（topotecan）是一种非竞争性抑制剂，通过在酶诱导缺口处的两条DNA链之间插入碱基，与酶-底物复合物结合。因此拓扑替康类似物成为一类特别有吸引力的ADC有效载荷，例如天然五环产物喜树碱(CPT)，极低的溶解度阻碍了其被广泛使用；半合成的喜树碱SN-38（伊立替康CPT-11的活性成分），其较高的疏水性和有限的偶联位点数量增加了偶联物制备的挑战性；水溶性的CPT类似物-甲磺酸依喜替康（DX-8951f）具有很强的TOPO-I抑制和抗肿瘤活性；新型高膜渗透性TOPO-I抑制剂DXd（DX-8951衍生物）能抵制P糖蛋白介导的多重耐药性，且有较强的疗效，但其F环含有第二个手性中心，增加了合成和衍生化难度。对CPT的化学修饰主要围绕C7-C11位点，例如研究显示C10位点的羟基修饰可增强抗肿瘤活性；C11位点的氟修饰会数倍增强细胞毒性；一些化学修饰为偶联提供了可选位点。图7 TOPO-I结构示意图吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮杂卓（PBD）PBD是在链球菌中发现的一类具有抗肿瘤活性的天然产物，主要由芳香A环、B环和吡咯烷C环组成。PBD在DNA小沟中进行选择性烷基化，DNA链交联导致DNA损伤，引起细胞凋亡。基于强大的细胞毒性，PBD二聚体具有成为ADC有效载荷的潜力，且正在通过一系列结构修饰以改进PBD作为有效载荷的性能。例如，C8位置进行侧链修饰可以得到多种有活性的化合物，而且侧链长度缩短也具备充足的细胞毒性。在结构中引入酸性或碱性基团能改变化合物的理化性质，通过引入磺酸会导致PBD二聚体从胞质溶酶体转运至胞质和/或胞核内。二硫化修饰的PBD二聚体在GSH水平较高的细胞内表现出更好的稳定性。从结构可以看出（如下图8），PBD类化合物的偶联位点是C2和N10。其中B环的N10位点能与DNA共价连接，比C2位点更安全。未来其偶联位点的修饰或许也是研究方向之一。图8 PBD及衍生物结构示意图3. 靶向RNA的有效载荷以RNA为靶点的小分子抑制剂既能杀死处于分裂状态的肿瘤细胞，也能杀死处于休眠状态的肿瘤细胞，作为ADC有效载荷有望解决无效肿瘤休眠细胞导致的肿瘤耐药和肿瘤复发扩散问题。目前，可作为ADC有效载荷的RNA抑制剂有两种主要类型：RNA剪接抑制剂（泰兰斯他汀及其类似物）和RNA聚合酶II抑制剂（毒伞肽）。泰兰斯他汀（Thailanstatin）RNA剪接抑制剂是一种有效的抗增殖药物，能够靶向分裂活跃和静止的细胞。Thailanstatin是一种从泰国布鲁氏菌中分离出来的天然产物，通过与剪接体U2snRNA复合物的SF3b亚基结合而激活。Thailanstatin家族化合物经抑制真核mRNA剪接途径，对剪接体有较强的结合和抑制作用，从而成为ADC的潜在有效载荷。辉瑞首次探索将RNA剪接抑制剂用作与曲妥珠单抗偶联的有效载荷（如图9-87），并在体外动物模型和细胞系药效研究中取得了不错的结果。图9 Thailanstatin类化合物结构示意图毒伞肽（Amatoxins）毒伞肽（Amatoxins）是一种由核糖体合成的毒性环状八肽，是真核RNA聚合酶 II的选择性抑制剂，能导致细胞凋亡。Amatoxins含有一个由八个L型氨基酸残基构成的大环，通过亚砜部分连接色氨酸和半胱氨酸残基，其三个侧链被羟基化，因此具有良好的水溶性。迄今，研究最深入也最有效的是α-Amatoxin（如图10-88），能显著抑制肿瘤转移和复发，是抗肿瘤耐药性的潜在化合物，目前已被用于靶向BCMA的ADC药物（HDP-101），且正在进行I/Ia期临床试验，用于治疗复发/难治性多发性骨髓瘤。此外，将β-amanitin的羧基（如图10-89）偶联到IgG赖氨酸的氨基上，也能得到具有良好血浆稳定性和高细胞毒性的ADC。图10 Amatoxins类化合物结构示意图4. 免疫类ADC有效载荷ADC在肿瘤临床治疗中的成功，激发了研究者对ADC在其他治疗领域的探索，尤其是免疫学。肿瘤免疫包括T细胞、巨噬细胞、树突状细胞等，通过免疫调节将冷肿瘤转化为热肿瘤，最终增强免疫治疗的效果。然而，对于不能产生自发性T细胞应答和T细胞浸润的癌症患者（冷肿瘤）来说，免疫检查抑制剂并不能很好地发挥作用。因此，开发出能够刺激患者先天性免疫应答，以及促进肿瘤特异性T细胞招募的免疫疗法成为研究热点。与传统ADC不同，免疫刺激抗体偶联物(ISACs)既有抗体的精度靶向特点，又能基于小分子调控先天性和适应性免疫系统。一方面，偶联的免疫激动型小分子能增强免疫应答。另一方面，抗体的靶向性降低了小分子免疫激动剂的毒性。此外，传统的ADC是依赖抗原介导的内吞作用杀死癌细胞，而免疫调节ADC是通过细胞表面FcγR介导的内吞作用激活免疫细胞。目前，正在研究的免疫调节ADC的有效载荷主要包括toll样受体(TLR)激动剂和干扰素刺激因子(STING)激动剂。Toll样受体激动剂Toll样受体(TLRs)是一类重要的参与先天免疫的蛋白分子，是机体抵抗传染病的第一道屏障。激活TLR受体可以改善肿瘤微环境中树突状细胞和巨噬细胞的抗原呈递，促进CD8+T细胞的增殖。Toll样受体激动剂作为一种免疫增强剂，在肺癌、黑色素瘤、白血病和胶质瘤中直接或间接地诱导和增强抗肿瘤免疫反应，从而有效地抑制肿瘤生长。