IFITM3

今天小编给大家解读一篇2月发表在Journal of Hepatology杂志（IF：25.7/Q1）的文章“Single cell landscape of functionally cured chronic hepatitis B patients reveals activation of innate and altered CD4-CTL-driven adaptive immunity”。在本文中作者结合单细胞数据、流式细胞术和免疫荧光，阐明与慢性乙型肝炎（CHB）和功能治愈（FC）患者相关的免疫病理细胞状态。背景慢性乙型肝炎(CHB)病毒感染影响2.57亿人，主要在亚太地区和非洲地区，每年估计有80万人死于肝硬化和肝癌。慢性乙型肝炎患者很难彻底治愈和清除病毒感染，在患者血清中出现或不出现抗HBs抗体的情况下，病毒表面抗原(HBsAg)的丧失，也叫功能治愈(FC)。病毒感染的清除在很大程度上取决于强大和持久的适应性免疫反应。病毒特异性CD8 T细胞参与急性乙肝病毒感染。然在慢性乙肝患者中，乙肝病毒特异的CD8 T细胞最终耗尽。最近的研究表明，适应性免疫反应的损害除了高抗原负荷外，还与暴露于病毒抗原的时间有关。先天免疫反应在慢性乙型病毒性肝炎中的具体作用仍存在争议，且相对知之甚少。先天免疫反应通常被认为是慢性乙肝患者的功能受损。最近一项研究发现了一种特定的Kupffer细胞(KC)亚群，该细胞在IL2的存在下重新激活了乙肝病毒特异性CD8 T细胞的抗病毒功能。此外，其他研究表明，NK细胞细胞毒活性的增强与肝脏炎症之间存在正相关关系，尤其是在核苷类似物(NA)治疗后清除乙肝表面抗原的患者中。这些研究暗示了先天免疫细胞在慢性乙肝的解决中的潜在功能。尽管最近的研究已经通过不同测序方法探索了CHB不同阶段的肝脏环境的动态情况，但FC患者的疾病相关细胞状态(DAC)仍然难以捉摸。在本文中，作者主要目的是探索持续控制乙肝表面抗原丢失的机制基础。同时用scRNA-seq和多参数流式细胞术检测了每例肝穿刺活检的核心细胞和匹配的PBMCs，并分离了CHB患者或已实现功能性治愈的患者。通过对转录组谱、推断的细胞间相互作用和基于流式细胞术的验证研究的系统分析，作者发现了不同的免疫和上皮细胞状态，如CD4-CTL、NK细胞、中性粒细胞和表达MHC-II类分子的肝细胞，这些细胞可能在FC患者实现和维持HBsAg持续丢失中发挥重要功能。此外，作者首次提供了FC患者中存在cccDNA的直接证据。结果CHB和FC患者肝脏和PBMCs的单细胞图谱作者将CHB患者分为治疗组(n=29)和未治疗组(n=29)，其中检测到病毒HBsAg, CHB患者达到FC (n=9)。FC患者在治疗后(n=7)或自发(n=2)显示病毒HBsAg清除，并在HBsAg消失后7 ~ 84个月进行分析。作者对肝脏活检和患者匹配的PBMCs中分离出的细胞进行了scRNA-seq，以及多参数流式细胞术。并利用多重免疫荧光(mIF)染色和图像分析对来自同一肝活检的组织切片进行了验证研究（图1A）。为了重点分析免疫细胞亚群和HBV特异性T细胞的表型，CHB患者根据其定量HBsAg (qHBsAg)进行分层，高(>10000 IU/ml)，中(1000-10000 IU/ml)，和低(0.05-1000 IU/ml)（表1）。 表1：样本的EASL指南图1 CHB和FC患者的肝脏单细胞转录组图谱和匹配的PBMCs肝脏中适应性和固有免疫细胞的组成有明显的变化CHB (n=15)和FC (n=8)患者的单细胞转录组分析在肝内捕获了47109个细胞，包括26种不同的主要细胞类型/状态，分别是上皮细胞(肝细胞和胆管细胞)、免疫细胞(T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、中性粒细胞和肥大细胞)、内皮细胞和星状细胞(图1B)。PBMCs主要由17种不同免疫细胞亚型(主要包括T、NK、单核细胞、DCs和B细胞以及干细胞和中性粒细胞)构成(图1E)。FC患者肝内环境中T细胞显著减少，同时NK细胞和中性粒细胞增加(图1D)。