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摘要自20 世纪初，先后暴发了多次威胁人类健康和社会稳定的传染病疫情，如埃博拉出血热、冠状病毒感染引起的严重急性呼吸综合征、中东呼吸综合征和新型冠状病毒肺炎以及寨卡病毒病等。对于尚未表征的新发病原体，尤其是变异速度快、宿主范围广、传播能力强的病毒病原体导致的相关疫情暴发尚无法进行有效预测。目前没有针对上述病毒感染的特效抗病毒药物，接种疫苗是防控疫情最为经济有效的策略。本文对埃博拉病毒、冠状病毒、寨卡病毒的病毒特征以及与之相关的核酸疫苗和病毒载体疫苗技术研究进展做一综述。近几十年各种新发突发传染病的不断流行充分说明，时至今日，世界依然面临着疫情大暴发的严重威胁。在几次让人类记忆犹新的疫情中，由各种病毒病原体引起的传染病流行情况更为严重，不但影响范围广，而且对人类公共卫生健康和社会经济造成的破坏更为剧烈。截至目前，应对大多数病毒感染并没有特异的抗病毒药物，因此接种疫苗成了有效控制疫情并消灭传染病的终极武器。传统的疫苗技术如灭活全病毒疫苗、减毒活疫苗和组分亚单位疫苗在疾病防控方面起到了重要的作用，如天花病毒的消灭、脊髓灰质炎和麻疹的有效控制等。但是由于病毒尤其是RNA 病毒超强的变异能力以及目前对于病毒感染的致病机理和免疫机制研究的缺乏，致使应用传统的疫苗技术可能无法有效应对未表征的新发病毒传染病，如: 艾滋病病毒、埃博拉病毒、冠状病毒、寨卡病毒、甲流病毒、基孔肯雅病毒、尼帕病毒、拉沙热病毒等。现对近年来暴发的埃博拉病毒、冠状病毒、寨卡病毒传染病及其疫苗研发新技术进行综述。1新发传染病及其病原体1．1 埃博拉病毒埃博拉病毒( Ebola virus，EBOV)属于丝状病毒科，该科由2 种埃博拉病毒和马尔堡病毒组成，其天然储存宿主可能为蝙蝠，感染后可导致出血热，死亡率极高。埃博拉病毒首次暴发于1976 年，此后呈现出定期暴发特点，主要发生在中非国家。在此期间，虽然尝试开发埃博拉病毒疫苗，但都处于研究和早期研发阶段。2013—2016 年在西非暴发了规模空前的埃博拉疫情，共有28 616 病例，其中11 310 例死亡［1］。在疫情流行的后期，一些候选疫苗开展了临床试验研究，其中最先进的疫苗( rVSV-ZEBOV) 在环围接种临床试验中显示出了较好的临床效果［2］。1．2 冠状病毒截至目前，冠状病毒( coronavirus，CoV) 感染已经导致3 次传染病的大流行。冠状病毒最早引起人类的注意是在2002—2003 年间的严重急性呼吸综合征( severe acute respiratory syndrome，SARS) 大流行，目前普遍认为该病毒的储存宿主为蝙蝠［4］。SARS 冠状病毒暴发流行导致全球26 个国家出现疫情，大约8 000 人感染，774 人死亡［4］。值得注意的是，由于制定了有效的阻断措施，SARS疫情传播得到迅速遏制，因此，SARS 疫苗的研发工作也很快停止［4］。2012 年一种新的冠状病毒出现在沙特阿拉伯，并引起中东呼吸综合征( middle eastrespiratory syndrome，MERS) 。与SARS-CoV 一样，该病毒起源于蝙蝠，可能通过受感染的单峰骆驼传染给人类［5］。根据WHO 报道，截至2016 年4 月，共有包括27 个国家的1 728 例MERS 确诊病例发生， 624 例死亡［6］。目前正在开发针对MERS 冠状病毒的疫苗，但是尚未有获得许可的疫苗上市。新型冠状病毒肺炎( coronavirus disease 2019，COVID-19) 是一种急性呼吸系统传染病，是由另一种新型冠状病毒( severe acute respiratory syndrome coronavirus2，SARS-CoV-2) 感染引起［7］。虽然COVID-19致死率较SARS 和MERS 低，但传染性更强。截至2020 年9 月13 日，已导致全球28 637 952 人感染，死亡917 417 人，全球197 个主权国家几乎无一幸免，COVID-19 疫情是一个世纪以来影响最严重的公共卫生事件［8］。更糟糕的是，目前疫情没有任何减缓的迹象，研发安全有效的COVID-19 疫苗成为当前科学研究的重中之重。1．3 寨卡病毒( Zika virus，ZIKV) ZIKV 于1947年首次在乌干达的非人灵长类( non-human primates，NHPs) 动物中被发现［9］，此后在不同地区数次暴发，但报告病例均为轻度症状，如自限性发热等。然而，自2014 年以来，亚洲和美洲的暴发显示出严重的临床症状，包括成人的格林-巴利综合征和妊娠期感染后的新生儿先天性异常，即新生儿小头畸形症。之所以出现症状加重的情况，可能的解释是病毒发生了突变，允许其适应新的环境并导致致病性的改变。南美洲约有100 万实验室确诊的寨卡病例，并且超过4 000 例小头畸形的发生，导致在2016 年2 月WHO 宣布寨卡疫情为国际关注的突发公共卫生事件。