Prepandemic influenza vaccine (H5N1)(Baxter International, Inc.)

中文摘要疫苗是预防控制传染性疾病的最有效手段，传染性疾病中约80%是由病毒引起的。传统病毒类疫苗的制备需经过病毒培养、抗原收获、抗原浓缩、纯化过滤等过程。由于病毒的生长和繁殖必须在细胞内进行，因此细胞基质的优劣直接影响疫苗的质量。此文对各类细胞基质使用情况及优缺点进行综述，旨在为选择合适的人用疫苗生产用细胞基质提供参考。正文疫苗的研发和使用为人类健康构筑了一道免疫屏障，疫苗的制备首先需要病原微生物的增殖。病毒的生长和繁殖离不开细胞，为病毒增殖提供营养的细胞称为细胞基质，包括原代细胞、传代细胞及二倍体细胞。早期曾使用受感染的人或动物组织以及被感染的血清等生产疫苗，使用细胞基质生产疫苗是当今疫苗生产企业的主流。细胞基质疫苗生产工艺经历了3次重要的变革：第1次变革是使用原代细胞培养技术成功研制脊髓灰质炎疫苗；第2次变革是从原代细胞中获得传代细胞和二倍体细胞；第3次变革是结合基因工程、克隆等分子技术建立专利细胞系。细胞基质的优劣直接影响疫苗产品的产量和质量，选择合适的细胞基质进行疫苗生产对于疫苗企业而言意义重大。本文对各类细胞基质使用情况及优缺点进行综述，旨在为选择合适的人用疫苗生产用细胞基质提供参考。1原代细胞原代细胞是指将来自健康动物的组织或胚胎以适当的方式消化分散后进行培养的细胞。我国已上市的疫苗中，乙型脑炎疫苗、肾综合征出血热疫苗、狂犬病疫苗均使用了地鼠肾细胞，麻疹、腮腺炎疫苗使用了鸡胚细胞，风疹疫苗、轮状病毒疫苗分别使用了兔肾细胞和牛肾细胞。原代细胞无致瘤性，对多种病毒敏感，易于培养，适合规模化生产；缺点是外源因子污染风险大，受动物个体差异影响较大，无法充分鉴定和标准化。1.1鸡胚细胞鸡胚细胞基质灭活流感疫苗上市已有80多年，具有良好的安全性和免疫原性，已在全球范围内大规模接种。德国的人用狂犬病疫苗Rabipur®是采用Flury LEP株狂犬病病毒适应鸡胚细胞培养而成，疫苗有效且耐受性良好，至今仍被广泛使用。鸡胚细胞的优点是对各类病毒广泛敏感且接种病毒不会产生针对性抗体，培养简便易操作；缺点是存在供应不足的风险，产量不一致，耗时，制造成本高以及鸡蛋成分可能引发过敏反应等。1.2地鼠肾细胞我国于1965年使用原代地鼠肾（primary hamster kidney，PHK）细胞成功研制狂犬病灭活疫苗，目前仍在市场上使用。1968年，使用狂犬病病毒SAD株适应PHK细胞制备的狂犬病灭活疫苗在加拿大批准上市。俄罗斯至今仍在使用PHK细胞培养的Vnukovo-32狂犬病灭活疫苗。我国使用乙型脑炎病毒JEVSA14-14-2减毒株接种PHK细胞生产的灭活疫苗和减毒活疫苗，相对于鼠脑灭活疫苗免疫效果良好、成本低、不良反应少。李佳林等建立了PHK细胞工厂传代培养狂犬病病毒工艺，为狂犬病疫苗的规模化生产提供了参考。由于PHK细胞需要贴壁生长，而传统的生物反应器通常用于悬浮细胞的培养，难以提供足够的表面积来支持大量贴壁细胞的生长，因此PHK细胞在生物反应器中进行大规模培养存在一定的困难，制约了其在疫苗研发方面的应用。2传代细胞传代细胞是初始细胞（原代细胞或已建立的细胞系）经过细胞分裂进行连续传代而得到的细胞群。由于肿瘤组织具有致瘤性，出于安全考虑，用于疫苗生产的传代细胞大都来源于正常组织。疫苗生产常用的传代细胞有Vero细胞、Madin-Darby犬肾（Madin-Darby canine kidney，MDCK）细胞、中国仓鼠卵巢（Chinese hamster ovary，CHO）细胞等。