而这一现象在PBMCs种并未观察到(图1G)。流式细胞术(图1H)也证实FC患者肝活检中T细胞的减少和NK/NK T细胞群的增加，而外周血则没有这种类似的改变(图1-I)。总体而言，这些观察结果提示，功能治愈的患者肝脏内的免疫细胞组成可能存在特定变化，而这些变化可能并不总是准确地反映在PBMCs中。FC患者表现为CD8 T细胞耗竭减少并出现CD4相关的适应性免疫应答接下来作者细分了主要的T细胞和NK细胞簇，然后对这些细胞类型进行重新聚类(图2A-A’)。确定了不同的细胞亚型，包括CD4辅助性T细胞、CD4细胞毒性T细胞或CD4-CTLs 、CD8效应T细胞、耗竭的CD8 T细胞、CD8记忆T细胞、Treg 细胞、肝脏常驻NK或LR-NK、常规NK或cNK 细胞以及NK T细胞。FC患者中，耗竭的PDCD1+CD8 T细胞显著减少，FOXP3+Treg几乎完全缺失(图2A-D)。耗竭标志物如TIGIT、LAG3和PDCD1在FC患者中显著降低(图2C-D)。而且这种图变化主要反映在肝脏而非PBMCs。与CHB患者相比，FC患者的FOXP3+ Treg频率下降，在肝脏中更明显(图2C)。对肝脏CD8 T细胞进行流式细胞术分析也显示，在FC患者中，PD1+和TIM3+耗竭CD8 T细胞的频率显著较低(图2E)。这不仅体现在CD69+组织驻留CD8 T细胞中，也体现在转运CD69- T细胞中。根据qHBsAg水平对CHB患者进行分层表明，耗竭CD8 T细胞的减少与qHBsAg的减少相关(图2E)。FC的患者中伴随着耗竭的CD8 T细胞和Treg细胞的丢失，CD4-CTL细胞数量增加（表达效应毒性淋巴细胞相关标志物PRF1、GZMA、GZMK、TNF、NCR3）(图2 F-F’)。此外，这些CD4-CTLs表达与终末分化、抗原敏感的CD4 T细胞(IL7R, KLRG1)相关的标记物，这些标记物显示出独特的炎症和细胞毒性效应细胞特征，包括肿瘤坏死因子(TNF)。同时它们也表达NCR3基因，类似于NK样细胞的特征（图2F, F）。流式细胞术分析显示，在组织驻留(CD69+)和转化(CD69-) T细胞中，KLRG1+ CD4 T细胞的频率均增加(图2F”)。低qHBsAg组CHB患者外周血中CD4+KLRG1+细胞比例显著高于高qHBsAg组。如图2G-G'所示，与高qHBsAg患者相比，低qHBsAg患者KLRG1+ CD4细胞中颗粒酶B和穿孔素的表达增加约2-3倍，进一步证实了qHBsAg的丢失可能与CD4-CTL的出现有关。RNA velocity 分析表明，FC患者CD4-CTL的出现和增加很可能是由naïve CD4细胞分化而来(图2H)。轨迹分析也揭示了CD4-CTL和传统CD8 T细胞之间存在明确界限。作者鉴定了两种CD8 T细胞亚群：一种细胞主要在CHB中，也产生耗竭的CD8 T细胞，以PDCD1、LAG3和TIGIT的表达为标志(图2C, D)。FC的标志是耗竭的CD8 T细胞簇明显消失。剩余的CD8 T细胞亚群向NKT和cNK细胞转变。在CMV暴露的情况下也观察到类似的观察结果，CD8 T细胞表现出先天样特征，这归因于BCL11B表达缺失。cNK和NKT细胞簇在FC患者的LR-NK细胞中增加，这表明从CD8到NKT或cNK到LR-NK的转变可能促进固有免疫激活状态。总之，这些数据表明存在与CD4-CTL表达效应蛋白(PRF1, GZMA, IFNG, TNF)和通路(如IL2, STAT5)相关的适应性免疫应答改变。也强调了T细胞的可塑性以获得先天样特征功能。图2 FC患者表现出Tregs缺失、CD8 T细胞耗竭以及cd4相关适应性免疫反应的出现抗原特异性CD4 T细胞在FC患者中作为病毒清除的关键调节因子接下来，作者利用流式细胞术全面表征并比较了在CHB患者(n=17)和FC患者(n=6)肝脏和PBMCs中发现的CD8和CD4 T细胞群的表型。HBV DNA水平和qHBsAg水平之间有很强的正相关。