IFNAR-2

引言 在人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）感染中，CD8+T细胞对于病毒的清除至关重要【1】。因此，CD8+T细胞生物学动态与HIV感染患者息息相关。在慢性感染和肿瘤中，持续的抗原刺激诱导耗竭性T细胞（exhausted T cell，Tx）的产生【2】。TX的典型特征是由TOX等转录因子驱动的转录组和表观组重塑介导的效应功能减弱和抑制性受体的高表达【2】。值得注意的是，TOX不仅表达于Tx，也会表达于部分多功能效应记忆性T细胞，有时甚至与TCF-1共表达【3,4】，呈现干细胞样特性。研究表明，在大多数HIV感染患者中，HIV-特异性CD8+T细胞耗竭分子表达增加与高病毒载量和疾病进展相关【3,5】。在HIV感染患者外周血中，部分HIV-特异性CD8+T细胞中检测到TCF-1和TOX共表达【4】。作为HIV病毒存在和复制的主要位点，淋巴结内CD8+T细胞的表型和功能状态对于治疗策略的改善和设计至关重要。 近日，美国埃默里大学国家灵长动物研究中心微生物与免疫学部Mirko Paiardini研究团队在Nature Immunology杂志发表了题为Distinct SIV-specific CD8+ T cells in the lymph node exhibit simultaneous effector and stem-like profiles and are associated with limited SIV persistence的研究文章。这项研究通过流式、质谱、scRNA-seq和TCR-seq等分析在淋巴结内鉴定一群具有干细胞特性中间效应功能的SIV-特异性TOXhiTCF1+CD39+CD8+T细胞，该细胞倾向于淋巴滤泡定居并与靶细胞靠近，且能分化为终末效应细胞参与SIV病毒控制，为SIV/HIV感染提供新的免疫治疗靶点。 作者首先在恒河猴中建立猴免疫缺陷病毒（simian immunodefciency virus，SIVmac239）早期（42天）和晚期（17个月）感染模型。流式分析表明淋巴结CD8+T细胞内TOX表达随SIV感染时间延长而显著增加，尤其在CD95+记忆性CD8T细胞（memory CD8+T，TM）。与此同时，流式分析进一步发现淋巴结内 TOX+CD8+TM呈现GzmB+TCF-1-CD39+PD-1+TIGIT+TIM3+CD101+（传统效应T细胞，effector T, TEFF）和GzmK+GzmBlowTCF-1highCD39+PD-1+TIGIT+TIM3+CD101+两种。在未感染恒河猴中，淋巴结CD8+TM主要是TCF1+CD39-（占87%），而TCF1+CD39+只占6%；而在SIV早期感染淋巴结CD8+TM中，TCF1+CD39-占60%，TCF1+CD39+增加至27%；在晚期感染中，TCF1+CD39-降低至30%，而TCF1-CD39+TEFF占30%，TCF1+CD39+增加至40%。尽管TCF1+CD39+细胞群低表达细胞毒GzmB分子，但其与传统TCF1-CD39+TEFF细胞群有相似地活化脱颗粒能力。总之，这些数据表明SIV感染促进淋巴结CD8+T细胞TCF1-CD39+和TCF1+CD39+两种细胞群中TOX表达，虽然TCF1+CD39+细胞低表达细胞毒分子，但表现中间效应功能。 为了深入探究TCF1+CD39+CD8+TM功能，作者分离SIV感染恒河猴淋巴结内TCF1+CD39-、TCF1+CD39+和TCF1-CD39+CD8+TM并行质谱分析。结果证实TCF1+CD39+低表达细胞毒分子，包括perforin、GzmB和GzmA。此外，TCF1+CD39+细胞群高表达CD62L（T细胞迁移和淋巴结驻留相关）、CRTAM（淋巴结驻留）、DAP10、EOMES和IFNAR2（抗病毒相关）、NKG2C、NKG2D、CD94、CD160和GzmM（NK细胞毒相关以及T细胞增殖、扩增和功能相关）、CCL5（限制HIV感染）、ZHX3和PLK1（促增殖）和Bcl6（维持CD8细胞干性）。随后，作者分离早期SIV感染淋巴结中SIV特异性CD8+TM并行scRNA-seq分析，发现细胞分为C1（效应）、C2（干细胞样）、C3（增殖）、C4（IFN）和C5（其他）群。值得注意的是，TCF1+CD39+主要富集在C2群，表明干细胞样特性。TCR-seq分析指出TCF1+CD39+细胞群TCR克隆扩增，且主要克隆型与C1群重叠，表明TCF1+CD39+细胞群与TEFF存在线性关系。研究报道PD-1阻断促进干细胞样CD8+T细胞增殖和向TEFF分化【6】。作者发现PD-1抑制剂确实显著增加TCF1+CD39+CD8+TM和TCF1-CD39+TEFF比例，但Ki-67的增加仅在TCF1+CD39+CD8+TM细胞。这些结果表明TCF1+CD39+CD8+TM是一种有干细胞特性的中间效应细胞群，且具有向TEFF分化的能力。 随后，作者在SIV感染恒河猴中发现TCF1+CD39+CD8+TM的比例与血浆病毒载量以及淋巴结SIV DNA库呈负相关，表明其可以控制病毒和疾病进展。考虑到CD8+T细胞归巢至淋巴结滤泡与低病毒载量有关【7-9】，作者检测TCF+CD39+CD8+T细胞向淋巴结滤泡的迁移能力。首先，相比于TCF-CD8+T细胞，TCF-CD39+和TCF+CD39+CD8+T细胞CXCR5（滤泡归巢受体）表达显著增加，且TCF1+CD39+CD8+TM中CXCR5的表达同样与血浆病毒载量以及淋巴结SIV DNA库呈负相关，表明CXCR5对于TCF1+CD39+CD8+TM抗SIV的重要作用。其次，免疫荧光证实相比于TCF-CD8+T细胞，更多的TCF1+CD39+CD8+TM定位于B淋巴滤泡区，且与病毒RNA+CD4+靶细胞距离更近，表明TCF1+CD39+CD8+TM细胞具有更好的能力与感染CD4+靶细胞相遇以控制病毒。最后，作者在人HIV淋巴结样本中同样检测到TCF1+CD39+CD8+T细胞的存在。虽然低表达GzmB，但抗原刺激同样诱导脱颗粒和IFNγ表达，表明人HIV感染中TCF1+CD39+CD8+TM细胞可能具有类似的抗病毒能力。 综上所述，这项研究在猴和人缺陷免疫病毒感染淋巴结中鉴定一群具有干细胞样中间效应功能的TCF1+CD39+CD8+T细胞群，该细胞尽管缺乏经典细胞毒分子表达，但可以通过CXCR5定位于淋巴结滤泡区并与病毒感染CD4+T细胞作用，并继续分化为终末效应T细胞控制病毒载量，为促进TCF1+CD39+CD8+T扩增介导的病毒控制免疫治疗提供理论基础。 参考文献 1. 