DNMT3A

靶向SMARCA2分子开发有两条主要的途径: 一是基于溴结构域的蛋白降解剂(见前期文章:合成致死靶点SMARCA2: PROTAC蛋白降解剂 (专利综述))。另一条是靶向 SMARCA2 的ATP酶小分子抑制剂，这里将分析靶向 SMARCA2 的ATP酶小分子抑制剂的研发进展。 1. 背景介绍 如前所述，最初抑制SMARCA2的方向是针对DNA 结合的溴结构域的抑制剂。然而，遗传学及细胞活性研究表明，抑制ATP酶结构域是抗增殖作用的关键，而不是溴结构域。开发选择性的高效的小分子ATP酶抑制剂将是一种更直接的方法来抑制SMARCA2的功能，并以合成致死机制治疗SMARCA4突变的肿瘤。此外，选择性/非选择性ATP酶抑制剂 还有可能转化为选择性SMARCA2 降解剂。 2. 专利评估 这里总结了针对SMARCA2 和/或 SMARCA4的小分子ATP酶抑制剂和PROTAC降解剂的专利文献汇总，见表1和表2，表1 总结了靶向 SMARCA2 的ATP酶抑制剂，表2 总结了基于ATP酶抑制剂的PROTAC降解剂。 表1. 靶向 SMARCA2 ATP酶的抑制剂专利 表2. 靶向 SMARCA2 基于ATP酶抑制剂的PROTAC蛋白降解剂。 3. 小分子ATP酶抑制剂 在过去的几年中已经看到了少量不同的靶向SMARCA2 和/或 SMARCA4的ATP酶抑制剂的骨架结构。总体来说，总结了4个申请机构发布的11份专利文件。 3.1. Bayer AG 2020年，拜耳报道了一项专利，有94个例子描述了N，N‘-二芳基脲化合物为SMARCA2 ATP酶抑制剂，如 图1。化合物1-3 中显示的2-氯吡啶基团存在于94个例子中的93个中，其余一个为2-氟吡啶基，这表明这个卤素取代对效力是必要的。这个骨架在诺华的一篇重要文献中报道过(JMC,2018,10.1021/acs.jmedchem.8b01318)，与化合物1 相似的化合物作为起点。 诺华化合物14 I 图１.　N，N-二芳基脲 SMARCA2 ATP酶抑制剂。 3.2. Epizyme, Inc Epizyme报道了一个有764个例子的专利，探索重点集中在杂环酰胺部分和吡啶酮环上的取代基。对SMARCA2的选择性适中，对SMARCA2的抑制活性一般小于SMARCA4的10倍，化合物4-5 (例139 和82c )（图2）。对全长SMARCA2（IC50=0.0099µM）和SMARCA4（IC50= 0.0661µM）具有较强抑制活性的。最高水平的肿瘤生长抑制为66%，前10天以50 mg/kg每日剂量，然后第11到13天是空窗期，和最后的低剂量30mg/kg的研究，可能表明由于抑制剂双重抑制导致缺乏耐受性。 图2. Epizyme 的 SMARCA2/SMARCA4 ATP酶抑制剂。 3.3. Foghorn Therapeutics, Inc Foghorn公司是目前对SMARCA2/SMARCA4 ATP酶抑制剂研究最为领先的公司，今年其选择性抑制剂FHD-909已进入临床。2019年， Foghorn Therapeutics报道了241个例子(WO2019152437)，描述了取代的2-酰胺乙酰胺衍生物为SMARCA2/SMARCA4 ATP酶抑制剂，这是围绕该核心骨架的一系列专利中的第一个（图3）。噻唑-2-烷基 是2-酰胺乙酰胺核上首选的N-取代基，2-酰胺取代基、噻唑取代基和亚甲基取代基是构效关系探索的重点。代表性的化合物6 (实例87，化合物A）和化合物7（WO2020160180，化合物B, 实例67，也称为FHT-1015）是有效的SMARCA2/SMARCA4 ATP酶抑制剂，并有效抑制葡萄膜黑色素瘤和血液瘤细胞系的生长。FHT-1015 在多个葡萄膜黑色素瘤细胞系（92-1、MP41、MP38、MP46）中表现出较强的生长抑制作用，GI50值约为0.010µM至0.100µM。 图3. 来自 Foghorn Therapeutics的基于酰胺乙酰胺骨架的SMARCA2/SMARCA4 ATP酶抑制剂 随后的2020年专利描述了47个化合物，重点是末端酰胺上不同取代的五元杂环基团(WO2020160100，WO2020106915)。此后，该骨架发表了两个专利，其中一个包括444个例子，如化合物10 (实例254，WO2021155316)，该专利中的部分化合物表现出一定选择性的SMARCA2抑制作用。