组织驻留(CD69+) CD4和CD8 T细胞显示了记忆样T细胞(CD127+)频率的增加，以及衰老(CD57+)和终末分化(HLADR+)标志物的丧失。这些观察结果再次表明，不仅在免疫表型变化的稳健性方面，而且在两种组织类型(肝脏与PBMCs)之间观察到的模式方面存在显著差异。耗竭和衰老的丧失，加上记忆样T细胞的增加，提示FC患者在缺乏病毒抗原的情况下，CD4和CD8 T细胞的效应表型和增殖能力增加（补充图1C-E）。这些观察结果表明，FC患者耗竭和衰老的丧失，加上记忆样T细胞的增加，提示FC患者在缺乏病毒抗原的情况下，CD4和CD8 T细胞的效应表型和增殖能力增加。补充图1在HBV感染的自然史中，HBV特异性T细胞，尤其是CD8 T细胞与病毒控制相关。作者询问HBV特异性T细胞应答在CHB和FC患者之间是否有差异。利用酶联免疫斑点技术（Enzyme Linked Immunospot Assay,  ELISpot）对HBV特异性T细胞进行去卷积，发现慢性乙型肝炎患者和FC患者的HBV特异性T细胞应答均具有肽-特异性（peptide-specific）。通过细胞内细胞因子染色进行的进一步分析表明，在出现FC的患者中，HBV特异性T细胞主要包含在CD4 T细胞群中，而HBs-特异性CD4 T细胞的出现频率高于相应的CD8 T细胞(图2I)。在所有CHB患者中均发现了核心和HBx-特异性CD8 T细胞，但频率较低(无论qHBsAg水平如何，图2I)。FC患者的pol和HBs特异性CD8 T细胞明显增加。HBV特异性CD4 T细胞(主要是pol和HBs特异性)只在出现FC的患者中观察到(图2I)，这提示在功能性治愈的长期维持中，某些肽-特异性（peptide-specific）T细胞的稳健效应功能具有重要意义。肝内NK细胞在FC患者中表现为启动状态除了CD4-CTLs的增加外，FC患者还表现出经典固有免疫应答的增加。肝脏scRNA-seq数据的分析显示，LR-NK细胞显著增加(图3A-A′)，这些细胞被认为通过分泌细胞因子和参与与各种类型细胞的信号相互作用(如招募DCs到炎症部位，促进抗原交叉呈递，从而重塑肝脏环境。FCGR3A+传统NK (cNK)细胞直接参与抗体依赖性细胞毒性(ADCC)，并且可促进抗病毒T细胞应答，在FC患者中也显示出轻度增加(图3A-A′)。LR-NK细胞和cNK细胞的免疫效应功能均增加，并具有细胞因子-趋化因子分泌特异性（图3B-C）。此外，肝脏中流式细胞术分析显示，随着qHBsAg水平的下降，CXCR6+ CD69+ NK簇逐渐富集(图3D)。在FC患者中，这些细胞中激活性受体(NKp46、CD38、NKG2D和TRAIL)的表达升高和抑制性受体(如PD1和TIM3)表达降低(图3D’-D’’)。在早期的研究中已经报道过CXCR6+ CD69+ NK细胞是scRNA-seq分析中确定的LR-NK细胞的代表。也就是说，部分FC患者的LR-NK细胞还表现出其他抑制性受体的中高表达，如PD1和LAG3(图3D’-D’’)。基于这些标志物，作者确定了CD69+ CXCR6high CD16-(图3D' )和CD69+ CXCR6low CD16+(图3D' )细胞亚群，这些细胞随着HBsAg水平下降而出现，并在FC中富集。作者还发现了另一个由CD69+CXCR6- CD16-标记的细胞群，该细胞中qHBsAg水平较低(图3D'-3D'')。总之，多参数流式细胞术数据表明，组织驻留的NK细胞的效应细胞毒性功能必须被活化和抑制受体的平衡表达仔细调节。图3 FC患者表现出肝内NK细胞的预激状态FC患者肝内髓样环境重塑为免疫活跃状态以上数据表明FC患者的肝脏逐渐向免疫激活状态转变。为了了解患者的全身免疫反应，作者通过Luminex分析了血浆细胞因子、趋化因子和可溶性受体。血浆分析显示，促炎细胞因子和趋化因子如IL -1 β， ENA-78 (CXCL5)， BAFF和MCP-1 (CCL2)逐渐增加，而qHBsAg水平降低。其中，ENA-78是一种上皮中性粒细胞吸引蛋白，已知由内皮细胞产生，募集中性粒细胞、T细胞、B细胞和嗜酸性粒细胞到肝脏，这表明FC患者的低度炎症。