Cyclic nucleotide-gated cation channels

▎药明康德内容团队编辑 当我们谈论起痴呆症时，往往首先联想到的是记忆、认知减退等典型症状，鲜少有人会将这种疾病与水痘相联系。然而，最新的研究结果开始颠覆我们对阿尔茨海默病（AD）和其他类型痴呆症起源的传统认知。一些研究表明，阿尔茨海默病及其它类型的痴呆症的起因或许比我们想象中更为复杂。特别是，有证据显示某些病毒感染，如水痘-带状疱疹病毒（VZV），可能在痴呆症的发展过程中发挥着重要作用。这一发现正在逐步改变我们对于这类疾病成因的传统认识。 图片来源：123RF 痴呆症通常被归类为一种神经退行性疾病，它在全球范围内影响着数以百万计的个体，且患病风险随着年龄的增长而增加。痴呆症涉及一系列认知功能的丧失，包括思维、记忆和推理能力的减退，这些认知功能的损害严重干扰了患者的日常生活和各种活动。此外，某些痴呆症患者还可能会遭遇情绪控制障碍和性格上的显著变化。 痴呆症的发生是由于大脑中的神经细胞及其连接的损伤或丧失引起的。当大脑中负责学习、记忆、决策或语言等功能区域受到感染或疾病的侵袭时，可能会触发痴呆症的发生。症状的具体表现取决于大脑中受损区域的特定位置。AD是引起痴呆症的最常见原因，但也有其他多种已知的病因，包括血管性痴呆症、路易体痴呆症、额颞叶痴呆症，以及由药物副作用或甲状腺问题等可逆因素引起的痴呆症。 图片来源：123RF 带状疱疹是由VZV引起的，据估计，几乎所有老年人的神经系统内都有这种病毒潜伏。随着年龄的增长，免疫细胞的抗感染能力逐渐减弱，为病毒的重新激活提供了可乘之机。带状疱疹病毒的再度活化会导致患者胸部、腹部或面部出现水泡，并伴有剧烈疼痛。令人惊讶的是，一些研究已经发现了带状疱疹病毒重新激活与痴呆症风险增加之间的显著关联。这些新证据不仅改变了我们对这种疾病的理解，还突出了疫苗在提供保护性益处方面的潜力，这些益处不仅限于预防感染，还有望预防痴呆症的发生。随着科学家们对病毒与痴呆症之间相互作用的研究不断深入，这些发现对于痴呆症的治疗和预防策略可能带来深远影响。 去年发布在medRxiv平台的一项预印本论文（尚未经同行审查）研究对比分析了接种/未接种带状疱疹疫苗Zostavax人群的痴呆症发生状况。科学家们发现，在为期七年的随访期内，接种Zostavax的人群中痴呆症确诊率减少了约五分之一。为了证实这一发现不是由于其他混杂因素所造成的，研究人员进行了进一步分析，结果显示接种带状疱疹疫苗仅仅与痴呆症的减少相关，而没有与任何其他常见的死亡或疾病成因有关联；接种带状疱疹疫苗也没有导致其他疫苗接种或预防性健康措施的增加。此外，探索性分析结果还表明，对于全因性痴呆和阿尔茨海默病，该疫苗的保护效果在女性当中尤为显著。 病毒感染至少在某些痴呆症病例中起作用的观点可以追溯到几十年前。但在阿尔茨海默病领域，这一观点仍然存在争议。在过去的十年中，病原体与痴呆症之间的联系逐渐得到加强，越来越多的研究人员开始更加认真地考虑这一可能性。 随着研究的深入，越来越多的科学家投身于探索病毒感染与痴呆症发生之间的关系。目前，Zostavax疫苗已在包括美国在内的许多国家和地区停用，大多数民众所接受的是带状疱疹重组蛋白疫苗Shingrix。为了验证带状疱疹疫苗在预防痴呆症方面的潜在作用，以及不同类型疫苗（Zostavax和Shingrix）之间是否存在效果差异，英国牛津大学的科学家们对美国的电子健康记录（EHR）进行了分析。这项分析涵盖了过去十年中在美国接种了Zostavax或Shingrix疫苗的20多万人的数据。具体来说，约一半的参与者在2014年10月至2017年9月期间接种了Zostavax，而其余人则在2017年11月至2020年10月期间接种了Shingrix疫苗。这项研究旨在比较这两种疫苗在预防痴呆症方面的有效性，并探讨它们在保护效果上是否存在差异。 分析结果表明，接种Shingrix的人群在随后的6年内，与接种Zostavax的人群相比，患痴呆症的风险显著降低。具体而言，接种过Shingrix的个体在无痴呆确诊时间上延长了17%，相当于延长了无痴呆状态164天。与其他两种常用于老年人的疫苗（流感疫苗和破伤风-白喉-百日咳疫苗）相比，也显示出Shingrix在降低罹患痴呆症风险方面的优越性。值得一提的是，在这项研究中，Shingrix在男性与女性个体当中均观察到痴呆预防的作用，但在女性中表现更为显著。结果发表在今年7月的《自然医学》（Nature Medicine）杂志上。 这些研究结果为带状疱疹病毒可能导致痴呆症的假设提供了更多证据。论文的通讯作者Paul Harrison博士指出：“这些结果不仅增强了带状疱疹病毒可能导致痴呆症的证据，而且也警醒人们，疫苗的作用可能不仅仅是预防感染。” 一些学者将研究重点转向了带状疱疹病毒。哈佛大学和布莱根妇女医院（Brigham and Women's Hospital）的研究人员从几项针对医疗工作者的大型、长期队列研究中提取并分析了数据。这些分析结果表明，一次带状疱疹的发作与多种远期并发症风险的增加有关，例如心脏病（包括严重的心脏事件）和中风。在针对同一队列数据的进一步研究中，研究人员还发现带状疱疹与主观认知能力下降的风险增加有关——这是阿尔茨海默病和相关痴呆症的早期症状之一。 科学家们开始在细胞和分子生物学层面探索带状疱疹病毒再激活与痴呆症风险增加之间的联系。最近，一项发表在IBRO Neuroscience Reports杂志的研究提供了新的见解。研究人员发现，当使用单纯疱疹病毒1型（HSV-1）感染未分化的人类嗅觉上皮细胞培养物时，会引起β淀粉样蛋白和环核苷酸门控通道亚基alpha 2（CNGA2，成熟嗅觉感觉神经元的标记）的表达显著增加。β淀粉样蛋白的积累可能形成神经毒性斑块，这正是阿尔茨海默病的一个标志性特征。