GPC1

摘要 胰腺癌是致命的恶性肿瘤之一, 现有的手术切除和化疗手段均未能很好地改善患者的预后情况, 因此亟需寻找更安全有效的治疗方法以满足临床治疗需求。抗体偶联药物(antibody drug conjugate, ADC)是一类利用化学连接子将单克隆抗体与小分子细胞毒药物偶联而成的靶向抗肿瘤药物, 具有选择性高、效力高、毒副作用低等优势。近年来, ADC在多种肿瘤治疗中的成功应用掀起了抗胰腺癌ADC的研究热潮。本文就ADC的结构和作用机制及其在抗胰腺癌领域中的研究现状作一综述, 为今后抗胰腺癌ADC的研究提供一定的参考依据。 _ 正文 _ 胰腺癌(pancreatic cancer, PC)被称为“癌中之王”, 是一种侵袭性极强、预后极差的消化道恶性肿瘤, 通常在晚期才被确诊, 5年生存率只有10%左右, 是癌症相关死亡的主要原因。随着全球人口老龄化加剧, 胰腺癌的发病率和死亡率均成上升趋势, 对全球人类生命健康构成了严重威胁。 目前, 手术切除和化疗仍然是胰腺癌治疗的主要手段。然而, 只有15%~20%的患者符合手术条件, 且术后仍然伴有复发的可能。大多数患者在确诊时已出现肿瘤的远处转移, 难以再进行根治性手术切除。因此, 化疗仍然在胰腺癌临床治疗中占据着重要地位。目前常用的一线化疗药物包括5-氟尿嘧啶、亚叶酸钙、伊立替康、奥沙利铂、吉西他滨和白蛋白结合型紫杉醇等, 通常会根据患者的具体情况制定联合化疗方案, 但由于疗效有限、肿瘤细胞耐药及引发严重不良反应等问题, 未能很好地改善患者的预后情况。面对当前常规疗法的局限性, 人们亟需寻找更安全有效的治疗方法以改善胰腺癌的临床治疗现状。为此, 高特异性的抗体偶联药物(antibody drug conjugate, ADC)成为了一种极具吸引力的靶向疗法。 ADC是一类新型靶向抗肿瘤药物, 利用抗体与肿瘤相关抗原之间的特异性结合作用, 将细胞毒性药物选择性递送至肿瘤部位, 在实现对肿瘤细胞的高效杀伤作用的同时降低对正常组织的毒副作用, 是近年来肿瘤靶向治疗的研究热点。目前全球已有15种ADC获批上市, 超过100种ADC处于临床试验阶段, 在血液系统恶性肿瘤及包括乳腺癌、尿路上皮癌和HER2+胃癌等在内的实体瘤的临床治疗中取得了良好的效果。令人遗憾的是, 迄今为止尚无ADC被批准用于胰腺癌的治疗, 但人们对新的胰腺癌靶向疗法的迫切需求以及ADC在多种肿瘤治疗中的成功应用, 使得抗胰腺癌ADC受到越来越多的关注。本文就ADC的结构和作用机制以及其在抗胰腺癌领域中的研究现状作一综述。 1 ADC的结构及作用机制 ADC由能够特异性靶向肿瘤相关抗原的单克隆抗体、被称为有效载荷的高效细胞毒性药物和将二者偶联的化学连接子三部分组成, 每个部分对ADC最终的有效性和安全性都至关重要。 1.1 抗体 抗体部分的主要功能是将有效载荷靶向递送至肿瘤部位。为了降低脱靶毒性, 理想的抗体靶标应在肿瘤细胞表面特异性高表达而在正常组织中低表达或不表达。除常规肿瘤细胞抗原外, 肿瘤微环境如脉管系统和肿瘤基质中的成分也可作为ADC开发的重要靶点, 受到了研究者的广泛关注, 此类ADC有望具有更广泛的疗效, 并为应对转移性肿瘤和肿瘤细胞基因突变引起的耐药性提供了一种有希望的解决方法。 抗体是靶抗原和ADC之间的特异性相互作用的关键载体。抗体应对靶抗原具有高结合亲和力和高效内化的能力, 并具有低免疫原性和较长的血浆半衰期。目前ADC采用的抗体多为人源化免疫球蛋白G(immunoglobulin G, IgG)中的IgG1亚型, 其在血清中含量最高, 可触发Fc介导的免疫效应功能, 如抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC)、抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(antibody-dependent cellular phagocytosis, ADPC)及补体依赖的细胞毒作用(complement-dependent cytotoxicity, CDC), 有助于增强ADC整体的抗肿瘤效力。 值得一提的是, ADC的肿瘤渗透率也是影响其抗肿瘤疗效的关键因素之一, 尤其在针对实体瘤的情况下, ADC的分布不均匀会降低其在临床研究中的疗效。有学者指出, 在实体瘤中, 过高的抗原亲和力和内化能力可能会使抗体聚集在肿瘤血管周围而不能均匀渗透至远离血管的肿瘤细胞, 进而形成结合位点屏障(binding-site-barrier, BSB), 削弱ADC的肿瘤杀伤效力。因此, 在设计ADC时应充分考虑抗体的靶标亲和力和抗癌效力之间的平衡, 同时, 还有研究表明采用单抗联合给药策略有助于克服ADC的BSB, 改善其抗肿瘤疗效。此外, IgG抗体的大分子量(约150kDa)也可能影响其对实体瘤复杂脉管系统的穿透性, 进而影响ADC的肿瘤渗透率。对此, 研究人员试图开发具有更小分子量的抗体片段, 使其在保留高亲和力和特异性的同时更易于穿过血管进入实体瘤, 从而提高其对实体瘤的杀伤效果。 1.2 连接子 连接子将抗体和有效载荷偶联, 保证ADC在血浆中保持稳定, 而当其到达靶向部位时可以有效释放出活性药物。目前使用的连接子主要分为可裂解和不可裂解两种类型(表1)。 Table 1 The common linkers used in ADCs. ADCs: Antibody drug conjugates; Val-Cit: Valine-citrulline; Gly-Gly-Phe-Gly: Glycine-glycine-phenylalanine-glycine 可裂解连接子利用正常组织和肿瘤组织之间的环境差异, 使ADC在肿瘤组织中特异性释放出游离的细胞毒药物。如果释放的有效载荷具有一定疏水性, 则其可扩散至邻近细胞发挥细胞毒作用, 引发旁观者效应(bystander killing effect)。这一作用可杀伤周围不表达靶抗原的肿瘤细胞, 但也可能将有效载荷递送至正常组织而产生脱靶毒性。常见的可裂解连接子包括: pH敏感型连接子, 如可在溶酶体酸性环境下水解的腙型连接子; 可在肿瘤细胞内高水平还原型谷胱甘肽(glutathione, GSH)条件下被还原的二硫键连接子; 对肿瘤组织中高表达的酶敏感的酶促裂解型连接子, 如组织蛋白酶B可裂解的缬氨酸−瓜氨酸(valine-citrulline, Val-Cit)二肽连接子和甘氨酸−甘氨酸−苯丙氨酸−甘氨酸(glycine-glycine-phenylalanine-glycine, Gly-Gly-Phe-Gly)四肽连接子以及β-葡萄糖醛酸酶可裂解连接子。 相反, 不可裂解连接子不易受到体内化学环境或酶的影响, 具有更高的血浆稳定性和较低的脱靶毒性, 如SMCC连接子和MC连接子。采用此类连接子的ADC被肿瘤细胞内吞后, 单抗部分在溶酶体中降解, 释放出带电氨基酸−连接子−有效载荷的复合物, 其带电性质限制了它通过细胞膜扩散。因此, 采用不可裂解连接子时需要考虑原型药物和复合物之间的活性差异, 如果化学修饰会影响小分子药物的细胞毒活性, 则不适合使用该类连接子进行ADC的制备。 1.3 有效载荷 有效载荷是ADC被内吞进入癌细胞后发挥细胞毒性的主体部分。由于可以与抗体偶联的药物数量有限, 并且给药后需经过体内循环、肿瘤微环境屏障及肿瘤细胞的内吞过程, 所以仅有一小部分ADC可到达肿瘤内部, 所以需要高效的细胞毒性药物(半数抑制浓度IC50在纳摩尔和皮摩尔范围内)才能达到治疗效果。 如今, 微管蛋白抑制剂、DNA损伤剂、免疫调节剂和放射性核素均可用作ADC的有效载荷(表2)。 