中性粒细胞是构成抵御病原体第一道防线的肝内髓系细胞群的关键组成部分。越来越多的证据表明，中性粒细胞可作为固有免疫的长期调节剂，并在病毒感染和消退期间改变免疫环境中发挥作用。因此，作者探索了中性粒细胞的性质和组成在CHB和FC患者的全血和肝室中的变化。如图4A和A'所示，FC患者的全血总体中性粒细胞频率较低。然而，cluster 4(图4A和A′′cl4)显示的成熟亚群似乎在FC患者中频率增加。在不同的全血中性粒细胞亚群中， FC患者的中性粒细胞募集标志物(如CXCR2、CXCL8、CEBPB、NCF和NAMPT)总体下降。然而，在FC患者中，全血cl4中性粒细胞显示出高水平的DUSP1、PTGS2、CEBPB、ISG15、IFIT3、IFITM1和IFITM3的表达(图4B)。与CHB患者相比，FC患者上调的通路显示了通过NFkB、干扰素应答、细胞因子产生的调节、对病毒和模式识别受体通路的应答增加(图4B'和B')。FC患者的肝室中中性粒细胞数量高于CHB患者(图4C-C”)。中性粒细胞的富集可能是由于在肺部疾病和其他组织中经常观察到的中性粒细胞浸润和边集现。此外， 中性粒细胞和内皮细胞的CXCR4-CXCL12相互作用增加，CXCR1/2-CXCL2相互作用减少(图4D)，这意味着在功能治愈的患者中，中性粒细胞运输增加，并且它们长期驻留在肝脏内。FC中性粒细胞中干扰素刺激基因(ISG)的减少表明，它们可能不再积极地参与诱导先天应答(图4E)。然而，这些细胞在病毒再激活过程中反复暴露的情况下，仍有能力分泌关键细胞因子给信号效应细胞(CD4/CD8 T细胞，NK细胞)以清除病毒。此外，作者还分析了MacParland等人整合的健康肝脏中的髓系细胞中炎症基因的表达，并将其与作者自己的scRNA-seq数据进行了比较。FC患者的髓系细胞显示出不同水平的促炎和免疫活性基因(IL1B, TNF, IFNG, TGFB1, NFKB1, IL6和CD80)，而抗炎基因，如IL10的表达似乎在FC患者中比CHB和健康肝脏低得多。此外，髓系细胞的单细胞谱也提示，FC患者的肝脏环境发生了明显的重塑，转变为免疫活动状态。流式细胞术分析证实，FC患者肝脏内的CD14+促炎单核细胞增加，表明存在低级别免疫应答的生态系统。CellPhoneDB分析显示，DC2和FOLR2/VSIG4 KC群体与CD4-CTLs和记忆样CD8细胞均显示出稳健的相互作用(补充图2E-E”)，因此提示它们在诱导主动免疫应答方面的假定功能。总之，这些数据强调了髓系细胞在调节从抗炎环境向免疫活性环境的转变方面的重要功能，其机制可能是通过FOLR2/VSIG4 KCs调节增加的病毒抗原呈递和效应细胞的再教育。重要的是，这些结果强调了中性粒细胞作为FC患者持续病毒清除的重要介质的重要作用，并进一步支持增强的固有免疫反应可能在实现功能性治愈中发挥重要作用的假设。补充图2图4 FC患者肝脏内存在边缘中性粒细胞图5 功能性治愈患者肝细胞中MHC II类分子表达增加FC患者肝细胞表达MHC-IIFC患者肝脏中的免疫细胞谱显示肝脏环境中存在促炎开关，通过LR-NK，cNK和中性粒细胞增加固有免疫应答；通过特异性KCs促进CD4和CD8 T细胞的抗原呈递；以及CD4-CTLs的出现，这些CTL可以被促炎刺激(IL2, TNF, IFNG)激活，并由KC培养。目前的关键问题是，在功能性治愈患者中，CD4-CTL或HBV特异性T细胞如何有效靶向呈递病毒抗原的肝细胞。在这项研究中，作者成功地从15例CHB和8例FC患者中提取了足够数量的肝细胞(n~1850)。肝细胞亚群(图5A-A′′)似乎与FC患者特异性相关。除了HLA-A、HLAB和HLA-C表达外，MHC Il类分子(包括HLA-DPA1、HLA-DPB1、HLA-DRA、HLA-DRB1、CD74和CTSS)也高表达(图5B、C)。总体而言，与CHB患者相比，FC患者中MHC I/MHC ll值较低的肝细胞数量较多。据报道，干扰素治疗可在体外肝细胞(HepG2-NTCP和PHH)和体内小鼠模型中诱导MHC Il类分子表达。