Vero细胞适合流感病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、天花病毒、脊髓灰质炎病毒、虫媒病毒的培养。MDCK细胞适合甲型和乙型流感病毒、脊髓灰质炎病毒等病毒的培养。CHO细胞适合乙型肝炎（乙肝）疫苗、新型冠状病毒重组亚单位疫苗等蛋白类疫苗的生产。2.1Vero细胞Vero细胞对多种病毒易感，感染后不产生干扰素，增殖力强，生产的病毒抗原具有良好的稳定性，可实现大规模培养，被WHO推荐为病毒性疫苗生产的首选细胞系。根据WHO的评估，Vero细胞在150代以内仍能保持其稳定的遗传特性和生长特性，没有观察到明显的细胞异常或致瘤性，上述代次范围内的Vero细胞被认为是适合病毒性疫苗生产的可靠和安全的细胞基质。目前国内使用Vero细胞生产的疫苗有人用狂犬病纯化疫苗、脊髓灰质炎灭活疫苗、新型冠状病毒灭活疫苗等。国外使用Vero细胞生产的疫苗有流感疫苗（Vepacel®和Preflucel®）、脊髓灰质炎疫苗（IMOVAX Polio®和OPV® ）、狂犬病疫苗（VERORAB® ）等。张炎华等报道，新型冠状病毒感染Vero-E6细胞48 h内迅速增殖，平均复制周期约为3.29 h，48 h后病毒感染滴度逐渐下降。刘鹏等使用自主研制的Vero细胞悬浮培养基（VSM-1）在搅拌瓶中驯化贴壁Vero细胞适应悬浮培养，接种H5N1和H7N9流感病毒后，悬浮Vero细胞平均血凝滴度均高于贴壁对照组。Vero细胞的缺点如下：悬浮驯化较难，大多使用微载体培养法，生产成本较高，效率低；可用的无血清培养基较少，疫苗质量和生产效率差异较大。目前研发改进主要从以下两方面进行：开发安全、稳定、可控的无血清培养基，或者通过基因工程手段改造Vero细胞，降低Vero细胞对血清的依赖性；通过Vero细胞的悬浮驯化实现Vero细胞的高密度培养，提高疫苗质量和产量。2.2MDCK细胞MDCK细胞因具有致瘤性而不如Vero细胞使用广泛，主要用于流感疫苗的生产。目前国外已有MDCK细胞基质流感疫苗上市，尚未出现不良反应报道。国内首个MDCK细胞流感疫苗于2022年10月启动临床研究。MDCK细胞对不同型和亚型流感病毒株都具有广泛的敏感性，且可以实现病毒的有效扩增，被广泛应用于流感病毒的分离、培养和感染性滴度检测。张哲罡报道，MDCK细胞基质流感疫苗诱导小鼠的细胞免疫及天然免疫的能力优于鸡胚细胞基质流感疫苗。马萍等报道，使用MDCK细胞进行流感疫苗的生产可以显著提高疫苗的效力。相比于Vero细胞，MDCK细胞对流感病毒更敏感，并且能够获得更高的病毒滴度。赵彩红等建立了无血清悬浮培养MDCK细胞系，实现了从5 L到75 L生物反应器的高密度线性放大培养。随着对细胞系安全性和稳定性的不断关注，无致瘤性MDCK细胞系成为研究和应用的前沿。这种细胞系具有与传统MDCK细胞相似的生长特性和对流感病毒的敏感性，但不会导致肿瘤的发生。目前，美国Medlmmune公司已经成功开发了这种细胞系，裸鼠注射剂量达107细胞后未出现致瘤性，该细胞系还可以在无血清培养基中生长。2.3CHO细胞CHO细胞能对蛋白质进行准确加工和修饰，表达的蛋白质纯度高、杂质少、与天然蛋白质接近，是生产重组蛋白疫苗的首选。20世纪90年代初，中国预防医学科学院病毒学研究所和长春生物制品研究所等机构共同研制了CHO细胞表达的基因工程乙肝疫苗。随后，兰州生物制品研究所、成都生物制品研究所、石家庄华北制药集团等研发的CHO细胞重组乙肝疫苗也获批上市。