CD3 x CLL-1

摘要：嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法的出现，为儿童和成人患者中复发/难治性血液系统恶性肿瘤的长期清除带来了前所未有的成果。然而，与CAR-T细胞相关的严重毒性，如细胞因子释放综合征和神经毒性，影响了治疗的实用性；并且对实体瘤的治疗效果仍然不够令人印象深刻。因此，出现了修改其他免疫细胞类型的工程策略，特别是自然杀伤（NK）细胞。由于CAR依赖性和CAR非依赖性（先天免疫介导的）抗肿瘤杀伤能力、主要组织相容性复合体非依赖性细胞毒性、降低异体反应风险以及缺乏主要CAR-T细胞毒性，CAR NK细胞构成了有前景的下一代CAR免疫细胞，并且也适用于“现成的”治疗。在这篇综述中，我们比较了CAR-T和CAR NK细胞疗法，特别关注免疫突触、工程策略和挑战。 引言 CAR T细胞疗法基于用重组抗原特异性CAR分子对T细胞进行工程改造，赋予CAR T细胞目标特异性细胞毒性，独立于T细胞抗原受体（TCR）。与传统的细胞毒性T细胞功能不同，后者受TCR复合物在T细胞上与目标细胞上的主要组织相容性复合体（MHC）分子的结合和识别的限制，CAR介导的CAR T细胞的细胞毒性是非MHC限制性的。CAR T细胞在患有复发/难治性血液系统恶性肿瘤的患者中实现了持久的缓解。然而，严重的毒性，如细胞因子释放综合征（CRS）和神经毒性，以及对实体瘤的有限疗效，促使人们改造具有细胞毒性潜力的替代免疫细胞，如NK细胞。尽管美国食品药品监督管理局（FDA）批准的所有CAR T细胞疗法都依赖于患者衍生的和工程改造的CAR T细胞的自体转移以避免移植物抗宿主病（GvHD），但FDA也批准了基因改造的同种异体CAR T细胞的临床试验。目前正在研究低免疫原性同种异体CAR T细胞的开发，以实现健康捐赠者的同种异体CAR T细胞的大规模工程和输血。在这篇综述中，我们比较了T细胞和NK细胞抗肿瘤细胞毒性的机制、CAR设计和工程策略，并讨论了解决CAR T细胞和CAR NK细胞疗法面临的挑战如何影响它们未来的应用，特别是针对实体瘤。 NK细胞是如何与T细胞一起抗击癌症的NK细胞是先天免疫细胞，作为第一线的防御者。与T细胞不同，NK细胞的抗肿瘤功能独立于MHC分子，并且不需要抗原启动。NK细胞表达一系列激活受体（aNKRs）和抑制受体（iNKRs）；取决于aNKR和iNKR信号之间的协调是倾向于NK细胞激活还是抑制，分别导致目标细胞的裂解或免疫自我耐受。当肿瘤细胞下调自身MHC I类分子，创造出“缺失自我”的状态，或者通过aNKRs识别肿瘤相关的压力配体时，NK细胞的脱颗粒和目标细胞裂解就会发生。NK细胞的细胞毒性也可以通过FasL与肿瘤细胞上的相应受体结合发生，通过抗体依赖性细胞毒性（ADCC）发生，涉及NK细胞上的CD16与抗体结合的目标细胞的结合，或者间接通过释放免疫原性细胞因子。免疫系统与实体瘤的战斗涉及一个复杂的先天和适应性免疫细胞网络。这些细胞在肿瘤内的丰度和它们的信号协调影响肿瘤进展或控制的命运。在新转化的实体瘤中，NK细胞可以检测到肿瘤细胞亚群上的压力配体。 CAR NK细胞相对于CAR T细胞的优势  CAR NK细胞相对于CAR T细胞具有几个优势，可以用来治疗实体瘤。例如，CAR NK细胞可以利用NK细胞的先天抗肿瘤能力，同时更倾向于目标特异性的杀伤。这使得CAR NK细胞能够杀死表达目标的癌细胞（CAR介导的杀伤）和缺乏目标的癌细胞。 (CAR独立/先天NK细胞毒性介导的)，这一优势对于治疗实体瘤尤为重要，对于治疗实体瘤来说尤其重要，因为这些肿瘤通常以抗原异质性和逃避免疫细胞毒性为特征。由于大多数NK细胞的细胞毒性能力在癌症患者中在肿瘤进展过程中以及在如手术等治疗性方案后会降低，大多数CAR NK细胞需要同种异体来源。迄今为止，对接受同种异体CAR NK细胞治疗的患者进行的临床研究记录显示，由于缺乏MHC I类限制，没有发生移植物抗宿主病(GvHD)。 尽管可逆，细胞因子释放综合征(CRS)是一种危及生命的状况，通常发生在接受CAR T细胞治疗的患者中，这是由于效应免疫细胞的过度激活和血清细胞因子水平的放大分泌，无论是由CAR T细胞还是CAR T细胞激活的巨噬细胞分泌的，包括干扰素γ(IFNγ)、肿瘤坏死因子、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、巨噬细胞炎症蛋白-1(MIP-1)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1，也称为CCL2)和白细胞介素-6 (IL-6)及IL-10。然而，在接受CAR NK细胞治疗的患者中，CRS的发生率非常低。虽然原因尚未完全理解，但在CAR NK细胞治疗后CRS病例的罕见可能部分归因于NK细胞激活后不同的细胞因子谱，包括干扰素γ、肿瘤坏死因子、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和趋化因子CCL1、MCP-1、MIP-1α（也称为CCL3）、MIP-1β(CCL4)、CCL5和CXCL8，以及与CAR T细胞试验相比完成的CAR NK细胞临床研究的数量有限。 此外，从脐带血、干细胞分化、外周血或NK细胞系大量生产CAR NK细胞的前景对于未来的现成生产是有希望的。例如，在一项研究中，通过在70天内进行五轮刺激，从脐带血中获得的NK细胞扩增了大约1100万倍，从外周血中获得的NK细胞扩增了超过2500亿倍。在另一项研究中，使用辐照的自体外周血单核细胞、IL-2和抗CD3抗体的混合物，可以获得高达15000倍的高活性外周血衍生NK细胞扩增。 CAR与典型T细胞和NK细胞免疫突触的比较  CAR淋巴细胞与目标肿瘤细胞之间形成的免疫突触的类型和特征对CAR淋巴细胞抗肿瘤效果至关重要（图1）。CAR T细胞与肿瘤细胞的第一次接触涉及通过形成免疫突触，在T细胞上的CAR分子与肿瘤细胞上的目标抗原之间进行识别和稳定结合；然而，由CAR分子形成的免疫突触与典型TCR在许多方面都有所不同。一个经典的成熟的免疫突触由三个同心的超分子激活簇(SMACs)区域组成，这些对于TCR细胞毒性功能是必不可少的。在溶解性免疫突触中，中央SMAC由Lck激酶-TCR微簇组成，参与启动激活信号级联和释放溶解颗粒。外围SMAC控制LFA-1整合素与目标细胞表面的ICAM-1粘附分子的结合，被认为是稳定突触的，远端SMAC主要是一个含有如CD43和CD45等糖萼蛋白排斥因子的肌动蛋白环，这些因子保护T细胞，并由CD2的冠与目标细胞上的CD58结构域相互作用，从而实现额外的共刺激信号。然而，在某些情况下，单个受体的参与或膜微簇的形成就足以触发T细胞激活，无需成熟的突触形成。另一方面，CAR T细胞中的免疫突触不涉及成熟的突触形成，而是包括复杂的Lck微簇，对LFA-1的依赖性较小，并且缺乏粘附环。这种较不组织的突触使得CAR介导的参与更快，随后比TCR更快地释放信号级联，并且与更快的细胞毒性颗粒分泌和随后CAR从目标细胞上的脱离有关。 肿瘤激活的NK细胞释放XCL1、XCL2和CCL5趋化因子，吸引传统的1型树突状细胞（cDC1s），导致炎症活跃的微环境，通常被称为“热肿瘤”。新抗原呈递或肿瘤相关抗原（TAA）呈递的cDC1s在肿瘤引流淋巴结中启动CD8+ T细胞，使进一步的T细胞浸润和MHC I类介导的肿瘤细胞裂解成为可能。多克隆的CD4+和CD8+肿瘤浸润性淋巴细胞，包括一个能够通过MHC II类介导的肿瘤杀伤的细胞毒性CD4+ T细胞亚群，具有多样化的TCR库和不同的记忆分化和耗竭表型，响应于这种启动而浸润实体瘤。免疫逃逸可以通过肿瘤细胞分泌前列腺素E2来促进，它不仅阻断了CD8+的细胞毒性，还降低了NK细胞的存活率、活性以及趋化因子CCL5和XCL1的分泌，这削弱了NK细胞介导的cDC1s到肿瘤微环境（TME）的招募。肿瘤细胞内在的对干扰素-γ（IFNγ）的敏感性，由活化的TAA特异性CD8+ T细胞分泌，促进肿瘤细胞上PD-L1和其他免疫检查点配体的表达，通过与T细胞上的相应检查点受体（如PD-1）结合，使肿瘤细胞对T细胞细胞毒性产生抗性。在这种情况下，免疫检查点阻断（ICB）可以是一种有效的免疫疗法；然而，肿瘤也可以通过减少抗原呈递来逃避T细胞细胞毒性并获得对ICB的抗性，从而使肿瘤内的T细胞通过CXCL12-CXCR4介导的趋化作用进入邻近的淋巴结。由于iNKR与自身MHC I类复合物的结合有利于NK细胞的抑制，ICB耐药肿瘤细胞中MHC I类复合物的丢失通过限制iNKR的结合，重新使肿瘤内的NK细胞敏感，从而恢复NK细胞的细胞毒性。然而，并非所有肿瘤内的NK细胞都具有细胞毒性。一项研究发现，在三阴性乳腺癌患者中存在一个促进肿瘤发生的亚群Socs3hiCD11b−CD27−未成熟NK细胞，这与预后不良相关，并可能促进肿瘤进展和阻碍异种移植小鼠模型中ICB的效力。肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）和髓源性抑制细胞被肿瘤细胞招募以创造一个缺氧和免疫抑制的TME。抗炎M2样巨噬细胞通过释放抑制性的转化生长因子-β（TGFβ）并推动NK细胞上CD85j抑制性受体的上调来抑制NK细胞的脱颗粒和功能。根据肿瘤类型、恶性阶段和TME的状态，TAMs可以通过向CD4+ T细胞交叉呈递新抗原来增强抗肿瘤功能，这些T细胞获得细胞毒性能力。