因此，TLR激动剂（主要是TLR7/8/9）成为肿瘤免疫治疗的热点之一。将其应用于ADC也能有效降低毒副作用，提高肿瘤杀伤效果。例如，以TLR8激动剂 (如下图11-91)为有效载荷的抗Her2抗体偶联物，在体外以Her2依赖的方式驱动多种抗肿瘤免疫机制，并在小鼠肿瘤模型中显示出良好的抗肿瘤效果。以TLR7激动剂 (如下图11-92)构建的一类新的免疫调节ADC（HE-S2）在体外试验中也有非常显著的抗肿瘤作用。目前，越来越多的国内外药企开始布局这一ADC差异化开发新赛道，包括恒瑞、百济、InnoventBio、Silverback等。图11 Toll样受体激动剂结构示意图STING激动剂干扰素刺激因子(STING)是天然免疫信号通路中的关键调控因子，具有启动机体自然免疫防御反应，促进T细胞形成适应性免疫的功能。STING介导的I型干扰素信号通路是自然免疫领域的重大发现，为肿瘤免疫治疗提供了新的靶点。鉴于游离STING激动剂的全身给药受到毒性限制，且广泛的生物分布可能不理想，因此可以通过与抗体偶联实现STING激动剂的肿瘤靶向递送、降低毒性，并发挥抗肿瘤作用。环二核苷酸（CDN）是STING蛋白的天然配体（如下图12-93），可通过磷酸酯、糖环和碱偶联抗体。例如，SPEROVIE通过将CDN中的硫代磷酸盐或甲酸酯与PD-1或CTLA-4抗体偶联形成了ADC药物（WO2021046426A1,2021.03.11）。此外，Mersana使用STING激动剂（图12-94）作为有效载荷获得的ADC候选药物XMT-2056也已经进入临床前研究阶段，并且基于其优秀的临床前数据，XMT-2056被FDA授予治疗胃癌的孤儿药称号。还有日本小野制药开发的一种非核酸STING激动剂（图12-95），作为有效载荷通过药物结构中的吡唑环与连接子偶联。图12 STING激动剂结构示意图5. 新型潜力有效载荷Bcl-xL抑制剂Bcl-xL是一种抗凋亡蛋白，在肿瘤形成、转移和耐药过程中发挥重要作用。理论上可以通过阻断Bcl-xL的BH3结合域，诱导癌细胞凋亡。将Bcl-xL抑制剂作为ADC药物的有效载荷，既可以保留活性，又能降低对血小板的毒性。通过一系列晶体结构和构效关系研究，发现因为Bcl-xL上E单元的抑制作用，其比W单元更重要，特别是B环。2017年，AbbVie首此将Bcl-xL抑制剂（如下图13-104）与抗B7H3抗体偶联，获得靶向EGFR 的ADC（ABBV-155），目前仍在临床研究中（ClinicalTrials.gov identifier: NCT03595059）。图13 Bcl-xL抑制剂结构示意图烟酰胺磷酸核糖转移酶（NAMPT）抑制剂烟酰胺磷酸核糖转移酶（NAMPT）是一种控制细胞内NAD+浓度的限速酶，能将烟酰胺转化为烟酰胺单核苷酸。当NAMPT被抑制时，NAD+水平下降到代谢所需的水平以下，导致能量危机，最终引起细胞死亡。虽然NAMPT抑制剂是强效的细胞毒性分子，但它们作为化疗药物在癌症治疗中的使用受到毒性的限制。但鉴于它们不同于其他有效载荷的作用机制、简单的结构和高效价，NAMPT抑制剂可以作为ADC有效载荷应用于临床。蛋白酶体抑制剂（Carmaphycins）蛋白酶体抑制剂是一类新兴的抗癌药物，对某些癌细胞具有超强的细胞毒性，如环氧酮类蛋白酶体抑制剂-carmaphycins。Carmaphycins A和B是从海洋蓝藻菌（Symploca sp.）中分离鉴定出的，它们的α,β-环氧酮可直接与甲基硫氨酸亚砜或甲基硫氨酸砜结合，抑制蛋白酶体的β5亚基。但由于较差的选择性，carmaphycins常表现出毒副作用。而作为ADC有效载荷，高毒性的carmaphycins衍生物可保持理想的效力并获得更好的耐受性。酪氨酸激酶抑制剂人类基因组包括500多种激酶，其中150多种与包括癌症在内的各种疾病有关。蛋白激酶是催化磷酸化的酶，分为3类：丝氨酸激酶、苏氨酸激酶和酪氨酸激酶。目前在临床试验中研究的小分子中有超过四分之一是蛋白激酶抑制剂，超过30种FDA批准用于癌症治疗的分子是激酶抑制剂。但是由于蛋白激酶抑制剂的效力低，因此尚未在ADC有效载荷领域进行广泛的探索。对有效载荷创新的思考除了上文介绍的有效载荷类型和一些经典的化合物，还有很多新的开发思路，如以PROTAC分子作为有效载荷，以近红外光免疫疗法（NIR-PIT）药物作为有效载荷，或开发双载荷ADC、放射性核素药物偶联物（RDC）、抗体-螯合物偶联物（ACC）、抗体-寡核苷酸偶联物（AOC）和肽-药物偶联物（PDCs）等。纵观整个ADC有效载荷开发历程，可以看到以问题为导向，不管是对天然化合物的优化改造还是对不同作用机制的探索，只要“脑洞大开”敢于尝试，终能走出自己的路。参考文献：[1] Shapiro MA. Regulatory considerations in the design, development and quality of monoclonal antibodies and related products for the diagnosis and treatment of cancer. Front Oncol. 