英国葛兰素史克公司研发的CHO细胞带状疱疹疫苗Shingrix（欣安立适）于2017年10月获FDA批准上市。2021年，中国科学院微生物研究所与安徽智飞龙科马生物制药有限公司共同研发了重组亚单位COVID-19疫苗，该疫苗具有良好的安全性和免疫原性；III期临床试验结果显示，3剂次疫苗接种6个月后，预防新型冠状病毒Alpha、Delta和Kappa等突变株引起的有症状感染的保护力为75.7%；预防重症、危重症感染的保护力为87.6%。CHO细胞在表达蛋白质时存在一定程度的异质性，包括糖基化模式和蛋白质折叠状态的差异，可能需要进一步后处理和纯化步骤来获得所需的产物。CHO细胞在培养过程中对氧气和营养物质的需求较高，特别是对血清和氨基酸的依赖性较大，培养成本相对较高。今后的研究可以从培养基的优化、高产重组CHO细胞株的构建、大规模培养3个方面展开，进一步提高重组蛋白在CHO细胞表达系统中的产量。3人二倍体细胞二倍体细胞通常来源于正常胎儿组织，可在一定代次内进行体外传代培养。目前用于疫苗生产的人二倍体细胞主要包括由英国汉普斯特德实验室制备的MRC-5细胞和我国自主研发的2BS细胞、KMB-17细胞。二倍体细胞作为人源细胞，与原代细胞相比外源因子污染风险低，与传代细胞相比无致瘤性，安全性好。刘欣玉等对疫苗生产用人二倍体细胞2BS和MRC-5中猪圆环病毒进行检测，结果为阴性。人二倍体细胞与人的抗原性一致，避免了疫苗的宿主细胞蛋白和外源DNA残留的问题，可以显著降低疫苗接种不良反应率。范斌等报道，使用Vero细胞生产的纯化狂犬病疫苗可能引发一些不良反应，如注射部位疼痛、发红、肿胀等，而人二倍体细胞狂犬病疫苗的注射往往耐受性更好，不良反应较少。尽管人二倍体细胞在疫苗生产中具有明显的优势，但其大规模培养仍面临挑战。人二倍体细胞的培养需要严格的环境控制、特定的培养基配方和复杂的培养技术，增加了生产过程的复杂性和成本。此外，人二倍体细胞的生长特性和代谢特点对培养条件的要求更为苛刻，大规模生产中的稳定性和一致性也是一个挑战。4新型细胞基质为了更好地适应特定生产工艺，生产商正在研发新型细胞基质，已经报道的专利细胞系有PER.C6®、AGE1.CR.pIX、EB66®、PBS-12SF、DuckCelt®-T17和MFF-8C1等。这些细胞系大都可以进行无血清悬浮培养。由荷兰Crucell公司研发的PER.C6®来源于人胚视网膜细胞，对腺病毒、流感病毒、脊髓灰质炎病毒、埃博拉病毒敏感。在比利时进行的首次临床研究评估了基于高产PER.C6®细胞系生产的Sabin株脊髓灰质炎病毒灭活疫苗（Sabin inactivated poliovirus vaccine，sIPV），结果表明基于PER.C6®细胞的sIPV在已有抗脊髓灰质炎病毒抗体的成人中具有良好的耐受性和高度的免疫原性。随后在婴儿中进行的评估也显示，基于PER.C6®细胞的sIPV对3个型别Sabin株病毒均诱导了较高的血清转化率和中和抗体几何平均滴度，安全性和免疫原性可接受。AGE1.CR.pIX由德国ProBioGen公司研发，来源于鸭视网膜细胞，对天花病毒、鸡痘病毒、流感病毒敏感。目前英国Vaccitech公司利用AGE1.CR.pIX研发了通用型甲型流感疫苗MVA-NP+M1。Trabelsi 等的研究表明，在 AGE1.CR.pIX 悬浮细胞系中，用化学限定的培养基能以可扩展工艺有效生产兽用狂犬病疫苗。EB66®由法国Valneva公司研发，来源于鸭胚细胞，对流感病毒、麻疹病毒、流行性腮腺炎病毒、痘病毒等病毒敏感。