Table 2 The representative payloads used in ADCs. PBD: Pyrrolobenzodiazepine; TLR: Toll like receptor; STING: Stimulator of interferon genes 微管蛋白抑制剂在获批ADC中应用较多, 通过抑制微管形成、干扰细胞有丝分裂来杀伤肿瘤细胞, IC50值一般在纳摩尔范围内, 常见的有澳瑞他汀(auristatin)衍生物MMAE、MMAF和美登素衍生物DM1、DM4。而DNA损伤剂可在细胞周期的任一阶段发挥细胞毒作用, 通过不同机制破坏DNA结构从而诱导细胞凋亡, IC50值可达皮摩尔级, 包括DNA双链断裂诱导剂, 如卡奇霉素(calicheamicin); DNA烷化剂, 如多卡霉素(duocarmycin); DNA拓扑异构酶I抑制剂, 如喜树碱衍生物SN-38和Dxd; DNA交联剂, 如吡咯并苯并二氮杂卓(pyrrolobenzodiazepine, PBD)二聚体。除了传统的细胞毒素外, 包括Toll样受体(Toll like receptor, TLR)激动剂和干扰素基因刺激蛋白(stimulator of interferon genes, STING)激动剂在内的小分子免疫调节剂也作为有效载荷用于新型ADC的开发, 这类ADC被称为免疫刺激抗体偶联物(immune-stimulating antibody conjugates, ISAC)。一些ISAC候选药物已陆续进入临床试验阶段, 并被证明其可激活抗肿瘤免疫反应, 引起肿瘤消退。而放射性核素抗体偶联物(radionuclide antibody conjugate, RAC)则是由放射性核素与抗体偶联而成, 是近年来放射免疫疗法的研究热点, 常用的放射性核素包括β辐射核素131I、90Y、177Lu和188Re以及α辐射核素213Bi和211At, 目前已有90Y-ibritumomab tiuxetan、131I-tositumomab等多种RAC获批用于癌症的诊断和治疗。 1.4 ADC的作用机制 理想的ADC应当在血液循环中保持稳定, 当到达肿瘤部位后, ADC的抗体部分与肿瘤细胞表面特异性高表达的靶抗原结合, ADC被内吞进入靶细胞, 在溶酶体的作用下降解释放出有效载荷, 通过靶向DNA或微管蛋白诱导细胞凋亡。如果释放的有效载荷具有一定的膜渗透性, 则可引发旁观者效应, 有助于增强其对异质性肿瘤的疗效。除此之外, 某些ADC的抗体部分可保留其原有的活性特征, 与靶抗原结合后抑制抗原受体的下游信号转导以抑制肿瘤生长, 还可通过ADCC、ADPC、CDC等免疫活性发挥肿瘤杀伤作用。 2  ADC在治疗胰腺癌中的应用 尽管目前尚无抗胰腺癌ADC获批, 但已有许多靶向胰腺癌相关抗原的ADC被构建并在活性评价中表现出显著的抗肿瘤活性, 表明ADC在胰腺癌治疗中拥有巨大的应用潜力。在此, 本综述对正在研究中的胰腺癌相关抗原及其相关ADC进行总结和梳理(表3)。 Table 3 The ADCs in development for pancreatic cancer. Globo H: Globohexaosylceramide; c-MET: c-Mesenchymal-epithelial transition factor; Val-Ala: Valine-alanine; CEACAM5: Carcinoembryonic antigen cell adhesion molecule 5; Trop2: Trophoblast cell surface antigen 2; EGFR: Epidermal growth factor receptor; ICAM-1: Intercellular adhesion molecule-1; MUC1: Mucin 1; GPC-1: Glypican-1 2.1 间皮素(mesothelin) 间皮素是一种糖基磷脂酰肌醇锚定的细胞表面糖蛋白, 其在间皮瘤、卵巢癌、胰腺癌等恶性肿瘤中的选择性高表达使其成为诊断和预后的生物标志物及治疗靶点。 Anetumab ravtansine(BAY94-934, AR)由人源化抗间皮素单克隆抗体MF-T、可裂解的二硫键连接子SPDB和有效载荷DM4组成, 药物抗体偶联比(drug-antibody ratio, DAR)值为3.2, 当其被肿瘤细胞内化后, 连接子被还原裂解释放出DM4, 干扰细胞微管聚合, 引起细胞周期停滞和细胞凋亡。游离的DM4还可产生旁观者效应杀伤邻近间皮素表达阴性的肿瘤细胞, 这一作用使其在患者来源的异质性间皮瘤、胰腺癌和卵巢癌异种移植模型中表现出强大的抗肿瘤活性。在一项I期临床试验中共招募了148例表达间皮素的晚期实体瘤患者, 其中包括9例胰腺癌患者, AR在这些患者中表现出可控的安全性和良好的药代动力学特征并观察到初步抗肿瘤活性。随后开展了一项多中心、非随机的II期研究, 评估了AR作为单药治疗对表达间皮素的晚期胰腺癌患者的疗效, 完成研究的14名受试者中有2名病情稳定, 中位进展时间为63.5天。此外, 还开展了AR联合免疫治疗和常规化疗治疗晚期胰腺癌患者的Ib期研究, 在接受AR联合纳武利尤单抗(抗PD-1单抗)和吉西他滨治疗的所有8名患者中观察到疾病稳定, 该联合疗法将在扩展队列中开展进一步测试。 2.2 Globohexaosylceramide(Globo H)  Globo H是最初从人乳腺癌细胞系MCF-7中分离得到的一种己糖, 属于肿瘤相关糖抗原(tumor-associated carbohydrate antigens, TACAs)中的一员, 在正常组织中表达水平较低, 而在乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌等多种癌症中高表达, 可诱导肿瘤血管生成及免疫抑制, 与癌症进展密切相关。因此, Globo H成为了开发疫苗、单克隆抗体和ADC等抗癌药物的有吸引力的靶标。 OBI-999是首个靶向Globo H的新型ADC, 运用ThioBridge技术, 通过Val-Cit连接子将MMAE定点偶联到抗Globo H抗体OBI-888被还原的链间半胱氨酸残基上, 获得DAR值为4的均质ADC。临床前研究结果显示, OBI-999被Globo H高表达的肿瘤细胞内化后释放出游离MMAE, 表现出纳摩尔级细胞毒性, 同时MMAE的膜渗透性使其能够引发旁观者效应以杀死周围Globo H表达水平较低的肿瘤细胞。在表达Globo H的乳腺癌、胃癌和胰腺癌异种移植模型中, OBI999表现出剂量依赖性的肿瘤抑制作用, 并在食蟹猴中初步确认了其安全性。 以上临床前研究结果支持了其进一步的人体试验, 目前已在结直肠癌、食管癌和胰腺癌等多种晚期实体瘤患者中开展了OBI-999作为单药治疗的I期临床研究。实验结果显示, OBI-999最大耐受剂量为1.2mg·kg-1, 具有良好的耐受性, 最常见的不良反应是轻度或中度中性粒细胞减少和贫血。在0.4~1.6mg·kg-1剂量范围内, OBI-999表现出非线性药代动力学特征, 清除率随剂量增加而降低。值得注意的是, 该研究未将Globo H表达水平纳入患者招募的筛选条件中, 大多数患者不表达Globo H或Globo H表达有限, 因此OBI-999的抗肿瘤疗效有待进一步证实。现正在招募高表达Globo H的胰腺癌、结直肠癌和其他癌症患者进行II期扩展队列研究, 并根据I期研究结果确定II期推荐给药剂量为1.2mg·kg-1, 每3周给药1次, 以进一步评估OBI-999的药效。 