TAMs也可以帮助肿瘤逃逸。最近的研究显示，TAMs是TME内主要的葡萄糖消耗者；通过细胞内在的持续糖酵解作用导致TME内乳酸积累，TAMs有利于调节性T（Treg）细胞的招募和CD8+ T细胞的驱逐。髓源性抑制细胞表达NK抑制性配体，分泌活性氧，有助于抑制性的腺苷和TGFβ的积累，并激活Treg细胞释放更多的TGFβ，这些协调作用对NK和T细胞功能有严重影响。TME中丰富的Treg细胞和表达PD-1的滤泡调节性T（TFR）分化细胞，具有强大的免疫抑制能力，可以减少肿瘤浸润性淋巴细胞的细胞毒性，并可能进一步抑制抗PD-1 ICB的效力。因此，持久的免疫抑制TME和克服肿瘤免疫逃逸机制对于成功的CAR T或CAR NK细胞疗法至关重要。 图1 | T细胞和NK细胞中的典型免疫突触与CAR免疫突触。辅助T细胞-APC相互作用代表了TCR和MHC之间典型的免疫突触。这种免疫突触由中心TCR-Lck复合体（中心SMAC）构成，但不包含溶解颗粒，周围是由外周LFA-1/ICAM-1组装（外周SMAC）和伴随CD45和CD2结合的远端肌动蛋白聚合环（远端SMAC）所环绕。CTL-肿瘤细胞溶解突触具有类似的SMAC簇，但也涉及MTOC极化后的中心SMAC内溶解颗粒释放。NK溶解免疫突触包括aNKR配体结合以及CD16介导的ADCC，抑制性NK细胞受体-自身MHC I类结合的丰度低或缺失，并由LFA-1/ICAM-1的外周组装所环绕。NK细胞在静息阶段含有溶解颗粒，并且只有在涉及MTOC极化的时空有序的信号级联发生后，才会经历“定向分泌”。CAR T细胞中的免疫突触包括卷曲的CAR-Lck微簇，对LFA-1的依赖性较小，并且缺乏粘附环。同样，CAR NK细胞的免疫突触涉及溶解颗粒释放和多个CAR-抗原聚集，但在突触裂隙处的肌动蛋白组织较少。PDZ CAR NK细胞-肿瘤细胞溶解突触与CAR NK细胞相比具有更好的突触组织，其特征是Scribble的积累以及浓缩的突触区域和激活的ZAP70与溶解颗粒的增强聚集。使用BioRender.com创建。 NK细胞的功能取决于aNKRs和iNKRs之间的信号平衡。抑制性受体，如人类杀手免疫球蛋白样受体（KIR）和小鼠Ly49，在维持自身MHC I类耐受对内源性健康细胞的同时，在促进NK细胞激活对抗低MHC I类表达细胞的过程中也起着关键作用，这一过程被称为“教育”。在NK细胞激活过程中，NK溶解免疫突触的形成始于含有SH2结构域的磷酸酪氨酸磷酸酶-1（SHP-1）形成小的中心簇，周围环绕着LFA-1，随后是细胞毒性颗粒在中心SMAC中的聚集，而LFA-1重新定位到外围，这一步骤使得NK细胞激活突触对低MHC I类表达目标的教育成为可能。有趣的是，在未受教育的自耐受小鼠Ly49A+ NK细胞（来自MHC I类敲除小鼠）与经过MHC I类分子H2Dd教育的自耐受Ly49A+ NK细胞（来自H2Dd转基因小鼠）中，SHP-1在NK细胞激活突触中的聚集模式不同，包括SHP-1在激活免疫突触中的积累程度以及SHP-1与F-肌动蛋白和SLP-76信号适配器的共定位。研究表明，激活突触中SHP-1的积累导致下游信号蛋白的去磷酸化，以维持“自我耐受”。一旦激活突触通过iNKRs接受“教育”，SHP-1就被排除在激活突触之外，从而解除抑制，激活下游信号，并提高NK细胞的响应性。 一般而言，免疫突触形成的多步骤过程对于许多免疫细胞相互作用都是成立的，包括辅助T细胞-抗原呈递细胞（APC）、细胞毒性T淋巴细胞（CTL）-肿瘤细胞，以及NK细胞-肿瘤细胞或NK细胞-健康细胞。对于溶解突触，它始于抗原识别和受体信号，并随后是效应器激活、微管组织中心（MTOC）极化和脱颗粒，并以从溶解目标细胞的解离结束，使免疫稳态和串行杀伤级联成为可能。然而，研究表明NK和CTL溶解突触之间存在一些动力学和机械转导差异。与T细胞不同，T细胞是在激活后诱导溶解颗粒，NK细胞在静息阶段就含有溶解颗粒，因此在激活和突触形成期间遵循精确的空间时间机制的溶解颗粒分泌，这一过程称为“定向分泌”。NK细胞也可以通过聚集iNKRs，例如与健康细胞上的自身决定因素结合的KIR，形成抑制性突触，形成超分子抑制簇，阻止SMAC形成并保护健康细胞不受溶解。NK细胞膜突出物有助于抑制性突触形成和细胞间蛋白转移。在一项研究中，从肝癌患者体内分离的肿瘤内NK细胞与肿瘤周围NK细胞或健康供者的外周NK细胞相比，膜突出物较少。肿瘤诱导的丝氨酸代谢改变降低了肿瘤内NK细胞膜中的鞘磷脂水平，导致膜突出物调节异常，损害了溶解突触形成和细胞毒性。阻断鞘磷脂代谢增加了解离自膜突出物的突触数量，并在体外以及在肝癌人源化小鼠模型中恢复了肿瘤内NK细胞的溶解活性。 由于CAR溶解突触需要比典型免疫突触更高的抗原识别阈值才能启动杀伤，并且更容易受到磷酸酶诱导的失活，科学家们假设通过靶向细胞极化并引发CAR免疫突触的更有序组装，可能会实现更好的CAR实体瘤细胞毒性。通过将细胞毒性和调节性T细胞分子（CRTAM）的突触后密度-95、discs large和紧密连接蛋白-1结合基序（PDZbms）插入到称为CAR PDZ NK的CD28z CAR的C末端，生成了突触调节的CAR NK细胞。与传统CAR NK细胞相比，这些发现表明体外增强了亲和力、抗原敏感性、细胞毒性、突触强度和CAR PDZ NK细胞极化，以及在实体瘤小鼠模型中延长了CAR PDZ NK细胞的存活和持久性。同样，当在T细胞中测试时，CAR PDZ构建物与传统CAR T细胞相比，在体外和异种移植小鼠模型中都有增强的效应功能。 CAR T细胞与CAR NK细胞工程 CAR设计的相似之处、差异和进展 与传统的T细胞受体（TCR）相比，CAR是一种合成受体，它赋予CAR T细胞以非MHC限制性机制的靶向特异性细胞毒性。第一代CAR由一个细胞外的单链可变片段（scFv）构成，通过一个铰链域和跨膜域连接到C末端的CD3ζ激活域，该激活域将非TCR外部-内部激活信号传递到T细胞。然而，第一代CAR T细胞的临床效果有限，可能是由于有限的植入和细胞毒性。为了提高CAR T细胞的细胞毒性、产生细胞因子和对目标刺激的增殖能力，后来对CAR分子进行了修改，包括插入一个（第二代）或两个（第三代）细胞内共刺激（ICS）域在CD3ζ上游（见图2a）。值得注意的是，CAR模块化域或链接结构的任何遗传改变都可能影响CAR T细胞的亲和力、效力和持久性。目前美国食品药品监督管理局（FDA）批准的六种靶向CD19或BCMA的CAR T细胞疗法已经在许多血液恶性肿瘤患者中实现了持久缓解。然而，为了创造下一代CAR T细胞以治疗实体瘤并增强CAR T细胞的细胞毒性、持久性、渗透性和安全性，已经实施了额外的工程策略。 CAR NK细胞采用了用于CAR T细胞工程的CAR骨架，但在跨膜和ICS域方面有更多的变化[7]（见图2a）。将scFv替换为aNKR的细胞外域，如NKG2D CAR T细胞和CAR NK细胞，可以增加对传统NK细胞靶标的效力。纳米抗体是单域骆驼抗体片段，由于更高的稳定性、改善的TME渗透性和更容易的遗传工程，比传统的单克隆抗体表现更好。对于CAR T细胞和CAR NK细胞，将CAR scFv域替换为纳米抗体在临床前对血液和实体瘤都显示出有效性。CAR NK细胞的一个主要特点是缺乏MHC依赖性细胞毒性，这使得来自健康捐赠者的异体NK细胞可以耐受MHC I类分子在供体和受体之间的差异。然而，从健康捐赠者异体CAR T细胞中遗传删除TCR以及MHC类-I相关和MHC类-II相关基因，以及在诱导的多能干细胞（iPS）细胞衍生的CAR T细胞中过表达HLA-E，允许生成通用CAR T细胞，这些细胞可以承受受体宿主免疫系统而不会诱发GvHD。尽管供体细胞中MHC类I的遗传删除提供了来自受体异体T细胞的保护，但它创造了一个“缺失自我”信号，使供体细胞暴露于受体NK细胞攻击。因此，规避受体NK细胞细胞毒性的策略包括额外过表达HLA-E、HLA-G或CD47，以生成低免疫原性CAR T或CAR NK细胞。 图2 | CAR设计和工程策略以克服实体瘤逃避CAR T和CAR NK细胞。a，典型TCR信号涉及Lck、CD3ζ和ZAP70的顺序激活，以及SLP76和LAT的磷酸化，它们与GADS和PLCγ形成信号复合体，导致T细胞激活。第一代CAR通过一个重组细胞外（Exc）域通过一个铰链和TM域连接到细胞内CD3ζ作为主要激活信号，以促进CAR细胞激活。在第二代和第三代CAR中，信号由一个或两个ICS域支持。LINK CAR T细胞使两个scFv CARs的门控激活成为可能，其信号取决于SLP-76与LAT作为ICS域的复合，仅当肿瘤细胞上呈现两种认知抗原并且与scFv CARs结合时。b，通过工程DN-TGFβ-RII单独或与IL-15受体激动剂（HCW9218）复合；DN-PD-1作为ICB；或者通过遗传删除T细胞或NK细胞中的负调节因子来阻断CAR细胞功能障碍。增强CAR T细胞细胞毒性的方法包括工程化TRUCK CARs，这些CARs使CAR诱导的细胞因子分泌，插入细胞因子受体作为额外的ICS，工程化组成型活性IL-7受体（C7R），或者通过过度表达orthoIL-2/orthoIL-2Rβ。