BLM

引言 DNA双链断裂（DSB）是细胞分裂过程中最严重的DNA损伤类型之一，如果不及时修复，会导致基因突变和癌症。同源重组（HR）是DSB修复的主要途径之一，HR依赖于同源染色体之间的序列匹配，以修复DSB【1】。HR的启动需要先对DSB末端进行DNA端重组，生成单链DNA模板，以便RAD51重组酶等蛋白组装并执行修复。BRCA1-BARD1复合体是重要的肿瘤抑制因子，在HR中发挥关键作用【2】。它参与多个HR阶段，包括DNA端重组，并已被证明与RAD51重组酶相互作用并增强其活性【3】。尽管BRCA1-BARD1在HR中至关重要，但其直接调节DNA端重组活性的机制尚不清楚。 近日，来自美国德克萨斯大学健康科学中心的Patrick Sung，Sandeep Burma研究团队和哥伦比亚大学的Eric C. Greene研究团队合作在Nature杂志上发表题为Promotion of DNA end resection by BRCA1-BARD1 in homologous recombination的研究论文，该研究发现BRCA1-BARD1通过增强关键重组酶的活性，以及与DNA端重组机器的协同作用，在DSB修复中发挥至关重要的作用。 首先研究人员利用体外酶促反应，将纯化的BRCA1-BARD1、BLM和DNA2与32P标记的DNA底物混合，并观察DNA解旋和DNA端重组的效率。结果发现BRCA1-BARD1显著增强BLM的解旋酶活性和DNA2的DNA端切割酶活性，并提高BLM-DNA2复合物的进程性和效率。接着通过亲和层析实验，研究人员验证BRCA1-BARD1与BLM和DNA2的相互作用。研究结果表明，BRCA1-BARD1与BLM和DNA2直接相互作用，这导致BLM-DNA2途径的DNA解旋和DNA端重组效率显著提高。BRCA1-BARD1的加入还促进了BLM-DNA2复合物的组装进程和效率，使其在DNA端重组过程中发挥更积极的作用。 与BRCA1-BARD1增强BLM-DNA2途径的实验类似，研究人员使用纯化的BRCA1-BARD1、WRN和DNA2与32P标记的DNA底物混合，并观察DNA解旋和DNA端重组的效率。通过亲和层析实验，验证BRCA1-BARD1与WRN的相互作用。结果发现BRCA1-BARD1显著增强WRN的解旋酶活性，并提高WRN-DNA2复合物的进程性和效率。与BLM-DNA2途径类似，BRCA1-BARD1的加入并没有改变WRN-DNA2复合物的组成，而是通过增强其活性来提高端重组的效率。 研究还发现，BRCA1-BARD1与EXO1直接相互作用，并显著增强EXO1的5’→3’外切酶活性。这意味着BRCA1-BARD1不仅作用于解旋酶和DNA切割酶，也作用于外切酶，进一步增强了DNA端重组的整体效率。机制解析发现BRCA1-BARD1通过与EXO1的特定结构域相互作用，提供辅助作用，促进DNA端的切割，并提高EXO1在DNA端重组过程中的稳定性和效率。例如，BRCA1-BARD1可能通过稳定EXO1的结构，或通过改变其活性位点的电荷状态，来增强其切割能力。 最后，研究发现，BRCA1和BLM1都含有独立的DNA结合模块，它们协同作用以增强DNA端重组的效率。此外，BARD1的DNA结合域对于BRCA1-BARD1促进DNA端重组的能力至关重要。这表明BRCA1-BARD1通过与DNA端的结合，更有效地引导和协调重组酶的活性。 同期在Nature杂志上，来自瑞士提契诺大学（USI）生物医学院的Petr Cejka研究团队发表题为Mechanism of BRCA1-BARD1 function in DNA end resection and DNA protection的研究论文，该研究也发现了BRCA1-BARD1在DNA端重组中的重要作用，并阐明了其保护DNA的功能。 总之，这两项工作都深入探讨了BRCA1-BARD1在DNA双链断裂修复中的关键作用，特别是它在同源重组过程中的DNA端重组阶段。这些研究不仅加深了我们对BRCA1-BARD1功能和癌症发生的理解，还可能为开发针对BRCA1-BARD1缺陷的癌症治疗方法提供新思路。 参考文献 1. Tarsounas, M. & Sung, P. The antitumorigenic roles of BRCA1-BARD1 in DNA repair and replication. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 21, 284-299 (2020). 2. Prakash, R., Zhang, Y., Feng, W. & Jasin, M. Homologous recombination and human health: the roles of BRCA1, BRCA2, and associated proteins. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 7, a016600 (2015). 3. Zhao, W. et al. BRCA1-BARD1 promotes RAD51-mediated homologous DNA pairing. Nature 550, 360-365 (2017). https://doi-org.libproxy1.nus.edu.sg/10.1038/s41586-024-07910-2 https://doi-org.libproxy1.nus.edu.sg/10.1038/s41586-024-07909-9 责编|探索君 排版|探索君 文章来源|“BioArt” End 往期精选 围观 一文读透细胞死亡(Cell Death) | 24年Cell重磅综述（长文收藏版） 热文 Cell | 是什么决定了细胞的大小？ 热文 Nature | 2024年值得关注的七项技术 热文 Nature | 自身免疫性疾病能被治愈吗？科学家们终于看到了希望 热文 CRISPR技术进化史 | 24年Cell综述

引言 人类基因组中存在多达三十亿的碱基对，因此在基因组学的核心挑战和最终愿景，是描述该三十亿碱基对中，每一个碱基对于特定基因调控及下游蛋白质功能的影响。因此，如何系统且高通量地对目标基因组序列进行诱导突变，成为一项核心技术挑战。当研究者聚焦于单一基因组位点时，如何利用区域性的靶向诱变，模拟自然进化过程，揭示序列与表型之间的关系，领域内仍然缺乏较好的技术平台。 2024年10月11日，来自博德研究所（Broad Institute）和哈佛大学丹娜法博癌症研究中心（Dana-Farber Cancer Institute）的Fei Chen和Bradley E. Bernstein研究组在Science上在线发表题目为Helicase-assisted continuous editing for programmable mutagenesis of endogenous genomes的研究论文（哈佛大学博士研究生Xi Dawn Chen和博后研究员陈则宇为共同第一作者），通过融合解旋酶（Helicase）和脱氨酶（deaminase）形成解旋编辑器（Helicase Editor），并通过nCas9或dCas9将解旋酶编辑器引导至特定基因组靶向区域，成功实现了在人类细胞上原位基因组上的长程，位置饱和的散在诱导突变，创立了在哺乳动物细胞上的原位定向进化系统，并在多种人类细胞系上实现筛选抗药性单碱基突变，RNA剪切酶活位点和原位增强子中的功能性碱基等重要生物学过程。 研究人员首先选择了PcrA M6解旋酶作为切入点，融合了可诱导C->U突变（DNA复制后体现为C->T或反链的G->A）的胞苷脱氨酶AID形成HE，并将靶向特定基因组位点的sgRNA，nCas9(D10A)和HE转染进入HEK293T细胞并突变72小时。研究人员发现只有细胞同时存在HE系统和nCas9-sgRNA系统时，目标靶向区域才会被显著突变。该突变方向以单侧为主，长度可达1kb以上，突变率平均在每个碱基0.5%左右。其中反链的G->A突变为主导突变类型，随着突变时间延长，每条单链上的突变也会随之累积。因此，研究人员将该系统命名为HACE（Helicase-assisted continuous editing）系统，即解旋酶介导的连续突变系统。 接下来，研究人员建立了模块化的HACE体系，搭建了不同解旋酶（BLM,NS3h,PcrA, PcrA M6等），不同脱氨酶（AID, rAPOBEC, TadA, TadDE）及不同Cas9（nCas9 D10A, nCas9 H840A, dCas9）的功能性描述矩阵，系统性的描述了每个组合条件下的突变率，突变方向，G->A和C->T的偏好，同时也实现了A->G或T->C的突变，使得HACE系统可在不同使用场景下，根据目标区域的突变预期特点，来进行工具盒式的置换，实现不同目的的单碱基筛选。 下一步，研究人员将HACE系统用于癌细胞的耐药性机制筛选中。研究人员将靶向MEK1外显子区域的HACE系统导入到A375细胞中，并使用Trametinib和Selumetinib两个MEK1抑制剂进行耐药性点突变筛选。在经历长达20天的耐药性筛选后，研究人员发现存活下来的A375细胞中，富集了G128D，G202E，E203K等多个点突变。利用单碱基编辑器和MAPK通路的活性报告系统验证发现，这些点突变可显著增强MAPK活性，并促进细胞在药物环境下生存和扩增。PDB结构分析进一步发现，以上突变位点均落在药物结合区域周围，阐释了MEK1突变的抗药机制。 进一步的，研究人员将HACE系统应用于鉴定影响RNA剪切的体内酶活突变位点。