疫情暴发的惊人规模以及该病毒在北美和其他地区的本地传播的可能性提高了人们对这种新出现的蚊媒疾病的认识［10］。寨卡危机促使寨卡病毒疫苗得到了快速研发，其中7 种疫苗已进入临床试验阶段［11］，但目前仍然没有安全有效的疫苗获得上市许可。1．4 其他病毒需要引起重视的还有甲型流感病毒、基孔肯雅病毒、尼帕病毒、拉沙热病毒等。甲型流感病毒虽然呈现出常规性的季节性暴发，但是由于该病毒宿主的多样性和病毒基因组的高变异性，虽然几乎可以肯定未来流感会发生大流行，但是预测流行病毒的型别及其引起症状的严重程度是不可能的［12］。目前季节性流感疫苗针对的是预测的特定病毒型别，并不能确定可以预防未来的大流行。因此，迫切需要开发具有广谱保护作用的新型流感疫苗。另外，基孔肯雅、拉沙热和尼帕等病毒的传播均引起了较为严重的地方流行病［13 － 16］，但遗憾的是，目前没有可用的针对这3 种疾病的疫苗。鉴于此3 种病毒感染有可能导致传染病的大流行，流行病防范创新联盟( CEPI) 将针对此3 种传染病的疫苗研发列为优先支持的项目［17］。2新发传染病对疫苗研发的挑战通过减毒或灭活相应病原体而开发的常规疫苗已成功地减轻了许多传染病的负担，不但消灭了天花，而且也限制了诸如脊髓灰质炎、麻疹等病毒感染疾病的流行。然而，过去建立的传统疫苗方法在疫情突发时可能并不总是有效［18］。减毒活疫苗存在返祖的风险，使得该方法不适用于高致病性、未表征的病原体。灭活疫苗成本高、研发周期长，而且有时可能不会诱导保护性应答，如埃博拉疫苗［19］，甚至可能导致疫苗接种相关的严重不良反应，如接种甲醛灭活的呼吸道合胞病毒( respiratory syncytial virus，RSV) 疫苗的受试者，在感染野生型RSV 后产生更严重的疾病［20］。为适应复杂多变的外界环境，病毒尤其是RNA病毒基因组具有很高的变异性，如发生突变、基因重组和重配等［21］，使得新发病原体的不可预测性成为应对大流行的关键难题之一，也是疫苗研发面临的巨大挑战之一。如人免疫缺陷病毒( human immunodeficiencyvirus，HIV) 逃避宿主免疫的高变异和异质群体［22］，流感病毒通过重配产生新的基因型、获得适应新的宿主和环境的能力等［23］。另一个疫苗研发的主要挑战是成本问题和生产能力。据统计，使用传统的疫苗开发和生产技术，新疫苗的开发估计将超过5 亿美元，生产设施和设备又将额外花费0． 5 ～ 7 亿美元［24］。传统的疫苗技术在短时间内扩充生产能力有限，难以支持全球范围的疫苗接种。即使是疫苗技术相对成熟的流感疫苗，在一个年度能达到的极限接种率也仅有43%［25］，更别说人类还未表征的导致全球大流行的新型冠状病毒SARS-CoV-2 了。基于以上事实，建立可快速研发、生产大量价廉的疫苗新技术和通用疫苗技术平台成为目前亟须解决的重大科研课题。在过去几十年间，各种新疫苗技术得到了快速发展并获得了有希望的临床或临床前研究结果。如靶向减毒疫苗技术、基因工程疫苗、多肽抗原疫苗、病毒载体疫苗、核酸疫苗技术以及新型疫苗佐剂技术等［26］。由于篇幅限制，本文仅对适用范围广、发展迅速的核酸疫苗技术和病毒载体疫苗技术进行重点介绍。3核酸疫苗技术 核酸疫苗技术包括DNA 疫苗技术和RNA 疫苗技术。经靶细胞摄取后，核酸编码的抗原可在细胞内表达，模拟病原体蛋白质在感染细胞中的合成过程，不但可以将蛋白质定位在质膜中，也可对表达的蛋白进行正确的翻译后修饰，诱导产生体液免疫和细胞免疫应答。重要的是，该方法支持各种抗原的递送，因此可以用于多种病原体的疫苗开发。由于疫苗的生产特点与编码的蛋白质种类无关，因此可以开发不同的疫苗而无需建立新的生产、纯化和验证方法以及建造新的生产设施。由于各种疫苗使用的基础原料( 脱氧核苷酸或核苷酸) 相同且为生物或化学合成，因此可以在同一个车间中快速地生产多种疫苗，从而可显著降低疫苗生产成本、减少生产时间。3．1 DNA 疫苗DNA 疫苗是通过将编码抗原基因的表达盒插入真核表达质粒中产生的。质粒基因组骨架通常含有允许其在大肠杆菌中复制和选择的元件，即支持质粒高拷贝的复制起点和选择标记。由于人用质粒载体中的非功能性序列，特别是抗生素抗性标记物存在安全隐患，标记物已在新一代DNA 疫苗中被替换或去除［27］。真核表达盒由5' 启动子、目的基因和3' 聚腺苷酸化( poly A) 信号组成。5' 启动子通常来自支持高转录水平的巨细胞病毒( cytomegalovirus，CMV) ，3' 末端的Poly A 信号是核转出、翻译和确保转录mRNA 的稳定所必需的，通常是从兔β-球蛋白或牛生长激素基因中获得的。DNA 疫苗接种能够通过分别激活CD+8细胞毒T 淋巴细胞和CD+4辅助性T 淋巴细胞来诱导细胞免疫和体液免疫应答，其确切的作用机制还有待深入研究。自1990 年首次报道以来，DNA 疫苗已被用于预防多种病毒感染导致的流行病疫情，如艾滋病毒、埃博拉病毒、寨卡病毒和冠状病毒等多种疫苗的开发，部分疫苗已进入到临床试验阶段。