2.3 Claudin18.2(CLDN18.2)  CLDN18.2是紧密连接蛋白家族中Claudin18的亚型, 在正常组织中表达有限, 在胰腺癌、胃癌、食管癌等癌症中过表达, 参与肿瘤细胞的增殖、分化和迁移, 是近年来癌症治疗的新兴靶点。 虽然尚无针对CLDN18.2的ADC被批准用于临床治疗, 但一些候选药物已被开发出来, 初期结果令人欣慰。CMG901、SYSA-1801、RC118及CLDN18.2-307-ADC是4种靶向CLDN18.2的ADC, 均以MMAE为有效载荷, 采用可裂解连接子将其与抗CLDN18.2单克隆抗体偶联, 在临床前研究中表现出良好的体内外抗肿瘤活性和安全性, 其中CMG901还被证明可通过激活ADCC和CDC等免疫效应诱导肿瘤细胞的凋亡。目前这4种ADC均已获批进入I期临床试验用于胃癌和胰腺癌患者的治疗。 2.4 间质表皮转化因子(c-MET) c-MET也被称为肝细胞生长因子受体(hepatocyte growth factor receptor, HGFR), 是一种由MET原癌基因编码的酪氨酸激酶受体, 在包括胰腺癌在内的多种实体瘤中过表达, 在癌细胞的增殖侵袭和化疗耐药进程中发挥着重要作用, 是一个极具潜力的癌症治疗靶点。 SHR-A1403(HTI-1066)是一种新型抗c-MET ADC, 由针对c-MET的人源化IgG2单克隆抗体通过不可裂解的硫醚接头ATPPA与澳瑞他汀类似物SHR152852偶联而成, 在高表达c-MET的AsPC-1胰腺癌异种移植小鼠模型中表现出强大的抗肿瘤效力。有趣的是, 研究人员发现, SHR-A1403可通过3种不同的作用机制发挥抗胰腺癌作用: ①通过介导微管解聚以抑制细胞增殖并诱导G2/M细胞周期阻滞和细胞凋亡; ②通过抑制上皮−间充质转化(epithelialmesenchymal transition, EMT)以减少胰腺癌细胞的迁移和侵袭; ③通过抑制胰腺癌细胞中的胆固醇生物合成来调节细胞代谢。目前, SHR-A1403已被证明在啮齿动物和非人灵长类动物中具有良好的药代动力学特性, 并被批准进入I期临床研究以评估其在晚期实体瘤患者中的安全性、耐受性、药代动力学特性及抗肿瘤疗效。 而Gymnopoulos等在抗c-MET的人源化IgG2单克隆抗体hD12的重链CH2结构域中引入半胱氨酸残基, 通过可裂解的缬氨酸−丙氨酸(valine-alanine, Val-Ala)连接子将其与PBD二聚体SG3199定点偶联, 生成DAR值约为2的均质ADC TR1801。相关研究表明, 该ADC在体内外均显示出显著的抗胰腺癌活性, 其与吉西他滨联合使用时在吉西他滨耐药的患者来源的胰腺癌异种移植模型中表现出良好的疗效。2019年开展了一项针对c-MET阳性实体瘤患者的I期临床试验以评估TR1801的安全性和药代动力学特性, 但目前该研究因投资者撤资而处于停止状态。 除此之外, 由靶向c-MET的单抗、Val-Cit连接子和有效载荷MMAE组成的ADC RC108也同样备受瞩目, 其在针对c-MET阳性晚期实体瘤的I期临床研究以及针对包括胰腺癌在内的c-MET阳性晚期消化系统恶性肿瘤的II期临床研究正在进行中。 2.5 癌胚抗原细胞黏附分子5(CEACAM5)  CEACAM5又称为CD66e, 是一种细胞表面糖蛋白, 在正常成人组织中表达有限, 在胃肠道癌、乳腺癌、非小细胞肺癌和胰腺癌等多种肿瘤中高表达, 促进癌症的侵袭和转移。CEACAM5在肿瘤和正常组织中表达水平的差异使其成为一个有吸引力的治疗靶点。 Govindan等设计了一系列连接子, 其马来酰亚胺部分用于和抗CEACAM5单克隆抗体labetuzumab偶联, 另一端则通过pH敏感的碳酸酯键或酯键与SN-38的20位羟基连接, 其中部分连接子还含有组织蛋白酶B可裂解的苯丙氨酸−赖氨酸(phenylalanine-lysine, Phe-Lys)二肽部分。通过体内外实验对得到的ADC进行评价, 最终确定含有碳酸酯键和组织蛋白酶B可裂解肽的labetuzumab-CL2-SN-38偶联物表现最佳, 其在人结肠癌和胰腺癌异种移植裸鼠模型中显著抑制了肿瘤生长并延长了生存期。 Tusamitamab ravtansine (SAR408701)是由人源化抗CEACAM5单克隆抗体SAR40837通过可裂解的SPDB连接子与DM4偶联而成的一种新型ADC, 在体外对表达CEACAM5的胰腺癌细胞系具有细胞毒活性。虽然未在胰腺癌模型中进行体内实验, 但该ADC在患者来源的结肠癌、肺癌和胃癌异种移植小鼠模型中表现出良好疗效, 目前已在晚期结直肠癌、胃癌和非小细胞肺癌等实体瘤患者的扩展队列中评估其临床活性。以上研究表明SAR408701是治疗CEACAM5阳性上皮肿瘤的有前途的候选药物, 值得进一步发掘其对胰腺癌的治疗潜力。 2.6 滋养层细胞表面抗原2(trophoblast cell surface antigen2, Trop2)  Trop2是一种跨膜糖蛋白, 参与多种致癌信号通路, 促进肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移, 其在多种实体瘤中的过表达使其成为肿瘤治疗的理想靶点。 目前, 靶向Trop2的ADC已在临床上取得了可喜的结果, 由人源化抗Trop2单克隆抗体hRS7、含有碳酸酯键的pH敏感型CL2A连接子和SN-38组成的sacituzumab govitecan(IMMU-132, SG)于2020年被FDA批准用于治疗三阴性乳腺癌。SG在临床前研究中便对Capan-1和BxPC-3胰腺癌异种移植小鼠模型表现出显著的抗肿瘤作用, 在I/II期临床试验中纳入了16例胰腺癌患者, 其中7例病情稳定, 中位总生存期为4.5个月, 中位无进展生存期为2个月, 但因其对胰腺癌的疗效并不十分理想, 后续的临床研究主要集中于乳腺癌和尿路上皮癌, 而未再对胰腺癌开展进一步的疗效评估。 然而, 针对Trop2的抗胰腺癌ADC的研究并未止步。Li等开发了一种靶向Trop2的人源化单克隆抗体hIMB1636, 分别与p-SCN-Bn-NOTA(NOTA)和DOTA-NHS-ester(DOTA)偶联后, 采用64Cu和177Lu对抗体进行放射性标记, 得到的64Cu-NOTA-hIMB1636T3M4可无创性评估体内Trop2的表达水平, 而177Lu-DOTA-hIMB1636可抑制T3M4异种移植肿瘤的生长。Sun等则采用Val-Cit连接子将hIMB1636与MMAE偶联, 得到的hIMB1636-MMAE可诱导胰腺癌细胞的G2/M细胞周期阻滞并引起细胞凋亡, 还能有效抑制肿瘤细胞的迁移并能引发旁观者效应和ADCC效应, 在T3M4和BxPc-3胰腺癌异种移植模型中表现出良好疗效。尤其在BxPc-3模型中, 同一剂量的hIMB1636-MMAE比SG具有更高肿瘤抑制率, 是一种有前途的胰腺癌治疗药物。Xu等则另辟蹊径, 不再选择传统的单克隆抗体作为靶向载体, 而是开发了一种人源化抗Trop2纳米抗体Nb4, 并将其与抗人血清白蛋白(human serum albumin, HSA)的纳米抗体连接以延长其血浆半衰期, 得到的分子HuNbTROP2-HSA再通过Val-Cit连接子与MMAE偶联, 生成一种DAR值为1的新型靶向Trop2的纳米抗体偶联药物(nanobody drug conjugate, NDC), 对Trop2具有较强的亲和力并能被肿瘤细胞有效内化, 在BxPC-3胰腺癌异种移植模型中表现出良好的疗效。