研究人员将RNA剪切报告系统导入到HEK293FT细胞中，同时设计好靶向SF3B1的多个sgRNA，再将HACE系统整体导入含有报告系统的细胞中。通过报告系统中被异常剪切的mRNA（GFP报告）强度进行亚群分选，筛选出对于RNA剪切有重要影响的细胞亚群，并对于其靶向区域的基因型进行鉴定。研究人员发现并用单碱基编辑和先导编辑验证了多个可影响RNA剪切的SF3B1突变位点，并在PDB结构分析中确认了这些突变所属的蛋白区域是与RNA结合相关的部分。 最后，研究人员设计了多条靶向CD69增强子的sgRNA，并利用HACE系统对于CD69基因的增强子进行突变筛选，并找到多个重要的转录因子结合区域，如ETS/IRF, GATA, RUNX等，揭示了这些转录因子家族可对CD69基因表达产生重要影响。进一步的，在探究RUNX结合区域是如何影响CD69表达的过程中，研究人员发现HACE所筛选的单碱基突变没有强制的人工连锁，而用于验证的单碱基编辑器，由于突变存在强制的人工连锁，则在破坏RUNX结合域的同时，又引入了GATA结合区域，导致单碱基编辑在分子库筛选中大概率无法识别该重要调控区域。因此，研究人员之后采用先导编辑，完善了对HACE筛选位点的系统性验证环节。 模式图（Credit: Science） 综上，HACE是可编程，可多靶向，可连续突变，低频，有方向性，靶区域内随机，位置饱和，罕见强制连锁的连续突变器，可实现哺乳动物原位基因组的定向进化。 参考文献 http://doi.org.libproxy1.nus.edu.sg/10.1126/science.adn5876 责编|探索君 排版|探索君 文章来源|“BioArt” End 往期精选 围观 一文读透细胞死亡(Cell Death) | 24年Cell重磅综述（长文收藏版） 热文 Cell | 是什么决定了细胞的大小？ 热文 Nature | 2024年值得关注的七项技术 热文 Nature | 自身免疫性疾病能被治愈吗？科学家们终于看到了希望 热文 CRISPR技术进化史 | 24年Cell综述

*仅供医学专业人士阅读参考 肿瘤脑转移（BM）是脑癌的主要类型，是最危险的癌症结果之一。在医学技术已经进步的今天，脑转移的中位总生存（OS）仍然仅有10-16个月。肺腺癌（LUAD）是最常见的脑转移癌种，超过三成的肺腺癌患者最终会出现脑转移。 脑转移很隐秘，主要在患者因为头痛或神经系统症状就诊时被发现，但此时能做的治疗已经不多。但由于缺乏有效的预测生物标志物，我们也很难识别脑转移高风险患者，无从开展早期检测和治疗。 本周，多伦多综合医院及多伦多大学科研团队在《自然·医学》杂志发文，研究者们收集了四百余份肺腺癌患者的肿瘤和血浆样本，构建了肺腺癌DNA甲基化特征模型，用于预测患者的脑转移风险。 该模型预测效果不仅优于临床特征，还可以仅凭血浆甲基化标志物对脑转移和其他脑瘤进行准确区分，可以成为神经影像学难以处理的肿瘤的“照妖镜”。 论文题图 研究者首先对166例原发肺腺癌临床注释队列进行了分析，综合详细临床数据筛选甲基化谱，共确定了5553个差异甲基化CpGs可以有效预测脑转移的发展，并依此构建了预测模型。 模型构建流程图 研究者在独立的验证队列中测试了模型效果，预测的患者脑转移高、中、低风险分层符合生存曲线，且效果独立于临床因素。 甲基化模型与其他基于临床数据的预测效果 整合临床预后因素后，模型可以更好地预测5年内脑转移的发展，AUROC高达0.82。 研究者还分别测试了不同疾病负担和分子亚型，甲基化模型都能起到不错的预测效果。 综合临床因素模型预测效果 研究者观察到，与脑转移密切相关的染色体和基因水平的拷贝数改变中，预测效果最强的有 8q23.2、21q21.3、ACTG2、BLM、FGFR3、MCL1、CCND1、EGFR、MDM2和MYC，仅有后四者曾被报道。 脑转移与其他的脑肿瘤不易区分，研究者尝试通过血浆甲基化生物标志物鉴别脑转移和神经胶质瘤/CNS淋巴瘤等主要脑瘤类型，最终得到的模型AUROC达到0.8。 模型构建流程 不过该模型在肺鳞癌（LUSC）中表现不佳，说明肺鳞癌和肺腺癌之间存在较大的甲基化差异。 总而言之，在肺腺癌脑转移缺乏预测标志物的情况下，这项研究提供了一种高准确性的脑转移预测方法，尤其是无创鉴别脑转移和其他脑瘤，具有显著的临床价值。 奇点糕近期推出了《2024ASCO年会深度盘点》课程，为大家系统盘点了2024ASCO年会上实体瘤领域的重磅进展，让您在100分钟内迅速深入把握前沿。长按识别下图中的二维码即可购买，购买后您可以在「奇点网小程序」收听，或下载奇点网「医学奇点」苹果客户端收听。如果遇到任何技术问题大家可以戳我们下图中的客服小伙伴来解决~~ 参考资料： [1]https://www-nature-com.libproxy1.nus.edu.sg/articles/s41591-024-03286-y 本文作者 | 代丝雨