2024 Apr 30;14:1379738. doi: 10.3389/fonc.2024.1379738. PMID: 38746685; PMCID: PMC11091260.[2] Wang Z, Li H, Gou L, Li W, Wang Y. Antibody-drug conjugates: Recent advances in payloads. Acta Pharm Sin B. 2023 Oct;13(10):4025-4059. doi: 10.1016/j.apsb.2023.06.015. Epub 2023 Jun 30. PMID: 37799390; PMCID: PMC10547921.[3] Choi Y, Choi Y, Hong S. Recent Technological and Intellectual Property Trends in Antibody-Drug Conjugate Research. Pharmaceutics. 2024 Feb 3;16(2):221. doi: 10.3390/pharmaceutics16020221. PMID: 38399275; PMCID: PMC10892729.[4] Conilh L, Sadilkova L, Viricel W, Dumontet C. Payload diversification: a key step in the development of antibody-drug conjugates. J Hematol Oncol. 2023 Jan 17;16(1):3. doi: 10.1186/s13045-022-01397-y. PMID: 36650546; PMCID: PMC9847035.识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

自2000年首次批准Gemtuzumab ozogamicin以来，抗体偶联药物(ADC)经过缓慢起步后开始加速进入全球市场。目前全球有15款获批上市的ADC药物(表1)[1]，其中7款针对血液恶性肿瘤，靶向6种不同的抗原-CD33、CD30、CD22、CD79b、B细胞成熟抗原(BCMA/TNFRSF17)和CD19；另外8款针对实体瘤，靶向6种不同的抗原-HER2、Nectin-4、肿瘤相关钙信号转导器2 (TROP2)、组织因子（TF）、EGFR和叶酸受体α (FRα)。2022年11月18日，AstraZeneca决定永久中止(Permanently Discontibue)美国市场的Moxetumomab Pasudotox[2]；此前，该药在欧盟于2021年2月获批上市，但于同年七月撤市。2023年5月15日，FDA暂停对Byondis的Trastuzumab duocarmazine (SYD985)[3]的批准决定(CRL表明FDA需要更多信息)[4]。另外两款ADC-Datopotamab deruxtecan (Dato-DXd; DS-1062a)[5, 6]和Tusamitamab ravtansine (SAR408701)[7]-的上市申请可能会在2023年提交。Cetuximab sarotalocan所连接的Payload为IRDye 700DX (IR700)，与传统ADC不同，属于光免疫疗法[8]。表1. 已获批准的ADC和正在监管审查中的ADC（未列出Moxetumomab Pasudotox，FDA已撤市） ADC的成功吸引了众多公司加入该赛道，致力于开发新型ADC。与小分子药物相比，ADC的结构更加复杂，因其是由抗体通过不同的偶联方法与细胞毒性有效载荷(Payload)偶联而成，故ADC的专利布局也复杂得多。本文整理了截至2023年4月1日前已批准ADC的保护专利，重点关注其Linker和Payload方面的专利技术[9]。相关阅读：DS-8201专利大战：第一三共 PK Seagen一、Mylotarg® (Gemtuzumab ozogamicin)Gemtuzumab ozogamicin[10] (图1，Black)于2000年获批，是第一个用于治疗急性髓性白血病(AML)的ADC。Payload为卡奇霉素类似物-奥佐米星，通过结合DNA小沟并引起DNA双链断裂来杀死细胞[11]。美国Cyanamid公司于1987年提交的三项专利(US4970198、US5024948和US5037651)，涉及卡奇霉素增强细胞杀伤活性的方法(基因工程、化学修饰等)。随后，又于1989年提交了两项专利，通过化学修饰引入可以抗体偶联的巯基Linker并制备抗体偶联物(US5053394)和N-乙酰化以提高细胞杀伤效力(US5079233)。1993年，将含有酰肼、巯基的不同Linker引入到卡奇霉素类似物中(US5606040)，基于以上Linker-payloads构建的ADC含有腙键和二硫键，ADC内化后，pH敏感的腙键可在癌细胞的酸性溶酶体和细胞质中水解；二硫键被细胞质中谷胱甘肽还原性裂解，释放出细胞毒性payload发挥抗肿瘤活性[12]。