该项研究填补了当前抗Trop2ADC用于胰腺癌治疗的研究空白, 为治疗胰腺癌和其他Trop2阳性肿瘤提供了新的可能性, 并为新一代ADC的设计研发提供了值得借鉴的思路。 2.7 表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)  EGFR是一种受体酪氨酸激酶, 属于ErbB家族蛋白, 通过激活下游MAPK、PI3K/AKT和JAK/STAT等信号通路促进细胞增殖和存活。已在多种恶性肿瘤中观察到EGFR基因的突变或扩增, 并发现其与肿瘤的生长、侵袭和转移有关。因此, EGFR一直是极具吸引力的癌症治疗靶点。 Li等通过两种接头不同的可裂解Val-Cit连接子MC-VC-PAB和PY-VC-PAB, 将MMAE偶联到人源化抗EFGR单克隆抗体RC68上, 合成了两种ADC, RC68-MC-VC-PAB-MMAE和RC68-PY-VC-PAB-MMAE, DAR均为4左右。体内外活性评价结果显示, 这两种ADC可与肿瘤细胞表面的EGFR结合并被有效内化, 导致EGFR阳性胰腺癌细胞死亡, 对BxPC-3异种移植肿瘤的抑制作用强于盐酸吉西他滨。值得一提的是, 前者的MC接头只能随机与抗体上的单个巯基反应, 而后者的PY接头可在抗体链间二硫键被还原后同时与形成的两个巯基反应, 将断开的两条链重新共价连接, 因此RC68-PY-VC-PAB-MMAE在人血浆中具有更好的稳定性。Greene等采用了与PY接头类似的链间半胱氨酸桥接定点偶联策略, 使用含二溴哒嗪二酮(dibromopyridazinedione, diBrPD)接头的Val-Cit连接子, 将MMAE偶联到靶向EGFR的西妥昔单抗(cetuximab, CTX)上, 得到平均DAR值为3.9的ADC, 在KRAS突变的MIA PaCa-2和PANC-1异种移植模型中表现出剂量依赖性的肿瘤生长抑制作用。Zhu等则以单克隆抗体LR004为靶向载体, DM1为有效载荷, 采用不可裂解的SMCC连接子将二者偶联, 构建了靶向EGFR的抗胰腺癌ADC, 在体内外均表现出显著的肿瘤抑制活性。以上研究结果展现了以EGFR为靶点的ADC在胰腺癌治疗方面的应用潜力, 但其最终能否实现临床转化还需进一步的临床研究验证。 2.8 细胞间黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1) ICAM-1又称CD54, 是免疫球蛋白超家族的一种跨膜糖蛋白, 在三阴性乳腺癌、黑色素瘤、胰腺癌等多种癌症中过表达, 且与肿瘤的侵袭性和不良预后有关。胰腺癌中常见的致癌突变KRASG12D可诱导胰腺腺泡细胞上调ICAM-1的表达水平以吸引巨噬细胞进而驱动胰腺癌病变的形成。ICAM-1在胰腺肿瘤中特异性高表达并能被细胞有效内化的特性使其成为抗胰腺癌ADC的靶点之一。 Huang等使用SMCC连接子和DM1构建了一种靶向ICAM-1的ADC, 其对人胰腺癌细胞的杀伤活性是当前治疗胰腺癌的一线化疗药物吉西他滨的2000多倍, 而在不表达ICAM-1的人正常胰管上皮细胞中未显示出细胞毒性。在具有KRASG12D突变的PANC-1胰腺癌小鼠模型中, ICAM-1-SMCC-DM1表现出有效且持久的肿瘤消退作用, 并能有效抑制胰腺癌向肺、肝和脾脏等正常器官转移。以上临床前研究数据证明了该靶向ICAM-1ADC的抗胰腺癌效力, 有望用于胰腺癌的靶向治疗, 但在进入临床应用之前还需进一步评估其安全性和有效性。 2.9 黏蛋白1(mucin1, MUC1)  MUC1是一种高度糖基化的I型跨膜糖蛋白, 在90%的胰腺癌患者中异常高表达, 且与其不良预后有关, 是胰腺癌治疗的重要靶点之一。MUC1的CA6唾液酸糖表位在正常组织中表达有限, 但在胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌等上皮癌中过表达。Nicolazzi等以此为靶点, 生成了人源化单克隆抗体huDS6, 通过含二硫键的可裂解SPDB连接子与DM4偶联, 得到的ADC SAR566658在Capan-2胰腺癌异种移植模型中表现出剂量依赖性的肿瘤抑制活性。Wu等则开发了一种靶向MUC1的SEA结构域的人源化单克隆抗体HzMUC1, 通过Val-Cit连接子与MMAE偶联生成HzMUC1-MMAE, 该ADC能够有效抑制CFPAC-1和Capan-2异种移植肿瘤的生长, 是一种有前途的胰腺癌靶向治疗药物。 2.10 磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1(glypican-1, GPC-1) 迄今为止, FDA批准的所有用于治疗实体瘤的ADC都直接靶向肿瘤细胞中特异性表达的抗原, 然而, 肿瘤基质中肿瘤相关成纤维细胞(cancer associated fibroblasts, CAFs)产生的细胞外基质蛋白会阻碍药物的有效递送, 这也是这些ADC对胰腺癌等富含基质的实体瘤治疗效果欠佳的原因之一。有趣的是, 研究发现胰腺肿瘤中的癌细胞和CAF均存在GPC-1的特异性过表达, 并与胰腺癌细胞的增殖、转移和血管生成有关。 在此基础上, Tsujii等提出了通过靶向CAF的ADC的旁观者杀伤效应治疗富含基质的实体瘤的新策略。该团队构建了一种由Val-Cit连接子将MMAE和具有高内化活性的小鼠抗GPC-1单克隆抗体01a033偶联而成的抗GPC-1ADC, 其可在体外抑制GPC-1阳性胰腺癌细胞的增殖, 在GPC-1阳性CAF/GPC-1异质性癌细胞以及GPC-1阳性CAF/GPC-1阴性癌细胞的胰腺癌肿瘤异种移植模型中均表现出显著的肿瘤生长抑制作用。进一步实验证明, GPC-1-MMAE被递送到CAF并被有效内化后, 连接子被蛋白酶水解释放出具有膜渗透性的游离MMAE, 因CAF高表达多药耐药蛋白-1(multi drug resistance-1, MDR-1)而未观察到CAF的凋亡, 但CAF可通过MDR-1将MMAE输送到邻近癌细胞从而产生旁观者效应, 诱导其凋亡。而使用MMAF作有效载荷时, 游离MMAF的羧酸末端会限制其穿过细胞膜而不能产生旁观者效应, GPC-1-MMAF对上述两种肿瘤异种移植模型的疗效有限。由此可见, 旁观者效应是抗GPC-1ADC发挥体内抗肿瘤活性的关键。基于以上研究, 该团队进一步开发了人源化抗GPC-1单克隆抗体T2, 用相同的方法与MMAE偶联, 得到的ADC被证明在胰腺癌患者来源的肿瘤异种移植模型中表现出良好的体内疗效, 有望进一步推进其临床开发。此项研究为克服肿瘤基质屏障导致的药物递送问题提供了新的ADC设计思路, 推进了ADC治疗胰腺癌等富含基质的实体瘤的应用研究。 3 小结与展望 ADC药物在治疗血液病肿瘤、乳腺癌和肺癌等疾病中的良好临床疗效激发了研究者对抗胰腺癌ADC的研究兴趣。然而, 胰腺癌复杂的肿瘤微环境和ADC本身的特性为抗胰腺癌ADC的临床转化提出了诸多挑战, 尽管临床前研究数据已显示ADC在胰腺癌治疗领域有着广阔的应用前景, 但其对胰腺癌患者的临床疗效仍未得到证实。 胰腺肿瘤微环境具有高度促结缔组织增生、强免疫抑制、缺乏血管分布等特性, 限制了高分子量ADC对肿瘤组织的渗透效率, 进而影响其疗效。对此, 摒弃传统的单克隆抗体结构, 选择将有效载荷偶联到分子量更小的靶向运输载体上成为了新的研究方向。已有研究报道, 由多肽或纳米抗体与有效载荷偶联而成的偶联物在胰腺癌治疗方面有着强大的应用潜力。