通路分析显示，在MHC ll高的肝细胞中，细胞质翻译、抗原呈递和处理、凋亡、白细胞分化信号和淋巴细胞活化等增加(图5D)。在CellPhoneDB分析中，与CHB患者相比，FC患者中肝细胞与LR-NK或CD4-CTLs之间的HLA-C-FAM3C、EGFR-MIF、EGFR-COPA的相互作用减少，而XCR1-XCL1/2、HLA-DPA1-TNFSF9、CD74-COPA、CD74-MIF的相互作用增加(图5E-F)。即使在NUC+/-IFNa治疗后HBsAg仍然为阳性的患者(表1)，与FC (Sloss)患者相比，MHC Il基因(HLA-DRA、HLADRB1、HLA-DPB1)的表达显著减少(图5G)。与此同时，与FC患者相比，接受治疗的非sloss (NSLoss)患者还表现出功能障碍、耗竭的CD4-CTL其效应蛋白(如GZMA、PRF1和TNF)的表达水平较低(图5H)，同时检查点基因(包括PDCD1)的表达水平显著较高(图5H’)。总之，MHC ll高的肝细胞与LR-NKs细胞和活化的CD4-CTL之间的相互作用增强，可能触发靶向免疫应答，从而维持对CHB的长期控制。作者猜想是否有低水平的残留HBsAg由整合DNA合成，或极低水平的残留活性cccDNA可能被anti-HBs抗体掩盖，因此不容易被qHBsAg检测法检出。通过数字微流控PCR对FC患者进行的病毒学研究显示，与CHB相比，FC患者的肝活检中cccDNA水平低50倍，但持续存在(图6A)。此外，尽管FC患者的cccDNA、HBV DNA(图6B)和3.5kb HBV RNA水平较低，但FC患者的3.5kb HBV RNA与cccDNA的比值与CHB患者相似(图6 C-D)。此外，利用HBV-bait捕获富集的病毒序列的单细胞cDNA扩增(sccDNA)证实了数字微流控PCR的结果(图6E-H)。具体来说，在映射到与患者匹配的病毒基因型(图6E-H)后，病毒转录本在CHB(图6E, F)和FC(图6G,H)肝细胞中均有表达。正如预期的那样，从FC样本分离的肝细胞中病毒转录水平比CHB低100-1000倍。总之，这些数据表明，FC患者的残留cccDNA可被积极转录，以支持少量肝细胞内低水平的持续病毒复制。图6 FC患者肝细胞内存在低水平的cccDNA和病毒转录物总结在这项工作中，作者使用了多种方法包括单细胞测序、流式细胞术、ELISpot、细胞内细胞因子染色等等，主要研究了乙肝患者不同治疗结局中的免疫病理标志以及潜在的机制。文章的亮点之一就是数据，作者的患者数据非常丰富,不仅有不同乙肝患者而且测了肝脏组织以及样本匹配的PBMCs。通过单细胞分析肝组织和相匹配患者的PBMCs中疾病相关细胞状态研究，以此来为非功能性治愈患者的潜在机制提供新的见解。另外的一个亮点是，虽然文章以生物信息分析为主，但使用了非常多的湿实验手段，来证明生信分析的结果。识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

异柠檬酸脱氢酶野生型高级别胶质瘤（isocitrate dehydrogenase wild type glioma, IDH-WT glioma）具有高度侵袭性，患者预后差。目前治疗胶质瘤的标准疗法包括手术切除、放疗和化疗，但这些传统疗法很少能治愈这种疾病。高级别胶质瘤肿瘤免疫微环境（tumor microenvironment, TME）中通常缺乏肿瘤浸润淋巴细胞（tumor-infiltrating lymphocytes）以及具备有大量的免疫抑制性髓样细胞（immunosuppressive myeloid cells），被认为是一种免疫冷肿瘤，这样的免疫抑制微环境组成使得当前新兴的肿瘤免疫治疗策略在胶质瘤治疗上也难以发挥良好的作用。因此，准确且全面地揭示肿瘤免疫微环境并检测其中的免疫细胞状态和基因表达的动态变化，将为胶质瘤免疫治疗提供新的靶点和策略。近年来，随着单细胞测序技术的飞速发展，已经能实现对于复杂肿瘤微环境中的免疫细胞状态鉴定以及基因表达的动态变化检测。