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摘要：疫苗是改善健康影响最大的药物。尽管对病原体非常有效，但癌症疫苗仍然是一个未兑现的承诺。然而，RNA技术的最新进展，加上科学和临床上的突破，加速了肿瘤抗原的发现和有效递送，使癌症疫苗成为一个诱人的前景。尽管我们正处于一个关键的转折点，未来几年将有多项随机临床试验成熟，但仍有几个关键问题：哪些抗原、肿瘤、平台和宿主能触发具有临床影响的强大免疫反应？在这里，我们用一个从抗原检测到递送的癌症疫苗原则框架来解决这些问题。通过这个框架，我们概述了使RNA技术能够快速、强大、实时地进行体细胞突变衍生的新抗原疫苗接种的特点——这是一种新兴的“理想”抗原类别——并强调了激发了人们对RNA能够实现对抗癌症疫苗持久愿景的信念的潜在特点。 1.引言 癌症免疫疗法的成功证明了免疫系统的力量可以被释放来对抗癌症。这些包括免疫检查点抑制剂（ICIs）和经过改造的T细胞在内的巨大进步，都建立在数十年关于T细胞如何识别同源抗原的发现之上，并将免疫疗法确立为肿瘤学的支柱。然而，该领域仍面临重大挑战——只有约20%的癌症对现有方法有反应，迫切需要为对当前药物不敏感的80%的癌症识别新的、有效的免疫疗法。尽管基础免疫学稳步揭示了启动、增强和维持T细胞识别癌症抗原的新策略，但值得注意的是，最成功的癌症免疫疗法都围绕着T细胞受体（TCR）与其同源抗原之间的基本相互作用。这照亮了一条道路，将最具影响力的药物应用于利用T细胞-抗原识别——疫苗——对抗癌症。 2.疫苗原则：从病原体到癌症 针对病原体的疫苗可以说是预防疾病最成功的药物。疫苗——递送抗原以诱导特定抗原免疫的药物——的成功根植于治疗性地利用免疫记忆的内在电路。也就是说，外来抗原激活免疫细胞清除威胁，并赋予一部分激活的细胞长期存在并在抗原再次暴露时重新扩张的能力。因此，预防性抗原保护未来遭遇，这是一个优雅且高效的解决方案，以保护宿主免受病原体侵害。 然而，尽管数十年来一直尝试，利用这一免疫框架对抗癌症却取得了令人失望的临床结果。然而，最近的证据表明人类T细胞能够识别转化细胞，并可以治疗性地利用，这激发了将以往癌症疫苗失败与成功病原体疫苗原则进行更密切比较的动力。作为一种有效的疫苗——无论是针对病原体还是癌症——必须从根本上向理想的宿主递送最佳抗原以激活免疫记忆，癌症疫苗的关键要素将进一步讨论（图1）。 图1. 有效的癌症疫苗需要四个关键要素 有效的癌症疫苗必须利用抗原（特异性、免疫原性、最小性、价性）、传递系统（模块化、佐剂性、速度、规模、安全性）和宿主（健康状况）的最佳特征，以持久激活目标免疫细胞（CD8+和/或CD4+ T细胞）。缩写如下：APC，抗原呈递细胞。© 2024 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, Memorial Hospital for Cancer and Allied Diseases, and Sloan-Kettering Institute for Cancer Research, each in New York, NY. 版权所有，经许可转载。 2.1.目标抗原 疫苗最关键的组成部分是抗原（框1）。对于病原体，疫苗可以被广泛分类为抗原不可知和抗原特异性。 2.1.1.抗原不可知疫苗 抗原不可知的减毒活疫苗递送抗原和佐剂（框1），使用失去致病性但保留抗原性和佐剂性的灭活微生物。这些疫苗，如针对天花、黄热病、麻疹、腮腺炎、风疹和水痘等不变病原体的疫苗，不需要事先选择抗原，并能引发强烈的细胞和体液反应，模仿自然感染的保护性免疫。甚至单次免疫接种也能提供长达数十年的免疫。在癌症中，类似的概念是使用辐照肿瘤细胞、用自体肿瘤细胞裂解物脉冲的树突状细胞（DCs）或异质肿瘤细胞系产生的全细胞疫苗。由于这种方法同样是抗原不可知的，理论上它广泛捕获了多种癌症克隆的癌症抗原，并规避了对个别癌症或患者进行抗原选择。为了诱导抗原摄取和启动，全肿瘤细胞和DC疫苗通常与“功能性佐剂”（如刺激DCs、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞和T细胞的细胞因子、趋化因子或共刺激分子，例如GM-CSF、IL-2、IL-4、IL-6、TNF-a或IFN-g）结合使用。尽管全肿瘤细胞疫苗在临床前模型中可能有效，但临床效果大多有限，这表明抗原不可知疫苗与全细胞的概念——尽管在缺乏致病性微生物的情况下是可行的——不能线性应用于癌症。与递送基因组简单、克隆群体的减毒病原体疫苗不同，全肿瘤细胞具有更复杂的基因组，这可能会用非免疫原性的自身抗原稀释相关的免疫原性抗原。尽管尚不清楚临床效果不佳是否是由于不精确的抗原选择和递送，但鉴于最近技术进步使能够快速实时识别和递送肿瘤特异性抗原，当前疫苗大多是抗原特异性的。 2.1.2.抗原特异性疫苗 与抗原不可知的减毒活疫苗不同，抗原特异性疫苗（也称为亚单位疫苗）选择并递送免疫原性抗原（例如乙型肝炎病毒中的重组蛋白、白喉和破伤风中的灭活毒素、肺炎球菌中的细菌多糖，以及与更免疫原性载体结合的流感B型和脑膜炎球菌中的弱抗原），与佐剂复合。 目前，大多数癌症疫苗类似于病原体亚单位疫苗。这种方法需要事先为特定癌症或个体肿瘤选择抗原，这带来了根本性的挑战。与病原体不同，癌细胞是宿主衍生的，具有大量的“自我”抗原，受到中枢和外周耐受的限制（框1），因此缺乏宿主外周T细胞库中的同源抗原特异性T细胞。单个癌细胞也可能包含一系列具有不同免疫原性的“非自我”抗原。因此，最佳癌症疫苗抗原必须足够（1）癌症特异性，以限制对健康组织的非目标免疫，（2）“非自我”以在外周库中有功能性抗原特异性T细胞，这些细胞可以在抗原递送后扩展，以及（3）免疫优势以最大化对个体癌细胞的免疫反应。快速且大规模地识别最佳癌症抗原的能力一直是限制癌症疫苗发展的一个关键瓶颈。 为疫苗选择最佳癌症抗原可能具有挑战性，不仅在单个癌细胞内，而且在癌细胞集合中也是如此。由于肿瘤是遗传异质性的转化细胞集合，不同的克隆群体可能具有不同的抗原库，类似于病原体血清型。此外，这些抗原可能在内源性或治疗诱导的免疫选择压力下随时间演变，从而改变抗原层次。因此，癌症疫苗接种类似于针对快速演变的群体进行疫苗接种，类似于季节性病毒疫苗。这种假设强调了需要平衡疫苗的“最小性”、“价性”和“持久性”（框1）——即用最少的主要和次要抗原对单个克隆进行疫苗接种，广泛疫苗接种以覆盖所有癌症克隆和亚克隆，以及频繁重新采样抗原和重新疫苗接种以维持随着克隆组成演变的保护。 总之，我们认为必须选择癌症抗原以优化五个疫苗特征（图1）——特异性、免疫原性、最小性、价性和持久性。 2.2.目标递送 最佳疫苗平台必须安全地以速度、规模和强度递送抗原，同时保留上述五个关键特征。疫苗平台包括基于细胞的、基于蛋白质/肽的和基于核酸的。