Xu 等［28］报道，肌内注射或基因枪皮内注射接种编码埃博拉病毒糖蛋白( GP) 和核蛋白( NP) 的DNA 疫苗后，可诱导产生体液免疫和T 细胞介导的免疫，并且可对啮齿动物病毒适应株的攻击产生保护作用。鉴于积极的临床前研究结果，2003 年启动了编码缺失GP 跨膜区和NP 蛋白的DNA 疫苗预防埃博拉病毒的临床Ⅰ期试验研究［29］。结果表明该疫苗具有较好的安全性和耐受性，并在所有受试者中至少对3 种抗原中的1 种产生了特异性的抗体反应。可惜的是，并没有诱导产生病毒中和反应。2008—2009 年进行的另一项Ⅰ期临床试验表明，编码2 种埃博拉病毒GP 的DNA 疫苗具有较好的安全性，其中80% 的受试者对其中1 个GP 产生了特异性的抗体反应。2009 年在乌干达进行的Ⅰb期临床试验结果表明，疫苗均耐受性良好，但免疫反应仍然较差，仅有约50%的受试者对埃博拉病毒产生了抗体反应［30］。寨卡DNA 疫苗是2016 年寨卡危机后首次进行临床试验的疫苗形式之一。Inovio 公司开发的第一种DNA 疫苗是通过将来源于非洲和最近分离的亚洲和美洲毒株的膜蛋白前体和囊膜蛋白( prM-E) 的蛋白基因进行修饰，使其包含有IgE 信号肽。通过电穿孔肌内注射后，该疫苗在小鼠模型中产生了免疫原性和保护作用。在NHPs 中的实验表明，电穿孔皮内接种后该疫苗可诱导产生病毒中和抗体和T细胞免疫应答。基于这些实验结果，启动了2 个Ⅰ期临床试验。临床试验的初步结果表明，该疫苗有良好的耐受性，并在62%的受试者中诱导产生了中和抗体应答［31］。分别于2016 年8 月和2016 年12月开始的另2 个Ⅰ期临床试验结果表明，2种疫苗的安全性和耐受性良好，并可诱导产生体液和T 细胞免疫应答。全程接种程序完成4 周后，中和抗体阳性率在60% ～ 100%之间［32］。为了应对2020 年初暴发的新冠病毒疫情，基于前期在MERS-CoV 病毒疫苗的研发经验［33］， Inovio公司又启动了靶向新冠病毒SARS-CoV-2 刺突( spike，S) 蛋白的DNA 疫苗研发( INO-4800) ［34］。在小鼠和豚鼠模型中的体内免疫原性研究表明，经INO-4800 免疫的动物血清中产生了较高水平的S蛋白反应性IgG 抗体。另外，经INO-4800 免疫的小鼠和豚鼠的肺洗液中也检测到抗SARS-CoV-2 结合抗体。这些肺中存在的抗体具有防止这些组织感染和预防与COVID-19 严重病例有关的下呼吸道疾病( LRD) 的潜力。除体液免疫应答外，在接种疫苗后的d 7 就可以诱导产生针对SARS-CoV-2 的T 细胞应答。快速的细胞免疫应答具有降低病毒载量的潜力，并有可能减少SARS-CoV-2 和相关COVID-19 疾病的传播。目前，在美国开展的INO-4800 Ⅰ/Ⅱ期临床试验正在进行中。值得注意的是，寨卡病毒DNA 疫苗和新冠病毒DNA 疫苗都是在疫情发生几个月后启动的临床研究，这突显了DNA 疫苗平台在用途广泛性和研发速度方面的优势。但是DNA 疫苗存在的缺点也不容忽视，其中之一是注射后DNA 质粒会长期存在于体内，存在外源基因整合到宿主染色体中的风险。实际上，在各种临床前研究中都证实了DNA 的持久存在，这些研究证明通过肌内注射小鼠模型后质粒DNA 的存在时间可长达2 年，并伴随有低度但可检测的表达和免疫原性［35］。另外，用于增强DNA 免疫原性的细胞因子或共刺激分子的表达及其释放可能会导致无法预料的不良反应，例如发生广泛的免疫抑制、慢性炎症或自身免疫。因此，WHO 已建议将整合研究和表达细胞因子质粒在体内的存在时间检测作为DNA 疫苗临床前安全性评价项目的一部分［36］。3．2 mRNA 疫苗mRNA 疫苗是指通过特定的递送系统将表达抗原靶标的mRNA 导入体内，在体内表达出蛋白并刺激机体产生特异性免疫反应，从而使机体获得免疫保护的疫苗形式。mRNA 用于疾病防治最早可追溯到1990 年Wolff 等研究者开始的基因治疗探索性研究，但由于当时无法解决mRNA 不稳定易降解的特点，其发展受到了一定的限制。目前通过分子修饰技术、mRNA 合成技术和传递技术等方法已大大提高了mRNA 的稳定性［37］。被用作疫苗的RNA 主要有2 种类型———非复制型mRNA和自我扩增型mRNA。两者的区别在于，自我扩增型mRNA 除含有帽子结构( Cap ) 、5' 非编码区( UTR) 、编码抗原蛋白的开放阅读框( open readingframe，ORF) 、3' 非编码区( UTR) 和Poly( A) 尾结构外，还含有亚基因组启动子和编码依赖RNA 的RNA 聚合酶( RdRP) 等非结构蛋白的ORF［38］。由于自我扩增型mRNA 疫苗编码的任何遗传信息将被扩增多次，从而使得较低剂量的疫苗即可产生高水平的抗原表达。通过mRNA 疫苗刺激模式识别受体( patternrecognition receptor，PRR) 可诱导产生强烈的固有免疫应答，包括在接种部位产生趋化因子和细胞因子如白介素-12( IL-12) 和肿瘤坏死因子( tumor necrosisfactor，TNF) ，这是诱导产生针对编码抗原的有效适应性免疫应答必需的前提条件［39］。