增强CAR NK细胞细胞毒性的方法包括增加细胞因子载荷或使用K562/4-1BBL/膜结合IL-21（mbIL-21）或K562/膜结合IL-15（mb15）/4-1BBL饲养细胞，或补充IL-2、IL-15和/或IL-21的培养基，体外扩增CAR NK细胞。通过与IL-12、IL-15和IL-18的刺激，可以产生具有改善持久性和代谢适应性的类似记忆的CAR NK细胞。多靶向CAR设计的例子以克服抗原异质性和丧失包括IL-13/抗EphA2 Tan-CAR T细胞或一种多靶向CAR NK细胞，该细胞共表达肿瘤可切割的抗CD73 scFv连接到抗GD2 CAR以及NKG2D CAR。抗CD73 scFv与CD73的结合阻止了从腺苷酸（AMP）产生免疫抑制腺苷。通过过度表达趋化因子受体或肝素酶，可以增强CAR T细胞的渗透和持久性，肝素酶降解蛋白聚糖和其他细胞外基质（ECM）蛋白，与CAR一起。αFAP-scFv CAR T细胞靶向癌症相关成纤维细胞上的FAP，以减轻FAP诱导的ECM重塑。将scFv替换为FAP在CAR NK细胞上改善了ECM降解，并增加了NK细胞的渗出和渗透。癌症相关成纤维细胞（CAF）、成纤维细胞激活蛋白（FAP）、髓源性抑制细胞（MDSC）。使用BioRender.com创建。 成功实施CAR T和CAR NK细胞疗法的另一个主要挑战是，由于正常组织共享抗原识别，存在严重的肿瘤外毒性风险。为了缓解这个问题，已经开发了几种逻辑门控和开关受体CAR T细胞[1]。最新的是一种可逆的布尔逻辑AND门控细胞内网络(LINK) CAR，其中CD3ζ被替换为细胞内近端下游信号分子LAT和SLP-76，以产生CD19-28TM-LAT和HER2-8TM-SLP-76 CAR T细胞(图2a)。CD19+ HER2+ 目标细胞诱导的LINK CARs刺激在体外和体内效应功能改善以及限制肿瘤外靶向毒性方面，优于以前开发的逻辑门控平台。同样地，对于CAR NK细胞，SENTI-202是一种新型的“或门和非门逻辑门控”CAR NK细胞候选物，它被设计成通过一个或门激活CAR靶向急性髓系白血病(AML)相关靶标FLT3或CD33，同时通过一个非门EMCN靶向抑制性CAR，避免健康造血干细胞受到肿瘤外毒性的影响。这最终将增强AML白血病干细胞/母细胞肿瘤清除，同时减少对骨髓移植的需求。 针对血液肿瘤的CAR T和CAR NK细胞的临床试验已在其他地方讨论。这里我们关注以实体瘤为靶标的CAR T或CAR NK细胞的临床试验，从Clinicaltrials.gov截至2023年7月1日提取，胶质母细胞瘤、乳腺癌和卵巢癌是目标肿瘤列表中的首选。对于CAR T细胞，针对实体瘤的试验总数为340（23项已完成，23项正在进行/不招募，165项积极招募或邀请注册，67项状态未知，33项暂停/终止/撤回，29项尚未招募）。与此同时，已报告19项针对实体瘤的CAR NK细胞试验（9项积极招募，6项状态未知，4项尚未招募）。表1列出了所有CAR NK细胞试验和已完成的针对实体瘤的CAR T细胞试验。虽然来自CAR T细胞疗法的临床数据未能再现血液肿瘤的持久反应率，但CAR NK细胞的数据仍在等待中。对于CAR T和CAR NK细胞来说，肿瘤内归巢和在实体瘤环境中的持久性是尚待克服的主要障碍。缺乏关于CAR NK细胞在实体瘤中的归巢的临床数据；然而，从第一个CAR NK细胞试验中推断出的投入，该试验利用了携带人类IL-15的CD19 CAR NK细胞，证明了输注的CAR NK细胞在患者外周血中至少持续1年，尽管水平较低。在NK细胞中过表达DNAM-1和/或NKG2D是增强NK细胞肿瘤内渗透的提议策略之一，并已在体外对患者衍生的肉瘤标本显示出有效性。 增强CAR T和CAR NK细胞特别是对实体瘤的抗肿瘤细胞毒性是一个不断增长的研究领域。研究人员使用的策略包括工程化共刺激域，增强CAR修饰细胞的激活细胞内信号。尽管TCR是介导T细胞细胞毒性的唯一主要受体，但许多跨膜共刺激分子，如CD28、4-1BB、ICOS和OX-40，可以放大TCR下游的信号能力，以获得优越的细胞毒性效果。这些分子中的每一个都有利于不同的信号通路，一旦包含在CAR构建物的ICS域中，就会影响CAR T细胞的细胞毒性、增殖和持久性。与此同时，NK细胞有各种激活和抑制受体，它们招募不同的下游信号介导者，其信号线索的微调控制了NK细胞的激活与抑制作用。研究表明，使用NK特异性信号域，如2B4和DAP10或DAP12，作为ICS域，定制NK细胞的CAR工程，可以增加CAR NK细胞抗肿瘤功效和IFNγ分泌，与T细胞定制的CAR构建物相比（图2a）。 克服实体瘤逃逸是CAR基础细胞工程中另一个积极扩展的领域。克服CAR T和CAR NK细胞功能障碍的方法包括过表达TGFβ（DN-TGFβ-RII）或PD-1（DN-PD-1）的优势负性受体(DNRs)，或遗传删除包括PD-1和二酰甘油激酶在内的负面CAR细胞调节器。正交和/或膜结合细胞因子/细胞因子受体工程策略也已被用于增强CAR T或CAR NK细胞的抗肿瘤功能。通过CAR T或CAR NK细胞对TAAs进行多靶向和串联靶向可以提高对实体瘤及其相关抗原异质性或丢失的功效，与单一CAR相比。改善CAR T或CAR NK细胞通过基质屏障的运输和渗透的策略包括过表达趋化因子受体，生成FAP-scFv CAR T或过表达FAP的CAR NK细胞，或过表达肝素酶。图2b总结了已经研究的突出工程方法。 增强抗肿瘤效果的联合免疫疗法 癌症免疫疗法是一系列旨在动员并增强免疫细胞效应功能以消灭肿瘤的治疗方式。图3a描述了CAR T和CAR NK组合免疫疗法的主要模型。 重组单克隆抗体或作为替代品的纳米抗体可以用多种方式增强CAR T和CAR NK细胞的功能[57]。激活性单克隆抗体作为特定激活受体或共刺激分子（如CD28、4-1BB和SLAMF7）的激动剂，对T细胞或NK细胞的扩增和持久性很重要。肿瘤特异性单克隆抗体单独使用或与高亲和力CD16的过表达结合，通过抗体结合的肿瘤细胞的Fc部分的包被作用，将CAR表达细胞重定向至肿瘤细胞和/或增强ADCC功能。阻断性单克隆抗体（如ICB中使用的）通过阻断免疫检查点受体或配体（如TIM3、CTLA4和PD(L)-1）靶向免疫抑制性的TME。尽管FDA批准的ICB作为单一疗法为一些实体瘤患者提供了持久缓解，但在许多其他患者中失败是因为肿瘤特异性的一级和二级抵抗机制。NK抑制性受体阻断单克隆抗体通过模仿通常在抑制配体下调或丢失时发生的“缺失自我”信号，促进NK功能。其他阻断性单克隆抗体靶向炎症性细胞因子受体。例如，tocilizumab是一种FDA批准的阻断性单克隆抗体，靶向IL-6受体（IL-6R），用于管理CAR T细胞诱导的CRS。免疫结合剂，如BiTE和TriTE（对T细胞）以及BiKE、TriKE和TetraKE（对NK细胞），是双特异性或多特异性T细胞或NK细胞结合剂，结合了scFv、纳米抗体和/或其他分子如细胞因子，以促进CAR表达细胞有针对性地消灭肿瘤。 Lenalidomide是E3泛素连接酶途径的免疫调节剂，具有多种免疫效应。除了诱导肿瘤细胞周期停滞外，lenalidomide可以通过阻断血管生成和抑制Treg细胞来调节TME，以及介导恢复与淋巴瘤相关的免疫突触缺陷。与T细胞结合使用时，lenalidomide是一种共刺激剂，增强了抗CD133或抗HER2 CAR T细胞对实体瘤的细胞毒性和细胞因子分泌。在I期临床试验中，lenalidomide促进了NK细胞的扩增，与抗抑制性KIR疗法结合使用，增强了对多发性骨髓瘤的类固醇节约细胞毒性。 溶瘤病毒是一组经过工程改造的病毒，可以增强肿瘤免疫原性和树突状细胞诱导的NK细胞活性，以及实现转基因的肿瘤靶向传递。溶瘤病毒表达截断CD19（OV19t）和抗CD19 CAR T细胞的联合瘤内治疗导致实体肿瘤消退。同样，溶瘤病毒表达人类IL-15/IL-15受体α sushi结构域融合蛋白（IL-15–suIL-15Rα）复合物（OV-IL15C）和抗EGFR CAR NK细胞的组合，在胶质母细胞瘤小鼠模型中引发了协同抗肿瘤细胞毒性和CAR NK细胞的持久性，并改善了生存率。 对于所有这些组合疗法，正在进行血液和实体瘤的临床前和临床评估。虽然ICB与CAR T细胞结合使用的临床评估看起来很有前景，但它在CAR NK细胞毒性中的作用还有待商榷。基于纳米抗体的疗法可能很快会在针对实体瘤的免疫疗法时代占据主导地位，因为它们能够穿透密集的基质；然而，纳米抗体从循环中的快速清除需要额外的工程化。增强两种CAR基础疗法的细胞毒性和持久性的细胞因子装甲已被证明是有效的，还有更多灵活的机会有待探索。最终，由不同癌症免疫疗法介导的多模式机制在增强CAR基础疗法时，考虑到可能的肿瘤外毒性，对未来选择与CAR T和CAR NK细胞一起的最佳组合免疫疗法至关重要。 这些数据来源：https://clinicaltrials.gov。DLL3，类DLL3配体3；CLDN6，紧密连接蛋白6；ROBO1，漫游导向受体1；MUC，粘液蛋白；Meso，间皮素；CIR，嵌合免疫受体；GPC3，糖蛋白聚糖3；CEA，癌胚抗原；CD133，蛋白I；CLDN18.2，紧密连接蛋白18.2；GD2，二唾液酸神经节苷脂；HCC，肝细胞癌；PSMA，前列腺特异性膜抗原；TNBC，三阴性乳腺癌；Cytoxan，环磷酰胺；Fludarabine，抗代谢物；Pembrolizumab，针对PD-1的单克隆抗体；Ezabenlimab，针对PD-1的人源化单克隆抗体；Aldesleukin，重组人类IL-2；AP1903，一种通过交联FKBP结构域发挥作用的化学二聚体剂。