如柔红霉素(daunomycin, Dau)通过肟键与Ser-Lys-Ala-Ala-Lys-Asn(SKAAKN)归巢肽偶联而成的肽−药物偶联物被证明对PANC-1荷瘤小鼠具有显著的抗肿瘤活性; 靶向癌胎抗原5T4的纳米抗体n501、CL2A连接子和SN-38组成的偶联物, 相较于传统的基于全序列IgG1的ADC而言, 具有更强的肿瘤渗透性、更高的肿瘤摄取率和更快的肿瘤部位积累速度, 在BxPC-3胰腺癌异种移植模型中表现出更强的疗效。这些新型偶联物为突破当前传统ADC在胰腺癌治疗方面的局限提供了新的可能。 另一方面, 以肿瘤微环境中的成分作为ADC的治疗靶点亦是一种有前途的研发策略。相关研究表明, 靶向肿瘤基质的ADC可克服基质屏障, 通过可裂解连接子释放疏水性游离药物, 产生旁观者效应杀伤邻近癌细胞, 是将细胞毒药物递送至富含基质的实体瘤的有效方法, 且有助于应对肿瘤细胞下调靶抗原表达水平导致的耐药性问题。如靶向肿瘤基质中表达GPC-1的CAF的ADC被证明在治疗富含基质的肿瘤方面有广阔的应用前景。此外, ADC与其他作用机制的药物的联合使用也是未来临床应用研究中值得关注的重点。合理设计的联合用药方案有利于克服耐药性问题、增强疗效、减少给药剂量并减轻毒副作用。已有的临床数据显示, ADC与抗PD-1单抗等免疫检查点抑制剂和吉西他滨等常规化疗药物的联合使用可能有助于提高整体疗效, 后续有待更多的临床研究来进一步证实。总体而言, 尽管抗胰腺癌ADC还未成功实现临床转化, 但其在胰腺癌治疗方面有着强大的应用潜力。随着人们对胰腺癌的研究逐步深入以及ADC研发技术的不断提升, ADC将在胰腺癌临床治疗领域大放异彩。 作者贡献 李泓璇负责文献检索和文章撰写; 王莹负责文章内容核对和修改;王菊仙负责文章选题、指导和审校。 参考文献 详见《药学学报》2024年 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

摘要：液体活检是一种通过血液、唾液和尿液等生物液体进行微创检测的革命性策略，用于癌症的诊断和预后预测。外泌体是细胞外囊泡（EVs）的一个子集，它们在供体细胞和受体细胞之间穿梭分子货物，并在调节细胞间通讯中发挥着关键作用。越来越多的研究表明，外泌体有很大的潜力作为液体活检中的新型生物标志物，因为大量的外泌体富集在体液中，并参与了许多生理和病理过程。然而，外泌体在临床应用中的进一步发展受到高质量分离和组分分析方法缺乏的极大限制。本综述旨在提供关于外泌体分离、表征和内容检测的传统和新型技术的全面概述。此外，总结了外泌体作为液体活检中潜在生物标志物在癌症诊断、治疗监测和预后预测中的作用。最后，评估了将基于外泌体的液体活检应用于精准医学的前景和挑战。 1.引言 癌症是全球主要的死亡原因之一。越来越多的证据表明，癌症的发展是一个动态过程，涉及多种组分，包括肿瘤细胞、基质细胞和免疫细胞。到目前为止，组织活检被认为是癌症诊断的最常用方法。然而，提取的少量组织无法代表肿瘤的异质性或监测动态的肿瘤进展，并且这种侵入性方法可能会增加转移的潜力，最终导致生存和预后不良。由于微创性，液体活检通过收集血液和尿液等生物液体的样本，已经引起了广泛关注，并为癌症诊断和实时监测创造了更多机会。外泌体，直径为40-160纳米，是由大多数细胞积极释放并在体液中稳定循环的脂质双层膜囊泡。最初被低估为细胞废弃物的运输工具，外泌体现在被认识到是细胞间通讯的重要参与者。积累的证据表明，包括核酸、蛋白质和脂质在内的各种生物活性分子富集在外泌体中，并且可以从供体细胞转移到受体细胞，导致信息的细胞内转移。外泌体中的生物活性货物可能被受体细胞摄取，促进肿瘤发生和进展。此外，外泌体参与了前转移生态位的形成、肿瘤血管生成和肿瘤免疫抑制。而且，外泌体可以反映其亲本细胞的生理和病理状态的改变。这些发现导致了分析循环外泌体及其衍生货物可能为癌症液体活检提供新机会的想法（见图1），突显了外泌体作为癌症诊断、进展监测和预后预测的生物标志物的潜力。 图1 外泌体作为液体活检的新靶标。外泌体在体液中富集，并在肿瘤发生、进展和转移中发挥关键作用。与传统的循环肿瘤细胞(CTC)和循环肿瘤DNA(ctDNA)相比，外泌体显示出卓越的特性，如活细胞分泌的囊泡、大量存在和稳定循环。传统和先进的技术已被用于从各种体液中分离外泌体并检测外泌体的载物。特定外泌体分子的检测可能为癌症诊断、进展监测和预后预测提供新策略。 目前，循环肿瘤细胞（CTCs）、循环肿瘤DNA（ctDNA）和外泌体已成为液体活检的三个主要分支。与CTCs和ctDNA相比，外泌体在液体活检中显示出更大的优势。首先，在生物液体中存在大量的外泌体（约10^9个/mL）有助于相对容易地获得囊泡，而每毫升血液样本中只有几个CTCs。其次，外泌体由活细胞分泌，具有来自其亲本细胞的丰富生物学信息。因此，外泌体比ctDNA更具代表性，后者有限地反映了凋亡或死亡肿瘤细胞的信息。第三，由于其脂质双层，外泌体本质上是稳定的，即使在恶劣的肿瘤微环境中也能稳定循环。高生物学稳定性允许长期储存样本以进行外泌体分离和检测。值得注意的是，将外泌体应用于液体活检的一个重大挑战是高效和高纯度的分离，这源于它们的纳米尺度大小和固有的异质性。此外，由于癌症外泌体只占体液中外泌体总数的一小部分，超敏感和特异性检测是发展基于外泌体的癌症诊断的先决条件。迄今为止，已经开发了各种方法用于外泌体分离以及外泌体蛋白和核酸的检测。尽管取得了显著进展，但灵敏度和特异性有限、纯度和通量低仍然是学术研究和实际应用的重大挑战。因此，需要积极研究开发易于操作、高灵敏度和高纯度的外泌体分离和检测平台。在这篇综述中，我们讨论了外泌体分离和检测的最新进展以及它们在临床上的应用，强调了新开发的外泌体分离和检测技术。此外，总结了外泌体作为癌症液体活检中潜在生物标志物的应用。 2.外泌体生物发生和内容物 外泌体是由大多数细胞积极释放的异质群体的膜结构囊泡，可以在许多人体液体中找到，如血液、唾液、眼泪和尿液。外泌体生物发生的过程涉及质膜的内陷、多囊泡体（MVBs）的形成和外泌体分泌。MVBs是由内吞体膜向内膨胀形成的内吞结构。在MVBs内部积累的囊泡，称为腔内囊泡（ILVs），通过MVBs与质膜的融合作为外泌体释放（见图2）。广泛的研究表明，供体细胞衍生的生物活性分子富集在外泌体中，这表明外泌体在遗传信息交换中的关键作用。值得注意的是，与亲本细胞相比，外泌体中特定的RNA组分显示出很大的差异，这可能归因于外泌体形成过程中独特的货物分选过程。货物分选的机制尚不清楚，已报道内吞体分选复合物（ESCRT）依赖方式和ESCRT独立机制参与了这一过程。有趣的是，四跨膜蛋白（CD9、CD63和CD81）、热休克蛋白（HSP60、HSP70）和ESCRT相关组分（Alix和TSG101）已被确认存在于外泌体中，这为它们的识别和检测提供了一定的标记。 图2 外泌体的生物发生、内容物和内化作用。外泌体是由多囊泡体与质膜融合而衍生的囊泡。来自供体细胞的细胞质内容物，如核酸和蛋白质，被分选进入外泌体，并通过内吞作用、吞噬作用、直接融合或直接结合（受体-配体相互作用）的方式传递给受体细胞。 越来越多的研究表明，各种与疾病相关的蛋白质和核酸被装载到外泌体中，并且在不同起源的肿瘤中差异性表达。Hoshino等人指出，通过蛋白质组学分析，血浆衍生的外泌体可以识别特定的癌症类型并区分肿瘤来源。他们发现，51种和19种血浆衍生外泌体蛋白分别在胰腺癌和肺癌中被特异性识别。此外，据报道，卵巢癌中外泌体的CD63高表达，而在肺癌中低表达。CD317和表皮生长因子受体（EGFR）在非小细胞肺癌（NSCLC）衍生的外泌体上高度表达。与健康受试者相比，糖蛋白-1（GPC-1）在胰腺癌患者的血清外泌体中显著增加，并且可以用于早期检测胰腺癌，具有100%的诊断特异性和敏感性。