2021年的专利US20210230154，其中的化合物11(实例1)，为他们的临床候选者（FHD-286）。该化合物于2021年年中进入 I 期临床试验，用于治疗复发/难治性急性髓性白血病（AML）、骨髓增生异常综合征（MDS）和转移性葡萄膜黑色素瘤。 FHD-286对葡萄膜黑色素瘤细胞系的体外生长抑制作用最强，其中92-1细胞系的绝对半抑制浓度为0.3 nM。该化合物在小鼠模型中也显示出显著的肿瘤生长抑制作用。在最高剂量（1.5 mg/kg）时，可观察到肿瘤消退，但体重无显著变化。另一项专利WO2021236080表明，在携带DNMT3A突变的OCI-AML2异种移植小鼠模型中，FHD-286抑制肿瘤生长。随后的专利(WO2022192365，WO2022198043)披露了FHD-286晶体形式以及配方、体外转运体和CYP谱数据。 2021年，同时发表了两项专利申请，以单酰胺骨的ATP酶抑制剂（图4）。第一个专利WO2021155264包含83个例子，探索了核心噻唑酰胺部分，用取代双环杂环，如苯并咪唑和萘啶。第二个专利WO2021155320是一个更广泛的526个实例，有两个不同的系列，第一个描述了六元杂环，主要是取代吡啶，作为噻唑酰胺替代品。本文还介绍了9元或10元杂环的其他实例，如萘啶和相关衍生物作为噻唑酰胺的替代物。根据提供的效价关系，它们是比SMARCA4更有效的SMARCA2抑制剂。 图4.  Foghorn Therapeutics的基于单酰胺的SMARCA2/SMARCA4 ATP酶抑制剂。 2022年，发表了856个例子的专利WO2022103899，探索了具有环状和非环芳基砜的酰胺与取代的9元或10元杂环核的结构。双环芳基砜酰胺与萘啶衍生的核心是在专利中最常见的特点。化合物15(实例15) 代表了化学物质和最具选择性的化合物，根据生化分析中的半抑制浓度值，其对SMARCA2的抑制选择性接近94倍。报道的例子的选择性差异显著，似乎很大程度上受到萘啶核心上的取代基的影响。 3.4. Novartis AG 2020年诺华报道了的八个例子的专利WO2020035779，将1-(isothiazol-5-yl)-3-(2-halo-pyridin-4-yl) ureas描述为有效的，SMARCA2/SMARCA4 双ATP酶抑制剂。2018年发表了一篇描述这些新型ATP酶抑制剂的报道，报道了N，N‘-二吡啶脲类 化合物16(实例1) 作为初始先导分子（图5）(见上文，10.1021/acs.jmedchem.8b01318)。化合物16对含有ATP酶和SnAC结构域的SMARCA2（636-1331）结构具有3.8µM的半抑制浓度，对含类似SMARCA4（658−1361）结构具有类似的效力(1.7µM 半抑制浓度)。优化后发现了化合物17(实例7)，这是一种有效的双抑制剂: SMARCA2/SMARCA4 IC50的<0.005µM。此外，在SMARCA2依赖的SMARCA4突变的黑色素瘤细胞系SK-MEL-5（绝对AAC50 = 0.004µM），而在SMARCA4正常细胞系SBC5（AAC50 = >10µM）中仅观察到微弱的抗增殖活性。在SMARCA4突变的人肺癌异种移植小鼠模型中，化合物17的体内活性，口服20 mg/kg连续3周，肿瘤生长抑制55%。然而，化合物受到了更高剂量时的耐受性问题的限制。化合物18与SMARCA2 ATPase结构域(705− 960）组成的晶体数据显示，抑制是通过在ATP结合位点附近与蛋白变构结合来实现的，脲与催化谷氨酸（Glu852）进行关键接触（图6，PDB：6EG3）。 图5. 诺华的二芳基脲骨架的SMARCA2/SMARCA4 ATP酶抑制剂。 图6. MBP-hSMARCA2[705–960] 与 化合物18 配合物的晶体结构（PDB：6EG3）。 4. ATP酶靶向PROTAC降解剂 4.1. Dana-Farber Cancer Institute (DFCI) 2021年，DFCI披露了一份SMARCA2ATP酶靶向PROTAC专利WO2021163302，包括14个实例。基于诺华报道的N，N‘-二芳基脲的ATP酶抑制剂基团，大部分连接点是通过末端的羧酸基序发生的。这些ATP酶结合物主要通过不同长度和灵活性的连接物与CRBN配体结合。