NA，不适用。 影响实体瘤中细胞毒性和持久性的挑战 用于体外扩增的T细胞来源包括外周血和iPS细胞衍生群体，很少有文献报告使用脐带血扩增的T细胞，因为这些细胞在扩增后往往富含Treg细胞。尽管CAR T细胞治疗在对抗血液恶性肿瘤方面取得了显著成功，但在对抗实体瘤方面却表现不佳[1]。除了长期体外扩增后诱导的CAR T细胞产品耗竭，影响记忆表型、寿命和增殖能力外，阻止CAR T细胞成功治疗实体瘤的第一障碍是由癌症相关成纤维细胞形成的密集基质，这抑制了CAR T细胞渗透到肿瘤部位。绕过这一障碍的肿瘤内CAR T细胞在持续刺激目标抗原和/或免疫抑制性肿瘤和相关TME后可能会变得耗竭。肿瘤逃逸可能发生，因为肿瘤试图通过突变逃避有效的肿瘤内CAR T细胞毒性，导致抗原丢失或抗原异质性。肿瘤内CAR T细胞也可能因内在和外在因素的复合作用而被驱逐到淋巴结，导致增殖能力降低和持久性丧失。 与可以存活数月的T细胞不同，NK细胞的寿命很短，年轻成人的半衰期不到10天，这一限制因素强调了需要反复输注NK细胞产品以维持体内的有效性和持久性。此外，扩增的NK细胞对冷冻和解冻的敏感性影响了输注后的细胞毒性和存活率。在三维肿瘤模型中，解冻后迁移NK细胞的比例下降了六倍，对细胞毒性效果有严重影响，这可能部分解释了冷冻保存的CAR NK细胞在体内的持久性受损。目前正在研究优化冷冻保存方案，包括使用替代二甲基亚砜的替代品，二甲基亚砜是传统上用于冷冻细胞的保护剂，以保持CAR T和CAR NK细胞在解冻后的完整性、活性、功能和效力，并促进未来的现成生产和冷冻保存。 体外扩增NK细胞需要用细胞因子进行启动，以防止NK细胞耗竭和衰老。NK细胞可以从多种来源扩增用于临床测试，如外周血、脐带血、iPS细胞和不朽的NK细胞系，如NK-92细胞；每种来源都有特定的限制和优势。CAR NK细胞的产生反映了未经编辑的NK细胞的体外扩增方案，尽管后者需要额外的病毒或非病毒工程以表达CAR构建物。这些扩增方案依赖于持续的细胞因子刺激，有或没有饲养细胞的共激活。尽管扩增的CAR NK细胞在体外对目标细胞提供了显著的细胞毒性，但研究表明，它们对细胞因子和激活信号的依赖可能是输注到患者后功能失常和寿命缩短的原因，特别是当这些信号线索在TME内变得稀疏时。 NK细胞暴露于许多肿瘤诱导和TME介导的细胞因子和代谢物中，这可以减少NK细胞的持久性和功能。对患者的血液和实体瘤样本分析表明，肿瘤介导和TME介导的NK细胞功能障碍，以及细胞毒性、持久性和寿命受损，可以总结为五种主要机制：耗竭、抑制、无反应、可塑性和增殖缺陷。导致NK细胞耗竭的肿瘤相关因素包括肿瘤细胞持续激活NK细胞导致效应功能降低。肿瘤相关和TME相关释放的TG-β和其他抑制性代谢物诱导aNKR下调；溶解颗粒释放减少；细胞因子产生缺陷；以及iNKR过度表达。无反应可能是由于过度抑制性信号或在缺乏iNKR许可的情况下持续刺激aNKR所致。由于NK细胞属于第1组先天淋巴细胞（ILC1），肿瘤相关因素诱导的ILC1和ILC3亚类之间的可塑性可能允许将传统的细胞毒性NK细胞转换为细胞毒性较低的或ILC1样表型，具有促肿瘤潜力。NK细胞功能障碍还伴随着增殖能力受损和NK细胞浸润数量减少。 图3 | CAR T和CAR NK组合免疫疗法及CAR细胞工程方法。a，抗CD3和抗CD3/抗CD28激活单克隆抗体偶联珠增强CAR T细胞扩增。CAR NK细胞激活单克隆抗体(mAbs)和纳米抗体(Nbs)的靶标包括共刺激分子和aNKR，单独或与高亲和力CD16(ha-CD16)的过表达结合。阻断单克隆抗体和纳米抗体针对免疫检查点受体或配体(ICB)、iNKR或IL-6受体(IL-6R)。FDA批准的阻断单克隆抗体的例子包括托珠单抗、阿特珠单抗、尼伏单抗和伊匹单抗。来普尼增强了CAR T细胞的细胞毒性和增殖，并且通过在多发性骨髓瘤(MM)细胞上增加aNKR配体的表达，与KIR阻断单克隆抗体(IPH2101)联合使用时增强了CAR NK细胞的细胞毒性。OV19t溶瘤病毒通过实体瘤细胞诱导截短型CD19(CD19t)的表达，使其易于受到抗CD19 CAR T细胞的细胞毒性，而OV-15C诱导肿瘤细胞表达和分泌人类IL-15/IL-15受体α寿司结构域融合蛋白(IL-15–suIL-15Rα)，这提高了抗EGFR CAR NK细胞的抗肿瘤效果。免疫结合剂的例子包括BiHC(抗HER2-Nb/抗CD3-scFv BiTE)或布利纳图单抗(抗CD19-scFv/抗CD3-scFv BiTE)用于CAR T细胞，以及抗EGFR-Nb/抗CD16-Nb BiKE或抗CD16-Nb/重组IL-15/抗CLEC12A-Nb TriKE，后者结合了ADCC和TAA特异性杀伤CAR NK细胞。b，病毒CAR转导导致CAR在T细胞或NK细胞内的整合。c，非病毒CAR工程策略的例子包括通过电穿孔或脂质纳米颗粒传递的mRNA，DNA纳米载体平台和转座子以及CRISPR-Cas9和碱基编辑作为基因编辑工具。正在开发中的先进策略包括使用生物材料进行体内CAR传递和扩增，以及通过顺序磁声激活将抗CD3/抗CD28珠与CAR T细胞结合创建的CAR T细胞基活体微型机器人(M-CAR T细胞)的靶向传递和扩增。使用BioRender.com创建。 当前CAR T和CAR NK细胞高效开发的工程策略包括通过额外的遗传操作或组合疗法来增强这些细胞，以解决T和NK细胞功能障碍和持久性问题。 增强CAR-T和CAR NK细胞的传递技术  传统的CAR T细胞生成涉及病毒载体传递CAR构建体，以实现高转导效率和CAR的稳定表达。最广泛使用的载体是慢病毒、逆转录病毒或腺相关病毒载体。与T细胞相比，NK细胞更难进行工程改造，这是由于其固有的抗病毒能力、对凋亡的高敏感性和有限的扩增潜力。由于慢病毒包膜直接影响原代NK细胞的转导效率，因此可以使用泡状口炎病毒G（VSV-G）、长臂猿白血病病毒包膜（GALV）、猫科内源性逆转录病毒包膜蛋白（RD114-TR）或狒狒包膜（BaEV）对慢病毒进行伪型化，后者显示出与逆转录病毒相当的转导效率。然而，增加的免疫原性、可能的插入突变、有限的插入大小、高昂的GMP级病毒生产成本和相关的监管复杂性是主要缺点，这些缺点激发了探索成本效益的非病毒传递途径。非病毒转座子平台Sleeping Beauty和PiggyBac能够更安全地整合CAR构建体，但效率低于病毒系统。通过电穿孔或脂质纳米颗粒传递的非病毒mRNA基CAR构建体产生高但短暂的CAR表达效率。科学家们还开发了一种简单、多功能、经济实惠、非病毒、非整合的DNA纳米载体平台，能够在体外和体内实现T细胞的非染色体CAR表达，且没有免疫原性或遗传毒性。其他的非病毒基因编辑平台包括CRISPR-Cas9，它能够实现CAR和其他有利基因的位点定向整合或免疫细胞负调节因子、TCR或MHC相关基因的删除。在一项研究中，通过结合T细胞相关基因的基础编辑和CAR-慢病毒转导，产生了抗兄弟细胞毒性的双重CAR T细胞。最后，生物材料传递车辆允许定向转移编辑或未编辑的免疫细胞，有病毒或非病毒编辑的选项，在体内，而无需事先的体外扩增，而基于CAR T细胞的活体微型机器人能够通过磁声激活实现CAR T细胞的靶向传递和激活。 结论  过去十年在CAR基础免疫疗法的工程方面取得了革命性的成功，已有六种FDA批准的CAR T细胞疗法使一些儿童和成人患者的血液恶性肿瘤实现了长达十年的缓解。然而，血液恶性肿瘤患者在接受CAR T细胞输注后的复发率是可变的，而且尚未实现对实体瘤有显著数量的完全缓解。CAR T和CAR NK细胞的耗竭、低反应性和被宿主免疫系统排斥被认为是许多患者肿瘤抵抗和复发的主要因素。因此，要实现CAR基础免疫细胞功能的最优化，需要解决这些细胞疗法面临的多重挑战，同时优化临床给药环境，并利用组合免疫治疗模式。 尽管一些CAR NK和CAR T细胞基础的临床前研究展示了对实体瘤的有效细胞毒性，但CAR NK细胞的临床数据很少，而CAR T细胞在临床上尚未成功。未来的治疗方案应该操纵工程策略和组合疗法，以解决阻碍CAR T和CAR NK细胞对实体瘤效果的挑战。这些挑战包括克服肿瘤诱导的抗原异质性或丧失；促进长期肿瘤内抗原遭遇，以实现有效的肿瘤细胞毒性；在肿瘤内维持更好的CAR表达细胞的持久性和保留；耐受缺氧和免疫抑制的TME；以及维持类似记忆的CAR细胞库，以实现更持久、更具肿瘤特异性的细胞毒性。与溶解性突触形成和稳定性相关的额外挑战，如免疫细胞-目标识别、结合动力学和效力，应该得到解决。应该继续研究消除受体中超活性或有毒CAR细胞的方法，包括逻辑门控和开关式CAR设计以及其他新方法，直到实现最佳平台。最终，成功开发针对实体瘤的高效CAR疗法可能需要一个全面的组合方法，而不是单独针对个别障碍。 未来需要从MHC不匹配的健康捐赠者那里生产“现成的”通用CAR T细胞产品，以促进在疾病关键阶段向患者、弱势社区或缺乏CAR T细胞开发设施的医疗机构提供已经FDA批准的产品。基于MHC非限制性细胞毒性、降低的肿瘤外靶向毒性和“现成的”生产便利性，我们预计未来十年将带来更多的研究结果，帮助优化NK细胞扩增工作流程；减轻NK细胞耗竭，改善解冻后恢复，并增强移植后的细胞毒性和持久性。