研究表明，自扩增和非复制型mRNA 疫苗都具有良好的应用前景，可以提供针对多种具有大流行潜力的病原体的免疫保护。编码HIV-1 包膜糖蛋白的自扩增mRNA 疫苗在非人灵长类( non-human primates，NHPs) 中诱导产生了有效的细胞免疫和中和抗体应答［40］。包裹在病毒样复制子颗粒( virus-like replicon particles，VRPs) 中编码拉沙病毒糖蛋白复合物的自扩增型RNA 复制子疫苗在小鼠中具有免疫原性和保护作用，并诱导产生了具交叉反应的、多功能T 细胞应答［41］。Chahal等［42］在小鼠模型中证明，基于枝状聚合物纳米颗粒( MDNP) 修饰的自扩增型RNA 复制子疫苗平台提供了针对致死性流感和埃博拉病毒感染的保护，并诱导产生了针对寨卡病毒的抗体和CD +8 T 细胞应答。Pardi 等［43］证明，通过皮下途径免疫脂质体纳米颗粒( lipid-based nanoparticle，LNP) 包封的编码ZIKV prM-E 糖蛋白的修饰非复制型mRNA 使小鼠和NHPs 产生了具有保护作用的有效且持久的中和抗体应答。Richner 等［44］的后续研究表明，类似设计的ZIKV 疫苗通过肌肉接种小鼠后可达到消除性免疫( sterilizing immunity) 的效果，不但诱导产生高水平的、具有保护性的中和抗体滴度，并且可限制ZIKV 在小鼠的宫内传播。该ZIKV mRNA 疫苗( mRNA-1325) 的随机、安慰剂对照、多个剂量范围的Ⅰ/Ⅱ期临床研究已于2016 年12 月启动。LNP 包封的编码埃博拉病毒GP 的修饰mRNA 可诱导产生特异性的IgG 抗体和中和抗体反应的能力，并可保护豚鼠免于致死性感染的攻击和不发生临床症状［45］。在2019 年末暴发的新冠肺炎疫情中，mRNA 疫苗又一次显示了其作为快速研发技术平台的巨大潜力。在疫情暴发不到半年的时间，先后有14 个mRNA疫苗启动了临床试验研究［46］，其中由美国国家过敏症和传染病研究所( National Institute of Allergyand Infectious Diseases，NIAID) 和生物技术公司Moderna 合作开发的mRNA-1273 是进展最快的mRNA 疫苗。该疫苗在2020 年3 月启动了Ⅰ期临床研究，通过初免-加强免疫二针接种法( 0 d， 28 d)分别对高( 250 μg) 、中( 100 μg) 、低( 25 μg) 3 个剂量的疫苗安全性和免疫原性进行了初步评估。第一阶段的结果表明，初免15 d 后，接种中、低剂量的8例初始受试者均检测到中和抗体，且免疫强度呈剂量依赖关系; 加强免疫2 周后，低剂量组和高剂量组受试者抗体水平达到或超过新冠患者痊愈后的水平［47］，目前该疫苗已经进入Ⅲ期临床研究阶段。德国生物科技公司BioNTech 与辉瑞制药公司合作开发的另一款mRNA 疫苗BNT162 于2020 年4月22 日获得德国相关部门批准，开始了首次临床试验［48］。该疫苗在约200 例18 ～ 55 岁健康受试者中进行，初步评价疫苗的安全性和免疫原性。初步数据表明BNT162 的耐受性良好，且可产生剂量依赖性的免疫原性。接受2 次疫苗接种的24 例均产生了中和抗体。安全性方面，接受10 或30 μg 剂量的受试者没有发现严重的不良反应。但是第2 剂注射30 μg 的群体中，有3 /4 出现38 ℃及以上的发热。目前该公司正在对更多受试者进行10 和20 μg 的剂量测试，希望减少不良反应的发生［49］。其他mRNA 疫苗目前均处在临床申报阶段或临床前研究阶段。mRNA 疫苗保留了DNA 疫苗能够胞内表达抗原的优点，同时又克服了其免疫原性低、可产生载体非特异性免疫的缺点以及整合到宿主DNA 的风险。但是mRNA 疫苗仍有不足需要引起注意。一是mRNA 的稳定性问题。核糖核酸酶遍布存在于细胞外，因此未受保护的“裸露”mRNA 在正常生理条件下很容易被降解。目前通过将mRNA 与LNP 结合可以克服这一难题。LNP 可保护mRNA 免受核糖核酸酶的降解从而允许目的抗原在体内长期表达，产生有效的体液和细胞免疫应答。另外，最近的临床研究表明，mRNA 免疫可产生轻度至中度的不良反应以及罕见的严重局部和全身不良反应［50］。因此，未来的研究应进一步评估mRNA 的分布、编码抗原在远端器官中的表达、局部和全身效应在内的潜在安全风险、新递送系统的毒性作用以及人体内的自身反应抗体的产生情况。4病毒载体疫苗技术 病毒载体疫苗通常使用病毒疫苗减毒株或非复制型病毒作为载体，将一种或多种抗原递送至宿主细胞内进行表达并诱导产生免疫应答的疫苗形式。病毒基因组可以表达任何特定的抗原，并且在其基因组中可稳定接受较大的插入基因的能力使得可用病毒载体技术开发多种疫苗。因为靶抗原是作为病毒自身遗传信息进行递送的，因此可以确保抗原在宿主中准确的合成、修饰以及靶向特异细胞。病毒载体在靶细胞中诱导刺激与自然感染过程相同，因此可诱导产生强烈的免疫应答。