本文还报道了两个使用 VHL E3连接酶配体的例子。通过ATPlite发光试验报告了化合物的细胞生长抑制数据，化合物19-22(实例 4、8、7和12）在人MV411细胞系中半抑制浓度≤为0.1µM（图7）。在A549和MOLM13细胞系中也有降解。 图7. DFCI的代表性PROTACs。 4.2. Foghorn Therapeutics, Inc 2021年， Foghorn Therapeutics公布了一份297个描述PROTACs的专利申请，利用它们的SMARCA2/4ATP酶抑制剂。SMARCA2 ATP酶结合剂是基于2-酰胺乙酰胺骨架，包括CRBN和VHL E3连接酶结合剂。第一个连接点附着在取代的氨基噻唑部分上，第二个是中心酰胺部分的亚甲基上（图8(a)）。以HeLa HiBiT检测了所有化合物的SMARCA2和SMARCA4降解数据。一些化合物表现出选择性的SMARCA2降解，有代表性的化合物23-25 (实例141,163和166）（图8(b)）。 图8. 针对 Foghorn Therapeutics的PROTAC降解剂。 4.3. Kymera Therapeutics, Inc 在2020年底，Kymera公司发表了一份538个实例的专利申请，描述了SMARCA2 PROTAC降解剂。虽然在此专利中绝大多数的化合物针对SMARCA2溴域，但有32个化合物利用了诺华报道的N，N‘-二芳基脲ATP酶抑制剂基团，并结合CRBN和VHL E3连接酶配体。代表性化合物26(实例301 )（图9）。 图9.　Kymera公司的PROTAC 降解剂。 2022年，Kymera公司随后披露了两项描述SMARCA2 ATP酶结合PROTACs的专利申请。第一个专利WO2022125800描述了40个化合物，基于2-酰胺乙酰胺SMARCA2 ATP酶结合剂，类似于早期 Foghorn Therapeutics。描述了三种不同的接入点：第一个是被取代的氨基噻唑部分（黑色箭头）；第二个是中心酰胺部分的亚甲基（蓝色箭头）；第三个来自末端杂芳酰胺部分（红色箭头）。40个化合物中有3个具有VHL E3连接酶配体，并利用黑色箭头表示的出口载体，其余具有CRBN E3连接酶配体。第二项专利WO2022178532申请描述了另外100种化合物，其中67种是PROTACs，33种是ATP酶抑制剂。CRBN和VHL E3连接酶结合剂都是一个例子。许多化合物包含一个单酰胺吡啶吡啶核心，与邻近吡啶的接入点（图10）。 图10.　Kymera公司的代表性2-酰胺乙酰胺和单酰胺SMARCA2/SMARCA4 ATP酶靶向PROTAC支架（箭头:接入点）。 参考：https://doi-org.libproxy1.nus.edu.sg/10.1080/13543776.2024.2338111 声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！ 长按关注本公众号  粉丝群/投稿/授权/广告等 请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓

*仅供医学专业人士阅读参考把肿瘤微环境内因抗原慢性刺激转入耗竭状态的CD8+T细胞“叫醒”，让它们重新活化为效应CD8+T细胞，是PD-1/L1抑制剂为代表的现有免疫治疗起效的关键，但实话实说，激活处在耗竭状态的CD8+T细胞，在奇点糕眼里总觉得有点像亡羊补牢，就没有什么办法能减少T细胞耗竭的发生吗？这对改善免疫治疗的持久疗效可也是挺重要的。但今天《科学》刊登的一项最新研究成果，提出了让奇点糕怎么都没想到的解题方法[1]：美国圣裘德儿童研究医院的研究者们基于对骨髓增生异常综合征（MDS）患者的观察，发现了调控T细胞从耗竭前体状态（TPEX）向终末耗竭（TEX）状态分化的关键表观遗传靶点，对它们进行抑制可使T细胞更好地保持干细胞样状态，更可能响应现有免疫治疗！研究显示，在MDS患者典型临床表现——克隆造血中常见的DNMT3A、TET2和ASXL1基因突变，能使一部分T细胞长期保持干性，延缓向TEX状态分化，从而扩大了它们响应免疫治疗的时间窗，携带上述基因突变的T细胞，在实验中可在慢性抗原刺激下存活超过1年；其中ASXL1突变是被首次揭示与T细胞持久力有关，研究者们专门揭示了它经由表观遗传调控T细胞自我更新的机制，将ASXL1抑制也可与现有免疫治疗协同增效。