在这里，我们专注于RNA，它已成为创建满足前述要求的癌症疫苗的有吸引力的平台（图2）。 典型的RNA疫苗是通过体外转录（IVT）在无细胞系统中将线性化的质粒DNA模板转录成RNA，以产生模仿内源RNA结构的RNA，包括50帽、50和30非翻译区（UTRs）、开放阅读框（ORF）和聚（A）尾。通过IVT生成的RNA与传递载体复合，通常为脂质，它封装并保护RNA免于降解，并通过巨胞饮、内溶体合并和内体逃逸将RNA有效载荷传递到目标细胞的细胞质中。在细胞质中，RNA作为翻译模板产生蛋白质。翻译的蛋白质被蛋白酶降解成短肽，并用于在主要组织相容性复合体（MHC；框1）分子上呈现。RNA对癌症疫苗的关键优势包括以下几点。 图2. RNA实现快速、强效、模块化和安全的疫苗接种 RNA能够实现可行的抗原传递、内在的佐剂性以及多功能的模块化，通过多种平台和途径安全地传递任何抗原。缩写如下：UTR，非翻译区；ORF，开放阅读框。© 2024 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, Memorial Hospital for Cancer and Allied Diseases, and Sloan-Kettering Institute for Cancer Research, each in New York, NY. 版权所有，经许可转载。 2.2.1.抗原递送和模块性 RNA可以同时编码多种蛋白质，无需体外细胞培养或蛋白质工程。由于RNA制造是序列独立的，它可以生成细胞或基于蛋白质技术无法制造的蛋白质，这是基于肽疫苗的优势。序列修改可以进一步优化RNA半衰期、反应原性、免疫原性、稳定性和翻译。这种模块性使得可以快速更新几乎任何目标抗原的制造，具有高度特异性和价性，以确保持久免疫。 2.2.2.佐剂性 RNA分子结合内体（Toll样受体[TLRs] 3、7、8）和细胞质（RIG-I、MDA5、OAS、PKR）RNA传感器，在靶细胞中产生I型干扰素（IFNs），提供强大的内在佐剂性。这一特性省去了外源性佐剂，并理论上将抗原和佐剂递送到同一抗原呈递细胞（APC）以最大化免疫原性。 2.2.3.速度、可扩展性和递送 由于RNA疫苗是直接从DNA模板通过重组酶和核苷酸三磷酸体外转录而成，它们可以快速生成（数小时）并产量高。所有反应组分理论上都可以从商业供应商处获得，作为良好生产规范等级的无细胞产品，使RNA疫苗平台高度可扩展。RNA平台还可以通过简单地更换编码序列来适应生产各种疫苗，提供了巨大的灵活性。RNA可以使用各种传递载体传递到目标细胞，包括体外和体内。RNA支持快速、高度可扩展疫苗制造的能力在COVID-19 RNA疫苗开发的速度和规模上得到了壮观的展示。 2.2.4.安全性 RNA是一种非传染性、非整合性分子（即没有插入突变或永久改变宿主基因组的风险），它通过正常的细胞过程降解，这限制了分子半衰期并防止了免疫过度刺激。此外，由于癌症疫苗可能需要针对不断演变的肿瘤进行重复剂量，RNA是合适的，因为它是一个最小的基因载体，没有抗载体免疫的风险。最近针对COVID-19的RNA疫苗的广泛应用进一步证实了RNA疫苗的高度有利的安全剖面。一致地，对于癌症疫苗，到目前为止只观察到轻微到中度的不良事件，包括全身反应如头痛、疲劳和发热。 2.3.目标宿主 从概念上讲，理想的宿主是那些在最小抗原暴露下触发最大长期免疫记忆的宿主。为了实现对传染病的这种记忆，病原体疫苗用于初级预防（即预防性疫苗）。 癌症疫苗，像病原体疫苗一样，旨在传递抗原以激活保护性免疫记忆，类似的宿主健康特征可能增强免疫力。因此，就像对抗传染病一样，这需要接种“免疫最健康”的宿主——在癌症中，这可能等同于“疾病最轻微”的宿主，以在疾病发作或复发前产生免疫力。在癌症中，宿主特征可以为预防性疫苗（即，预防癌症发作）优化的概念现在已经在病毒驱动的癌症中被证明是可行的，早期研究表明，这在二级预防（即，预防癌症复发）中也可能是可行的。然而，大多数先前的临床癌症疫苗都是在晚期癌症宿主中部署的，因此可能存在广泛的免疫学损害，例如抗原呈递的缺陷、T细胞激活的抑制以及肿瘤内交通的损害等。这些多因素宿主免疫失调可能损害疫苗诱导的抗原特异性免疫，并可能解释了早期癌症疫苗临床效果信号较弱的原因。 在晚期癌症患者中测试疫苗和其他免疫疗法药物的范式也反映了一种历史药物开发方法，这种方法针对直接针对癌细胞的细胞毒素，如化疗和靶向疗法。然而，疫苗作为前药，必须激活宿主免疫细胞，而这些细胞又必须保持长期功能。因此，我们认为疫苗单药疗法应该在能够产生和维持长期记忆和功能的宿主中部署——这在最小疾病宿主中可能是最大的，疫苗旨在用于癌症的一级或二级预防。支持这一点的是，几项针对晚期疾病患者的癌症疫苗临床试验显示了有限的临床效果，而最近在最小残留疾病患者中进行的疫苗试验显示了更强大的疫苗诱导免疫。 2.4.目标细胞 大多数病原体疫苗刺激B细胞产生中和抗体，这些抗体主要识别细胞外蛋白。这些抗体通过结合同源表位来中和病原体毒素、抑制病原体进入或通过吞噬作用、补体固定、抗体依赖性细胞毒性或其他机制杀死病原体，以保护宿主。 尽管体液反应可能在免疫肿瘤学中发挥作用，但大多数癌症免疫疗法针对的是细胞免疫，因为T细胞具有内在的细胞毒性能力，并且能够识别由MHC分子在转化细胞中呈递的细胞内抗原。因此，当前的疫苗优先考虑CD8+ T细胞，它们能够识别人类癌症抗原并通过多种机制溶解目标细胞。此外，由于持久的免疫力是疫苗的一个关键特征，因此最大化长寿命记忆CD8+ T细胞的策略也是可取的。然而，越来越多的证据表明，除了CD8+ T细胞外，CD4+ T细胞在自发性和治疗性免疫中，包括疫苗中，也起着关键作用。因此，癌症疫苗的最佳目标细胞和细胞亚群仍在不断发展。 3.新抗原作为最佳靶标抗原 作为疫苗最关键的组成部分，抗原有三个特征定义了一个能够激发特定、强大、持久且最小自身反应的强效癌症疫苗抗原：肿瘤特异性、免疫原性和克隆性。尽管癌症抗原可以来自几个类别，例如在癌细胞中选择性或过度表达的蛋白质，包括来自病毒的蛋白质，但最近从癌症特异性遗传变异中产生的新抗原（Box 1）已经成为一个理想的疫苗抗原类别。 3.1.特异性 随着癌细胞的分裂，它们累积了各种遗传变异，最常见的是非同义突变，以及插入/缺失（indels）、新融合基因产物和选择性剪接RNA转录本。 这些遗传变异的一部分产生了正常组织中不存在的新蛋白质，称为“新抗原”。最近的研究表明，新抗原在人类癌症中刺激内源性T细胞，并且它们的存在与多种癌症中的T细胞活性相关。此外，癌症新抗原是生存的预后因素，受到自发编辑的影响，并且诱导临床免疫疗法的成功。因此，新抗原是肿瘤特异性的、由肿瘤发生产生的基本副产品，使免疫系统能够识别癌细胞，因此是理想的癌症疫苗抗原类别。 