1994年，专利US5773001公布了与抗体偶联的各种含腙Linker，其中一种包括4-(4'-乙酰基苯氧基)丁酸部分(AcBut acyl hydrazine)，后整体被命名为奥佐米星；后续于1995年和1996年申请了两项专利，涉及奥佐米星与靶向CD33的抗体的偶联(US5712374和US5714586)。2000年，FDA批准其用于治疗CD33+ AML；2002年，该公司更名为惠氏；2009年，惠氏被辉瑞收购。2010年6月，针对该产品安全性和有效性的担忧，辉瑞自愿将Mylotarg撤市；2017年，辉瑞基于ALFA-0701临床试验[13]的良好结果提交复市申请，于同年9月获批。自FDA批准上市以来，惠氏公司仍继续申请涉及卡奇霉素衍生物的新合成方法专利(WO2007098124)。 图1. Mylotarg® (Gemtuzumab ozogamicin)，Besponsa® (Inotuzumab ozogamicin, Orange)二、Adcetris® (Brentuximab vedotin)Brentuximab vedotin[15] (图2，Black)于2011年获批，用于治疗霍奇金淋巴瘤和间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)，其Payload是Auristatin E的类似物，Auristatin E是一种强效合成细胞毒素，由亚利桑那州立大学的研究人员根据天然细胞毒素Dolastatin 10的结构衍生(US5635483)。2001年，Seattle Genetics的科学家设计了一种新型Auristatin E衍生物，称为单甲基Auristatin E (MMAE; US6884869)，其N端单甲基化氨基部分随后将用作许多已批准的ADC的Linker的引入位点，文章后续会涉及。MMAE是一种高效细胞毒素，通过与α-和β-微管蛋白结合来杀死细胞，防止细胞在有丝分裂过程中形成微管，导致细胞周期停滞并最终死亡[16]。图2. Adcetris® (Brentuximab vedotin, Black), Polivy® (Polatuzumab vedotin, Orange), Padcev® (Enfortumab vedotin, Blue), Tivdak® (Tisotumab vedotin, Green), Aidixi® (Disitamab Vedotin, RC48, Purple)Linker部分涉及的专利可追溯至1993年，百时美施贵宝(Bristol-Myers Squibb)的研究人员开发出一种组织蛋白酶B可裂解的Linker，其中包含与自降解的对氨基苯氧羰基(PABC)间隔子连接的缬氨酸-瓜氨酸(VC)二肽(US6214345)。组织蛋白酶B是细胞中普遍存在的溶酶体蛋白酶，PABC间隔子的存在对组织蛋白酶B裂解VC二肽C端酰胺键至关重要[17]；该专利还描述与伯胺(来自PABC)键合的马来酰亚胺-己酰基(MC)部分，三者构成新型Linker：MC–VC-PABC。2003年，Seattle Genetics提交了一项专利，涉及MC-VC-PABC与MMAE的单甲基化胺连接，该Linker-payload被称为Vedotin (US7659241)；该专利中还描述了各种ADC的构建，包括Brentuximab vedotin。此后，Seattle Genetics在2007年至2010年间申请了多项ADC专利，涉及各种抗体、Linker和细胞毒性MMAE类似物(US7745394、US7829531、US7851437、US8906376)。三、Kadcyla® (Trastuzumab emtansine, T-DM1)Trastuzumab emtansine[30] (图6，Black)于2013年获批，用于治疗HER2+乳腺癌，该细胞毒素是天然植物细胞毒素美登素的合成衍生物。美登素是一种是安莎霉素类的大环内酯，通过与β-微管蛋白结合来杀死细胞，防止细胞在有丝分裂过程中形成微管，导致细胞周期停滞并最终死亡[31]。1992年，ImmunoGen的科研人员将亚甲基硫醇(-CH2-SH)引入到细胞毒素中，作为后续Linker的键合位点(US5208020和US5416064)，这种合成的细胞毒素被命名为Mertansine/DM1。在这之前(1977年)，Mitsui Toatsu化学公司的科研人员开发了一种对羧基环己基甲基马来酰亚胺Linker (JP52085164)，用于将酶与兔抗体连接。ImmunoGen的科研人员将该接头与靶向CD19抗体上的游离赖氨酸偶联，从而使DM1与暴露在溶剂的马来酰亚胺形成ADC。如专利(US5208020)所述，通过硫代琥珀酰亚胺键形成将Mertansine共价连接至马来酰亚胺(Mal)，该种Linker-payload被命名为Emtansine。2000年，ImmunoGen将这项技术授权给Genentech，两家公司于2001年联合提交了一项专利，涉及了将Emtansine与不同的抗HER2抗体偶联(US7097840)。ImmunoGen于2004年提交了一项关于Trastuzumab与Emtansine偶联的专利(US8088387)。