这些发现暗示病毒感染可能会破坏嗅觉功能和海马体的下游功能，从而加速阿尔茨海默病的进展。 尽管VZV再激活与痴呆症风险增加之间的确切机制尚不明确，仍需要进一步的研究来阐明，但这一领域的研究已经激发了新的科学兴趣，并催生了多项研究。目前，一项临床2期试验（试验注册号：NCT03282916）正在进行中，旨在研究针对包括VZV在内的抗病毒药物伐昔洛韦（valacyclovir）是否能够延缓阿尔茨海默病早期患者的病情发展。该试验纳入了130名HSV-1或HSV-2检测呈阳性的轻度阿尔茨海默病患者，其中65名接受伐昔洛韦治疗，65名接受安慰剂治疗。研究人员将使用正电子发射断层成像（PET）技术来监测淀粉样蛋白积累和tau蛋白等阿尔茨海默病病理特征的变化。 随着研究人员继续探索病毒可能影响神经变性的复杂机制，我们期待他们能开发创新方法应对这一日益严峻的公共卫生挑战，最终改善数百万受认知能力下降影响的人的生活质量。 ▲欲了解更多前沿技术在生物医药产业中的应用，请长按扫描上方二维码，即可访问“药明直播间”，观看相关话题的直播讨论与精彩回放 参考资料 [1] Chickenpox, shingles, Alzheimer’s? Evidence mounts for a viral cause of dementia，Retrieved Oct 25, 2024 from https://www.statnews.com/2024/10/18/dementia-alzheimers-evidence-for-viral-cause-grows/ [2] What Is Dementia? Symptoms, Types, and Diagnosis，Retrieved Oct 25, 2024 from https://www-nia-nih-gov.libproxy1.nus.edu.sg/health/alzheimers-and-dementia/what-dementia-symptoms-types-and-diagnosis [3] Dementia，Retrieved Oct 25, 2024 from https://my.clevelandclinic.org/health/diseases/9170-dementia [4] Eyting M, Xie M, Heß S, Geldsetzer P. Causal evidence that herpes zoster vaccination prevents a proportion of dementia cases. medRxiv [Preprint]. 2023 May 25:2023.05.23.23290253. doi: 10.1101/2023.05.23.23290253. PMID: 37292746; PMCID: PMC10246135. [5] Taquet M, Dercon Q, Todd JA, Harrison PJ. The recombinant shingles vaccine is associated with lower risk of dementia. Nat Med. 2024 Jul 25. doi: 10.1038/s41591-024-03201-5. Epub ahead of print. PMID: 39053634. [6] Curhan, Sharon G et al. “Herpes Zoster and Long-Term Risk of Cardiovascular Disease.” Journal of the American Heart Association vol. 11,23 (2022): e027451. doi:10.1161/JAHA.122.027451 [7] Yeh, TS., Curhan, G.C., Yawn, B.P. et al. Herpes zoster and long-term risk of subjective cognitive decline. Alz Res Therapy 16, 180 (2024). https://doi-org.libproxy1.nus.edu.sg/10.1186/s13195-024-01511-x [8] Restrepo, Diego et al. INFECTION OF HUMAN OLFACTORY EPITHELIUM WITH ALPHAHERPESVIRUS ELICITS EXPRESSION OF BETA AMYLOID. IBRO Neuroscience Reports, Volume 15, S484 免责声明：药明康德内容团队专注介绍全球生物医药健康研究进展。本文仅作信息交流之目的，文中观点不代表药明康德立场，亦不代表药明康德支持或反对文中观点。本文也不是治疗方案推荐。如需获得治疗方案指导，请前往正规医院就诊。 版权说明：本文来自药明康德内容团队，欢迎个人转发至朋友圈，谢绝媒体或机构未经授权以任何形式转载至其他平台。转载授权请在「药明康德」微信公众号回复“转载”，获取转载须知。 分享，点赞，在看，聚焦全球生物医药健康创新