然而，由于同种异体CAR NK细胞可能促进免疫原性并在后期被宿主免疫细胞排斥，因此需要进行额外的遗传操作，类似于应用于通用CAR T细胞的操作。也应该采用创造最佳无饲养层扩增的新型策略，以实现CAR NK细胞的大规模生产，并绕开监管和一致性问题。 关于CAR T或CAR NK细胞抗肿瘤效果的大多数临床可用数据都是从分析晚期癌症的重度预处理患者中推断出来的，同时缺乏作为早期肿瘤进展阶段的一线疗法的有效性证据。因此，进一步研究CAR基础疗法的最佳时间、剂量、途径和频率，将更好地指导临床决策，并扩大治疗适用患者的范围。CAR基础细胞疗法的另一个主要缺点是治疗成本的显著提高，包括对伴随副作用的症状管理。未来有助于降低成本的步骤包括优化“现成的”生产和冻存“通用”工程CAR产品，减轻肿瘤外靶向毒性，缩短体外扩增工作流程，优化非病毒CAR递送以及微调体内动力学和个别CAR设计的效力。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 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6 月 6 日，据 ClinicalTrials.gov 官网显示，齐鲁登记启动了一项 II 期临床试验，评估 CD3/CLDN18.2 双抗 QLS31905 和/或 QL1706 联合化疗治疗 CLDN18.2 阳性晚期实体瘤的疗效（登记号：NCT06446388）。 来自：ClinicalTrials.gov 官网 QLS31905 是齐鲁自研的一款 1 类新药。据 Insight 数据库显示，当前全球共有 18 款 CD3/CLDN18.2 双抗在研，其中进入临床的仅 6 款，涉及的中国企业有 5 家，而齐鲁就是其中之一，与信达、百济等同台竞技。 齐鲁制药是国内老牌药企了。在仿制药领域的实力自然无需赘言，改良新又在前些年的布局之中逐渐开花结果，当前创新药也同样开始发力冲刺。Insight 数据库显示，和国内总体趋势一致，齐鲁制药的创新药申报也在 2020 年开始蓄势，2021 年开始逐渐上升，进入高峰期。 齐鲁制药创新药近年趋势（*国内进度） 来自：Insight 数据库网页版（下文如无特殊标注，为同一来源） 据 Insight 数据库显示，齐鲁当前共有 52 款 1 类新药进入临床阶段，21 款化药，31 款生物药，生物新药的布局已超过化药，且双抗居多，此外，还布局了新兴领域，比如 siRNA、PROTAC 等。 齐鲁全球进入临床 52 款 1 类新药成分类别分布 最先实现上市商业化的是 ALK/ROS1 抑制剂伊鲁阿克片。2021 年 7 月首次申报上市，并去年 6 月获批上市，二线治疗 ALK 阳性 NSCLC；今年 1 月则获批了一线疗法。 另有两款产品处于上市申请阶段，包括 PD-1、CTLA-4 组合抗体 QL-1706（艾帕洛利单抗/托沃瑞利单抗）以及 PD-1 单抗艾帕洛利单抗，先后于去年 8 月、9 月上市申请获受理。 QL-1706 也是齐鲁制药申报上市的首个大分子创新药，基于齐鲁自主研发的 MabPair 抗体平台开发的，采用创新技术对 CTLA-4 抗体的重链进行改造，降低了 CTLA-4 抗体的毒副作用，同时保持高表达、易纯化、高活性、高稳定性的特点。 与常规双特异性抗体平台相比，MabPair 开发的新药在结构上更接近天然抗体，成药性高，在两个抗体之间比例的配置及 Fc 骨架的选择灵活性方面有很大的优势。该平台基于电荷不同相互作用方式解决了轻、重链错配问题，更大程度地确保了抗体药物的稳定性。 MabPair 平台与普通双抗、单抗联用的对比 来自：企业官网 2023 ESMO 大会上公布了 QL1706 一线治疗宫颈癌的 II 期临床结果：双抗联合化疗队列 mPFS 为 12.5 个月，双抗联合化疗+贝伐珠单抗队列 mPFS 为 16.4 个月，有将近 4 个月的提高。 而近期 ASCO 年会上则公布了 QL1706 联合吉西他滨和顺铂一线治疗鼻咽癌 的 II 期试验数据：共 28 例患者至少有 1 次基线后肿评，ORR 为 82.1%，mPFS 为 12.5 个月。在 13 例 PD-L1 高表达（CPS≥50）的患者中，mPFS 为 16.2 个月。 当前 QL1706 已在小细胞肺癌、结直肠癌、肝细胞癌等多个癌种开展临床试验，其中肝细胞癌、宫颈癌、NSCLC 以及鼻咽癌都已进展至 III 期临床阶段（包括 II/III 期临床）。 除 QL1706 之外，CD20/CD37 单抗复方 PSB 202（QLP31907）也是基于 MabPair 平台开发的双抗。 在双特性抗体领域，据 Insight 数据库显示，在研 10 款进入临床，包括 PD-L1/4-1BB 双抗 QLF31907、CD3/LY6G6D 双抗 QL335，CD3/CLL-1 双抗 QL325，DLL3/CD3 双抗 QLS31904，CD47/PD-L1 双抗 QL401 等。 在早期化药管线中，齐鲁也布局了多款抗肿瘤药，包括四代 EGFR 抑制剂 QLH11811 和 pan-RAF 抑制剂 QLH11906，以及刚于上个月进入 I 期临床的 KRAS G12D 抑制剂 QLC1101 等。 此外，据 Insight 数据库显示，齐鲁还有超 40 款产品处于临床前阶段，ADC 领域，布局了一款 MUC1 ADC，来源于与 Peptron 公司的合作，另有布局 CAR-巨噬细胞等。 封面来源：企业 Logo 免责声明：本文仅作信息分享，不代表 Insight 立场和观点，也不作治疗方案推荐和介绍。如有需求，请咨询和联系正规医疗机构。 编辑：Hebe PR 稿对接：微信 insightxb 投稿：微信 insightxb；邮箱 insight@dxy.cn 多样化功能、可溯源数据…… Insight 数据库网页版等你体验 点击阅读原文，立刻解锁！

摘要：双特异性抗体（bpAbs）能够结合抗原上不同且不重叠的表位。这种独特的结合模式能够实现超越单特异性和双特异性抗体（bsAbs）的新作用机制，使得bpAbs成为针对肿瘤学和传染病在内的各种疾病的有效治疗剂。双特异性结合可以带来更高的亲和力和特异性，促进拮抗作用，锁定目标构象，并导致更高高效的目标聚集。这样的抗体-目标复合物可以引发强烈的激动作用，增加免疫效应功能，或导致快速的目标下调调节和溶酶体运输。这些特性不仅对治疗性抗体具有吸引力，而且越来越多地被探索用于其他模式，如抗体-药物偶联物、T细胞接合器和嵌合抗原受体。近期在bpAb工程方面的进展使得构建越来越复杂的格式成为可能，这些格式开始在临床上展现出良好前景。 1.引言 抗体治疗在2022年美国新药批准中占据了30%的比例。在开发中的抗体中，观察到包括双特异性抗体（bsAbs）在内的高度工程化分子数量显著增加。双特异性抗体（bpAbs）是bsAbs的一个子集，对同一分子目标上的独特、不重叠的表位具有特异性。这种独特的结合模式是在30多年前建立的，它能够实现差异化的作用机制（MoAs）。在过去的十年中，随着临床试验中首次取得成功，bpAbs的治疗潜力已经变得明显。这些开创性的分子为当今临床开发中越来越多的bpAbs铺平了道路（见表1）。这篇综述提供了bpAbs的不同格式和MoAs、当前的临床管线以及bpAbs的前景概述。 2.双特异性格式 在抗体发现和工程方面的进展使得构建日益复杂的结合不同表位结合域的bpAb格式成为可能。格式的选择取决于目标生物学和MoA。设计的关键考虑因素包括目标表位、单个结合域的数量和性质、半衰期延长和效应功能介导域的添加，以及确保所有域正确组装。后者可以在一个单一蛋白中用柔性连接链串联单个域，或者在含有结晶片段（Fc）域的bpAbs中，依赖于高达四种不同蛋白的正确配对以及相应的引导突变在重链（HCs）和轻链（LCs）中。有效的表位对很难合理预测或用抗体混合物实现。因此，有效地生成并筛选给定bpAb格式下的大量表位对矩阵是关键。除了功能性和可行性，开发性考虑在选择bpAb格式时至关重要。早期对bpAb的生物物理负债进行测试可以降低动物研究和临床试验失败的风险。同样，bpAb格式的选择可能会影响下游的制造和质量控制，因为bpAb格式复杂性可能导致不良的开发性或错误配对的副产品。 到目前为止，在临床上测试的bpAbs不仅具有多样的格式，还利用了大量不同的单个结合域（见图1）。单链抗体格式，如单域抗体（sdAbs）和单链可变片段（scFvs），特别容易在双特异性格式中配对。进入临床的前两个bpAbs，ALX-06517和BI 1034020，由串联的sdAbs组成。基于抗体片段的bpAbs通常在循环中具有短暂的半衰期，并且需要进一步的工程化以提高暴露量。如双特异性CAR-T疗法ciltacabtagene autoleucel和OriCAR-017所强调的，小尺寸使sdAbs成为嵌合抗原受体（CARs）的理想构建块。 到目前为止，在临床上测试的大多数bpAbs具有更典型的含Fc的结构，可以通过HC轴对面称性进行分类。对称的bpAbs由相同的HC或HC/LC对组成，而不对称分子由具有不同结合域的不同半部组成。四价分子MEDI4276和BAT2022是对称bpAbs的例子。具有2+2价态（每个整数表示分子中存在的相同副位点的数量）以及分别附加在重链（HC）的N-或C-末端的单链可变区（scFv）或单域抗体（sdAb）。