随后，Genentech和ImmunoGen在2006年至2007年间分别提交了涉及不同Linker的专利(例如US7575748、US7989598和US8337856)。值得注意的是，Trastuzumab emtansine是FDA批准的第一个具有不可切割Linker的ADC，也是第一个批准用于治疗实体瘤的ADC。图6. Kadcyla® (Trastuzumab emtansine, Black), Elahere® (Mirvetuximab soravtansine, Pink)四、Besponsa® (Inotuzumab ozogamicin)Inotuzumab ozogamicin[14] (图1，Orange)在时间线上属于第四款获批的ADC，于2017年上市用于治疗前体B细胞急性淋巴细胞白血病，其Linker-payload部分与Gemtuzumab ozogamicin一致。针对CD22抗原的第一个ADC专利由Wyeth于2003年提交(US8153768)；2009年，惠氏被辉瑞收购；随后，惠氏于2012年和2014年递交申请了更多抗CD22的ADC专利(US8835611和US9351986)。五、Lumoxiti® (Moxetumomab pasudotox)Moxetumomab pasudotox[22] (图3)由阿斯利康研发，于2018年9月由FDA批准用于治疗复发或难治性毛细管白血病(HCL)。Linker采用MC-VC-PABC，其专利归属同前所述(US6214345)；Payload为假单胞菌外毒素-PE38[23]。MedImmune (AstraZeneca子公司)于2011年申请专利(WO2012015912)，公布就Moxetumomab pasudotox，后续分别于2014年和2015年就Moxetumomab pasudotox制备生产进行了相关的专利申请(WO2014100443和US20150337040)。 图3. Lumoxiti® (Moxetumomab pasudotox)[24]Moxetumomab pasudotox作为首个获批治疗HCL的药物标志着该疾病领域的重大进展，但遗憾的是该药在欧盟于2021年7月撤市，AstraZeneca计划于2023年8月在美国撤市。Lumoxiti从美国市场撤出与该药品的安全性或有效性无关[2]。自2018年9月13日获得FDA批准以来，Lumoxiti的临床使用率一直非常低，原因是存在其他治疗选择，也可能是由于患者给药、毒性预防和安全监测需求的特殊复杂性导致用量低[2]。AstraZeneca对Lumoxiti做撤市选择可能是其处于商业方面的考量。六、Polivy® (Polatuzumab vedotin)Polatuzumab vedotin[18] (图2，Orange)于2019年获批，用于治疗弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)，其Linker-payload由Seattle Genetics于2013年获得专利(US7659241)，后授权给Genentech公司使用。第一个描述与MC–VC-PABC-MMAE偶联的抗CD79b的ADC专利由Genentech于2008年提交(US8088378)，后经多年临床试验获批上市。在此期间(2010年-2018年)，Genentech申请了多项涉及与各种Linker-Payload偶联的抗CD79b的ADC专利(US8545850、US8691531、US9896506、US9975949、US10494432、US10544218、US10941199)。七、Padcev® (Enfortumab vedotin)Enfortumab vedotin[19] (图2，Blue)于2019年获批上市(第六个)，是第一个用于治疗实体瘤-尿路上皮癌-的ADC药物。Linker-payload的专利归属同前(US 7659241)。Seattle Genetics和Agensys (2007年被Astellas收购)于2011提交关于Vedotin与抗Nectin-4抗体的专利(US8637642)。随后，两家公司在2013年至2020年间联合提交了多份具有不同类型Linker-payload的ADC的相关专利(US9078931、US9314538和US20210283268)。八、Enhertu® (Trastuzumab deruxtecan, DS-8201a)Trastuzumab deruxtecan[34] (图7)于2020年获批，用于治疗HER2+乳腺癌和胃癌，其细胞毒素Exatecan/DX-8951f是天然细胞毒素喜树碱的合成衍生物。Exatecan由第一制药公司的科学家于1995年设计合成(US5658920)。与喜树碱一样，Exatecan与拓扑异构酶1-DNA复合物结合，防止DNA重新连接，从而导致DNA链断裂，最终导致细胞死亡[35]。后续两份专利申请(US5770605和US5834476)中报道了各种Exatecan类似物。