论文核心机制总结既往不少在CAR-T细胞上开展的研究已经证实，干预DNMT3A和TET2的正常功能可延缓T细胞进入终末耗竭阶段，使它们持久存在以改善细胞疗法的疗效[2-3]；而ASXL1则是圣裘德儿童研究医院团队此前工作的成果了，T细胞存在该突变的MDS患者接受免疫+化疗方案治疗（阿替利珠单抗+吉西他滨），预后显著较野生型或仅有髓系ASXL1突变的患者更好[4]。而在本次研究中，研究者们首先用CRISPR敲除了LCMV特异性CD8+T细胞的DNMT3A、TET2和ASXL1基因，再将它们回输到相应感染小鼠体内，发现在LCMV病毒长期存在、即抗原慢性刺激的情况下，这些LCMV特异性CD8+T细胞可存在超过1年，且通过增殖保持数量大致稳定，而野生型LCMV特异性CD8+T细胞的数量在2个月后就大降了。同时，敲除DNMT3A、TET2和ASXL1也使CD8+T细胞的干细胞特征相关标志物（Ly108）表达明显上升，而PD-L1、TIM-3等耗竭标志物表达下调，而且小鼠脾脏和肺部也明确存在TCF1+干细胞样CD8+T细胞，这些都表明敲除DNMT3A、TET2和ASXL1保存下来了一部分具有干细胞样特征的CD8+T细胞亚群，使它们成为响应免疫治疗的“火种”。敲除三个表观遗传调节基因可有效保存有干细胞样特征的CD8+T细胞接下来，研究者们把重点放在“比较新”的ASXL1身上，开始探索它维持T细胞自我更新能力的表观遗传调控机制。分析显示，敲除ASXL1会改善T细胞的染色质可及性，并通过降低多梳抑制性去泛素化酶（PR-DUB）复合物稳定性，在TPEX向TEX状态分化的过程中，调控组蛋白H2AK119位点单泛素化修饰（H2AK119Ub）等多种组蛋白修饰，从而调节T细胞维持干细胞样特征和细胞毒效应的关键基因表达水平，起到保存火种的作用。因此在小鼠实验中，敲除CD8+T细胞的ASXL1可有效改善它们在小鼠体内和过继后的抑癌效果，也能够与PD-1/L1抑制剂治疗实现协同增效，对人类实体瘤患者的分析也证实，ASXL1突变可为患者带来生存优势，那接下来就可以期待将成果转化为全新的治疗策略啦。简要总结研究发现------奇点糕近期推出了《2024ASCO年会深度盘点》课程，为大家系统盘点了2024ASCO年会上实体瘤领域的重磅进展，让您在100分钟内迅速深入把握前沿。长按识别下图中的二维码即可购买，购买后您可以在「奇点网小程序」收听，或下载奇点网「医学奇点」苹果客户端收听。如果遇到任何技术问题，大家可以戳我们下图中的客服小伙伴来解决~~参考文献：[1]Kang T G, Lan X, Mi T, et al. Epigenetic regulators of clonal hematopoiesis control CD8 T cell stemness during immunotherapy [J]. Science, 386(6718): eadl4492.[2]Prinzing B, Zebley C C, Petersen C T, et al. Deleting DNMT3A in CAR T cells prevents exhaustion and enhances antitumor activity[J]. Science Yranslational Medicine, 2021, 13(620): eabh0272.[3]Fraietta J A, Nobles C L, Sammons M A, et al. Disruption of TET2 promotes the therapeutic efficacy of CD19-targeted T cells[J]. Nature, 2018, 558(7709): 307-312.[4]O'Connell C L, Baer M R, Ørskov A D, et al. Safety, outcomes, and T-cell characteristics in patients with relapsed or refractory MDS or CMML treated with atezolizumab in combination with guadecitabine[J]. Clinical Cancer Research, 2022, 28(24): 5306-5316.本文作者丨谭硕