目前已有多种病毒作为载体用于疫苗的研发，包括腺病毒( adenovirus，Ad) 、麻疹病毒( measles virus，MV) 、水疱性口炎病毒( vesicular stomatitis virus，VSV) 和重组牛痘病毒安卡拉株( modified vaccinia strain Ankara，MVA)等［51］。4．1 腺病毒载体疫苗腺病毒为双链DNA 无包膜病毒，长度在30 ～ 40 kb 之间。人体内的大部分细胞表面均表达有腺病毒受体，因此腺病毒具有广泛的组织趋向性，是最常用的病毒载体之一。复制缺陷型的腺病毒载体通过用抗原表达盒替换病毒的E1A 和E1B 基因区域( 早期转录物1A 和1B) 而产生，从而消除了病毒的复制能力。此外，为防止免疫系统清除被腺病毒感染的细胞使插入抗原无法表达，病毒E3 和E4 基因经常也被删除。复制缺陷型腺病毒载体需要在可提供反式作用因子E1 蛋白的哺乳动物细胞中进行培养，最常见的是HEK 293 细胞。腺病毒载体能够稳定表达高达8 kb 的插入片段，可以支持大多数靶抗原以及多价或多病原体疫苗的表达。复制缺陷型Ad5 是使用最广泛的腺病毒载体之一，能够诱导产生很高的CD+8 T 细胞以及抗体免疫应答。然而，由于人群中广泛存在对该病毒的免疫力，阻碍了Ad5 在临床上的应用［52］。通过开发非人源的腺病毒载体，例如来源于黑猩猩的病毒载体ChAd63，已经克服了这一问题。另一种方法是选择在人群中流行率低的罕见血清型作为载体，例如Ad26 或Ad35，其诱导产生的免疫记忆更强、多功能CD +8 T 细胞更多［53］。Sullivan 等［54］通过用复制缺陷型Ad5 同时表达埃博拉病毒的GP 和NP 的病毒载体在非人灵长类动物模型中进行了评价。结果表明，单次接种即产生了完全的免疫保护。并且发现，完全保护作用与特异性CD+8 T 细胞的产生和抗体反应均成正相关。鉴于令人鼓舞的研究结果， 2006 年开始进行该疫苗的临床试验。结果显示，该疫苗是安全的并且可以诱导抗体产生和T 细胞应答，但没有产生高滴度的中和抗体。该研究还发现，在预存Ad5 免疫力的受试者中诱导的抗体会减少［55］。鉴于Ad5 在人群中的流行率高达60% ～ 90%，这一发现可能会影响Ad5 在人类疫苗开发中的应用。2014 年，军事科学院军事医学研究院和康希诺生物技术有限公司联合开发了一种基于Ad5 的腺病毒载体疫苗，该疫苗于2017 年10 月获得原国家食品药品监督管理总局新药证书和药品批准文号。这种疫苗将2014 年埃博拉病毒的流行株整合到Ad5 载体中，并于当年启动了Ⅰ期临床试验。结果表明，该疫苗安全性良好，没有严重的不良事件发生。另外研究发现，通过注射高剂量的Ad5 载体疫苗能够克服受试者体内预存的Ad5 免疫力对疫苗应答的影响，并诱导产生较高的GP 特异性抗体和T 细胞免疫应答［56］。另外，基于相同技术开发的腺病毒载体COVID-19 疫苗Ⅱ期临床结果显示，单针肌内注射28 d 后，低剂量组( 5 × 1010病毒颗粒) 和高剂量组( 1 × 1011 病毒颗粒)均能诱导产生强烈的体液免疫和细胞应答。抗SARS-CoV-2 中和抗体几何平均滴度( geometricmean titres，GMTs) 分别为18. 3 和19. 5，并且在88%( 低剂量组) 和90% ( 高剂量组) 受试者中诱导产生了γ-干扰素［57］。目前该疫苗已进入Ⅲ期临床研究阶段。由美国国家过敏及传染性疾病研究院( NIAID)开发的2 种疫苗，即单独表达EBOV GP 或与苏丹型埃博拉病毒( SUDV) GP 共表达的复制缺陷型黑猩猩腺病毒3 型( ChAd3) 载体疫苗，在临床前研究中进行了评价。结果表明，单次注射5 周后2 种疫苗均能对NHPs 产生完全的免疫保护。然而，免疫反应在接种疫苗后几个月就会减弱，通过用表达EBOV 和SUDV GPs 的MVA 载体疫苗进行加强免疫可以避免这一情况的发生［58］。2014 年9 月开始的Ⅰ期临床试验结果显示，2 种疫苗都具有可接受的安全性，在大部分受试者中均诱导产生了GP 特异性抗体应答，在部分受试者中产生了T 细胞免疫应答［59］。4．2 MV MV 为副粘病毒科单股负链RNA 病毒。目前常用的麻疹病毒疫苗是通过将野毒株在不同细胞系中连续传代而产生的一种活的减毒株，MV 疫苗诱导产生的免疫力长达25 年之久［60］。研究表明，MV 可接受高达6 kb 的外源基因的插入，这为麻疹病毒载体提供了可用于多病原体或多价疫苗研发的机会。MV 能够感染免疫细胞，包括巨噬细胞和树突细胞，从而能将靶抗原直接递送至抗原提呈细胞，诱导高水平的体液和细胞免疫应答［61］。然而，由于需要通过反向遗传学构建麻疹病毒的反义RNA 基因组全长克隆，使得病毒的制造和转基因的插入较为困难。另外，由于MV 减毒活疫苗在许多国家用于常规儿童免疫接种计划，因此预存的免疫力也是MV 作为病毒载体需要关注的因素之一。