近期Signal Transduction and Targeted Therapy杂志（IF=40.5）上发表了一篇重量级AAV基因治疗综述文章（通讯作者为美国马萨诸塞大学Chan医学院的高光坪教授），深入探讨了AAV基因治疗的最新突破与未来趋势。这篇文章不仅汇聚了行业内的权威观点，更揭示了关键技术的最新动态，为学术界和产业界的创新提供了全新启发。上篇我们了解到基因治疗的背景和AAV生物学基本概念，接下来咱们继续深入剖析基因治疗递送载体AAV-载体开发。 rAAV的衣壳序列和基因组（包括启动子、外源基因、增强子和ITRs等），都在被深入研究。本篇将介绍rAAV的衣壳和基因组开发策略，以提高AAV的感染效率、组织特异性和治疗基因的表达效率。 AAV衣壳设计 衣壳设计是为不同临床应用开发定制rAAV的主要策略。它主要包括三种方法：鉴定自然存在的AAV变体、理性设计和定向进化（图1）。最近，AI辅助进化已成为rAAV衣壳设计的新工具。 图1 开发新型AAV变体的策略。a 可以从人类和小鼠等非人灵长类动物（NHP）组织中通过多轮PCR和高通量测序分离出自然存在的AAV变体。b 利用AAV生物学的知识进行合理设计，修改AAV衣壳中的相关氨基酸，以增强转导能力或逃避免疫监视。c 定向进化是一种工程方法，用于开发具有特定组织/细胞特异性的新型AAV变体，包括随机或特定的肽段插入、衣壳重组、易错PCR和饱和突变。d 通过计算机模拟方法利用已知的衣壳序列重建AAV衣壳氨基酸序列。通过对大量AAV变体转导样本数据集的学习，预测AAV基因组中特定序列与包装能力和组织靶向性之间的关系。 01 鉴定自然存在的AAV变体 在早期阶段，人体组织是发现新AAV的关键来源。从1965年到2004年，有限数量的AAV主要从人类临床样本中分离出来，随后被转化为载体并进行了测试。AAV9最初是从人类肝脏组织中发现的，但由于其能够穿越血脑屏障（BBB），且对大脑有强烈的嗜性，因此成为中枢神经系统（CNS）转导的常用载体。AAV7和AAV8是从恒河猴的心脏和淋巴结中分离出来的，对骨骼肌和肝脏有出色的嗜性。 研究表明，40-80%的人对已知的野生型AAV血清型有抗体，这强调了发现更多血清型AAV的必要性。研究人员已经在人类和非人灵长类动物之外的物种中筛选AAV血清型，以找到新的衣壳，避免人类AAV预存抗体的中和效应，但这些AAV在人类中的转导可能有限。因此，发现人类来源的AAV变体，并筛选转导效率高，具有特定组织嗜性的候选者已经成为一种常见的方法。AAVv66，一种通过长读长测序从人类样本中分离出来的AAV2变体，具有比AAV2更高的产量和CNS转导效率。这些发现表明，鉴定自然存在的AAV变体可以为改善组织特异性转导提供有价值的工具。虽然只有少数团队还在鉴定和评估自然衣壳变体作为基因治疗的潜在载体，但源自野生型AAV血清型的rAAV仍然是当前临床研究中的主要选择。 02 理性设计 理性设计方法涉及对rAAV衣壳的特定位点进行结构修改，需要对rAAV的结构和生物学有一定的理解，常用的三种关键方法包括：遗传突变、插入功能结构域以改善组织亲和力，以及化学修饰。有研究探索了特定氨基酸残基对rAAV转导效率的贡献，发现rAAV2衣壳表面的酪氨酸残基的磷酸化会导致它们在入核前被降解，而将这些残基修改为苯丙氨酸（Y444F/Y500F/Y730F）可以增加rAAV2在中枢神经系统中的基因递送效率。虽然rAAV2不能通过玻璃体内注射转导光感受器，但含有特定残基替换（Y272F/Y444F/Y500F/Y730F/T491V）的变体实现了高达25%的光感受器细胞感染。此外，改变表面暴露的残基可能实现组织去靶向，从而提高安全性。例如，在黑猩猩组织样本中发现了H527Y和R533S的替换，如果将这种替换引入至rAAV9衣壳，在新生小鼠和一种致命性儿科白质营养不良症小鼠模型中，当AAV的导入方式为静脉注射时，rAAV9在外周组织的感染更少。 另一种理性设计方法是将功能结构域引入rAAV衣壳的特定位点。一项研究通过插入人类黄体生成素受体（LH-R）的15个氨基酸结合域，成功地在卵巢癌细胞中实现了与HSPG无关的通过LH-R的转导。另一项研究通过在rAAV9衣壳中插入细胞穿透肽，成功鉴定出两种变体，它们能够在系统给药后穿越血脑屏障（BBB），并改善了中枢神经系统的感染。宿主免疫反应是rAAV能够诱导有效和长期转基因表达的主要障碍。结构研究表明，rAAV衣壳上的中和抗体（NAbs）识别位点可能是保守的。根据冷冻电子显微镜（cryo-EM）图像显示的rAAV1衣壳与三种小鼠单克隆抗体复合物的结构信息，工程化的rAAV变体能够逃避小鼠、非人灵长类动物和人类血清中的NAbs。将rAAV衣壳与生物素-聚乙二醇（PEG）和N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）结合可能有助于逃避NAbs，尽管这可能会改变rAAV的组织嗜性，降低感染效率。一项研究使用域交换技术从rAAV2和rAAV8生成了27个嵌合体衣壳，并证明了rAAV8的肝脏嗜性与第四环域相关。此外，在AAVrh10的可变区域VIII中插入精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）整合素结合基序，可提高心脏特异性感染效率并减少肝脏分布。 不改变rAAV衣壳氨基酸组成的化学修饰是衣壳工程的一个有前景的方法。对表面氨基酸的微小修改可以改变受体结合亲和力，从而影响感染和嗜性。一项研究使用带有亲电性琥珀酰亚胺丙酸功能团的聚乙二醇-N-羟基琥珀酰亚胺（PEG-NHS）与rAAV2衣壳上的赖氨酸残基交联，以逃避中和抗体（NAbs）。研究发现糖化的rAAV2与肝素和单克隆抗体A20的结合减少，导致其在肌肉中的转基因表达显著提高。一项研究将抗骨骼肌特异性蛋白CACNG1的抗体共价结合到rAAV9衣壳的可变区域，导致工程化的衣壳能够在小鼠肌管中特异性表达转基因，与未结合抗体的rAAV9相比，肝脏靶向性降低。同样，另一项研究工程化了一个rAAV9和rAAVrh74的混合衣壳，可以特异性结合在骨骼肌表达丰度较高的受体整合素αVβ（AVB6）。一个由此产生的变体，LICA1，在人类肌管和小鼠杜氏肌营养不良症（DMD）模型的骨骼肌中显示出更强的感染性。此外，还可以通过遗传密码扩展技术来实现对rAAV衣壳的化学修饰。遗传密码扩展技术允许研究者在蛋白质中特定位置引入非天然氨基酸（ncAAs），从而赋予蛋白质新的或改变其原有的功能。