星形胶质细胞是哺乳动物大脑中丰度最高的一类细胞，为神经元提供结构支撑和代谢供应，调控突触活动，并会在损伤和疾病状态下被激活。有一小部分的星形胶质细胞存在于成人大脑的特定区域，这些星形胶质细胞会产生分化的神经元和胶质细胞，因此被称为神经干细胞。普通的大脑实质星形胶质细胞和静止的神经干细胞虽然功能迥异，但是具有相似的转录组，神经干细胞活性在分子层面上是如何被编码的仍不清楚。 近日，来自德国癌症研究中心的Ana Martin-Villalba和Simon Anders研究团队在Nature上发表题为DNA methylation controls stemness of astrocytes in health and ischaemia的文章，发现星形胶质细胞和神经干细胞具有相似的转录组和染色质可及性，但是具有不同的甲基化组，干细胞功能是由星形胶质细胞基因的甲基化和干细胞基因的去甲基化调控的，并且大脑缺血损伤诱导星形胶质细胞获得干性需要甲基转移酶DNMT3A介导的甲基化组重编程。 研究人员首先用流式细胞术从小鼠的脑室-亚脑室区分离了神经干细胞（NSC）及其后代，进行了单细胞核小体、甲基组和转录组测序（scNMT-seq），检测基因表达、基因组范围DNA甲基化和染色质可及性，将他们的单细胞转录组与一个更大scRNA-seq 参考数据库整合在一起，可以坚定到先前描述的14个休眠NSCs (qNSC1)、静止NSCs (qNSC2)、活跃NSCs (aNSC)、TAPs、神经母细胞和神经元，以及一些少突胶质细胞，从表观组分子层数据也可以将这些细胞类型区分开，说明DNA甲基化和染色质可及性在这一谱系中具有动态变化。然后他们将表观特征和基因表达想对照来鉴定vSVZ区活跃的调控元件，他们扫描了整个基因组的可变甲基化区域（VMR）和可变可及性区域（VAR），发现VMR比启动子区域更能去测基因表达，并经常出现在（TSS）下游约3kb第一个内含子中，在NSC谱系发生过程中，在TSS下游获得额外甲基化的绝大多数基因的转录表达降低。转录组数据分层聚类将 qNSC1和qNSC2细胞与来自其他组织的星形胶质细胞聚在一起，然而，甲基组聚类只将qNSC1细胞与其他区域的星形胶质细胞聚类，而qNSC2细胞与NSC谱系的其他细胞聚类，由于qNSC1细胞与纹状体和皮层的星形胶质细胞具有相同的转录组和甲基组，因此他们将其称为vSVZ星形胶质细胞，甲基组数据中最引人注目的是vSVZ星形胶质细胞和qNSC2之间的差异，而二者在基因表达和染色质可及性中的差别不明显，因此，vSVZ星形胶质细胞具有星形胶质细胞的甲基组，在过渡到qNSC2阶段时被重编程为NSC甲基组。 接下来他们想知道在vSVZ星形胶质细胞和qNSC2之间DNA甲基化的区别是否是导致其功能差异的原因，发现低甲基化区域（LMR）附近的许多基因都是高表达的，包括参与氨基酸、离子和胆固醇转运和代谢的基因，由于这些代表星形胶质细胞的基本功能，他们将这些位点标记为星形胶质细胞LMR，而在qNSC2的LMR附近的基因包括参与细胞分化、DNA结合和调控ephrin信号传导（控制神经母细胞迁移和NSC静息态）的基因，他们将这些区域标记为NSC LMR，在这些区域附近的基因高表达。因此，可能是DNA甲基化的差异导致了NSC和星形胶质细胞功能上的差异。 局部缺血损伤会诱导纹状体星形胶质细胞的神经干性程序，产生神经母细胞。他们将2个月大的小鼠进行短暂的大脑缺血损伤，发现缺血损伤诱导大多数vSVZ星形胶质细胞转化成qNSC2态，这些星形胶质细胞并不具有星形胶质细胞的甲基组特征，反而具有NSC的甲基组特征，说明NSC的甲基组对于神经再生和干细胞功能是必需的。最后他们在小鼠纹状体中特异性敲除Dnmt3a，进行缺血损伤，对照组小鼠神经母细胞数目显著增加，而在Dnmt3a敲除小鼠中这一反应被完全抑制，说明Dnmt3a介导的甲基组重塑对于获得神经干性潜能是必需的。 总的来说，这项研究揭示了星形胶质细胞和神经干细胞虽然具有相似的转录组，但是具有不同的DNA甲基化组，并且DNA甲基化可以调控星形胶质细胞的干性，为将来再生医学提供新的理论依据。 参考文献 https://doi-org.libproxy1.nus.edu.sg/10.1038/s41586-024-07898-9 内容来源于网络，如有侵权，请联系删除。