目前，由于新抗原必须在实时中快速识别以产生临床疫苗，计算技术仍然是识别新抗原的主要方式。在这里，下一代测序（NGS；全外显子或全基因组与RNA测序和患者特异性人类白细胞抗原[HLA]分型）识别在正常组织中不存在的肿瘤中表达的突变作为新抗原。新抗原是否可以通过较少侵入性的肿瘤细胞采样方法（例如，循环肿瘤DNA或其他检测液体活检中的肿瘤DNA的策略）被检测到，仍然是一个正在进行的研究领域。 3.2.免疫原性 尽管NGS识别了癌症特异性新抗原，但新抗原的免疫原性各不相同。因此，使用专门的下游计算策略进一步选择和排名免疫原性部分。尽管目前可用的计算工具准确性有限，但它们仍然是当今临床预测策略的主流。 目前，一个免疫原性新抗原必须满足两个要求：新抗原必须产生一个结合MHC-I或MHC-II分子的新表位（Box 1），并且呈现的新表位必须逃避宿主耐受性，以在库中繁殖并激活同源TCR（识别）。计算工具分别估计每个要求。 3.2.1.估计呈递 翻译。在通过NGS识别突变后，通常通过RNA测序获得的RNA表达可以估计一个突变是否被翻译成蛋白质以及翻译蛋白质的丰度。将RNA转录本丰度纳入新抗原识别的理由是观察到较高的RNA转录本丰度可以抵消较低的肽-MHC结合亲和力。一致地，转录本表达幅度与肽-MHC复合物密度相关，具有较高转录本的新抗原是T细胞的靶标，并且转录本下调被认为是一种补偿性免疫逃逸机制。对于疫苗来说，转录本表达已被用于优先选择疫苗的新抗原。MHC结合。一个翻译后的新抗原被呈递给T细胞，如果它产生一个结合MHC I或MHC II分子的新表位（Box 1）。 为了识别结合在宿主MHC分子上的表位，理想情况下，需要分离肿瘤细胞，并通过液相色谱与串联质谱法鉴定结合到患者特异性HLA等位基因上的肽段。这种方法理论上可以捕获最广泛的MHC呈递肽段，并且可以包括翻译后修饰和非典型抗原（即来自编码区序列之外的抗原，以及非典型抗原处理机制）。 尽管这种方法可以鉴定肿瘤抗原，但它需要实时的体外抗原纯化，这限制了快速和大规模检测抗原的能力。这一挑战，加上获取足够新鲜实体瘤样本的技术障碍，以及低灵敏度和样本重现性，限制了免疫肽组学在临床新抗原检测中的当前应用。 为了匹配临床检测新抗原所需的速度和规模，各种计算工具被用来估计新抗原是否能产生结合患者特异性HLA分子的新表位。这些计算工具是基于神经网络构建的，它们在体外实验测量的MHC-新表位结合亲和力和人类及小鼠的质谱免疫肽组上进行训练。这些工具倾向于更常见的HLA等位基因，尽管已有努力利用MHC序列同源性来估计与罕见HLA等位基因的表位结合亲和力，这些罕见等位基因的实验数据很少。其他工具模拟了MHC结合之前的分子途径，例如蛋白酶体切割和内质网转运，以及其他结合特征，例如MHC-新表位稳定性，但这些额外参数是否提供额外的准确性仍然不清楚，因为当前的结合工具是在包括这些早期步骤的MHC洗脱配体上训练的。绝对结合亲和力的不准确性可以通过测量相对或与野生型（WT）表位的差异结合亲和力来抵消。然而，预测体内免疫原性的最优结合阈值仍然不清楚，因为具有低预测结合亲和力的新抗原在体内可能是免疫原性的。 3.2.2.估计T细胞识别 并非所有MHC结合的新表位都会被T细胞识别。相反，由于中心和外周耐受性会删除和失活与高亲和力的生殖系编码MHC结合自身肽段的TCR，因此，幼稚的外周库缺乏识别自身表位并与抗原性相似的新表位交叉反应的TCR。因此，只有与WT表位足够“抗原性距离”的新表位才可能逃避中心和外周耐受性，并在库中具有同源TCR。与呈递不同，呈递在当前新抗原选择流程中研究得更好并被纳入，而识别则较少，目前通过以下策略进行估计。 自身相似性和不相似性。与WT肽段的差异性可以识别足够抗原性距离以使其具有免疫原性的新抗原。差异性通过与人类蛋白质组、WT表位的差异性，或者与病原体表位的相似性来估计。确切的生物学原理，即为什么新表位序列与病原体序列的相似性能够改善免疫原性新抗原的预测，尚不清楚——即，是否存在“理想”的表位特征，可被人类TCR库识别，或者它是否代表通过预先存在的T细胞对新抗原交叉反应的异源免疫。由于特定TCR的产生是通过生殖系编码序列的重组而发生的，这被认为是随机的，可能重组倾向于产生更频繁和强烈识别某些抗原的TCR。虽然缺乏直接证据，但这种可能的库对偏好识别具有“外来性”特征的肽段的固有倾斜可能解释了为什么自身不相似性的代理增强了免疫原性新抗原预测。 类似于不相似性，自身相似性可以识别与WT表位过于抗原性相似的新抗原，因此受到宿主耐受性的影响。最近的努力已经确定，对于由单个氨基酸替换产生的表位，替换大小、疏水性、生化家族和位置（即，TCR-肽-MHC接触区之外的替换）可以广泛估计表位之间的抗原相似性。总体而言，估计自身相似性和不相似性的稳健框架依赖于实验验证，这是完善和测试的活跃领域。 TCR结合。与自身相似性/不相似性不同，它通过比较新肽段与其他肽序列来预测免疫原性新抗原，新肽段-MHC复合物是否直接结合TCR也已被研究，但这是预测免疫原性新抗原最不发达的特征。一些当前策略包括估计氨基酸组成是否有利于与TCRs的相互作用，纳入对配对α和β TCR链的训练数据，以及基于迁移学习的模型来预测TCR-新抗原结合特异性。 黑箱方法。尽管当前的工具，如神经网络，可以熟练地提供现成的模型结构来分类新抗原识别的各个方面，但机器学习的最新进展可能允许自然改进现有方法来预测免疫原性新抗原。由于这些方法需要更大的实验数据集，它们可能随着这些数据的可用性而变得更加可行。 3.3.克隆性 由于癌症是由具有不同突变集合的不同肿瘤克隆组成的异质混合物，因此疫苗需要完全针对这种异质群体，以避免未靶向克隆的无限制生长。因此，新抗原靶标选择应最大化肿瘤克隆覆盖。为此，采用两种策略：针对（1）来自（如驱动突变）的截断突变的新抗原，以及（2）完全涵盖所有肿瘤克隆的乘客突变集合。特定策略是否诱导更持久的T细胞反应仍然未知。 3.3.1.截断新抗原 针对截断突变有几个吸引人的优势——由于它们在定义上存在于绝大多数肿瘤克隆中，它们满足了最大化肿瘤克隆覆盖的要求。此外，如果截断突变是驱动因素，诱导的免疫可能针对癌细胞的致癌功能。尽管在治疗上理想，但大多数驱动内源性免疫的免疫原性新抗原似乎不是截断的，因为免疫原性新抗原将受到T细胞选择压力，使免疫原性新抗原在癌细胞进化过程中变为亚克隆。此外，有证据表明，由于MHC-I呈递不佳和可能选择具有较弱免疫原性的驱动突变的进化压力，驱动突变可能是较弱的抗原。一致地，尽管已有报道称肿瘤突变的体外免疫原性，但免疫原性驱动新抗原很少见，并且似乎不是主要的内源性免疫靶标。尽管克隆新抗原的存在与增强对ICIs的免疫反应相关，这些ICIs放大了新抗原特异性T细胞，并且早期工作表明克隆肿瘤的存在可能与增强的疫苗免疫相关，但如果这种相关性意味着肿瘤、新抗原或两者的致敏特征仍然不清楚。