此外，第一制药公司还与药物输送系统研究所合作，探索蛋白酶可切割的多肽Linker，并于1997年申请了一项专利，其中涉及甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸(GGFG)以及许多短肽Linker (US6436912)。GGFG连接序列是由药物输送系统研究所研究人员于1994年研究多肽-阿霉素药物偶联物时报道的(US5688931)。图7. Enhertu® (Trastuzumab deruxtecan, DS-8201a)2005年，第一制药公司与三共公司合并，成立第一三共公司。2013年，第一三共提交了一项专利，涉及含有各种Linker-payload的抗CD30和抗CD33的ADC，包括通过自降解的氨基甲氧基亚甲基羰基(-NH-CH2-O-CH2-CO-)间隔子连接Exatecan和GGFG的Linker-Payload (US10195288），现称为Deruxtecan。2016年，第一三共提交专利申请，涉及一种ADC，该ADC含有与Deruxtecan偶联的抗HER2抗体(Trastuzumab) (US10155821)。随后，于2016-2019年提交了多项关于Trastuzumab deruxtecan的专利(WO2017002776、WO2018066626、WO2018066626、WO2019039483、WO2019044947、WO2019230645、WO2020022363、WO2020027100、WO2020027100、WO2020122034、WO2020122034)。2019年，第一三共和阿斯利康达成合作，共同开发Trastuzumab deruxtecan。值得注意的是，这是第一个获批的针对拓扑异构酶1-DNA复合物的细胞毒素的ADC，也是继Trastuzumab emtansine之后第二个获批用于治疗HER2+乳腺癌的ADC。九、Trodelvy® (Sacituzumab govitecan)Sacituzumab govitecan[36] (图7)于2020年获批，用于治疗三阴性乳腺癌，其Payload为7-乙基-10-羟基喜树碱(SN-38)，其相关专利于1982年申请(US4473692)。与喜树碱一样，SN-38与拓扑异构酶1-DNA复合物结合，防止DNA重新连接，从而导致DNA链断裂，最终导致细胞死亡[37]。2013年，Immunomedics提交了一项专利，涉及多种ADC，其中包括一种靶向肿瘤相关钙信号转导器2 (TROP2)的ADC，其具有与SN-38连接的新型Linker (US9028833)，其中一种命名为“CL2A”的Linker后来被用于Sacituzumab govitecan。2006年，Immunomedics曾报道通过酸可裂解碳酸酯键将PABC间隔子连接到SN-38 (US8877901)，其基本原理是基于癌细胞的细胞内和溶酶体pH值低于正常生理pH值，ADC可以利用这一点在内化后释放其细胞毒素有效负载[38]。 图8. Trodelvy® (Sacituzumab govitecan)关于Sacituzumab govitecan Linker的专利可追溯至1988年，雅培实验室报道的Linker—马来酰亚胺-亚甲基-环己基羰基部分—可将蛋白质连接到抗体(US4994385)；二十年后，Immunomedics通过“点击”化学将其连接到PEG链上，以增加Linker的水溶性，从而在2008年产生了CL2A Linker的前体(US7591994)；2009年，组织蛋白酶B可裂解的苯丙氨酸-赖氨酸二肽被整合到Linker中(US8268317)，但由于该Linker导致ADC活性下降，该设计被放弃；2011年，在PABC间隔子旁边引入了组织蛋白酶B耐受的赖氨酸残基，形成了CL2A Linker (US8420086)。在同一份专利中，Immunomedics研究人员还描述了通过碳酸酯部分将CL2A Linker连接到SN-38，从而产生称为Govitecan的Linker-payload (US8420086)。随后，Immunomedics于2013年提交了涉及与Govitecan偶联的抗TROP2的ADC专利(US9028833)。后续Immunomedics在2014年至2018年间持续申请专利，主要涉及Govitecan制备ADC的改进方法(US 9107960、US 9226973、US 9375489；US 9629926、US 9931417、US 10034950、US 10143756)。十、Blenrep® (Belantamab mafodotin)Belantamab mafodotin[25] (图4)于2020年获批，用于治疗多发性骨髓瘤(MM)，其Payload为单甲基Auristatin F (MMAF)，是Teikoku激素制造公司1994年报道的合成细胞毒素Auristatin F的类似物(US5767237)。Auristatin F与Auristatin E一样，都是Dolastatin 10的合成类似物(US4816444)。2004年，Seattle Genetics的科学家设计了一种Auristatin F类似物，使其具有单甲基化氨基部分，可作为Linker引入位点(US7662387)。