表达基孔肯雅病毒( chikungunya virus，CHIKV)结构基因( C，E3，E2，6K 和E1) 的MV 病毒载体疫苗( MV-CHIK) 随机、双盲、安慰剂对照的Ⅰ期临床试验表明，单次接种后血清转化率为44% ～ 92%，第2 次接种后血清阳转率达到100%，安全性良好，没有与疫苗接种相关的严重不良事件。另外一个重要的发现是，受试者体内预存的麻疹免疫似乎没有影响这种CHIKV 疫苗的免疫原性［62］。2016 年进行的Ⅱ期临床试验结论和Ⅰ期基本一致，没有发现与疫苗接种相关的严重不良反应事件发生，血清转化率介于50% ～ 95． 9%［63］。另一项研究发现，接种表达寨卡病毒可溶性E蛋白的MV 载体疫苗，可使雌性小鼠产生针对E 蛋白的特异性中和抗体和细胞免疫反应，并可显著减少小鼠妊娠后受病毒攻击的胎鼠感染，没有发现胎鼠生长迟缓、贫血或死亡的现象，具有进一步开展临床前和临床研究的潜力［64］。4．3 VSV VSV 为弹状病毒科成员，是一种含有约11 kb 的单股负链RNA 包膜病毒。家畜为该病毒的自然感染宿主，在人群中仅呈现零星感染。因此，人群中预存免疫程度低，并且在病毒复制过程中缺乏DNA 中间体，作为载体在人群中使用具有较好的安全性。由于野生型VSV 在动物模型中具有脑内神经毒力，在使用前应对VSV 进行减毒。减毒可以通过不同方法实现，例如在病毒基质( M) 蛋白中引入突变、对病毒蛋白顺序进行重排、插入非病毒蛋白以及部分或完全缺失与病毒感染性密切相关的病毒糖蛋白。在不影响其遗传稳定性的情况下，基因组可接受4 ～ 5 kb 的外源基因插入。虽然VSV 可诱导产生中等强度的CD +8和CD+4 T 细胞免疫，但相比而言，其诱导产生的强烈抗原特异性体液免疫应答是VSV 载体疫苗的最大优势［65］。由加拿大国家微生物实验室开发的VSV 载体疫苗( rVSV-ZEBOV) 可能是目前最有希望的埃博拉候选疫苗。该疫苗通过用EBOV 分离株的GP 替换VSV 中的GP 而构建。临床前研究结果表明，单次接种即可完全保护NHPs 抵抗致死性EBOV 小鼠适应株的攻击［66］。当接种rVSV-ZEBOV 后仅7 d 即进行攻击，在NPHs 中仍然具有完全保护作用，并且在EBOV 暴露后的1 或24 h 注射1 剂或2 剂疫苗可获得33% ～ 67%的保护率［67］，表明该疫苗具有暴露后预防的潜力。Ⅰ期临床研究的初期结果表明，其可诱导产生强烈和持久的GP 特异性的抗体反应，并且在高剂量组诱导产生了较高滴度的病毒中和抗体。但是，高剂量组的受试者可能会发生关节炎类的病痛，部分受试者发展出斑丘疹，表明VSV 在受试者体内发生了复制和扩散。后期通过降低剂量使得不良事件的发生相应减少，尽管诱导的GP 特异性抗体水平仍然与高剂量的群组相似，但诱导的抗体应答水平却降低了［68］。令人意外的是，进一步Ⅰ期临床试验结果显示出了不同的结果。接种高剂量的所有参与者诱导的GP 抗体滴度均呈现出剂量依赖性特征，仅有轻度不良反应而无其他关节炎病例发生［69］。因此，2015年3 月在几内亚启动了该候选疫苗的Ⅱ/Ⅲ期临床试验，评价了接种高剂量( 2 × 107 PFU) 疫苗后的免疫效果。包括高风险个体在内的参与者，被随机分组到即时接种和延迟接种( 21 d 后) 的组群中。在随机分组后的至少10 d 后，即时疫苗接种组中未检测到出现症状的埃博拉病毒病例，而7 个延迟接种组中共发生16 例埃博拉病毒病例，疫苗接种的有效性达到100%。在接种疫苗后登记的43 个严重不良反应中，只有1 个被认为与疫苗接种有因果关系［70］。鉴于此， rVSV-ZEBOV 被认为是目前最有希望获得上市许可的埃博拉病毒候选疫苗。开发病毒载体疫苗在以下几个方面值得注意。首先，目前使用的大部分病毒载体为经过基因工程改造过的活病毒，即是一种转基因生物( geneticallymodified organisms，GMOs) ，在临床前和临床研究期间应充分评估转基因生物所带来的潜在环境和健康风险［71］。另外，如果使用的病毒载体是来源于感染人的病原体( 如腺病毒、麻疹病毒等) ，则应考虑人体预存免疫对病毒载体疫苗免疫效果的影响。5结语  如上所述，病毒载体疫苗和核酸疫苗技术，由于其可快速生产、高度通用和较低的成本优势，为快速应对新发、突发传染病疫情提供了新的解决思路。但是每种疫苗技术都有其自身的缺点，如DNA 疫苗的弱免疫原性和整合到宿主基因组的潜在可能性以及特殊接种装置( 如电穿孔或基因枪) 的依赖性、mRNA 疫苗的不稳定性和潜在毒性、宿主预存免疫对病毒载体疫苗免疫效果的影响等。因此，用单一的疫苗技术似乎不太可能为未来的所有疫情暴发提供解决方案。另外，尽管前期进行的临床前和临床研究已经在安全性和免疫原性方面得到了令人鼓舞的结果，但是由于各种原因，目前鲜有病毒载体疫苗和核酸疫苗获得上市许可。因此未来只有通过持续的努力和合作，将相关学科知识和疫苗研发经验相结合，才能为成功应对全球范围内的新发、突发传染病疫情并提供更有效的策略、方法和工具。参考文献详见 中国新药杂志 2020年 第29卷 第21期识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