尽管如此，针对在各种癌症类型和患者中常见的驱动新抗原，如在突变的KRAS或TP53中产生的新抗原，仍然是许多正在进行的努力开发高度可扩展的现成疫苗的重点，最近的KRAS肽疫苗试验显示在一部分患者中可测量的免疫反应。 3.3.2.乘客新抗原 针对乘客突变的策略有一个缺点，它们发生在肿瘤发生的后期，并且通常是亚克隆的。它们也可以驱动内源性免疫，受到编辑，因此会不断进化。然而，由于它们构成了一个更大的多样化的癌细胞特异性抗原库，它们允许选择最有力而不是最普遍的抗原。此外，由于乘客突变在功能上可能与致癌性相比更脱钩，它们可能会在长期内最小化疫苗抗性。事实上，目前大多数团队选择具有保守免疫原性特征的乘客新抗原，而不是最普遍的新抗原，用于疫苗（表1）。 为了选择覆盖所有肿瘤克隆的疫苗乘客新抗原，必须确定肿瘤克隆结构，将新抗原映射到克隆上。目前，这是通过从大量DNA测序（全外显子或全基因组）中计算每个突变的变异等位基因频率（VAFs），将VAFs聚类到克隆中，然后构建系统发育树来实现的。此外，选择不同克隆中不同的新抗原疫苗靶标，以最大化疫苗价力，既可以提高免疫反应的概率，最大化诱导疫苗免疫的克隆覆盖，理论上也可以最小化克隆生长。直接使用单细胞技术（如单细胞DNA测序）实验测量肿瘤克隆结构和异质性，目前尚未在临床上适用。 3.4.疫苗新抗原选择的其他考虑因素 3.4.1.热肿瘤和冷肿瘤 新抗原选择原则可能在具有更强（热）和较弱/缺失（冷）内源性免疫针对新抗原的肿瘤中有所不同。 免疫学上的“热”肿瘤显示出针对新抗原的更强内源性T细胞免疫。这些肿瘤通常突变程度较高（例如，黑色素瘤、非小细胞肺癌、错配修复缺陷癌症），具有足够的内源性新抗原特异性T细胞免疫，使肿瘤对ICIs的免疫增强敏感。因此，疫苗新抗原必须从抑制宿主抑制途径的主导内源性靶标中选择，从不驱动内源性免疫的亚主导新抗原中选择，或两者的组合。针对主导内源性靶标可以使与ICIs的合理组合进一步放大新抗原特异性T细胞；然而，疫苗单药疗法可以重新放大ICI增强的新抗原特异性T细胞以驱动临床效益的程度仍然不清楚。一种可能性是，对于热肿瘤，ICIs增强的主导新抗原特异性免疫，针对亚主导新抗原的疫苗将扩大和堆叠免疫反应，以赋予持久性。 免疫学上的冷肿瘤表现出针对新抗原的较弱内源性T细胞免疫。这些肿瘤通常突变程度低/中等，只有少数患者表现出针对肿瘤新抗原的自发性T细胞免疫，这间接支持了缺乏预先存在的、被抑制的新抗原特异性T细胞，这些T细胞会使肿瘤对ICIs敏感。历史上，这些肿瘤被认为是不适合疫苗的，因为它们的突变数量少，因此产生适合疫苗的新抗原的可能性低。几个团队挑战了这一概念，证明突变程度低的癌症，如结肠癌、胰腺癌和胶质母细胞瘤，确实含有新抗原，这些新抗原可以预测临床结果，驱动选择患者的内源性T细胞，并且可以通过疫苗增强治疗效果。在这里，大多数患者将通过疫苗对新抗原进行新的T细胞启动。此外，由于激活的T细胞在初次启动后上调免疫检查点，疫苗可以与ICIs协同作用。观察到疫苗可以在冷肿瘤中诱导强大的免疫反应，这包括目前对ICIs不敏感的80%的癌症，可能特别重要，鉴于它们巨大的未满足需求，总体预后差，重大的全球医疗负担，以及继续依赖上一代细胞毒素药物，如化疗，作为当前的临床标准。 3.4.2.新抗原的数量、类型、位置和演变 疫苗的最佳新抗原数量仍然不清楚。当前的个性化疫苗接种策略包括多个新抗原，最近的试验中从20到34不等（表1），主要是为了最大化价力。虽然理论上可以将整个突变组纳入疫苗，但疫苗中的更多新抗原可能导致免疫优势，减弱对亚主导和可能更具临床相关性靶标的免疫。理论上，理想的疫苗新抗原数量不应是一个预定的数量，而是最大化最小性和价力所需的最小新抗原数量。此外，尽管MHC-I限制的新抗原驱动CD8+ T细胞被认为是有效癌症疫苗的主要靶标，但MHC-II新抗原在小鼠模型中实现了最佳的抗肿瘤免疫，并且也应该纳入疫苗中。 如果新抗原是内源性T细胞靶标，它们可能会受到免疫选择压力，并随着肿瘤的进展而演变。因此，新抗原的组成和层次可能在原发和复发/转移部位之间有所不同，需要对多个肿瘤的患者进行多点采样。类似地，由于这也可能影响疫苗接种后演变的肿瘤，可能需要重新采样新出现的肿瘤，并用新的新抗原靶标重新接种疫苗，以实现持久的反应。 4.RNA作为最佳疫苗平台 RNA最初被认为是一种不稳定的分子，容易被细胞外的RNA酶降解，因此不适合作为治疗剂。然而，通过坚持不懈的科学努力，对RNA细胞摄取、分子稳定性和蛋白质翻译进行工程化和修饰，导致了1990年首个基于RNA的疫苗的出现。这些进步，以及Kariko和Weissmann获得诺贝尔奖的发现，即mRNA基础修饰可以避免被先天免疫受体不必要的免疫识别，共同改变了我们对如何在体内工程化和传递mRNA给细胞的理解，为有效的mRNA疗法奠定了基础。 4.1.优化稳定性和翻译 为了增强RNA稳定性、优化翻译并增加抗原传递，通常使用一系列药理学RNA修饰。治疗性RNA编码序列可以被50和30 UTR元素所包围，通常来自自然表达的α和β球蛋白RNA，具有可以增加RNA半衰期和蛋白质翻译的50帽状结构。新型合成50序列也可以增强RNA的可用性并增强抗原呈递。合成帽状类似物和加帽酶进一步增加蛋白质翻译。最佳的聚(A)尾巴（带有自由30端的120个核苷酸）可以防止RNA被外切酶降解并增强RNA翻译和稳定性。密码子优化和G-C含量富集可以进一步改善蛋白质翻译，并通过算法获得。在ORF中的序列修饰，如MHC-I转运域和与溶酶体相关的膜蛋白，可以将有效载荷定向到溶酶体隔室，并在MHC-I和MHC-II上提高抗原呈递效率。ORF可以通过连接序列连接，最近的一项研究表明，基于丙氨酸的连接序列可能比基于甘氨酸的连接序列更增加抗原处理和呈递。最后，修饰的核苷类似物可以增加翻译。尽管最近的一项研究表明某些核苷修饰可能导致移码，但这一点的重要性仍然不清楚。 RNA的固有佐剂性可以触发强大的I型IFN产生，但也可能抑制蛋白质翻译。因此，限制RNA佐剂性的策略已经被纳入RNA药物产品设计和制造中。一个不希望的先天刺激是IVT反应中产生的双链(ds) RNA污染物。由于dsRNA触发病原体关联分子模式，包括TLR3、RIG-I、MDA-5和NLRP3，以产生I型IFNs，因此，通过反向相快速蛋白液相色谱和高性能液相色谱从酶制备的RNA中消除dsRNA的策略已经被Kariko、Weissman和同事开创。这种纯化进一步在原代人类DCs中将蛋白质翻译提高多达1000倍。为了限制来自单链RNA的先天刺激，用天然发生的化学修饰核苷类似物修饰的RNA，如假尿苷或N1-甲基假尿苷，进一步限制了TLR3、TLR7和其他先天感应器产生的I型IFN，同时抑制了dsRNA识别，从而也在体外和小鼠体内提高了蛋白质产量。