除了蛋白质，如miRNA、mRNA和lncRNA等核酸在外泌体中差异分布，并且可以用作特定的癌症生物标志物。例如，在胶质母细胞瘤患者的血清外泌体中检测到突变型EGFRvIII mRNA。Zhou等人报道，外泌体miR-15a-5p的表达水平在子宫内膜癌中比其他癌症类型高7-19倍。此外，外泌体miR-1247-3p的高表达与肝癌的肺转移正相关，这表明预后不良。鉴于外泌体由活细胞分泌，外泌体中的具体内容物可以反映其亲本细胞的病理生理状态，这使它们成为疾病进展动态监测的有用生物标志物。总的来说，被分选到外泌体中的货物不仅可以为它们的识别提供额外的特征，而且为癌症患者的诊断、治疗监测和预后预测提供了有希望的生物标志物，为液体活检提供了一种新工具。 3.外泌体分离和富集方法 由于独特的形成方式和特定的货物分选过程，外泌体在大小和分子内容上是异质的。从复杂的生物组分中外泌体的分离和富集对于基础研究和临床转化至关重要。到目前为止，已经开发了许多方法，这些方法在分离外泌体的数量和纯度上有显著差异。 4.传统分离方法 4.1.基于超速离心的分离 作为外泌体分离的金标准，超速离心是最常用的方法，包括差速超速离心和梯度密度超速离心。传统的差速超速离心最初由Johnstone等人提出，用于从网织红细胞的培养基中分离外泌体。通常，首先使用低速离心（300 g）去除细胞碎片，然后使用20,000g速度的离心去除其他大囊泡。最后使用高力（100,000g）沉降外泌体。然而，这种方法需要昂贵的仪器，并且存在聚集蛋白的污染。更多的离心周期可以获得更纯净的结果，但会导致更低的回收率。梯度密度超速离心是获得更高纯度外泌体的更好选择。在离心过程中，不同大小的颗粒从两个或多个溶液中分离成不同的层，其密度从上到下增加。基于此，该方法已被应用于分离外泌体，发现它们在密度为1.15到1.19g/mL处浮动。尽管比超速离心具有更高的纯度，但耗时的过程和对大量生物液体的需求大大限制了其在临床应用中的使用。 4.2.基于大小的分离 固定范围直径的特征允许通过基于大小的方法分离外泌体。过滤是使用具有特定孔径的膜过滤器进行外泌体分离的一种基于大小的方法，具有操作简单和有效纯化的优点，但产量低。超滤通常应用于从大量原始材料（如细胞培养基）中浓缩外泌体。目前，超滤与超速离心的结合已被广泛采用，在这种方法中，过滤用于去除细胞和大囊泡，而外泌体的纯化通过超速离心实现。此外，尺寸排除色谱（SEC）可以根据样品的大小和凝胶孔径分离生物分子组分。在分离过程中，大分子早期被洗脱，而小分子或颗粒直接扩散进入孔中。Anita N Böing等人开发了一种基于交联琼脂糖CL-2B柱的SEC协议，该协议可以有效地从无血小板上清液中分离直径大于70nm的外泌体。郭等人表明，CL-6B柱在颗粒产量和外泌体纯度方面比CL-2B柱表现更好。与离心和过滤方法相比，SEC具有温和处理和非破坏性结果的优点。此外，SEC与超速离心的结合可能具有提高的回收率和纯度。 4.3.沉淀技术 对于沉淀技术，使用高度亲水的聚合物与外泌体膜周围的水分子竞争性结合，从而降低溶解度，最终实现外泌体分离的低输入体积。迄今为止，聚乙二醇（PEG）是用于外泌体分离的最常用聚合物。Rider等人提出了一种名为ExtraPEG的外泌体纯化方法，该方法能够快速富集外泌体，并从囊泡中获取足够的内容物以供下游分析。最近，许多依赖沉淀技术的商业试剂盒已经被开发用于外泌体的分离和富集，如ExoQuick™和Total Exosome Isolation。Ding等人的研究表明，与其他试剂盒相比，ExoQuick™能够产生相对较高的外泌体产量。然而，这种方法经常因其高成本和共沉淀蛋白聚集体的污染而受到批评。 5.新的富集方法 外泌体特异性标记物和组分的发现为分离外泌体及外泌体亚群（图3）提供了新的途径。通过针对肿瘤相关蛋白如GPC-1和EpCAM（上皮细胞粘附分子）的特异性抗体和核酸适配体，可以很好地区分癌细胞来源的外泌体和正常细胞来源的外泌体。此外，微珠、微流控芯片和热泳等应用使得外泌体的快速便捷富集成为可能。在这里，我们总结了新方法在外泌体富集中的优势和局限性（表1）。 5.1.免疫亲和富集 由于简单性和特异性的优势，免疫亲和分离策略已被用于许多研究中的外泌体富集（图3A）。例如，张等人制造了一种针对活化微流控芯片的抗CD81功能化外泌体分离方法。杨等人报告了一种通过形成AuNC-外泌体-AuR复合物的三明治结构进行外泌体分离的集成微流控装置（图3Aa）。该装置在30分钟内从5mL尿液样本中获得了5×109个颗粒的产量。然而，捕获的外泌体的解离仍然是一个巨大的挑战，这源于抗原和抗体之间的强亲和力。为了解决这一挑战，康等人开发了一种外泌体特异性双模式免疫过滤（ExoDIF）装置。生物素化的抗CD63抗体固定在内通道表面，该表面依次用3,3'-二硫双磺苏糖咪啶（DTSSP）、生物素化牛血清白蛋白和亲和素处理。结果，从高稀释的细胞培养基中捕获了近87.1%的外泌体。值得注意的是，被捕获的外泌体可以通过DTT（二硫苏糖醇）解离，通过破坏DTSSP中嵌入的二硫键（图3Ab）。 最近，康等人提出了一种EVs on demand芯片（EVOD），通过四氮唑-抗EpCAM/抗EGFR抗体（TzAb）与TCO（反式环辛烯）功能化的微流控表面之间的反应，实现了癌症相关外泌体亚群的捕获。该芯片能够从癌症患者中选择性地比从健康捐赠者中多分离出76%的EGFR+外泌体，显示出对NSCLC早期检测的巨大潜力。孙等人设计了一个有趣的共价化学介导的EV点击芯片，通过多标记鸡尾酒（抗EpCAM、抗ASGPR1（唾液酸糖蛋白受体1）、抗CD147）从血浆样本中识别、富集和回收肝细胞癌（HCC）特异性外泌体（图3Ac）。所提出的外泌体纯化系统实现了超过81%的回收率和超过85%的纯度，为检测肝细胞癌提供了一种新的液体活检工具。尽管意义重大，但这些方法成本高且依赖于标记物。此外，应更多关注捕获外泌体的非破坏性释放。 5.2.磁性分离和富集 基于磁性珠的免疫亲和富集近年来因其便利性和高效率而受到广泛关注（图3A）。通常，外泌体通过抗体修饰的磁性珠被捕获，然后通过磁场力分离。例如，方等人进行了CD63抗体共轭磁性纳米粒子以分离外泌体。此外，新型免疫亲和超顺磁性纳米粒子（IS-NPs）被证明具有高效率，通过β-环糊精（β-CD）和4-氨基偶氮苯（AAB）之间的相互作用将抗CD63抗体与超顺磁性纳米粒子结合（图3Ad）。α-CD，一种从β-CD-AAB包合物中提取AAB的竞争性试剂，被适应用于外泌体的洗脱。结果，在人工模型样本中外泌体的捕获和释放效率分别高达80%和86.5%。与传统分离方法相比，IS-NPs方法显示出更高的产量、更高的纯度以及更好地保留了外泌体的结构和功能完整性。特别是癌症衍生的外泌体亚群的分离可以通过将磁性珠与针对肿瘤特异性生物标志物的抗体结合来实现。罗等人通过免疫亲和磁性珠和基于DNA折纸的核酸适配体进行了外泌体的快速分离和捕获。通过与DNA荧光探针的结合，可以实现外泌体的定量检测。李等人开发了一种均质磁荧光外泌体（hMFEX）纳米传感器，用于从乳腺癌患者的80μL血浆中分离GPC-1阳性外泌体。何等人开发了一个微流控平台，通过将样本与抗EpCAM或抗CA125抗体标记的磁性珠混合来捕获肿瘤衍生的外泌体。总的来说，免疫磁性分离方法有潜力促进快速分离和临床应用的循环外泌体在所需领域的实现。 图3 外泌体分离新技术。A 免疫亲和/免疫磁性富集。版权所有 2020 年 Yang ，2017 年 Kang ，2018 年 Cai ，2020 年 Sun 。B 基于物理特性的分离。版权所有 2017 年 Liu ，2019 年 Sunkara V ，2019 年 Hattori 。