最近的一项研究使用了这种方法，通过工程化的正交原核tRNA/tRNA合成酶（正交意味着这些tRNA和tRNA合成酶对不会与宿主细胞中已有的tRNA和tRNA合成酶发生相互作用，从而避免了非目标氨基酸的掺入）插入单个ncAAs来工程化一类新的rAAV，称为Nε-AAVs。这些突变的Nε-AAVs成功地与功能分子结合。体内研究表明，在异种移植动物模型的目标细胞中，与Nε-AAVs结合的功能分子导致了高度特异性的摄取。另一项研究还表明，在AAV5衣壳的D374位置整合一个ncAA可以增强其在小鼠肺部的特异性感染。尽管取得了这些进展，但理性设计方法仍受到我们对rAAV结构和生物学不完全理解的限制。 03 定向进化 定向进化通过模仿自然进化的过程，人为设计的实验条件分离具有优势属性的衣壳变体，如更高的rAAV产量和感染效率、免疫逃逸或特定的细胞/组织嗜性。一种定向进化策略涉及诱导随机、无偏倚的突变，并对衣壳施加病毒适应性的选择压力。有研究通过使用易错PCR然后通过交错延伸以生成VP1-3的Cap突变体库，筛选对肝素亲和力发生改变且能实现免疫逃逸的变体。此外，基于DNA重组的方法，通过组合来自不同亲本AAV血清型的衣壳氨基酸序列，也被用来生成多样且广泛的随机嵌合体库。用这种技术构建的大量AAV变体在体外和体内都显示出广泛的细胞嗜性。饱和突变不同抗原印记也被用来工程化AAV8衍生的衣壳以逃避Nabs，改善肝脏嗜性。 在AAV衣壳上表面筛选随机肽段是定向进化的另一种方法。例如，基于Cre重组的AAV靶向进化（CREATE）系统（图2）将短肽段插入到rAAV9衣壳上以改变其属性，已有研究用该方法成功获得了AAV-PHP.B。AAV-PHP.B在C57BL/6小鼠模型中表现出了优异的穿透血脑屏障（BBB）的能力，因此被广泛用于小鼠的中枢神经系统（CNS）研究。然而，后续的研究表明，AAV PHP.B的这种特性并没有在其它品系的小鼠和非人灵长类动物（NHPs）中得到相同的效果，这表明AAV PHP.B衣壳与宿主因素之间存在复杂的相互作用，而这些因素在不同物种之间可能存在差异。 图2  基于Cre从感染的靶细胞中恢复AAV衣壳序列。a  CREATE选择过程示意图。用PCR引入多样性（多色光谱垂直带）到一个衣壳基因片段（黄色），该片段被克隆到携带剩余衣壳基因（灰色）的rAAV基因组中，并用于生成病毒变体库，之后该库被注入Cre转基因动物体内，最后用PCR从Cre+细胞中选择性恢复衣壳序列。b  rAAV-Cap-in-cis-lox rAAV基因组。Cre颠倒了被lox71和lox66位点包围的聚腺苷酸（pA）序列。PCR引物（半箭头）被用来选择性扩增Cre重组序列。c  从两个Cre+或Cre-小鼠中恢复的衣壳库序列的Cre重组依赖性（顶部）和独立性（底部）扩增的PCR产物。d 示意图显示了Rep-AAP AAV辅助质粒内的AAV基因以及由cap基因编码的蛋白质。在cap基因中插入的终止密码子消除了VP1、VP2和VP3衣壳蛋白的表达。e 与用标准的AAV2/9 Rep-Cap辅助质粒+ rAAV-UBC-mCherry（中间）或AAV2/9 Rep-AAP + rAAV·UBC-mCherry质粒（底部）生产的病毒相比，使用分离的AAV2/9 Rep-AAP + rAAV-Cap-in-cis-lox质粒也能生成有DNase抗性的AAV载体基因组（vg）（顶部）（AAV基因组的DNase抗性是AAV在生产、纯化、储存和给药过程中过程中具有较高的稳定性的指标）。f 将7-mer衣壳库克隆到rAAV-∆Cap-in-cis载体中。g  AAV9表面模型显示了7-mer插入在氨基酸（aa）588和589（洋红色）之间的位置。黄色表示用PCR生成的库片段编码的位点（aa 450-592）。 随后，Voyager Therapeutics公司开发了一种名为TRACER（Tropism Redirection of AAV by Cell-type-specific Expression of RNA，通过细胞类型特异性表达RNA重新定向AAV的嗜性）的新型rAAV进化平台（图3）。这个平台的核心是基于RNA进行筛选，能快速发现穿透血脑屏障（BBB）并增强CNS嗜性的AAV衣壳。这一过程不需要转基因动物，因此可以用于多种物种，包括非人灵长类动物（NHPs）。一项在小鼠中的研究基于在rAAV9衣壳上展示的肽库，鉴定了十个优势变体，这些变体在系统给药后，大脑的转导效率比亲本rAAV9高了多达400倍。最近一个研究报道，VCAP-102，一种基于TRACER开发的rAAV9变体，在非人灵长类动物的不同大脑区域显示出比rAAV9高20-90倍的感染效率。对VCAP-102的迭代进化产生了新的衣壳变体，其BBB穿透性进一步提高了6-7倍。同样，基于TRACER开发的VCAP-100衍生物在非人灵长类动物中显示出比其亲本AAV5高六倍的大脑感染效率，而在的肝脏感染效率则降低了300倍，预示着更低的肝毒性。 图3 TRACER策略。（A）野生型AAV（顶部）和TRACER文库载体（底部）结构示意图。ITR，反向末端重复序列。Pro，启动子。虚线表示AAV内含子（顶部）或合成的CMV globin内含子（底部），实线代表次要（细线）和主要（粗线）衣壳转录本。底部显示了用于恢复2.8-kb衣壳文库扩增子的引物。（B）在TRACER平台中将CAG、SYN和GFAP启动子串联（左边）或单一启动子（右边）的活性。转基因被包装在AAV9衣壳中，并在HEK293T细胞或小鼠原脑细胞中进行测试（1E+5 vg/细胞，n = 3）。感染后48小时通过实时RT-PCR定量RNA。（C）肽展示文库的构建。在包含SYN或GFAP启动子的载体中，将由AQ、DG或DGT残基引导的随机序列引入至AAV9 VP1的特定位置。