基于此项技术，多个研究团队已对胶质瘤中不同的肿瘤细胞亚型或是浸润的免疫细胞类型进行了初步分类鉴定。然而，大多数研究都集中在肿瘤细胞与免疫细胞之间的相互作用和影响上，而缺失了不同免疫细胞类型之间的细胞间相互作用所带来的影响。此外，因缺乏相应病人自体的非肿瘤环境中的免疫细胞作为对照组，现存研究也难以细致准确的评估肿瘤细胞特异的免疫调控作用。近日，西湖大学生命科学学院谢琦研究员，联合浙二医院神经外科祝向东主任、华山医院神经外科秦智勇主任，在Cancer Immunology Research上发表题为“Single-cell transcriptomics reveals the heterogeneity of the immune landscape of IDH-wildtype high-grade gliomas”的研究论文，利用单细胞转录组测序技术，对IDH-野生型高级别胶质瘤肿瘤浸润的免疫细胞和配对的外周血单核细胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMC）的免疫景观进行了深入的分析，并且发现了胶质瘤免疫治疗的潜在靶点。该项研究整合了九对来自肿瘤组织浸润的免疫细胞及相匹配PBMC的单细胞转录组图景，确定了肿瘤中具备高促瘤发生特征的两个肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages, TAM）的亚群，以及通过T cell轨迹分析以及体内体外实验验证确定芳基烃受体（aryl hydrocarbon receptor, AHR）是T cell功能障碍的调节因子，并对肿瘤微环境相较于PBMC中存在的独特免疫细胞配体-受体相互作用介导的细胞间通讯进行了鉴定。该研究对九对高级别IDH-野生型胶质瘤患者的肿瘤组织浸润的免疫细胞以及相匹配的PBMC细胞进行了单细胞转录组测序，分别获得了53,843个肿瘤浸润的免疫细胞和53,229个PBMC单细胞。通过单细胞数据分析，识别了多种淋巴细胞和髓系细胞亚群。通过GBM肿瘤与PBMC的各个细胞类型的比例计算，该研究揭示了Macrophage和DC在肿瘤浸润的免疫细胞中的比例较高，而T cell, B cell和NK cell的比例则占比较低（图1）。图1.肿瘤浸润的免疫细胞及其配对PBMC的免疫细胞图谱该研究进一步对于肿瘤内浸润的两个主要的TAM群体单核细胞来源的巨噬细胞（monocyte-derived macrophages, MDMs）和脑内小胶质细胞（brain-resident microglia, MG）进行分析。MDMs和MG可进一步聚类为三个亚群，其中MDM-1高表达干扰素相关基因（IFITM3、ISG1、TNF和LY6E），MDM-2高表达抗原呈递相关基因（HLA-DMA、HLA-DMB和HLA_DQA2），而MDM-3高表达缺氧反应基因（MIF、ENO1、ALDOA、LDHA和EPAS1）；MG-1高表达趋化因子相关基因（CCL4、CCL4L2、CCL3、CCL3L1和SPP1)、MG-2高表达应激反应基因（HSPA6、HAPA1A、HSPA1B和DNAJB1）和MG-3则高表达干扰素相关基因（IFI27、IFI6、MIX1和IFI44L）。通过在不同的TAMs亚群中评估血管生成和吞噬基因表达，该研究发现MDM-3和MG-1中表现出较强的血管生成特征，而MDM-1和MG-3中表现出较高的吞噬作用特征。图2.TAMs的亚群分类以及功能通路富集基于对于肿瘤内浸润的CD8+T cell的轨迹分析，该研究发现转录因子AHR在CD8_Stress态和CD8_Exhaustion 俩终末端状态中均高度表达。该研究进一步通过在CRISPR/Cas9 技术敲除CAR T细胞中的AHR，体内和体外实验验证了敲除AHR可以抑制T细胞的耗竭，上调IFNγ分泌，从而增加其对于胶质瘤的杀伤能力，延长菏瘤小鼠的中位生存期，提示AHR可以作为改进胶质瘤的CAR T疗法的潜在靶点。图3.AHR敲除促进T cell的抗肿瘤能力综上所述，该研究描绘了IDH野生型高级别胶质瘤浸润的免疫细胞和其配对的PBMC的免疫景观的异质性，为改进胶质瘤的免疫治疗策略提供了新的线索。本文仅用于学术分享，转载请注明出处。若有侵权，请联系微信：bioonSir 删除或修改！