11,12 KN060则是一个对称的双特异性抗体（bpAb），具有串联的sdAb臂和没有轻链（LC）。类似于KN060，三特异性TAVO412通过一个串联的sdAb臂实现双特异性靶向，该臂嵌入在一个更复杂的不对称格式中。不对称的双特异性抗体通常依赖于Fc突变，以促进双特异性抗体产品的纯化或指导异二聚体形成。例如，REGN5093的两个重链被设计成对蛋白表现出不同的亲和力，并允许纯化异二聚体产品。另一方面，GEN3009是一个不对称的双特异性抗体，其Fc区域的引导突变确保了两个不同的重链的正确配对。除了重链异二聚体化外，正确的轻链配对对于不对称双特异性抗体来说可能是一个挑战。在GEN3009的例子中，通过两个亲本抗体的温和体外反应实现正确的配对，这允许重链重组而不打乱原始的轻链配对。REGN5093展示了一种避免轻链配对问题的根本性策略，它由两个不同的重链与两个相同的轻链配对组成。这样的通用轻链可以直接从具有定义的轻链多样性的发现平台中获得，如REGN5093的例子，或者像anbenitamab和GR2002那样从现有的轻链中工程化改造而来。18–20 ISB 1442和SAR441236是不对称双特异性抗体的例子，它们分别通过增加额外的Fab或scFv结构域来扩展免疫球蛋白G（IgG）的结构，以实现更高的价态，甚至在SAR441236的情况下实现三价结合。也可以利用较小的不对称格式，如基于片段-Fab的zanidatmab23或基于片段-片段的TNB-73824。Zanidatamab将scFv结构域与一个完整的Fab臂配对，而TNB-738则从两个sdAb衍生其结合臂，并添加了一个惰性的LC以提高可制造性。在免疫球蛋白折叠之外，双特异性设计的ankyrin重复蛋白（DARPin），MP0274，突出了替代支架的潜力。 3.MoAs of bpAbs 3.1双特异性靶向通过亲和性增强了结合能力 与同一目标上的两个不同、不重叠的表位结合，使得双特异性抗体（bpAbs）与其它抗体相比具有独特的属性。许多双特异性抗体与其单特异性亲本抗体相比，显示出更优越的结合能力和更慢的解离速度。这是由于其能够通过亲和性与两个不同的表位结合在同一分子（顺式）还是不同分子（反式）上（见图2a）。与单价或双价单克隆抗体（mAbs）相比，双特异性抗体的解离可以显著变慢，使它们成为更优越的拮抗剂或反向激动剂。顺式结合形成1:1的双特异性抗体目标复合物对于这些应用很重要，以避免不必要的激动剂活性。除了表位选择外，结合域的几何排列、sdAb连接优化和亲和力调节对于实现期望的作用机制和最大化效力至关重要。Kast及其同事证明，结合域的几何形状对于HER2的双特异性和四价融合蛋白的拮抗作用至关重要，某些配置显示出激动剂活性。同样，不同的三价抗表皮生长因子受体（EGFR）IgG-纤维连接蛋白融合体的结构显示出在受体下调中不同的效力。对于基于sdAb的拮抗剂，最佳的方向和连接属性可以通过顺式亲和结合实现超高性能。最后，临床双特异性抗体ISB 1442依赖于仔细调节CD38和CD47的亲和力，以减少靶向毒性。ISB 1442的抗CD47 Fab已工程化为弱亲和力，以实现与CD47阳性红细胞的最小反应性。一个高亲和力的双特异性抗CD38臂能够实现亲和目标参与和对CD38低肿瘤细胞的高度特异性。 双特异性抗体的高亲和力和缓慢解离也适用于免疫细胞的招募。例如，Liu及其同事通过将两个针对非重叠表位的sdAbs与抗CD3 Fab融合，设计了一个抗HER2的T细胞接合双特异性抗体。与相应的单特异性亲本分子相比，所得到的构建物在HER2阳性细胞上的结合增加了30倍，并在体内在HER2低表达模型中显示出更优越的肿瘤抑制活性。同样，Rennert等人设计了一个针对C型凝集素结构域家族12成员A（CLEC12A）的双特异性桥接蛋白，该蛋白由分泌并招募抗CD19 CAR-T细胞。双特异性靶向实现的高亲和力导致增加的抗CD19 CAR-T细胞毒性。由于sdAbs的小尺寸，CAR可以直接配备双特异性抗体，正如cilta-cel9和OriCAR-017所强调的。这些CAR的高亲和力双特异性结合可以导致增强和持久的效力。 双特异性抗体能够实现双途径抑制，并可以锁定受体和外酶的构象 结合两个不重叠的表位可以为双特异性抗体解锁独特的活动。例如，通过双特异性抗体靶向低密度脂蛋白受体相关蛋白6（LRP6）实现了双途径抑制，同时阻断Wnt1和Wnt3a介导的β-catenin信号通路，显著地没有激动剂活性（见图2b）。 3.2 双特异性抗体能够实现双途径抑制，并可以锁定受体和外酶的构象 结合两个不重叠的表位可以为双特异性抗体（bpAbs）实现额外的功能。例如，通过同时靶向低密度脂蛋白受体相关蛋白6（LRP6）的双特异性抗体实现了双途径抑制，它可以同时阻断Wnt1和Wnt3a介导的β-catenin信号通路，且这种阻断没有激动剂活性（见图2b）。 另外，双特异性抗体可以通过物理上限制它们来使目标失活。针对HER2的双特异性DARPin的晶体结构，靶向I和IV亚域，揭示了两个HER2受体的结合和扭曲，阻止了与EGFR家族成员形成具有信号传导能力的二聚体。此外，针对CD38和CD73的双特异性抗体，包括临床双特异性抗体TNB-738，在锁定各自的外细胞域于催化非活性状态时，被证明作为酶抑制剂发挥作用（见图2c）。虽然单独的亲本抗体没有显示出任何活性，但针对CD73的双特异性抗体具有亚纳摩尔级的活性，并实现了超过90%的抑制。 3.3 双特异性抗体可以形成免疫复合物，导致激动作用、快速目标内化、溶酶体运输和提高的免疫效应功能 双特异性抗体的一个独特特性是它们能够通过同时结合两个非重叠的表位在反式中形成更高阶的免疫复合物。目标交联是多种作用机制的基础，包括增强的激动作用、通过Fc介导的效应功能或清除可溶性目标以及受体下调调节。 由双特异性抗体介导的聚集可以促进激动作用，特别是对于那些依赖交联以实现有效下游信号传导的受体（见图2d）。例如，肿瘤坏死因子受体超家族（TNFRSF）的成员由于其在免疫调节和细胞增殖中的作用而成为重要的治疗靶点。针对TNFRSF的单克隆抗体通常依赖于Fc受体介导的更高阶聚集，这阻碍了它们的治疗应用。杨等人最近展示了针对TNFRSF成员OX40和死亡受体5（DR5）的四价双特异性抗体实现了强大的内在激动作用，优于外在交联的亲本单克隆抗体，突出了双特异性抗体激动剂的潜力。 双特异性抗体也可能独特地定位于激活多组分受体复合物。例如，史等人设计了一种双特异性抗体，针对成纤维细胞生长因子受体1c（FGFR1c）的共受体β-klotho的两个不同表位。 双特异性抗体通过聚集受体增加了Fc结构域的局部浓度，从而可以提高效应功能（见图2e）。这种效应已在被单克隆抗体靶向的多价复合物中观察到，例如治疗性单克隆抗体利妥昔单抗靶向的B细胞标记CD20。双特异性抗体的结合将这种作用机制扩展到更多目标。例如，zanidatmab形成的大HER2聚集体被证明由于Fc结构域的预组织和随之而来的C1q沉积增加，导致比亲本单克隆抗体组合更强的补体依赖性细胞毒性（CDC）。这种效应在引入Fc区域增强六聚体形成的点突变的抗CD37双特异性抗体GEN3009中进一步放大。17 尽管效果不那么显著，双特异性抗体通过聚集Fc还已被证明可以通过增加与自然杀伤（NK）细胞上的FcγRIII受体的结合来提高抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）。 类似地，一个针对白细胞介素6（IL6）的双特异性抗体被用来增加吞噬细胞上的Fcγ受体结合，并促进可溶性目标的快速清除。被交联的受体已被证明可以迅速内化并运输到溶酶体，导致目标快速下调。 值得注意的是，交联效率及其相关效应可能取决于表位选择以及双特异性抗体：目标几何形状。快速内化和溶酶体运输使双特异性抗体成为抗体-药物偶联物（ADCs）中越来越受欢迎的构建模块，它们推动了肿瘤输送和细胞毒性有效载荷的细胞内释放，如MEDI4276、REGN5093-M114和zanidatmab zovodotin所示。与单价剂相比，双特异性抗叶酸受体α（FRα）ADC IMGN151显示出优越的有效载荷输送。由于这种效应独立于细胞表面FRα的密度，人们推测IMGN151增加的有效载荷输送是通过增强FRα阳性细胞上的结合事件而不是聚集，后者应该随着受体密度的增加而减少。然而，这两种作用机制并不是互斥的，需要进一步的研究来阐明IMGN151的作用机制。 3.4 同时结合不同的表位可以克服抗性机制 在治疗病毒感染时，一个常见挑战是找到一种广泛中和抗体（bnAb），它能够结合衣壳蛋白的保守区域并产生持久的反应。单价抗体可以针对保守区域，但容易因突变逃逸而受到选择性压力的影响。与小分子药物的疗法类似，bnAb的组合已被证明在减少单药治疗抗性方面有效，因为它降低了单一突变逃逸变体的机会。 针对严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）的双特异性bnAb BAT2022已被证明能够结合包括受体结合域（RBD）突变体在内的所有主要关注变体，该突变体不再被其中一个亲本抗体识别。对于HIV，三特异性bnAb SAR441236和几个临床前分子通过针对病毒衣壳蛋白上的多个表位显示出前景。 防止抗性的多价靶向在临床上对于肿瘤相关抗原（TAA）的靶向也可能有用。肿瘤细胞可以通过选择性剪接等机制消除靶向表位。