（D）体内选择过程示意图。（1）DNA文库用于生产病毒库，（2）将病毒文库通过静脉注射（i.v.）感染小鼠（1E+12 vg/只），（3）注射后28天从整个大脑中恢复大量RNA，（4）通过RT-PCR扩增编码肽库的衣壳片段，通过下一代测序（NGS）进行分析，然后克隆到TRACER载体中进行另一轮选择。（E）在注射SYN和GFAP启动子文库后28天，从三只小鼠中获得的RT-PCR产物示例（顶部和中间，分别）。底部：RT阴性对照。 DELIVER（Directed evolution of AAV capsids leveraging in vivo expression of transgene RNA, 定向进化AAV衣壳，利用体内表达的转基因RNA）策略是另一种开创性的方法（图4），该方法通过在体内筛选AAV衣壳变体，以实现对特定组织的高效递送。已经有研究者采用这种策略鉴定出一类含有RGD基序的衣壳，这些衣壳在小鼠和非人灵长类动物中通过静脉注射后，能够以更高的效率和选择性感染肌肉组织。进一步分析表明，目标细胞中表达的与RGD结合的整合素异二聚体与含有RGD基序的病毒变体有很强的相互作用。研究人员最近生成了一个嵌入RGD的7个氨基酸肽库，插入衣壳的可变区域VIII，并鉴定出一些新的AAV衣壳变体，其骨骼肌转导效率比基准衣壳增强了20多倍。 图4 DELIVER鉴定出一类含有RGD基序的肌肉趋向性AAV衣壳变体。（A）使用DELIVER生产病毒文库和选择衣壳变体的示意图。（B）使用含有ITR的质粒产生的rAAV滴度比较，这些质粒在CMV、CK8或MHCK7启动子的控制下表达AAV9衣壳编码序列。（C和D）在8周龄C57BL/6J小鼠的骨骼肌（C）和心脏（D）中，由CMV、CK8或MHCK7启动子控制表达的AAV9衣壳库mRNA的体内表达。病毒库感染方式为系统性注射，剂量为1E+12 vg/只小鼠。（E）图表显示在不同小鼠骨骼肌中，由MHCK7启动子表达的衣壳变体在DNA和mRNA水平上相对于病毒文库的富集情况。（F）在8周龄C57BL/6J小鼠肌肉中注射1E+12 vg病毒库后，经过第二轮基于转录本的选择，高度表达的衣壳变体中7个氨基酸的插入序列。每组中颜色相同的变体由同义密码子编码。变体的排序是基于每个变体在股四头肌、胫骨前肌、腓肠肌、肱三头肌、腹肌、膈肌和心脏中的mRNA表达量之和。 定向进化是一个强大的工具，用于生成和识别具有特定属性的变体，虽然这些属性并不总是能够在灵长类动物中跨物种转化，如AAV-PHP.B在小鼠中显示出比AAV9更强的CNS感染，但在狨猴中则没有，这表明在衣壳工程中进行跨物种进化的必要性。然而，一项在多个物种中的顺序进化rAAV衣壳库的研究确定了rAAV.cc47作为一种强大的跨物种变体，与rAAV9相比，在非人灵长类动物的大脑和心脏中具有增强的感染能力。AAV2.7m8是一种AAV2变体，通过10个氨基酸的插入，在小鼠中通过玻璃体内注射能够强烈转导外层视网膜层，如光感受器和视网膜色素上皮（RPE）细胞。使用ADVM-022（AAV.7m8-aflibercept）治疗糖尿病性黄斑水肿（DME）的II期临床试验（NCT04418427），接受高剂量【6.0 × 10^11病毒基因组（vgs）/眼】后16-36周内多名患者出现严重不良反应，包括难以治疗的眼内压降低，因此该临床试验暂停，这显示了工程化衣壳在该领域的转化挑战。 04 AI辅助设计 计算机辅助的rAAV工程是一种前沿的方法，它利用计算工具来辅助rAAV的设计和优化。各种研究已经从rAAV的进化谱系中探索了其多样的属性，并使用预测的祖先基因组重建来创造新的衣壳变体。有两项类似的研究通过合理设计或采用定向进化来计算建立祖先衣壳库。这两项研究都生成了具有更好的热稳定性的衣壳变体，热稳定性是血清型特征的一个指标，是显示临床应用潜力的生物学属性。在这些变体中，Anc80L65是一个有前途的载体，可用于内耳或眼睛相关疾病的基因治疗。 机器学习在生物医学研究中得到了广泛使用，包括医学图像分析、遗传学和药物发现。一项开创性的研究应用机器学习来理解rAAV2衣壳，从衣壳的适应度视角描述了单密码子替换，并使用机器学习来设计精确的多突变变体，这些变体基于它们对目标组织的影响。此外，深度学习已被用来多样化rAAV2衣壳变体，准确预测它们的活力。这种方法揭示了在衣壳之外工程化rAAV基因组的新可能性，这在未来的rAAV发展中具有创新应用潜力。 rAAV基因组设计 rAAV基因组由ITRs和转基因表达盒组成，后者包括感兴趣的基因和调控元件。rAAV基因组的设计策略包括修改ITRs或内含子，插入组织特异性启动子进行转录调控和/或使用可诱导表达系统，密码子优化，减少转基因cDNA的CpG基序，以及通过微小RNA（miRNA）介导的转录后调控重靶向等。这些元件各有其功能，它们各自和共同作用决定了转基因表达、细胞类型特异性、rAAV转导的安全性和持久性。 01 rAAV ITRs的设计 传统的rAAV携带单链载体基因组。其转导效率和速率取决于mRNA转录发生前载体DNA的第二链合成，这是限速步骤。为了提高转导效率，可采用突变其中一个ITR，生成具有双链载体基因组的自互补AAV（scAAV）的策略。scAAV可绕过dsDNA合成的限速步骤，更快、更高效地转导目标细胞。然而，使用scAAV有明显的局限性：较小的包装能力（scAAV为2.5 kb，而ssAAV为4.7 kb）以及由于转基因产物快速积累而导致的免疫反应风险的增加。 ITRs可以被改变，通过选择性地从两个相邻的ITRs中移除D序列，可以选择性地限制包装载体基因组的正链或负链。ITRs还包含CpG基序，可被toll 样受体（TLR）-9识别并诱发炎症反应。