与MMAE一样，MMAF通过与α-和β-微管蛋白结合来发挥其细胞毒性作用，防止细胞在有丝分裂中形成微管[16]。MMAF的另一个特殊功能是将MMAE的苯丙醇胺部分替换为苯丙氨酸；其基本原理是苯丙氨酸的阴离子羧基会阻止MMAF通过细胞膜被动扩散逃离出癌细胞，从而限制脱靶细胞毒性作用，但同时也扼杀了该类Payload的旁观者效应[26]。同年，研究人员将MC Linker连接到MMAF上，产生MC-MMAF，也被称为Mafodotin (US7498298)。随后，2007年的专利中描述了各种MMAF类似物，包括具有两个羧基的MMAF衍生物(US7745394)。图4. Blenrep® (Belantamab mafodotin)2009年，GSK与Seattle Genetics签署一项许可协议，利用其Linker-payload技术，并且GSK在2013年共同提交了关于Mafodotin偶联的靶向B细胞成熟抗原(BCMA)的ADC专利(US9273141)。Belantamab mafodotin是继Trastuzumab emtansine之后第二个获批的具有不可切割Linker的ADC。随后，GSK在2015年至2020年间提交了多项关于含有各种Linker-payload的BCMA靶向的ADC专利申请(US 20160193358、US 20180147293、US 20200197529)。十一、Akalux® (Cetuximab Sarotalocan Sodium)Akalux (图9)由乐天医药(Rakuten Medical)研发，于2021年9月在日本获批上市，用于治疗不可切除的局部晚期或复发性头颈癌[39]。该药物靶向表皮生长因子受体(EGFR)，其毒素为IRDye700，属于近红外光敏染料，需要与BioBlade激光系统(690 nm红光)合并使用，激活药物中的抗体从而达到破坏癌细胞的目的(光免疫疗法)。其中关于Payload-IRDye700的专利可追溯至US62206774、US62006790，该专利公布了其制备方法。Rakuten于2016年提交关于Cetuximab Sarotalocan的专利申请(WO 2017031363)，提供了制造偶联物的方法，包括制备或生产、配制和包装偶联物的方法，提高偶联物稳定性；该专利还提供了给受试者以进行光免疫治疗的方法。2018年，Rakuten对光免疫治疗进行进一步优化，包括联合用药(WO2018156815)。2020年，Rakuten就Cetuximab与IRDye700偶联位点的选择(轻链Lys145，重链Lys215/292/416)对活性的影响申请了专利(WO2021026393)。图9. Akalux® (Cetuximab Sarotalocan Sodium)十二、Zynlonta® (Loncastuximab tesirine)Loncastuximab tesirine[27] (图5)由ADC Therapeutics研发，于2021年获批用于治疗大B细胞淋巴瘤。该ADC的Payload是天然吡咯并苯二氮卓(PBD，蒽霉素)细胞毒素的合成二聚体，其中PBD是从链霉菌中分离出来并于1964年得到鉴定(US3361742)。蒽霉素通过与DNA小沟中的鸟嘌呤共价结合，抑制核酸合成和细胞分裂来发挥其细胞毒性机制[28]。1999年，Spirogen研究人员发现利用烷二氧基链(Alkyldioxy)连接两个PBD可增强其效力，并申请了二聚PBD专利(US7049311、US7067511和US7265105)。此类Dimer与DNA小沟强烈结合，引起DNA链间和链内交联，抑制细胞分裂并导致细胞死亡[29]。图5. Zynlonta® (Loncastuximab tesirine)此外，Spirogen还于2011年提交了多项关于ADC Linker的专利申请，其中包括一种具有与聚乙二醇(PEG8)键合的马来酰亚胺丙酰基(MP)部分的Linker，该Linker与缬氨酸-丙氨酸二肽(VA)-PABC间隔子相连，该二肽Linker可被组织蛋白酶B切割(US20110256157)。关于MP-PEG8 Linker，苏黎世大学研究人员早在2007年就报道了连接子(US8450284)；关于VA-PABC Linker，Seattle Genetics公司则于2006年在其带有多柔比星Payload的ADC中予以报道。2012年，Spirogen申请了一项含有不同Linker的新二聚体的专利，其中包括VA-PABC (US9102704)。2013年，Spirogen申请了一种新型二聚体PBD细胞毒素-SG3199/SCX-的专利，其与DNA的结合更加牢固，并且不易聚集(US9889207)；该专利同时将SG3199与MP-PEG8-VA-PABC Linker键合以产生Linker-payload：Tesirine/SG3249。同年，阿斯利康子公司MedImmune收购了Spirogen，并与ADC Therapeutics合作，共同提交了一项专利，涉及一种带有与Tesirine偶联的抗CD19抗体的ADC (US9931414)，后续获批上市。