有人推测，双特异性CAR-T细胞可以通过同时针对两个表位来防止肿瘤逃逸。虽然进一步的机制研究将很重要，但这对于癌症免疫疗法来说是一个有趣的前景。尽管概念上不同，Spangler等人证明了针对EGFR的三价靶向可以恢复对带有下游信号通路突变的cetuximab耐药异种移植模型的效力。最有效的三价构建物实现了必要的受体下调水平，这是仅用双价或单价构建物无法实现的。 4.治疗应用与方式 迄今为止，大多数双特异性抗体（bpAbs）已开发用于肿瘤学应用，并且随着cilta-cel的批准，首个基于bpAb的细胞疗法已获准用于复发和难治性多发性骨髓瘤。其他一些bpAbs目前正在早期临床试验中，用于血液癌症的治疗，包括ISB 1442和OriCAR-017，它们都处于治疗复发/难治性多发性骨髓瘤的I期。 对于实体瘤的治疗，许多bpAbs针对HER2，这是一种涉及包括细胞增殖在内的各种细胞功能的受体酪氨酸激酶。在20-25%的乳腺癌患者中观察到HER2的高水平过表达。使用针对非重叠结构域IV和II的临床单克隆抗体trastuzumab和pertuzumab组合靶向两个不同的HER2表位，已被证明可以显著改善治疗结果。HER2的重要性以及双重表位靶向的临床先例可能解释了包括anbenitamab和zanidatmab在内的众多针对HER2的bpAbs在研发管线中，这两种药物是临床进展最领先的针对HER2的bpAbs。其他显著的肿瘤学靶点也在用bpAbs进行研究，包括通过REGN5093 (-M114)和IMGN151分别针对间充质上皮转换因子(MET)和FRα。 大多数临床bpAbs作为裸抗体发挥作用，用于治疗病毒感染，通过相应的受体抑制或促进细胞信号传导，或者如TNB-738,24通过抑制酶活性。bpAbs被用作ADCs11,23,56的一部分进行有效载荷输送，因为它们独特的作用机制促进了内化和溶酶体运输。目前有六种双特异性ADC正在进行临床评估，其中三种也作为裸bpAbs进行研究。此外，bpAbs的高亲和力和选择性使其成为工程化高效T细胞招募剂和CARs的理想选择。 4.1 ALX-0651 Ablynx的ALX-0651是一种靶向CXCR4的双特异性串联单域抗体，是首个用于GPCRs的生物制剂，据我们所知，也是首个进入临床试验的双特异性抗体（2011年）。虽然构成ALX-0651的单个单域抗体显示出中和拮抗活性，但双特异性ALX-0651不仅展现了更高的亲和力，还显示出对CXCR4的反向激动活性。临床前数据表明ALX-0651在阻断CXCR4介导的病毒进入以及诱导快速干细胞动员方面是有效的。 4.2 BI 1034020 BI 1034020是由Ablynx和Boehringer Ingelheim开发的半衰期延长的双特异性串联单域抗体。这种双特异性抗体靶向大脑中淀粉样蛋白（Aβ）的两个独立表位，旨在用于阿尔茨海默病的治疗。BI 1034020的I期研究于2013年开始，但在发生与药物相关的严重不良事件后被终止。 4.3 MEDI4276 由MedImmune开发的针对HER2的抗体药物偶联物MEDI4276于2015年进入临床。MEDI4276由一个四价双特异性抗体组成，基于曲妥珠单抗的scFv靶向域IV，N端融合到mAb 39S的重链上，靶向域II。这种双特异性抗体向HER2过表达的肿瘤细胞输送四个位点特异性结合的tubulysin有效载荷，其中ADC被内化并运输到溶酶体释放细胞毒素。与曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的组合不同，MEDI4276可以交联受体，从而实现快速内化和通过将HER2从循环重定向到溶酶体降解，有效地进行细胞质输送。在异种移植肿瘤模型中，MEDI4276显示出对HER2低肿瘤以及对ado-trastuzumab emtansine耐药的肿瘤具有高效力，从而满足了一个高度未满足的医疗需求。在I期剂量递增研究中，MEDI4276在HER2阳性的乳腺癌和胃癌中显示出临床活性，但最终由于不利的毒性特性而被终止。 4.4 Ciltacabtagene autoleucel Ciltacabtagene autoleucel（cilta-cel）据我们所知，是迄今为止唯一获批的基于双特异性抗体的疗法。最初由Legend Biotech开发为LCAR-B38M，cilta-cel是一种第二代自体CAR-T疗法，其特点是具有两个靶向B细胞成熟抗原（BCMA）不同表位的单域抗体的双特异性外细胞域。双特异性靶向实现了比单特异性构建更高的亲和力结合和优越的疗效。基于CARTITUDE-1 Ib/II期研究（NCT03548207），cilta-cel在2022年获得批准，该研究表明其具有深度和持久的反应以及可管理的安全特性。整体响应率为97.9%，甚至高于初始I期研究（NCT03090659）观察到的87.8%。有趣的是，cilta-cel的批准仅在idecabtagene vicleucel（ide-cel）获批后1年，后者是一种具有单特异性BCMA靶向的类似CAR-T疗法。虽然应该谨慎比较各自的临床试验，但双特异性cilta-cel似乎在反应率和反应持续时间上都优于单特异性ide-cel。 4.5 Zanidatamab and zanidatamab zovodotin 源自Zymeworks专有的Azymetric Fc平台，双特异性抗体zanidatmab（ZW25）结合了一个靶向HER2域IV的单链可变区（scFv）和识别域II的Fab臂。Zanidatamab跨式结合两个HER2分子，引起细胞膜上独特的受体重组。除了快速内化和下调外，Fc结构域的聚集引发了强烈的补体依赖性细胞毒性（CDC），这在曲妥珠单抗、帕妥珠单抗或它们的组合中均未观察到。双特异性HER2结合在体内异种移植模型中显示出比曲妥珠单抗和帕妥珠单抗组合更优越的抗肿瘤活性。Zanidatamab在患有不同HER2表达水平的各种肿瘤的患者中显示出安全性。Zanidatamab目前正在进行多项临床试验，包括乳腺癌的II期试验（NCT04224272）和晚期胃食管腺癌的III期试验（NCT05152147）。Zanidatamab还在探索用于输送细胞毒性微管抑制剂。57 这种双特异性ADC，zanidatmab zovodotin（ZW49），已被证明是免疫原性细胞死亡标志的强诱导剂，并且在一系列HER2表达水平的乳腺癌和胃癌患者来源的异种移植模型中表现出高度活性。目前正在进行I期临床试验（NCT03821233）。 4.6 MP0274 由Molecular Partners开发的MP0274通过DARPins实现双特异性HER2靶向，DARPins是可像串珠一样串联的替代支架。四价MP0274分子分别包含一个DARPin，用于靶向HER2的域I和域IV，以及两个用于延长半衰期的人类血清白蛋白结合域。与基于IgG的抗HER2双特异性抗体类似，MP0274交联HER2受体，导致在各种HER2阳性细胞系和小鼠模型中与曲妥珠单抗和帕妥珠单抗组合相当的抗肿瘤活性。然而，MP0274可能通过稳定AKT调节的叉头转录因子FOX03a导致诱导凋亡来展现独特的作用机制。在HER2阳性实体瘤患者的I期研究中，MP0274显示出良好的暴露和有利的安全性。一位既往接受过曲妥珠单抗和帕妥珠单抗治疗的转移性乳腺癌患者对MP0274显示出持续反应，确立了临床概念验证。回顾性生物标志物分析显示，这位患者是唯一一个携带HER2阳性、PI3K野生型遗传特征的患者，并且接受了最高剂量水平的治疗，表明患者选择可以在良好的MP0274暴露下实现更高的反应率。 4.7 Anbenitamab and JSKN003 Alphamab Oncology基于曲妥珠单抗和帕妥珠单抗设计了一种靶向HER2的双特异性抗体anbenitamab（KN026）。通过组合使用旋钮进入孔和静电引导突变，实现了相应重链的异二聚体Fc配对。基于对HER2相互作用残基的结构阐明，工程化了一个可以与曲妥珠单抗和帕妥珠单抗重链分别有效配对的通用轻链。结果得到的双特异性抗体anbenitamab在多种HER2水平不同的肿瘤细胞系中显示出比曲妥珠单抗和帕妥珠单抗组合更优越的抗肿瘤活性，并在小鼠模型中显示出相当的活性。初步特性表明，anbenitamab保留了亲本单克隆抗体观察到的ADCC和抗体依赖性细胞吞噬作用（ADCP），同时结合HER2的两个不同表位。Anbenitamab于2018年进入临床，并在至少接受过一线治疗（包括曲妥珠单抗）的晚期转移性乳腺癌患者中显示出良好的安全性。Anbenitamab在包括HER2表达晚期胃癌和胃食管结合部癌患者的第二项临床试验中耐受性良好。基于有希望的初步活性，anbenitamab目前正在进行多项临床试验的评估，包括作为HER2阳性晚期或转移性胃癌二线治疗的两项注册研究（NCT05427383）和作为HER2阳性复发或转移乳腺癌一线治疗的研究（NCT05838066），均与化疗联合使用。将anbenitamab结合到拓扑异构酶I抑制剂上得到的双特异性抗HER2 ADC JSKN003，目前正在进行针对晚期实体瘤的第一项人体I期研究中。 4.8 Additional HER2-targeted bpAbs MBS301、BCD-147、TQB2930和KM257是四个基于曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的额外临床阶段的抗HER2双特异性抗体。