C 脂质介导分离。版权所有 2018 年 Xu ，2021 年 Jiang 。D 基于声学的分离/热泳富集。版权所有 2021 年 Tayebi ，2019 年 Liu ，2021 年 Tian 。 5.3.基于物理特性的分离方法 基于尺寸的微流控芯片被用来从大细胞碎片或其他膜状囊泡中分离外泌体（见图3B）。刘等人设计了一个基于尺寸的外泌体全隔离芯片（ExoTIC），其中30-200纳米的外泌体通过多个纳米孔膜被富集和纯化（见图3Ba）。与传统的超速离心和商业PEG沉淀试剂盒相比，ExoTIC从小体积的人类血浆中获得了更多的外泌体产量。然而，膜孔堵塞大大限制了外泌体的连续分离。为了克服这个问题，陈等人引入了一个超快隔离系统，EXODUS，它将双耦合谐波振荡集成到双膜过滤器配置中。通过周期性负压和气压切换，在线性纳米孔阳极氧化铝膜上产生了周期性负压振荡，允许小颗粒（即蛋白质和核酸）和流体通过，而较大的外泌体则留在中心腔室。此外，两对振荡器通过横向波和声流学流动使颗粒重新悬浮到液体中，有效限制了污染和颗粒聚集。此外，切向流过滤（TFF）是一种有效减少孔堵塞潜在技术，由于流向和过滤方向垂直状态。Sunkara等人开发了一个微流控切向流过滤装置，Exodisc，用于从人类血浆和尿液中分离外泌体，与传统方法相比，显示出更好的外泌体产量（见图3Bb）。决定性横向位移（DLD）已被用于外泌体分离，因为不同大小的颗粒在具有特定角度显示的微柱平台上表现出不同的轨迹。Wunsch等人提出了一个纳米尺度的横向位移（nano-DLD）阵列，其中较大的囊泡在阵列中横向位移并被收集在侧通道，而较小的囊泡以之字形从阵列中排出，最终实现尿液来源的外泌体的收集。然而，DLD受到通量低和需要高电压的限制，囊泡的密度和刚度可能会干扰基于DLD的外泌体分离。 5.4.基于脂质的分离 囊泡表面的脂质分子使外泌体捕获得以通过亲和介导（见图3C）。万等人报道了一种脂质纳米探针，用于从血浆中快速分离外泌体。外泌体的脂质双层被生物素标记的1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-聚（乙二醇）（DSPE-PEG）探针标记，其中DSPE通过疏水效应插入外泌体膜，PEG在水相中提供溶解性。NeutrAvidin包被的磁性亚微米颗粒被用于通过亲和素-生物素亲和收集外泌体。结果，仅需要15分钟就能分离外泌体，大大缩短了分离程序。值得注意的是，胆固醇-PEG1000约6.4纳米被认为可以最小化脂质纳米探针表面固定时的空间位阻，从而实现了更高的捕获效率。此外，吸附在囊泡膜上的脂质分子也被应用于捕获外泌体。T细胞膜蛋白4（Tim-4），对磷脂酰丝氨酸（PS）有很高的亲和力，已被证实有助于从血清样本中简单分离外泌体，使快速下游分析更加容易（见图3Ca）。此外，TiO2壳层与外泌体磷酸基团的亲和作用是富集磷酸化肽段的一种新策略。庞等人使用Fe3O4@TiO2纳米颗粒在5分钟内富集和分离外泌体，捕获效率为96.5%。Fe3O4@TiO2纳米颗粒与表面增强拉曼散射（SERS）标签的结合可以同时富集外泌体并实现目标miRNAs的原位鉴定（见图3Cb）。 5.5.基于声学的分离方法 基于声学的微流控是一种简单高效的外泌体分离方法。通常，超声波应用于样本，颗粒根据其物理特性（如大小和密度）经受不同的作用力并被分离（见图3D）。Anson等人利用微米级种子颗粒和纳米颗粒在谐振腔中的超声波散射来富集外泌体。集成的声学装置实现了快速操作、非接触和连续分离尿液和血浆样本中的外泌体。吴等人开发了一个声流学平台，用于直接、无标记、非接触富集全血中的外泌体。该装置集成了两个分离模块，其中一个能够去除直径大于1微米的颗粒，另一个可以从未外泌体和其他颗粒中分离外泌体。最近，顾等人报道了一个声学驱动的旋转液滴装置，其中倾斜的交错换能器（IDTs）被用来根据不同频率的声波使纳米颗粒移动。通过将两个不同大小的液滴放置在一起，可以特别集中固定大小的颗粒。结果，该方法可以从5微升样本中在不到1分钟的时间内分离外泌体。此外，Tayebi等人将声辐射力（ARF）与介电泳（DEP）结合起来，在流动路径中放置高频（>10 MHz）的交错换能器，同时产生ARF和介电泳力场。介质中的颗粒通过流体阻力、ARF和DEP力场之间的竞争呈现横向平移，从而实现了细胞外囊泡的主动分离（见图3Da）。 5.6.热泳富集 热泳是指颗粒通过局部激光加热诱导的温度梯度，从高温区域迁移到低温区域的现象。为了解决耗时的分离和纯化程序的挑战，刘等人开发了一种敏感的热泳方法来富集肿瘤衍生的外泌体。通过使用针对肿瘤特异性标记物的核酸适配体，热泳能够实现快速分离和富集外泌体，而无需预先分离外泌体（见图3D）。外泌体的积累产生了核酸适配体的放大荧光信号，这使得外泌体表面生物标志物的分析以及miRNAs的检测成为可能（见图3Db）。田等人进行了类似的检测，分析了1微升血浆中的外泌体，为转移性乳腺癌的液体活检提供了一种低成本、敏感的方法（见图3Dc）。 6.外泌体表征 如2018年细胞外囊泡研究的最小信息标准（MISEV2018）所建议，外泌体的鉴定应包括西方墨点验证外泌体特异性标记物，并且至少使用两种方法对外泌体单个颗粒进行表征。 6.1.可见表征 透射电子显微镜（TEM）被认为是识别和表征单个外泌体的常用方法，其典型结构为杯状（见图4A）。对于扫描电子显微镜（SEM），通过收集从样本中弹出的电子来呈现图像（见图4C）。值得注意的是，外泌体的形态可能会受到样本处理过程中脱水的影响。相反，冷冻电子显微镜（冷冻-EM）是更好的选择，因为它避免了样本固定和脱水。外泌体在非常低的温度下被分析，并且呈现出与TEM图像不同的圆形结构（见图4B）。此外，原子力显微镜（AFM）可以通过振幅调制和相位调制提供表面形态和材料属性（刚度、粘附性）的信息（见图4D）。而且，特定外泌体膜标记功能化的AFM探针允许单个外泌体中蛋白质的识别和检测。 图4 外泌体表征技术。A 透射电子显微镜。版权所有 2020 年 Li。B 冷冻电镜。版权所有 2018 年 Tian。C 扫描电子显微镜。版权所有 2010 年 Sharma 。D 原子力显微镜。版权所有 2010 年 Sharma。E 动态光散射。F 纳米颗粒追踪分析。G 可调电阻脉冲传感。 6.2.定量表征 动态光散射（DLS）是一种测量外泌体尺寸分布和zeta电位的技术。散射光的干涉和强度变化可以通过传感器识别，从而估计颗粒的尺寸分布（见图4E）。然而，蛋白质聚集体和大囊泡的污染使得DLS很难将它们与外泌体区分开来。纳米颗粒跟踪分析（NTA）是一种广泛用于确定颗粒浓度和尺寸分布的方法（见图4F）。颗粒被一束光照射，散射光信号被光学显微镜收集。可调电阻脉冲传感（TRPS）检测外泌体通过充满导电介质的孔时离子电导率变化产生的电信号（见图4G）。 7.检测外泌体内容物的技术 7.1.传统的蛋白质分析 外泌体中的膜蛋白和细胞质蛋白都可以被检测到。一些外泌体上的膜蛋白参与了癌症的发展和进展，因此被用作外泌体分离和纯化的靶点。西方墨点和酶联免疫吸附测定（ELISA）是检测外泌体蛋白质的两种常规方法。然而，这些方法面临着复杂程序和低灵敏度问题。 8.新的蛋白质检测方法 8.1.比色检测 到目前为止，已经开发出多种新技术来检测外泌体蛋白质（见表2）。比色检测是一种通过比较或测量有色物质的颜色强度来确定组分含量的方法（见图5A）。与其他纳米材料如Fe3O4 NPs和AuNPs类似，DNA具有显著增加单壁碳纳米管（s-SWCNTs）过氧化物酶活性的能力。夏等人开发了一种直观简单的外泌体检测方法。