随后，MedImmune于2014年提交了描述二聚PBD类似物新偶联位点的专利(US10188746)，并于2018年提交了具有新PBD类似物的新型抗CD19 ADC的专利(US10780181)。十三、Aidixi® (Disitamab Vedotin, RC48)Disitamab Vedotin[21] (图2，Purple)是由荣昌生物研发的中国首个原创ADC，是我国首个获得美国FDA、中国药监局突破性疗法双重认定的ADC药物，其用于治疗胃癌、尿路上皮癌，分别于2021年6月、2021年12月在中国获附条件批准上市。2021年8月，荣昌生物与国际知名生物制药企业-Seattle Genetics达成一项全球独家许可协议以开发和商业化其ADC新药RC48，以高达26亿美元的首付款和里程碑付款、从高个位数到百分之十五以上的梯度销售提成获得Disitamab Vedotin的全球(亚太区除外)独家许可协议，交易额一度刷新中国制药企业单品种海外授权的最高纪录。荣昌生物于2015年申请专利(CN105008398A/WO2015074528)公开Disitamab vedotin，其中人源化抗体靶向Her2，其Linker-payload部分(Vedotin)如前所述。2020年，荣昌生物提交专利申请(CN112353947)，涉及二甲双胍和Disitamab vedotin的联合用药，该种治疗方案能有效抑制肿瘤细胞的增殖，对肿瘤治疗具有显著疗效，其抗肿瘤作用显著优于单一用药，具有显著的增效作用，是一种高效低毒的肿瘤治疗药物组合物。2022年，荣昌生物先后提交两项专利申请-WO2022174775和WO2022242692，用于拓展RC48的适应症以及和抗PD-L1抗体(Durvalumab, Envafolimab或RC98等)联用所致抗肿瘤效果的评估。十四、Tivdak® (Tisotumab vedotin)Tisotumab vedotin[20] (图2，Green)于2021年获批，用于治疗宫颈癌，其Linker-payload部分(Vedotin)如前所述。Genmab与Seattle Genetics于2011年开始签署许可和合作协议后，Genmab于2014年提交了第一个针对ADC的专利，涉及Vedotin与靶向组织因子的抗体偶联(US10617764)，经临床试验后获批上市。十五、Elahere® (Mirvetuximab soravtansine, IMGN853)Mirvetuximab soravtansine[32] (图5，Pink)于2022年11月14日获得FDA的加速审批，用于治疗叶酸受体α (FRα)阳性、铂类耐药的上皮性卵巢癌、输卵管癌或原发性腹膜癌(PPC)。IMGN853的Linker-Payload为sulfo-SPDB-DM4 (Soravtansine)[33]，其中sulfo-SPDB由ImmunoGen在专利US10413615中公布；DM4与DM1结构类似，在前述专利中公布其结构。ImmunoGen于2011提交关于Soravtansine与抗FRα抗体偶联的专利(US9133275/CN103037900)。针对FRαR靶点，ImmunoGen后续提交了多项专利申请(WO2018213260、WO2019050935、WO2020223221、WO2022256507)。IMGN853是首次批准针对FRα+、铂类耐药卵巢癌的靶向治疗，也是首个批准用于卵巢癌的ADC。根据专利的20年寿命期，部分Payload的专利应该已经/即将到期。预计未来几年将有更多ADC获得批准，其中一些会采用全新的或改进的Linker-payload技术。打算将其ADC商业化的公司应该注意，在利用专利Linker和Payload技术时必须避开专利雷区，同时也要对自身专利进行迭代/衍生、提早布局等，延长自己ADC的市场独占期。免责声明：本文仅作信息交流之目的，文中观点不代表个人立场，亦不代表个人支持或反对文中观点。本文并非治疗方案推荐。如需获得治疗方案指导，请前往正规医院就诊。 参考文献 1. Dumontet, C., et al., Antibody-drug conjugates come of age in oncology. Nat Rev Drug Discov, 2023.2. https://www.fda.gov/media/164425/download.3. Manich, C.S., et al., LBA15 Primary outcome of the phase III SYD985. 002/TULIP trial comparing [vic-] trastuzumab duocarmazine to physician’s choice treatment in patients with pre-treated HER2-positive locally advanced or metastatic breast cancer. Annals of oncology, 2021. 32: p. 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