这种修饰的RNA疫苗在预防COVID-19方面引起了高度有效的保护性免疫，并且已经获得食品和药物管理局的批准，有几种其他核苷修饰的RNA病原体疫苗正在进行临床开发。 由于抗癌免疫的主要免疫臂是直接和间接使用I型IFNs的CD8+ T细胞，I型IFNs在癌症疫苗佐剂性中可能发挥更关键的作用。事实上，I型IFN受体缺陷（Ifnar1或Ifnar2）增加了小鼠化学致癌诱导的肉瘤发病率，Ifnar1-/- DCs显示出向CD8+ T细胞交叉呈递肿瘤抗原的受损，并未能拒绝免疫原性肿瘤。I型IFNs还诱导DC成熟和淋巴结迁移，增加细胞毒性T细胞中的穿孔素I和颗粒酶B表达，并促进记忆T细胞的存活，突出了I型IFNs在宿主对转化细胞反应中的重要性。一致地，在使用未修饰RNA疫苗的临床癌症模型中，Sahin和同事报告说，IFNAR缺陷（Ifnar1-/-小鼠）和抗IFNAR1阻断损害了DC激活，CD8+ T细胞获得颗粒酶B、IFN-g、TNF-α和脱颗粒功能，并减弱了体内抗肿瘤疫苗效力。此外，Seder和同事使用一种激活TLR7/8的自组装纳米颗粒疫苗的小鼠结肠癌模型，显示I型IFN消除了抑制性肿瘤内单核细胞，以增强系统性疫苗抗肿瘤效力。未修饰的RNA确实在人类单核细胞中诱导了更高水平的I型IFN反应，迄今为止，大多数RNA癌症疫苗使用未修饰的核苷类似物。 4.2.RNA传递策略 裸露（未配方）RNA可以局部给药，但会被细胞外的RNA酶迅速降解。RNA还具有负电荷的磷酸二酯骨架，体积大（104-106 Da），亲水性，这阻止了它进入阴离子脂质双层和细胞质，在那里它可以被翻译成蛋白质。尽管有几种技术允许RNA在体外培养皿中和在小鼠体内使用物理方法传递，如电穿孔和基因枪穿透细胞膜，但在体内疫苗接种需要将RNA传递给免疫细胞。已经使用了两种方法：体外RNA DC加载与细胞重新输注，以及RNA复合或不复合载体的全身注射。 4.2.1.DC RNA加载 DCs是主要的专业APC，能够激发细胞介导的抗肿瘤免疫，并且对RNA转染非常敏感。这些特性，以及能够直接和特异性地将免疫原传递给APC，使得体外RNA加载具有吸引力。通常通过电穿孔将RNA加载到从患者体内收集的DC上，电穿孔使用高压脉冲创建膜孔，允许RNA进入细胞质。缺点包括需要实时操作自体细胞产品以生成疫苗。这种缺点，以及直接将免疫原传递给体内目标APC的更大简单性，激发了直接RNA传递系统的发展。 4.2.2.RNA的系统给药 最常见的RNA传递系统使用脂质/基于脂质的材料。脂质通过静电相互作用包裹RNA，保持RNA稳定性，防止细胞外RNA酶降解，并使细胞内体摄取，随后通过膜破坏逃脱，允许RNA胞质释放。其他传递系统包括聚合物和基于肽的车辆，如精氨酸。 第一代RNA疫苗使用了阳离子脂质，如1,2-二-O-十八烯-3-三甲基铵丙烷及其合成类似物二油酰-3-三甲基铵丙烷。然而，由于它们的正电荷触发炎症反应，并且为了将这些RNA-脂质复合物(RNA-LPX)从肝脏/肺部重定向到二级淋巴器官和骨髓中的DCs，引入了电荷修饰。使用这种封装策略的RNA疫苗的静脉给药在临床肿瘤模型中产生了强大的抗原特异性CD8+ T细胞，具有效力。 目前，基于脂质的纳米颗粒(LNPs)是疫苗中最常用的RNA传递平台(RNA-LNP)，包括所有SARS-CoV-2 RNA疫苗。LNPs包括四个组成部分——一种阳离子脂质、胆固醇、一种辅助磷脂和一种聚乙二醇化脂质——共同包裹和保护RNA有效载荷。阳离子脂质是LNPs最重要的组成部分——它们促进自组装成病毒大小的颗粒，并且在血清中的生理pH下保持中性电荷，这两者都延长了半衰期并促进了内体摄取（酸性内体环境调节正电荷并介导膜融合和胞质RNA释放）。LNPs的其他组成部分包括胆固醇，它填补脂质间隙以增强纳米颗粒稳定性；辅助脂质，它有助于纳米颗粒流动性并促进脂质相变以协助内体膜融合；以及聚乙二醇化脂质（聚乙二醇与脂质锚结合），它稳定LNP大小，减少RNA聚集和吞噬作用，限制肾脏清除，并增加半衰期。脂质传递车辆不仅可以传递RNA（从而传递抗原），还可以提供内在的佐剂信号。最近的工作表明，脂质可以增强NLRP3炎症体激活，以增强RNA诱导的IL-1b产生，并且激活STING途径以诱导APCs的成熟。 由于传递途径可以影响传递的免疫原的大小和持续时间，从而影响随后免疫的效力，因此正在测试各种传递封装RNA的途径，包括局部（肌肉内、皮内、淋巴结内、鼻内、皮下和肿瘤内）和全身（静脉内、腹腔内、鞘内和气管内）。鉴于直接将有效载荷传递给APCs的明显优势，Sahin和同事的早期研究直接将裸露的RNA注射到二级淋巴器官（腹股沟淋巴结）中，通过巨噬细胞吞噬作用将模型抗原传递给DCs，刺激抗肿瘤免疫，并延长了淋巴瘤和黑色素瘤模型中小鼠的存活时间。类似的结果随后在临床前模型中发现，使用裸露的RNA将肿瘤相关和病毒抗原传递到黑色素瘤、淋巴瘤、肥大细胞瘤、白血病和HPV驱动的癌症的淋巴器官。直接注射到另一个淋巴结（脾脏）也刺激了抗肿瘤免疫并在黑色素瘤小鼠模型中有效。此外，还测试了皮内和皮下疫苗传递，以优化有效载荷转移到皮肤中的APCs，许多APCs位于皮肤中。皮内RNA注射在早期研究中被证明可以延迟免疫原性致癌物质诱导的纤维肉瘤。类似地，皮内疫苗接种被证明可以在自发性前列腺癌模型中触发细胞毒性T细胞。还测试了其他传递途径，包括鼻内、肌肉内和肿瘤内注射RNA，传递固有的RNA佐剂信号或编码的共刺激。 4.3.其他疫苗平台 上述特点突出了RNA作为癌症疫苗有吸引力的传递平台。除了RNA，临床上用于传递新抗原和其他肿瘤抗原的其他传递平台包括合成肽和DNA质粒。肽疫苗已用于预防HPV和乙型肝炎的疫苗，以及作为黑色素瘤和胶质母细胞瘤的新抗原疫苗。尽管肽疫苗具有有利的安全性概况，但基于肽的个性化新抗原疫苗的一个主要缺点是无法制造针对相当一部分序列的临床级新肽，这阻止了对任何已识别的新抗原的无偏疫苗接种。此外，肽疫苗主要产生了CD4+ T细胞，与最近RNA-LPX疫苗可以强烈诱导细胞毒性效应CD8+ T细胞的证据形成对比，尽管这是否是疫苗平台、新抗原选择或肿瘤类型的结果尚不清楚。尽管基于DNA的新抗原疫苗也在临床上使用，并且显示出与RNA类似的理想特征，具有TLR9依赖的内在佐剂性，并且能够编码任何新抗原，但插入突变的可能性仍然是一个潜在的安全缺点。 5.RNA癌症疫苗在临床上 随着检测突变衍生新抗原的工具在临床兼容的时间框架内发展，早期针对实体癌症的RNA癌症疫苗的临床试验集中在共享的肿瘤相关抗原(TAAs)作为“现成”目标。对于有多个可靶向TAAs的前列腺癌，针对晚期患者的四个TAAs的皮内精氨酸配方RNA疫苗的1期和1/2a期临床试验发现，58%的接种患者对多个抗原有反应，但免疫反应在时间上不一致。