完全从ITRs中移除CpG并不会对治疗动物中载体基因组的拷贝数或转基因表达产生不利影响，然而，这会导致rAAV滴度的降低，并且尚不清楚是否能减少对rAAV的炎症反应。总的来说，ITRs可能是异质的，原因是ITRs天然容易发生突变，具有回文结构、高GC含量和二级结构。优化ITRs中的GC含量可能是一种潜在的改善rAAV属性的设计策略。 02 优化启动子 选择和优化转基因表达盒中的启动子可以满足特定的需求，如组织特异性和表达水平。常用的巨细胞病毒（CMV）或鸡β-肌动蛋白（CBA）启动子可提供强大且广泛的基因表达，而组织特异性启动子如CK8或MHCK7则在肌肉中提供组织特异性的基因表达。组织特异性转基因表达对于实现低剂量下足够的转导效率和最小化脱靶效应至关重要。一项研究采用了携带内源性人类存活运动神经元1（SMN1）启动子的scAA9载体，以在神经元中特异性驱动SMN1的表达。这种方法显示了更好的安全性，显著降低了肝脏毒性，并在患有脊髓性肌肉萎缩症（SMA）的SMNdelta7小鼠中增强了治疗效果。这一结果超越了使用CMV/CBA启动子被FDA批准的治疗方法Zolgensma的性能，从而强调了组织特异性启动子的优势。其它的调控元件，如添加上游增强子可以提高表达活性和特异性。许多增强子已被设计用于临床基因治疗载体中，目的是增加转基因表达，减少病毒剂量。另一项研究报告称，小鼠甲基-CpG结合蛋白-2启动子的一个片段在神经元中特异性地实现了强大的长期表达。 基于机器学习的多组学数据可以用于设计组织特异性启动子，使转基因活性在靶组织和非靶组织之间实现超过1000倍的动态增加。 03 转基因表达调控 转录调控：可以上调或下调感兴趣基因或蛋白的表达，以优化和微调所需的效果。四环素诱导系统是一种广泛使用的策略，用以实现特定水平的表达，虽然由于潜在的免疫原性问题，它不太可能被应用于人类。有研究开发了一种使用免疫抑制药物雷帕霉素来激活的反应性转录因子的系统，该系统最初由两个不同的rAAV递送，随后被优化成只需要一个rAAV就足够了。目前该系统已被用于对雷帕霉素处理的可诱导剂量-反应表达，以长期表达所需的转基因。重要的是，在没有给予雷帕霉素的情况下，转基因表达只有最小限度，表明这可能是一个特异且安全的调控系统。 转录后调控：一种策略是使用核糖开关（riboswitches），这是一类非编码RNA元件，主要存在于细菌mRNA的5'非编码区（5'UTR），但在真核生物mRNA的3'UTR及初始转录产物的内含子区段也有发现。核糖开关通常由两部分组成：适配体（aptamer）域和表达平台（expression platform）域。适配体域负责结合特定的小分子代谢物，即配体（ligand），而表达平台域则负责基因表达的调控。当特定分子（配体）结合适配体域时，会引起表达平台域的局部构象发生变化，从而打开或关闭下游基因的表达。核糖开关广泛存在于细菌中，它们在细菌的硫代谢、辅酶合成、氨基酸合成等基础代谢中发挥着非常重要的调控作用。迄今为止，已有20余类感应不同分子的核糖开关在细菌中被确认。目前核糖开关正被用来系统工程化哺乳动物基因表达调节器aptazymes，以改善其调控范围。使用核糖开关的优点包括与FDA批准的药物兼容、RNA的小尺寸，以及几乎没有免疫原性。重要的是，核糖开关序列非常短，这与rAAVs有限的包装能力相结合时尤为重要，使其成为调控rAAV基因治疗的强大系统。 非编码RNA是转基因调控中的多功能工具。将带有可切割的聚A信号（PAS）的RNA aptamers整合到转基因的5'-非翻译区（UTR）中，在没有小分子的情况下，PAS切割导致mRNA降解，从而沉默转基因表达；添加小分子时， mRNA的完整性得以维持，转基因可表达，可以将这种工具与可变剪接相结合，以更精确地控制基因表达。 一些调控系统需要外源性添加或共表达某些元件才能起作用。为了缓解这个问题，研究者们一直在追求使用药物诱导剪接作为基因表达调控的机制。这种方法涉及递送一个包含过早终止密码子的基因，以防止蛋白质的翻译。添加小分子剪接诱导剂有助于将一个特别设计的外显子包含到成熟转录本中，并排除终止密码子，从而使得感兴趣蛋白质的翻译成为可能。启动子的强度和诱导分子的剂量可精确激活目标基因的表达水平。然而，当前技术依赖于固有蛋白质周转机制来降低目标蛋白质的水平。 翻译后调控：调节感兴趣蛋白质半衰期的策略之一是使用蛋白质降解系统（degron），该系统允许对蛋白质的移除和恢复进行可逆和快速响应。一些研究已在体外建立degron系统，但在尝试将其转化为体内系统时发现存在较高的毒性。然而，通过优化已经生成了一些有前景的可应用于体内的系统，如在感兴趣蛋白质上结合一个SMASh (small-molecule–assisted shutoff) 标签，然后引入一种已经获批用于人类的小分子药物，以防止SMASh标签的分离，从而导致蛋白质的降解。结合可诱导表达系统、替代剪接策略和蛋白质降解方法，有可能实现对目标蛋白表达水平的精细控制。 04 优化转基因（转录后水平） 在表达盒优化中一个常见的方法是密码子优化，即使用计算机算法识别转基因中罕见或次优的密码子，并用更受偏好的密码子替换它们。研究已经证明，在小鼠模型中，对FVIII和人类囊性纤维化跨膜传导调节因子（CFTR）进行密码子优化后，其表达水平显著提高。此外，对Canavan病的致病基因，一种天冬氨酸酰酶（ASPA）的密码子进行优化，显著恢复了ASPA蛋白的表达，并在小鼠模型中挽救了致命的疾病表型。虽然密码子优化是提高rAAV递送的转基因表达的有效策略，但这种效果可能因特定的转基因和宿主生物而异。密码子优化方法可能会引入意外的免疫原性和毒性，以及损害其它特性，如嗜性。事实上，一项研究发现密码子优化在基于rAAV8的FIX Padua基因治疗中引入了大量CpG基序，这可能引发先天免疫反应。