2014年，基于EB66®细胞的H5N1大流行流感储备疫苗在日本获得上市许可。Endo等开发了使用EB66®细胞培养平台（KD-295）生产的AS03佐剂H5N1流感疫苗，具有良好的耐受性和高免疫原性。Nikolay等报道，EB66®灌注培养可以有效提高黄病毒和寨卡病毒的产量。Coussens等建立了一种永生化的鸡胚细胞系，称为PBS-12SF，该细胞系适合在无血清条件下生长，能够将人和重组H5N1流感毒株扩增至高滴度。在许多情况下，PBS-12SF细胞培养的流感病毒滴度高于原代鸡胚肾细胞、MDCK细胞和Vero细胞。此外，在PBS-12SF细胞培养中，流感病毒被释放到培养液，不需要外源蛋白酶，这可以简化疫苗生产的下游处理。DuckCelt®-T17细胞系是由鸭端粒酶逆转录酶组成性表达的原代鸭胚胎细胞培养而成，在批量悬浮培养和无血清条件下生长的最高密度可达6.5X106 ml-1，培养体积可以从10 ml放大到3 L生物反应器。通过优化感染条件，使用DuckCelt®-T17细胞系培养各种人、禽和猪流感病毒，大部分可以获得高感染滴度（>5.8 lgTCID50/ml）。Dong等通过单细胞克隆从蹶鱼鱼苗的早期原代培养物中建立了新的成纤维细胞样细胞系，命名为MFF-8C1。MFF-8C1细胞在含10%胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培养基中生长良好，培养的巨细胞病毒悬浮液对感染的蹶鱼具有高度毒性，是用于巨细胞病毒疫苗生产的有前途的候选细胞基质。5总结与展望引入和建立用于病毒性疫苗生产的新细胞基质是一个繁琐、耗时且成本高昂的过程，目前仍然只有少量的细胞基质可用。用于疫苗生产的理想细胞基质应当显示出“工业友好”的特性：能快速、高密度增殖，具有广泛的病毒敏感性及较高的感染滴度，保持其安全性及传代过程中的稳定性，可以满足大规模生产的需求。此外，细胞基质作为疫苗制剂的组成部分，必须满足安全和监管法规的要求，主要考虑外源因子污染、逆转录酶活性、细胞致瘤性、细胞DNA残留和蛋白残留、抗生素残留等。原代细胞虽然培养简单，可以大规模生产，但是不同个体动物的细胞在质量和病毒敏感性方面存在较大差异，培养过程中容易受外源因子污染。与之相比，传代细胞使用细胞种子库生产，经过充分鉴定和标准化，外源因子污染风险较小，有利于进行质量控制，但是存在致瘤的潜在风险。二倍体细胞无致瘤性，安全性好，但是培养难度大，难于大规模生产。新型细胞基质的研发产生了专利细胞系，可以进行无血清悬浮培养。无血清培养可以降低培养基成本，以及避免血清差异带来的批间差异，而悬浮培养可以加大细胞培养密度从而提高产量。专利细胞系适合大规模生产，但是其安全性和有效性还有待评估和验证。目前尚无细胞基质能满足所有的标准，每种新候选疫苗都需要考虑和评估不同的细胞基质，以选择最佳的细胞基质平台。作者程尧  程小玲  申瑷琳综述  施金荣审校武汉生物制品研究所有限责任公司质量控制室，武汉 430207通信作者：施金荣，Email：jrshi2002@sohu.com引用本文：程尧, 程小玲, 申瑷琳, 等. 人用疫苗生产用细胞基质使用现状及研究进展 [J]. 国际生物制品学杂志, 2023, 46(5): 295-299.  DOI: 10.3760/cma.j.cn311962-20221108-00078识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。