同样，在Lipo-MERIT试验中，静脉注射RNA-LPX编码TAAs诱导了部分反应，在抗PD-1治疗的晚期/转移性黑色素瘤患者中，50%的目标病变退缩，具有显著强烈的抗原特异性CD4+和CD8+ T细胞反应，包括在选定患者中大约1.2年后可检测到的抗原特异性CD8+ T细胞。 与此同时，NGS和计算生物学的技术进步使得实时、个性化的新抗原预测与临床疫苗接种相兼容。在这种方法中，通过活检或手术切除对肿瘤进行采样、测序、识别新抗原、优先排序、实时制造疫苗，并在大约14周内交付给患者，最近在仅9周内。 6.个性化RNA癌症疫苗的人体首项研究 在13名患有III/IV期黑色素瘤且复发风险高的患者的腹股沟淋巴结中，通过直接注射未修饰的RNA，编码多达10种个性化新抗原。疫苗在所有患者中诱导了针对多种（平均三种）新抗原的特异性免疫反应，其中三分之一的新抗原扩大了预先存在的T细胞，三分之二的新抗原扩大了新的T细胞（57% CD4+，17% CD8+，26%两者都有），这些T细胞展示了多功能细胞因子的产生和溶解能力。总体而言，60%的预测新表位具有免疫原性。新表位特异性T细胞表达了PD-1，PD-1阻断进一步增强了疫苗反应，并且接种疫苗与减少转移相关。这项研究为免疫学上的“热”肿瘤中的个性化新抗原疫苗提供了第一个原理证明，并为随后在热、晚期癌症中的研究奠定了基础。 与上述原则一致，即疫苗可能在疾病最轻微的宿主中诱导最大的免疫活性，我们的团队完成了首个针对胰腺癌的个性化RNA新抗原疫苗的试验——这是一种免疫学上的“冷”癌症，被认为含有很少的新抗原，因此被认为不适合疫苗接种。在这项试验中，手术可切除的胰腺癌患者的肿瘤被切除，然后接受顺序的PD-L1阻断、静脉注射未修饰的RNA-LPXs（编码多达20种个性化新抗原）和化疗。在16名可评估的患者中，疫苗在50%的患者中诱导了高幅度的多功能CD8+ T细胞，包括针对单一（50%）和多种（50%）新抗原的T细胞。与接种疫苗的黑色素瘤患者的发现相反，我们发现PD-L1阻断和疫苗接种扩大了不重叠的T细胞克隆，这可能是因为在胰腺癌中，大多数患者的内源性新抗原特异性免疫反应低/低于阈值，无法用PD-L1阻断来增强，但可以用疫苗来诱导新的反应。一致地，疫苗诱导的T细胞在接种疫苗后长达1.9年的时间内在血液中持续存在。此外，尽管只有24%的预测新抗原具有免疫原性，但有疫苗诱导T细胞的患者表现出延迟复发，这一结果促使全球多中心2期随机试验测试疫苗在胰腺癌中的效力。 7.测量疫苗免疫反应 为了确定新抗原疫苗是否刺激了免疫反应，需要适当的生物标志物。在病原体疫苗中，通过针对病毒组分的血浆抗体滴度来测量B细胞反应，或针对共享病原体表位的肽-MHC四聚体来测量T细胞反应，相对来说比较简单。然而，由于新抗原疫苗诱导对患者特异性抗原的免疫反应，这需要一种策略来追踪可以广泛扩展的个性化抗原特异性反应。新的测序技术显示出解决这一挑战的希望。 在疫苗研究中，最常用的测量抗原特异性T细胞的方法是使用抗原特异性体外T细胞敏感性试验（例如，酶联免疫吸附试验[ELISpot]）或荧光标记的肽-MHC多聚体。这两种试验在速度和规模上都有使用上的挑战——两者都是劳动密集型的，需要体外湿实验室实验/校准，难以标准化，并且依赖于定制试剂的可制造性。更常见的免疫学技术，如通过流式细胞仪进行的表型分析，不足以从背景噪声中区分出新抗原特异性T细胞。 通过测序TCR CDR3域（TCR Vb测序）来识别T细胞克隆的最新进展，提供了更大的灵敏度，以高通量方式准确追踪个体T细胞克隆。TCR Vb测序可以逐个克隆解析，并已用于在针对病原体和癌症的RNA疫苗试验中追踪疫苗诱导的T细胞克隆。这种方法还可以与额外的依赖TCR序列的工具配对，如单细胞RNA/TCR a/b测序，以测量疫苗扩大的T细胞克隆的表型和功能。 动态追踪疫苗诱导的T细胞最重要的理由是实时监测疫苗反应，并根据需要重新干预，类似于当前用病原体疫苗的抗体滴度下降来增强免疫的做法。如果疫苗诱导的T细胞克隆下降到保护阈值以下，或者变得耗竭，可以根据需要重新接种疫苗（或重新激活）。识别适合响应或注定会丧失功能的T细胞的表达标志物，可以进一步发现推动T细胞长期持久或耗竭的疫苗特征。鉴于这些测序工具比目前的方法更适合扩展，因为它们在患者间的校准更简单，且不依赖于定制试剂。 一个并行的考虑，特别是考虑到当前计算新抗原预测工具的不准确性，是检查疫苗诱导的T细胞是否正确识别了在自体肿瘤细胞上处理和呈现的抗原。这种验证需要将疫苗诱导的T细胞与自体患者衍生的肿瘤材料进行体外共培养。然而，这些研究目前在后勤上存在挑战，因为对于某些肿瘤小和/或基质含量高的癌症，大部分肿瘤材料将需要分配给疫苗制造。此外，患者肿瘤衍生的细胞系可能无法捕捉所有异质的肿瘤克隆进行体外筛选，因此，缺乏反应性可能错误地意味着缺乏肿瘤特异性T细胞活性。是否可以用肿瘤衍生的类器官克服这一限制，仍然是一个未解决的问题。 8.疫苗抗性的成因 尽管由于大规模辅助癌症疫苗临床试验的数量有限，目前对癌症疫苗抗性机制的全面理解还不是很深入，但从治疗性疫苗和其他T细胞疗法的临床试验中了解到的抗性机制可以提供合理的见解。 疫苗失败主要有两种情况：（1）疫苗未能产生免疫反应；（2）随着时间的推移，疫苗诱导的免疫反应逐渐失效。 8.1.疫苗因素 未能优化疫苗的基本要素（特异性、免疫原性、最小性、价性和持久性）、疫苗传递或疫苗时机可能导致失败。抗原特异性和免疫原性不足可能导致初次失败，因为缺乏肿瘤特异性的自身抗原和与佐剂不足（因此免疫原性弱）的抗原可能诱导耐受性。价性不足的疫苗，因此无法充分覆盖克隆，可能导致逃逸克隆的出现。未能优化抗原层次结构的疫苗可能导致优势反应，饱和且可能偏斜的反应。同样，传递效果不佳的疫苗可能无法将T细胞激活到足够高的水平或长期持久，从而导致初次或二次疫苗失败。最后，由于在疾病最轻微的宿主中癌症复发是随时间不对称的，大多数复发发生在早期，随后逐渐减少，因此在癌症易感窗口期间最大化疫苗免疫可能对预防二次失败至关重要。 8.2.肿瘤因素 从T细胞选择压力下出现的耐药克隆可能适应限制新抗原呈递或T细胞杀伤的观察中，可以了解到导致疫苗失败的肿瘤内在因素。限制新抗原呈递的适应包括肿瘤抗原的下调，以及MHC表达的下调或失活，导致失去肿瘤特异性疫苗诱导的反应。肿瘤细胞还可以通过获得性遗传改变来抵抗T细胞的细胞毒性，这些改变限制了肿瘤细胞对细胞因子的敏感性，包括IFN-g和TNF-a，或通过表达抑制CD8+ T细胞的配体。肿瘤细胞也可能利用策略将T细胞排除在肿瘤微环境之外，例如通过激活β-catenin信号或PTEN的丢失。这些策略在治疗性疫苗的抗性中可能起主要作用，而不是针对初级或二级癌症预防的疫苗接种。 8.3.