我们都知道，病毒无法脱离宿主细胞而存活，如果想要拷贝自己的遗传物质，就需要进入宿主细胞，并借助宿主细胞的DNA或RNA合成、加工工具。不同病毒侵入细胞的方式不同，但大都需要通过结合至细胞表面特定的受体蛋白或脂质结构来实现细胞内化，如果能够阻断这些机制的发生，将有可能开发出预防感染的新方法。比如甲型流感病毒，是通过病毒表面的血凝素（hemagglutinin，HA）与呼吸道上皮细胞的唾液酸受体结合，吸附于上皮细胞表面，然后再通过内吞作用进入细胞，随后H+经病毒的另一种跨膜蛋白——M2离子通道——进入病毒颗粒内，导致病毒内部pH值改变，HA构象改变并暴露出融合肽，使得病毒与包裹病毒的囊泡发生膜融合，病毒内部的组分因此释放出来，开启后续的转录与复制过程。新冠病毒则有两种不同的进入细胞的途径。其一是通过衣壳上的棘突蛋白（S蛋白）与人体细胞表面的ACE2（血管紧张素转换酶2）受体结合成复合物，并在网格蛋白的介导下通过内吞作用进入细胞。之后，人体细胞中的蛋白酶将会切割S蛋白，暴露出S蛋白的内层结构S2以及S2’。S2可促使病毒与包裹病毒的囊泡发生膜融合，暴露出病毒的遗传物质并开始复制。另一种途径是当人体细胞表面还有TMPRSS2（跨膜丝氨酸蛋白酶2）存在时，在细胞表面就可对S2’位点进行切割，因此在质膜处，病毒与宿主细胞就可以发生膜融合，并释放出遗传物质。图1 新冠病毒的两种进入途径（图源：[2]）具有高度传染性的埃博拉病毒是一种丝状病毒体，其进入宿主细胞主要是通过宿主细胞非特异性的巨胞饮作用或网格蛋白介导的内吞作用。随后，在宿主细胞表面受体或低pH环境的影响下，病毒表面的三聚糖蛋白（GP）被激活，启动病毒与包裹病毒的囊泡之间的膜融合。图2 埃博拉病毒进入细胞（图源：[4]）由此可见，膜融合可以算是各种病毒将遗传物质释放到细胞内的“最后临门一脚”。膜融合的过程中，融合孔的形成提供了病毒遗传物质释放的“隧道”。如果能够阻止这一步的发生，就有可能预防病毒的感染。事实上，人体的免疫系统也有朝着这个方向进行努力。当受感染的细胞感知到外来基因组的存在，就会向未感染的细胞发送干扰素分子进行“通知”。干扰素会诱使“接到通知”的细胞产生一种名为IFITM3（interferon induced transmembrane protein 3，干扰素诱导跨膜蛋白3）的蛋白，而这种特殊的蛋白能够有效地阻止甲型流感病毒、新冠病毒和埃博拉病毒等的侵入。然而，这种蛋白的作用机制尚不明了。为此，海德堡大学的研究人员使用低温电子断层扫描计算机模拟研究了病毒渗透的最后阶段。他们发现，IFITM3能够选择性地对囊泡膜中的脂质进行分选，这改变了囊泡膜的局部脂质组成，进而阻止了融合孔的形成。相关成果以“IFITM3 blocks influenza virus entry by sorting lipids and stabilizing hemifusion”为题发表于Cell Host & Microbe。图3 研究成果（图源：[5]）研究表明，IFITM3不会影响病毒膜和囊泡膜的融合以及脂质的混合，但是会对胆固醇产生排斥，因此，胆固醇会向无IFITM3的区域富集，原本胆固醇所在的位置则被具有相对正向曲率的脂质取代，这会导致膜中张力的变化，阻碍融合孔的形成。没有了大门，病毒会被一直困在囊泡“牢笼”中，直到被内体-溶酶体系统中的蛋白酶和脂肪酶降解。图4 IFITM3引起脂质分选（图源：[5]）研究的资深作者、海德堡大学生物量化中心和海德堡大学医院综合传染病研究中心的病毒学家Petr Chlanda博士表示：“这些病毒被脂质陷阱捕获了，然后被摧毁。”模仿这一机制，研究人员认为或许可以开发出将自身插入病毒膜的脂质分选肽，从而使病毒无法进行膜融合。“这种肽可以是喷鼻剂的形式。”Chlanda说。