冠心病是动脉粥样硬化导致冠状动脉狭窄和闭塞，引起心肌缺血、梗死的高死亡率心血管疾病。血管新生构建侧支循环对于心肌组织的血运重建十分重要。然而，冠心病状态下，多种危险因素持续损伤血管的功能，导致一系列促 冠心病是动脉粥样硬化导致冠状动脉狭窄和闭塞，引起心肌缺血、梗死的高死亡率心血管疾病。血管新生构建侧支循环对于心肌组织的血运重建十分重要。然而，冠心病状态下，多种危险因素持续损伤血管的功能，导致一系列促进血管生长的措施没有疗效，其中一个关键因素是高密度脂蛋白(HDL)的功能障碍。正常HDL (nHDL)具有诱导血管新生的功能，但在冠心病等状态下，HDL的组分发生改变，导致诱导血管新生的功能丧失，甚至损伤血管新生，这种HDL称为失功能HDL(dHDL)。目前，对于dHDL为什么丧失诱导血管新生功能的机制尚未完全清楚。 非编码RNA（Non-coding RNA）是指不编码蛋白质的RNA。其中包括微小RNA（miRNA），长链非编码RNA (lncRNA)等。这些RNA的共同特点是都能从基因组上转录而来，但是不翻译成蛋白，在RNA 水平上能行使各自的生物学功能了。其中lncRNA是一类大于200nt的非编码RNA，它的数量极其庞大，功能复杂多样，可调节血管细胞的增殖、衰老、凋亡等细胞活动，影响血管的生长和功能。我院区景松教授团队前期研究发现nHDL和dHDL诱导血管内皮细胞的lncRNA表达谱存在明显差异。然而，这些lncRNAs在nHDL和dHDL调节血管新生中的作用尚未清楚。2023年8月14日，中山大学附属第一医院区景松教授团队在Signal Transduction and Targeted Therapy 在线发表了题为“High-density lipoprotein regulates angiogenesis by long non-coding RNA HDRACA”的研究论文，首次发现nHDL通过抑制血管内皮细胞的lncRNA HDRACA表达来促进血管新生，而在冠心病状态下，dHDL对HDRACA的抑制明显减弱，导致dHDL丧失促进血管新生的功能。 团队首先通过对lncRNA测序结果分析筛选，发现HDRACA可调节血管内皮细胞的增殖和管状形成，并确定了HDRACA是定位于内皮细胞浆中的长度553nt的无蛋白编码能力的lncRNA。进一步实验证实，nHDL可降低血管内皮细胞中的HDRACA表达，而dHDL对HDRACA表达的降低作用明显减弱。通过一系列分子实验发现，nHDL携带的S1P可与血管内皮细胞的S1P1相互作用诱导WWP2泛素连接酶磷酸化激活，催化HDRACA的转录因子KLF5泛素化降解，抑制HDRACA的转录。而dHDL携带的S1P含量明显减少，导致dHDL对HDRACA表达的抑制作用明显减弱。进一步实验证实nHDL抑制血管内皮细胞的HDRACA表达可促进血管新生，而dHDL对HDRACA表达的抑制明显减弱，导致它无法有效地促进血管新生。团队还发现HDRACA可以结合重要的血管新生调节蛋白RAIN，抑制RAIN和Vigilin的相互作用，进一步促进Vigilin诱导PCNA的mRNA不稳定降解，从而抑制PCNA的表达。nHDL通过抑制HDRACA表达影响RAIN-Vigilin-PCNA相互作用，促进PCNA的表达而促进血管新生。而dHDL无法有效地抑制HDRACA的表达，导致PCNA的表达减少，无法促进血管新生。 该研究阐明了nHDL通过抑制lncRNA HDRACA表达促进血管新生，dHDL不能有效抑制lncRNA HDRACA表达而丧失诱导血管新生的作用和机制，为冠心病的血管新生治疗提供新的研究方向和靶点。 HDL通过调控lncRNA HDRACA影响血管新生 此外，近年研究发现，HDL不但包含多种蛋白质和脂质，而且还携带非编码RNA，区景松教授团队发现，dHDL携带miRNA-24-3p明显nHDL多，nHDL可以通过HDL的经典受体SRB1抑制血管内皮细胞miRNA-24-3p的表达，从而使vinculin表达增多，激活PI3K-AKT-eNOS/ERK信号通路促进血管新生，但dHDL可以通过SRB1将携带的miRNA-24-3p导入血管内皮细胞，从而使vinculin表达下降，抑制PI3K-AKT-eNOS/ERK信号通路损伤血管新生。研究发现以题为“Angiogenic and antiangiogenic mechanisms of high density lipoprotein from healthy subjects and coronary artery diseases patients发表在期刊Redox Biology上。 最近，区景松教授团队还发现HDL可以通过调控不同的miRNA影响血管新生。nHDL通过SRB1抑制另一个miR-181a-5p表达，使ATG5表达上调促进自噬，增强eNOS表达，增加内皮一氧化氮（NO）产生，诱导血管新生。 