宿主因素 由于有效的疫苗需要能够产生并持久维持疫苗诱导细胞的宿主，癌症发展和治疗过程中获得的宿主损害可能会改变疫苗诱导细胞的动态和功能，并导致疫苗失败。考虑到最佳疫苗接种应该在最适合的宿主中进行——例如在疾病最轻微的宿主中进行辅助疫苗接种——任何和所有接种前的治疗，包括化疗（新辅助或辅助）、手术和其他治疗，可能会影响宿主的健康状况、疫苗接种潜力以及疫苗诱导的免疫细胞的动态和功能。事实上，接种前的治疗可能会影响B细胞和对SARS-CoV-2 RNA疫苗的抗体反应，类似的接种前治疗可能会影响T细胞。一致地，接种前使用类固醇可能会影响疫苗诱导的T细胞，但某些化疗似乎不会，这表明特定治疗可能会不同地影响疫苗诱导的免疫。由于淋巴区域对于产生强烈的疫苗诱导免疫至关重要，完整、功能性的淋巴结区域的存在可能会影响宿主产生高强度免疫的能力，因为有观察表明，如果脾切除术先于静脉注射RNA-LPX新抗原疫苗，反应会减弱。疫苗诱导的T细胞也可能随着时间的推移通过频率或功能的丧失而失去功能。 9.展望 尽管在对抗传染病方面取得了巨大成功，但针对癌症的疫苗尚未成为现实。然而，RNA技术的进步，加上在抗原发现和临床传递方面的科学突破，极大地增强了人们对癌症疫苗的兴趣，临床试验现在涵盖了各种癌症。随着这些试验似乎准备实现教会宿主免疫系统识别改变的自我这一持久的追求，新型RNA传递平台（如环状RNA和自扩增RNA）的技术加速将开辟新的疫苗接种途径。然而，由于任何成功疫苗的基本组成部分是最佳抗原，迭代改进新抗原选择策略对于成功推进临床疫苗接种至关重要。尽管目前源自体细胞突变的新抗原疫苗仍然是“个性化”的——因为大多数新抗原出现在有限的基因组范围内——迭代映射癌症突变组可能会开辟新的可能性，例如用于预防性疫苗的新抗原库和多价疫苗以防止克隆逃逸。

干扰素(IFN)通过诱导干扰素刺激基因(ISGs)参与宿主的抗病毒反应。然而，它们的作用靶点和作用机制尚不清楚。2024年4月13日，武汉大学舒红兵、姚镜、钟波及林丹丹等合作在Cell Reports 在线发表题为“Viral infection and spread are inhibited by the polyubiquitination and downregulation of TRPV2 channel by the interferon-stimulated gene TRIM21”的研究论文，该研究报道了一种ISG， TRIM21，其与髓细胞中的TRPV2通道相互作用并降解，降低其表达并为宿主提供抗病毒感染的保护。此外，病毒感染通过旁分泌和自分泌方式上调TRIM21，下调邻近细胞中的TRPV2，以防止病毒传播到未感染的细胞。同样，Trim21-/-小鼠比Trim21+/+幼崽更容易感染HSV-1和VSV，而Trim21+/+幼崽通过抑制或删除TRPV2来挽救病毒易感性。机制上，TRIM21在Lys295位点催化TRPV2的K48连锁泛素化。TRPV2K295R对病毒感染诱导的TRIM21依赖性泛素化和降解具有抗性，当重组为Lyz2-Cre;Trpv2fl/fl骨髓细胞时，比野生型TRPV2更深刻地促进病毒感染。这些发现表明靶向TRIM21-TRPV2轴是控制病毒向旁观者细胞扩散的有利策略。病毒是严重威胁人类健康和生命安全的绝对细胞“寄生虫”。病毒成功进入宿主细胞是病毒生命周期的关键初始步骤，靶向宿主细胞蛋白干扰病毒进入已成为病毒性疾病的新兴治疗策略。病毒通常劫持宿主细胞膜上的各种受体或离子通道蛋白以进入宿主细胞。例如，在HSV-1进入过程中，由Orail/STIM1介导的钙内流触发TRPC1在细胞膜上积聚，从而促进HSV-1大量进入细胞。此外，已经报道了TRPV2介导的Ca2+通透性控制质膜(PM)的流动性和机械力，以促进病毒进入髓细胞TRPV2是一个多模态离子通道，参与多种生理和病理过程，TRPV2的活性或稳定性通过多种翻译后修饰受到关键调控。最近的研究表明，JAK1-和PTPN1介导的TRPV2在Tyr335/471/525上的相互磷酸化和去磷酸化对其活性和巨噬细胞的吞噬能力起着关键的调节作用，TRPV2的Met528/607氧化增强了其通道功能此外，脂筏相关蛋白flotilin-1与TRPV2通道的表面水平相互作用并维持其水平病毒感染还会诱发一系列广泛的防御机制，以保护宿主细胞免受进一步感染。然而，TRPV2是否以及如何在髓细胞病毒感染过程中受到调节，以及这种调节在抗病毒应答中的意义尚不清楚。入侵的病毒被宿主模式识别受体(PRRs)检测到，触发一系列信号级联，诱导下游基因的表达，包括I型干扰素(IFNs)。I型IFNs以自分泌和旁分泌的方式结合IFNAR1和IFNAR2，激活细胞内激酶(JAK1, JAK2, TYK2)，使转录因子STAT1和STAT2磷酸化。激活的转录因子转位进入细胞核，诱导大量IFNs刺激基因(ISGs)的转录ISGs的产物通过干扰病毒的生命周期、诱导细胞死亡或生长抑制或激活先天和适应性免疫细胞来抑制病毒复制。例如，包括USP25、OTUD4和INKIT在内的多个ISGs可调节prr启动的信号传导并严格调节细胞抗病毒反应。模式图（Credit: Cell Reports）TRIM21是一种ISG，参与多种生理或病理过程，包括癌症、代谢、自噬和抗病毒免疫。TRIM21是一种细胞内Fc受体，与免疫球蛋白包被病毒结合并中和病毒以抑制病毒复制。此外，TRIM21还可调节细胞内PRR介导的信号传导，积极或消极地调节抗病毒反应。TRIM21的PM定位参与细胞抗病毒反应的作用和机制仍有待研究。该研究确定TRIM21是一个与TRPV2相互作用的E3泛素连接酶。TRIM21与TRPV2组成性相互作用，在Lys295位点催化TRPV2的K48连锁泛素化，从而促进TRPV2的蛋白酶体依赖性降解。该研究发现病毒感染通过I型IFNs诱导TRIM21在感染细胞(通过自分泌信号)和旁观者细胞(通过旁分泌信号)中上调，随后导致TRPV2的降解和病毒感染的抑制。此外，与Trim21+/+胎仔相比，Trim21-/-小鼠对HSV-1和VSV感染过敏。Trim21-/-小鼠对HSV-1或VSV感染的这种超敏反应可以通过TRPV2抑制剂SKF96365或髓细胞特异性删除TRPV2来恢复，这表明TRPV2是Trim21在小鼠宿主防御病毒感染中的关键下游靶点。总之，该研究结果强调了TRIM21-TRPV2轴是宿主细胞预防病毒感染的有效策略，并为针对病毒感染相关疾病的治疗干预提供了潜在的靶点。原文链接：https://doi-org.libproxy1.nus.edu.sg/10.1016/j.celrep.2024.114095来源：iNature、生物探索识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。