在另一项研究中，Chlanda率领团队研究了埃博拉病毒的最后渗透。埃博拉病毒的丝状形态是它的独特之处，这一形态受基质病毒蛋白40（VP40）决定。“我们一直对这种长病毒如何能穿透细胞并通过膜融合释放基因组感到困惑。”Chlanda说。现在，他们得到了答案。研究结果以“The Ebola virus VP40 matrix layer undergoes endosomal disassembly essential for membrane fusion”为题发表于EMBO Journal。图5 研究成果（图源：[6]）这项研究发现，VP40基质会在膜融合之前发生分解，而该过程是由囊泡内的低pH环境驱动的，这将破坏VP40蛋白和病毒膜之间的静电相互作用，导致VP40基质的分解。如果能阻止VP基质的分解，比如开发病毒基质特异性的弱碱基抑制剂，埃博拉病毒将像甲型流感病毒一样，被困在无法逃脱的陷阱中无法感染细胞。图6 低pH值驱动VP40基质分解（图源：[6]）责编|风立宵校对|风立宵End参考资料： [1]池晓娟, 王松, 黄一帆, 等. 甲型流感病毒蛋白和遗传物质在宿主细胞质内顺向转运过程及其机制. 生物工程学报, 2012, 28(9):1021−1030.[2]Jackson, C.B., Farzan, M., Chen, B. et al. Mechanisms of SARS-CoV-2 entry into cells. Nat Rev Mol Cell Biol 23, 3–20 (2022). https://doi-org.libproxy1.nus.edu.sg/10.1038/s41580-021-00418-x[3]Wang H, Shi Y, Song J, et al. Ebola Viral Glycoprotein Bound to Its Endosomal Receptor Niemann-Pick C1. Cell. 2016 Jan 14;164(1-2):258-268. doi: 10.1016/j.cell.2015.12.044.[4]Wells AI, Coyne CB. Inhibiting Ebola virus and SARS-CoV-2 entry. Science. 2020 Oct 9;370(6513):167-168. doi: 10.1126/science.abe2977. PMID: 33033203.[5]Klein S, Golani G, Lolicato F, et al. IFITM3 blocks influenza virus entry by sorting lipids and stabilizing hemifusion. Cell Host Microbe. 2023 Apr 12;31(4):616-633.e20. doi: 10.1016/j.chom.2023.03.005. Epub 2023 Mar 31. PMID: 37003257. [6]Sophie L Winter, Gonen Golani, Fabio Lolicato, et al. The Ebola virus VP40 matrix layer undergoes endosomal disassembly essential for membrane fusion. The EMBO Journal, 2023; DOI: 10.15252/embj.2023113578 本文系生物探索原创，欢迎个人转发分享。其他任何媒体、网站如需转载，须在正文前注明来源生物探索。   往期精选 围观 ‍新突破！可注射细胞疗法, 能克服骨关节炎免疫障碍，促进软骨再生！ 热文人类首个泛基因组草图公布！又多了1.19亿个碱基对，更好反映人类多样性！ 热文这种人工智能策略被引入蛋白质设计领域，或将开启蛋白质设计新时代！ 热文人工智能设计T细胞疫苗！可持久应对不断出现的新冠变异株！ 热文 确定白血病耐药性的又一机制，联合使用这种药物可以克服！ 点击“阅读原文”，了解更多~