一项研究开发了一种新的基于循环神经网络的工具，该工具使用来自小鼠心肌细胞、神经元和肝细胞的数据，为特定细胞类型优化密码子使用，这种方法提高了蛋白表达水平并减少了CpG二核苷酸，为提高组织特异性基因治疗效率提供了希望。 05 修改其他顺式调控元件 在表达盒中修改其它顺式调控元件可以调节基因表达和特异性。例如，土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件（WPRE）是一个约600 bp的RNA元件，通常添加在转基因下游。WPRE可以通过增加与转基因无关的mRNA转录量来提高体外和体内的转基因表达。有研究谨慎地报告了WPRE在小鼠中递送的慢病毒载体中潜在的致癌活性。然而，通过从原始WPRE中移除致癌序列，可以降低此类风险。 在转基因表达盒中包含内含子也可以改善动物中的基因表达。有研究表明内含子在体内可以将转基因表达提高40-100倍。然而，内含子对基因表达的影响可能是复杂的，取决于多种因素，如内含子的大小和位置以及特定的目标细胞。选择合适的polyA信号对于优化转基因表达和稳定性很重要【例如，β-球蛋白、SV40或牛生长激素（BGH）】。一项比较研究发现，修改后的SV40晚期polyA（135 bp）的较短版本在小鼠大脑中的转基因表达与BGH polyA（223 bp）相当。此外，包含Kozak序列可以进一步增强转基因表达。 确保仅限在目标组织中表达目的基因对于避免有毒性的过表达和免疫毒性至关重要。rAAV设计采用了细胞特异性启动子作为目标表达的主要策略，并进一步开发了微调策略，例如在3′-UTR中添加miRNA结合位点以抑制目标基因在表达互补miRNA的细胞中的表达。如在rAAV9中添加miR-122结合位点可以实现在中枢神经系统表达的同时减少靶向肝脏、心脏和骨骼肌。当rAAV携带外源转基因，或对患者体内发生无义突变的基因拷贝进行替代时，转基因产物可能被抗原呈递细胞（APCs）视为非自身抗原，然后APCs处理转基因产物，通过主要组织相容性复合体（MHC）进行提呈，启动免疫清除。减轻转基因免疫的一种策略是在rAAV的表达盒中结合APC特异性miRNA结合位点，如miR-142和miR-652，以抑制转基因在APCs的表达。结果显示，在小鼠中转基因特异性免疫反应减少，目标细胞中转基因表达持续。这种策略已在非人灵长类动物中转化，通过rAAV递送后，针对人类免疫缺陷病毒的NAbs得到了广泛持久的表达，突出了这种策略在临床转化中的潜力。 06 扩展rAAV包装能力 rAAV应用中的另一个重大挑战是递送超过其4.7 kb包装能力的转基因，如Leber先天性黑蒙症10型的中心体蛋白（CEP290）（约7.5 kb），或基于CRISPR的工具，如胞嘧啶碱基编辑器或先导编辑器2（超过5 kb）。为了克服这一障碍，可将大基因片段分成两部分，每部分都封装在rAAV衣壳中。这些分段的转基因被共同引入同一细胞，从而重组成全长基因和蛋白。这种重构可以在遗传信息流的不同阶段发生。在DNA水平上，可以通过rAAV ITRs、部分转基因序列或在两个rAAV基因组中都存在的优化的重组元件来促进载体间DNA重组。重叠序列可以在转录后通过特别设计的剪接信号被切除，产生成熟的全长mRNA，随后被翻译成所需的蛋白。在RNA水平上，通过每个转录本中存在的剪接供体和受体介导的两个单独载体的转录本之间的跨剪接，生成全长转录本和蛋白。在蛋白水平上，可以通过分裂型内含肽（分裂型内含肽是能够切除自身并连接附近蛋白片段的天然多肽）实现蛋白重构。 参考资料： 1.     https://doi-org.libproxy1.nus.edu.sg/10.1038/nbt.3440 2.     https://doi-org.libproxy1.nus.edu.sg/10.1016/j.omtm.2020.12.006. 3.     https://doi-org.libproxy1.nus.edu.sg/10.1016/j.cell.2021.08.028 4.     https://doi-org.libproxy1.nus.edu.sg/10.1038/s41392-024-01780-w 关于派真生物

欢迎关注凯莱英药闻 2024年8月12日，MeiraGTx公司公布了2024年上半年及第二季度的财务和运营情况： H1累计收入97.90万美元，同比减少85.76%；累计净亏损6906.20万美元，同比扩大15.21%。 其中，Q2研发费用为 3490 万美元，同比增加 1500 万美元；一般及行政开支为 1130 万美元，同比减少110 万美元。 截至 2024 年 6 月 30 日，公司现金、现金等价物和受限现金为 1.01 亿美元。 同时，该公司还宣布以每股 4.00 美元的价格出售 1250 万股普通股。此次融资由赛诺菲牵头，并通过此次发行向该公司进行了3000 万美元的股权投资；其他参与者包括Perceptive Advisors 和领先的机构医疗保健基金。预计将于 2024 年 8 月 13 日左右完成。 2023年11月，赛诺菲曾以每股 7.5 美元的价格购买了MeiraGTx 的 400 万股股票，投资约3000 万美元；目前累计投资6000万美元。 凭借现有资金和此前与强生达成的交易，公司将拥有足够的资本来支付 2026 年第二季度前的运营成本和资金支出。    一、关于MeiraGTx MeiraGTx是一家处于临床阶段的基因治疗公司，在病毒载体设计和优化方面拥有核心能力，旨在开发一种可以通过简单的药丸每日调节的基因治疗技术，这种技术名为核糖开关技术，旨在通过口服小分子（包括GLP-1、GIP、胰高血糖素和PYY)精确、剂量响应性地控制基因表达。 公司在载体优化方面的程度使其区别于其他基因治疗开发者，其基因治疗平台通过优化衣壳和启动子，建立了包含对不同组织具有更高嗜性的衣壳的广泛专有库，从而深入了解启动子及特定基因在特定细胞中的表达方式。 