dHDL通过SRB1增强miR-181a-5p表达，抑制ATG5表达从而抑制自噬，下调eNOS表达，刺激氧自由基产生，损伤血管新生。通过过表达ATG5增加自噬可以恢复高胆固醇血症的血管新生。研究发现以文章题为：“High-density lipoprotein regulates angiogenesis by affecting autophagy via miRNA-181a-5p”于2023年6月20日在线发表在期刊Science China-Life Sciences上。 综上，区景松教授团队近年来的研究系统地阐明了高密度脂蛋白通过调控非编码RNA影响血管新生的新机制, 为缺血性心脏病的血管新生治疗提供新的理论基础和治疗靶点。 该研究得到国家重点研发计划项目、国家杰出青年科学基金、国家自然科学基金重大研究计划重点项目、国家自然科学基金重点项目、科技部国际重大合作项目等的联合资助。

由中国科学院分子病毒与免疫重点实验室、中国农业科学院长春兽医研究所、分子植物卓越中心中科院合成生物学重点实验室、国家应急防控药物工程技术研究中心、长春中医药大学、华东理工大学、临港实验室等多单位团队，在SCIENCE CHINA Life Sciences发表了题为 猴痘病毒mRNA疫苗最新合作研究论文。该研究针对猴痘病毒繁殖过程中存在的包膜病毒（EV）和成熟病毒（MV）两类病毒颗粒，分别选择EV和MV特异性的表面抗原，设计制备EV抗原（2价）、MV抗原（2和4价）、和EV加MV混合抗原（6价）等不同组合的多价mRNA疫苗。通过动物免疫实验和病毒感染实验，发现猴痘病毒EV和MV两类病毒颗粒表面抗原的不同免疫原性和免疫中和能力，揭示了多价mRNA疫苗对猴痘病毒的增强抵御机制。为进一步开发高效和安全的mRNA疫苗，增强对猴痘病毒流行性爆发的抵御能力打下了基础。猴痘病毒（MPV）于20世纪50年代首次在非洲非人类灵长类动物中发现。20世纪70年代在刚果共和国首次确诊人类感染猴痘病毒，并引发类似天花的病变。其后猴痘病毒在非洲大陆蔓延，主要是中非和西非。近年来，人与人之间的传染事件增加，导致猴痘病毒感染的流行规模在全世界不断扩大。截至2023年3月，110个国家报告了超过86000例确诊病例和110多例死亡病例。面对猴痘疫情的威胁，开发猴痘病毒的特异性疫苗，防止猴痘病毒的传染和传播成为当务之急。猴痘病毒（MPV）属于双链DNA病毒的一个大家族，即正痘病毒科，其中还包括水痘病毒、天花病毒、痘苗病毒（VACV）等其他病毒。病毒在其复制周期中产生两种不同形式的病毒颗粒：包膜病毒（EV）和成熟病毒（MV）。基于对其他正痘病毒的人群免疫研究和对猴痘病毒表面蛋白的模拟计算，研究人员选择了EV和MV特异性的表面抗原，设计制备EV-抗原、MV-抗原、和EV加MV混合抗原等不同组合的多价mRNA疫苗，以研究各种多价mRNA疫苗的有效性和安全性。 研究发现，通过不同组合的抗原制备的多价mRNA疫苗，接种小鼠后各种表面抗原可以强烈诱导特异性IgG免疫反应，但各种抗原具有不同的动力学和反应强度。同时，不同抗原组合免疫的小鼠血清的病毒中和活性，对应其总IgG抗体水平有良好的相关性。研究还发现，猴痘病毒mRNA疫苗接种小鼠产生的免疫反应，是通过诱导抗原特异性CD4+T淋巴细胞反应，而这种免疫反应是依赖于Th1细胞。 免疫小鼠的VACV攻毒实验发现，用致死剂量的VACV病毒感染免疫过的小鼠后， 4个不同mRNA多价疫苗都可以保护小鼠免受病毒感染致死；其保护能力与小鼠总的IgG反应成正相关。而用两类病毒颗粒（EV+MV）抗原组合的六价mRNA疫苗，提供了最佳的保护能力。与之对比，对照组(安慰剂疫苗注射)的小鼠则不受保护（因体重严重下降按照伦理规范第6天被牺牲）。以上研究表明，利用计算分析选择的EV/MV病毒颗粒表面抗原组合的mRNA疫苗实验，发现猴痘病毒两类颗粒表面抗原的不同免疫原性和免疫中和能力，揭示了多价mRNA疫苗对猴痘病毒的增强抵御机制。研究提供了对不同猴痘病毒表面抗原及其诱导体内免疫反应的机制和动力学分析。用致命剂量的VACV攻击小鼠的模型，验证了多价mRNA疫苗对免疫小鼠保护的有效性。此研究中的多价mRNA疫苗，在免疫小鼠体内没有观察到毒性反应，具有良好的安全性。为进一步开发高效和安全的mRNA疫苗，增强对猴痘病毒流行性爆发的抵御能力打下了基础。分子植物卓越中心中科院合成生物学重点实验室张牛冰、程香，中国农科院长春兽医研究所朱羿龙，中科院分子病毒与免疫重点实验室莫欧阳为论文共同第一作者。中科院分子病毒与免疫重点实验室郝沛研究员、中国农科院长春兽医研究所李霄研究员、分子植物卓越中心中科院合成生物学重点实验室李轩研究员、国家应急防控药物工程技术研究中心钟武研究员为论文共同通讯作者。这项工作得到了国家重大专项和重点研发计划（2021YFC2300704，2021YFA1301402, 2018YFA0903700）、中科院战略先导项目（XDA24010400)、上海重点科技项目（ZD2021CY001）和国家自然科学基金（32270695,31972881）的支持。