MBS301结合了曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的半抗体，这些半抗体在工程化的CHO细胞系中分别产生，并通过旋钮进入孔突变在体外异二聚体化。从Fc结构域去除岩藻糖可以增强ADCC活性，结合双特异性靶向，在不同HER2水平的肿瘤细胞系以及小鼠模型中产生强大的活性。目前正在进行一项I期临床研究(NCT03842085)，评估MBS301用于治疗HER2阳性复发或转移性恶性实体瘤。 4.9 SAR441236 由于HIV的高度病毒遗传多样性，鉴定和发展有效的广泛中和抗体(bnAbs)一直是一个挑战。大分子和小分子单一药物疗法在很大程度上失败了，因为选择性压力增加了突变逃逸变体的机会。使用bnAbs组合的临床前和临床研究表明，通过靶向多个表位，可以提高疗效。Sanofi正在进行I期临床开发的SAR441236(NCT03705169)，由一个双特异性交叉双变量Ig样(CODV-Ig)臂与具有第三种独特特异性的Fab臂配对，使其成为一种三特异性bnAb。临床前体内数据表明，三特异性bnAb在减少病毒载量和预防感染方面更有效，在非人灵长类动物(NHP)的猴/人免疫缺陷病毒(SHIV)病毒挑战模型中。 4.10 GEN3009 Genmab结合了他们的专有DuoBody和HexaBody技术，设计了GEN3009，这是一种靶向CD37的双特异性抗体，具有增强的Fc介导的六聚体化。这种双特异性抗体包含互补的Fc突变，指导体外控制的Fab臂交换反应中的异二聚体化，并通过E430G突变增强六聚体化。由于双表位靶向，局部Fc结构域密度的增加，结合增强的六聚体化，在B细胞淋巴瘤细胞系以及慢性淋巴细胞白血病患者的样本中，与单一亲本单克隆抗体或组合相比，产生了更优越的CDC。Fc结构域聚集进一步增加了ADCC和ADCP，导致在几种细胞系衍生的异种移植模型以及非霍奇金淋巴瘤患者的异种移植中产生强大的抗肿瘤活性。GEN3009已在复发或难治性B细胞非霍奇金淋巴瘤患者中进行了首次人体试验(NCT04358458)，但由于战略原因，最近已停止进一步的临床开发。 4.11 REGN5093 和REGN5093-M114 Regeneron的双特异性抗MET通用轻链抗体REGN5093，已作为抗体(NCT04077099)和作为ADC(NCT04982224)进入临床。源自Regeneron的专有VelocImmune平台，REGN5093有效地抑制配体独立的MET和HGF诱导的信号传导。DaSilva等人表明，REGN5093创建了具有2:2化学计量比的抗体-受体复合物，与创建1:2复合物的单价抗体形成对比。这些更大的复合物可能导致与REGN5093相关的MET降解，作为bpAb:受体复合物回收效率降低和溶酶体运输增强的产物。Regeneron进一步利用了REGN5093的这一特性，通过将专有的细胞毒素maytansinoid有效载荷结合到REGN5093-M114中。这种分子在MET依赖性和非MET依赖性肿瘤模型中都显示出疗效，进一步证明了双特异性ADC方法的效用。 4.12 OriCAR-017 Oricell的双特异性GPRC5D靶向CAR-T细胞疗法OriCAR-017，已进入临床，用于治疗复发和难治性多发性骨髓瘤(NCT05016778)。类似于cilta-cel，OriCAR-017 CAR包含串联的sdAbs，靶向GPRC5D上的两个不同表位。作者推测，双特异性靶向增加了他们的CAR-T细胞疗法的特异性和亲和力，从而提高了疗效。已报告有利的I期安全性和有效性数据，并支持OriCAR-017的进一步开发。 4.13 SARS-CoV-2 neutralizing bpAbs 几项研究表明，通过要求多个同时发生的突变，bpAbs极大地减少了突变逃逸的发生率。与通常限制通过抑制RBD-ACE2界面来发挥传统阻断作用的单价结合剂不同，顺式结合的bpAb显示出阻断和构象变化，而反式结合的双特异性结合则展示了阻断和多聚化。目前临床进展最领先的针对SARS-CoV-2的bpAb，BAT2022，已完成I期安全性和耐受性研究（NCT05518695）。BAT2022是一个对称的2+2 Fc-含有分子，由一个sdAb分子与HC的C-末端连接。BAT2022作为一种广谱中和抗体，针对多种SARS-CoV-2亚变体保持了其有效性，展示了作为治疗性抗体的效用。 4.14 ISB 1442 Ichnos Sciences的ISB 1442是一种基于专有BEAT 2.0（基于TCR的双特异性抗体结合）平台的双特异性bpAb。ISB 1442在一个串联Fab臂上以高亲和力结合两个不同的CD38表位，并将此与低亲和力的CD47 Fab臂相结合，以阻断巨噬细胞上的信号调节蛋白α（SIRPα）。低CD47亲和力旨在防止对红细胞的靶向毒性，同时在高亲和力双特异性CD38臂的引导下，实现强大的抗肿瘤活性。结合增强效应功能的Fc突变，ISB 1442不仅影响ADCP，还表现出ADCC和CDC。临床前数据表明，与单一靶向药物相比，这种复杂的MoA可能具有增加的疗效和安全性。因此，ISB 1442目前正在进行针对复发/难治性多发性骨髓瘤患者的I/II期临床研究（NCT05427812）。4.15 TNB-738 Ancora Biotech的TNB-738是一种由两个源自Teneobio的专有转基因UniRat平台的sdAbs组成的非对称抗CD38 bpAb，它们以高亲和力结合不同的CD38表位。TNB-738使用旋钮进入孔突变来实现重链配对，一个完全沉默的IgG4 Fc来消除效应功能，以及在一个臂上添加惰性的kappa LC和CH1以提高可制造性。目前正在健康志愿者中进行I期剂量递增（NCT05215912），TNB-738通过酶抑制发挥作用。4.16 IMGN151 Immunogen的下一代FRα ADC已进入临床（NCT05527184），紧随其第一代FRα ADC mirvetuximab-soravtansine之后，该药物于2022年获得美国食品药品监督管理局（FDA）的加速批准。IMGN151包含一个scFv臂和一个mirvetuximab Fab臂，每个臂结合FRα的独特且不重叠的表位。IMGN151的双特异性靶向模式增强了在FRα阳性细胞上的结合事件，从而在高、中、低FRα表达的细胞系中实现了更优越的有效载荷输送。与mirvetuximab soravtansine相比，由bpAb增加的输送结合更有效的链接-有效载荷，可能使IMGN151能够面向更广泛的患者群体。5.总结 从单价单克隆抗体的组合中演化而来，双特异性抗体已证明其临床安全性和有效性，并且首个基于双特异性抗体的疗法已于2022年获得FDA批准。临床管线中的双特异性抗体基于多样的格式，除了存在Fc结构域以提供稳定性和效应功能外，没有明显的趋势。最终，生物学决定了双特异性抗体的设计。与传统的单克隆抗体、双特异性抗体，甚至是针对不同表位的单克隆抗体组合相比，双特异性抗体提供了独特的作用机制，使它们成为针对多种适应症的有吸引力的治疗剂。双特异性结合所实现的亲和性能够实现高度选择性的肿瘤靶向，如双特异性抗体ISB 1442所展示的特性，这些特性还可以使T细胞接合器或CAR-T细胞等治疗方式受益，正如双特异性CAR-T疗法cilta-cel的临床成功所突出的。目前正在临床测试的大多数双特异性抗体已被证明能够影响肿瘤相关抗原（TAA）的聚集，以改善受体激动作用、效应功能和/或有效的内化和溶酶体运输。除了治疗性单克隆抗体外，这种作用机制特别适合于通过六种目前正在临床评估的ADCs来改善向肿瘤的有效载荷输送。除了亲和结合和受体聚集外，双特异性抗体已被用于其他作用机制，如双途径抑制、多组分目标的刺激，或者像针对CD38的双特异性抗体TNB-738那样，锁定目标处于酶促非活性状态。在传染病领域，双特异性抗体有希望解锁具有增加反应持久性、对多样病毒景观更广泛有效的广泛中和抗体，并可能大大限制突变逃逸变体的出现。该领域正从双特异性转向三特异性以及更高级，以解决一些最具挑战性的人类疾病，如HIV和SARS-CoV-2。 正如临床中越来越多的双特异性抗体所见证的，双特异性抗体对于靶向治疗具有巨大的潜力。当前的临床双特异性抗体格局显示出对靶向HER2的药剂和依赖于受体聚集的相关作用机制的聚焦。HER2的突出地位可能由曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的组合治疗的临床先例所解释。然而，随着新技术使更复杂的结构工程化变得更加可行，我们预计双特异性抗体的靶点和适应症的数量将大幅增加。以前在临床上用传统抗体未能成功的靶点，可能因双特异性抗体的独特作用机制而变得可行，同时可能会出现特别适用于双特异性抗体的新靶点。正如SAR441236和临床前研究所强调的，三特异性或更高价的结构可以扩大双特异性抗体的效果，甚至解锁新的作用机制。由首个双特异性抗体治疗的批准验证，双特异性抗体的临床管线正在迅速扩展，并将激励对这一类独特抗体的更多研究，以充分利用双特异性抗体在靶向治疗中的潜力。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。