通过对衣壳进行细微的改变，MeiraGTx能够影响基因传递的效率；同样，通过优化启动子，公司的科学家们可以影响表达水平，例如限制某些细胞类型的表达。 Part.1 公司与强生的交易、合作项目情况 早在 2019 年，强生旗下杨森就以 1 亿美元预付款及 3.4 亿美元里程碑付款获得了AAV-RPGR（botaretigene sparoparvovec，bota-vec）的全球开发和商业化权益。2023年12月，强生斥资累计4.15亿美元收购botaretigene sparoparvovec的所有权益。 AAV-RPGR是一款基于腺相关病毒载体（AAV）的基因疗法，旨在将RPGR基因的功能拷贝递送至视网膜下空间，改善和维持视觉功能；该药物通过一次性的视网膜下注射，用于治疗由眼睛特异性RPGR基因（RPGR 0RF15）突变导致X连锁视网膜色素变性（XLRP）的患者。该疗法已获FDA快速通道资格与孤儿药资格，以及EMA的优先审批资格与先进治疗药物资格。1/2 期研究数据显示，与未治疗的对照组相比，使用 bota-vec 治疗可改善功能性视力以及视网膜和视觉功能。 Part.2 获赛诺菲投资的重点项目情况 与强生不同，赛诺菲对 MeiraGTx 的Riboswitch基因调控技术感兴趣，并拥有 MeiraGTx 治疗辐射引起的口干症项目AAV-AQP1（AAV2-hAQP1）的优先谈判权。 Riboswitch 技术是将口服小分子和适配体相结合，通过改变靶 RNA 形状，特异性地调节与免疫和中枢神经系统疾病以及 GLP-1 等肠道激素相关靶点的表达。 AAV-AQP1是一种腺相关病毒载体，能安全的将人水通道蛋白-1（HAQPQ，CDNA基因）转移到唾液腺功能衰减患者的腮腺，诱导唾液分泌增加。该药物已被 FDA 授予孤儿药称号，并被欧盟委员会授予孤儿药称号。1 期 AQUAx 临床试验的数据显示，使用AAV-AQP1治疗可显著改善患者的唾液分泌，且未报告与治疗相关的严重不良事件或剂量限制性毒性。 Part.3 其它重点开发项目 除与强生合作项目，以及用于唾液腺病的基因治疗项目外，MeiraGTx的后期临床项目包括一种针对帕金森病的基因治疗项目、多项针对遗传性视网膜疾病的项目处于临床试验阶段，还有一些适应症的候选产品处于IND阶段。 将公司其它已进入临床阶段的药物统计如下： NLX-P101（AAV-GAD）：是一款AAV载体基因治疗药物，通过抑制谷氨酸脱羧酶（GAD）选择性的改变影响帕金森病发生的神经通路；其治疗策略是恢复过渡活动的脑细胞，抑制电活性和使脑部网络活动恢复正常。NLX-P101可恢复γ- 氨基丁酸（GABA），通过 AAV 载体把GAD转移到丘脑底核，改善患者的运动控制能力。据悉，评估 AAV-GAD 输送到帕金森病患者丘脑底核 (STN) 时的安全性和耐受性试验，预计将于 2024 年第四季度公布；公司计划在 2024 年第四季度就第 3 阶段临床计划与全球监管机构展开讨论。 Cevaretigene ritoparvovec（AAV-RPE65）：该药物是一款针对RPE65的眼科基因治疗药物，RPE65是在视网膜色素上皮表达的、参与视网膜类视黄酮循环中发色团生化循环的关键酶；RPE65双等位基因突变相关的视网膜营养不良包括2型Leber先天性黑矇、20型视网膜色素变性、早发性视网膜营养不良以及其它视杆细胞介导的严重视网膜营养不良。研究显示，在接受AAV-RPE65治疗的 11 名 LCA4 儿童中，有 11 名观察到了有意义的反应；所有儿童均在 1 至 3 岁之间接受治疗，所有儿童在治疗期间均失明，且在治疗后 4 周或更长时间均恢复视力。 AAV-CNGB3和AAV-CNGA3：两款基因疗法主要针对由CNGB3或CNGA3基因突变引起的全色盲，用于治疗遗传性视网膜疾病（IRDs）；色盲相关研究表明，基因 CNGA3 或 CNGB3 突变在色盲患者中最为常见。    二、基因疗法及市场 基因治疗是指将外源基因导入靶细胞，以纠正或补充因基因缺陷和异常所引起的疾病，从而达到治疗疾病目的的技术方法。该疗法既能够克服传统小分子和大分子抗体药物在蛋白质水平进行调控的局限性，可在分子层面通过基因表达、沉默或者体外改造的手段来实现“无药可医”疾病的治疗，且在多个临床前研究和临床结果都展示出其强有力的治疗效果。 基因编辑药物需要以DNA、mRNA、蛋白质或者核糖核蛋白的形式递送到细胞中。基因载体主要包括病毒载体和非病毒载体两类。目前，在这两大类中，新药研发应用最为广泛的分别是腺相关病毒（AAV）和脂质纳米颗粒（LNP）。 目前，许多病毒载体已用于基因治疗药物的递送，应用于超过1000项临床试验中。绝大多数的基因治疗药物都采用AAV为递送载体，少部分临床前试验中使用了慢病毒或腺病毒为递送载体。 据不完全统计，目前全球已经有8款AAV基因疗法获批上市，适应症涵盖眼科疾病、代谢类疾病、神经类疾病、骨骼肌疾病、血液疾病等。 根据弗若斯特沙利文预测，2025 年全球基因治疗市场规模将达到305.4亿美元；国内基因治疗市场仍处于起步阶段，随着国家政策支持基因治疗药物发展，2025年国内基因治疗市场规模有望达到178.9 亿元。 全球细胞和基因治疗市场规模（单位：亿美元） 中国细胞和基因治疗市场规模（单位：亿元） 以重磅品种Zolgensma 为例，该药物为诺华研发的一款用于治疗脊髓性肌萎缩症（SMA）的AAV 基因治疗产品，2019年获得FDA 批准在美国上市，2023 年其销售额为12.14 亿美元，显示了基因治疗药物的市场潜力。 参考资料 1、公司官网 2、同花顺、大药时记、神封、医药经济报 3、DeepTech、中信证券 感谢关注、转发，转载授权、加行业交流群，请加管理员微信号“hxsjjf1618”。 “在看”点一下