简要地说，CD63核酸适配体提高了s-SWCNTs的微小过氧化物酶活性，并有效地催化了3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）的氧化，使无色溶液变蓝。相反，外泌体的加入诱导核酸适配体从纳米管表面释放，溶液的颜色由深变浅，这可以通过肉眼或紫外-可见光谱仪观察到，检测限（LOD）为5.2×105个粒子/μL。如前所述，ZnO-芯片被设计用于有效分离外泌体。在外泌体与一抗混合物（抗CD9/CD63抗体）孵育后，通过HRP（辣根过氧化物酶）标记的二抗识别（见图5Aa）。最后，通过紫外-可见光谱仪或微孔板分析仪获得了最小可检测浓度为2.2×104个粒子/μL。梁等人设计了一个与双膜过滤器和ELISA集成的微流控系统，用于检测膀胱癌患者尿样中外泌体的含量。除了常见的外泌体蛋白，比色法也可以用来检测癌症特异性蛋白。例如，PSA（前列腺特异性抗原）核酸适配体基础传感器被用于在500μL人类血浆中直观检测前列腺癌特异性外泌体。此外，Di等人报告了一种纳米酶辅助免疫吸附测定（NAISA），它能够灵敏和快速地多重分析外泌体蛋白（见图5Ab）。外泌体表面蛋白可以被固定在微孔板表面的抗体特异性捕获并催化比色反应。来自微孔板阅读器的信号强度与目标蛋白的数量成正比。结果，NAISA允许从临床样本中快速分析多种外泌体蛋白，如CD63、CEA（癌胚抗原）、GPC-3（Glypican-3）、PD-L1（程序性死亡配体1）和HER2（人类表皮生长因子受体2）。 8.2.荧光检测 荧光光谱光度法是一种根据荧光光谱线的阳性和强度进行物质鉴定和含量测定的方法（见图5B）。何等人进行了一种微流控芯片，用于检测30μL血浆样本中的表面和腔内生物标志物。该芯片获得了IGF-1R（胰岛素样生长因子1型受体）的显著提高的检测灵敏度，0.281pg/mL的IGF-1R和0.383pg/mL的p-IGF-1R，这比ELISA实现的灵敏度高100倍（见图5Ba）。刘等人开发了一种免疫吸附测定，其中免疫磁性珠被用来捕获外泌体，然后与酶报告分子结合，可以产生用于量化液滴微流控系统中GPC-1+外泌体的荧光信号。魏等人提出了类似的单分子阵列（SiMoa）平台，通过该平台可以超灵敏地检测通用外泌体和肿瘤衍生外泌体，检测限分别为34个粒子/μL和25个粒子/μL。余等人进行了一种基于CD63核酸适配体的检测方法。外泌体上的CD63可以与修饰在磁性珠表面的核酸适配体结合，导致Cy3标记的短序列进入上清液。上清液中的荧光强度用于量化复杂临床样本中的外泌体。氧化石墨烯具有通过荧光共振能量转移（FRET）与荧光染料结合时淬灭荧光的能力。例如，当FAM标记的核酸适配体被吸收到氧化石墨烯膜上时，荧光被淬灭，而目标外泌体与核酸适配体竞争性结合并重新表现出荧光信号，检测限为1.6×105个粒子/mL（见图5Bb）。李等人开发了一种基于聚集诱导发光体（AIEgens）的简便荧光核酸适配体传感器。氧化石墨烯吸收（含有四苯基的叔胺）TPE-TAS/核酸适配体复合物在没有外泌体的情况下允许荧光淬灭。当目标外泌体被引入时，核酸适配体优先与其目标结合，导致TPE-TAS/核酸适配体复合物从氧化石墨烯表面分离，随后出现“开启”的荧光信号。在优化条件下，肿瘤衍生外泌体的线性范围大约为4.0×105个粒子/μL至1.8×107个粒子/μL。 8.3.电化学检测 电化学检测是通过测量样品的电化学势或电流来检测分析物的方法，具有高灵敏度和宽测量范围的优点（见图5C）。近年来，研究人员开发了电化学生物传感器，因为当识别元素如抗体和核酸适配体特异性结合到外泌体时，改变的电化学信号可以量化外泌体。曹等人提出了一种电化学生物传感器，用于准确检测PD-L1+外泌体（见图5Ca）。外泌体首先被抗CD63功能化的磁性珠捕获，然后与抗PD-L1连接的DNA链结合，引入超支化滚环放大（HRCA）。HRCA可以降低环境pH值，导致PVP@HRP@ZIF-8分解并释放HRP，从而产生放大的电化学响应，因此实现了癌症衍生PD-L1+外泌体的识别和检测。这种生物传感器对PD-L1+外泌体显示出宽动态范围（1×103至1×1010个粒子/mL），检测限为334个粒子/mL。Jeongmin等人报告了一种HiMEX方法，该方法集成了磁性外泌体分离和外泌体结合蛋白的电化学检测，经过酶放大。从20μL血浆样本中外泌体中肿瘤生物标志物（EGFR、EpCAM、CD24和GPA33）的联合检测有助于结直肠癌的诊断和监测。电化学方法，特别是基于核酸适配体的生物传感器在检测和分析外泌体蛋白方面显示出巨大潜力。Kashef-Kheyrabadi等人介绍了一种可分离的微流控装置，该装置实现了基于核酸适配体的电化学生物传感方法（DeMEA）。在这个系统中，针对EpCAM的核酸适配体被固定在预先电镀金纳米结构的电极表面，微流控涡旋可以增加外泌体和传感表面之间的碰撞（见图5Cb）。因此，DeMEA能够量化不同阶段乳腺癌患者血浆样本中的外泌体，为癌症特异性外泌体的高度敏感和早期检测提供了一种方法。 图5 新方法检测外泌体内容物。A 比色检测。版权所有 2018 年 Chen，2020 年 Di 。B 荧光检测。版权所有 2014 年 He，2018 年 Jin 。C 电化学检测。版权所有 2020 年 Cao 。2020 年 Kashef-Kheyrabadi L。D SPR/SERS 检测。版权所有 2014 年 Hyungsoon Im ，2020 年 Dong。E 单外泌体检测。版权所有 2019 年 Wang，2019 年 He 。F ddPCR。版权所有 2020 年 Sun ，2021 年 Liu。G 分子信标。版权所有 2016 年 Ji Hye Lee ，2015 年 Ji Hye Lee 。H LSPR 检测。版权所有 2021 年 Wu 。 8.4.表面等离子共振检测 表面等离子共振（SPR）是一种物理光学现象，由金属膜/液体界面处的全反射光引起，用于分析分子间相互作用（见图5D）。Im等人开发了一种基于透射SPR的纳米等离子体外泌体（nPLEX）检测方法，通过周期性纳米孔阵列（见图5Da）进行。每个阵列中的功能化抗体，nPLEX传感器显示出与目标外泌体蛋白水平成比例的光谱移动或强度变化。在另一项研究中，由于等离子体效应，AuNC-Exosome-AuR上观察到显著改善的散射波长移动和散射强度。通过抗LRG1抗体偶联的AuR探针评估了肺癌患者和健康个体尿液中外泌体中LRG1（富含亮氨酸的α-2-糖蛋白1）的差异表达。范等人开发了一种基于SPR成像（SPRi）的生物传感检测方法。抗体（抗CD63/抗EGFR/抗EpCAM）修饰的金芯片与不同识别位点之间的生物亲和相互作用允许对NSCLC衍生的外泌体进行多重表征。这种生物传感器的检测限估计为104个粒子/μL。尽管具有多种优点，但纳米等离子体生物传感器的广泛应用受到纳米结构制造困难的限制。为了解决这一挑战，刘等人开发了一种无需纳米结构的强度调制SPR生物传感器。在这个传感器中，激光的反射强度和参考强度被两个光电探测器记录，并用于量化外泌体蛋白的表达水平，显示出比ELISA更高的检测灵敏度。 8.5.表面增强拉曼散射 表面增强拉曼散射（SERS）能够通过电磁和化学机制增强附着在粗糙金属表面的小型分子的拉曼信号（见图5D）。一种新的检测方法被报道用于外泌体的实时检测和蛋白质分析。通常，镀金的载玻片与3D打印的抗体阵列结合使用，用于捕获外泌体，QSY21包覆的金纳米棒被用作标记剂，用于定量检测目标蛋白。通过这种针对HER2和EpCAM的检测方法，定量确定了乳腺癌患者血浆衍生的外泌体水平。提出的3D打印阵列模板实现了廉价、便携且易于建立的检测平台，为新型癌症液体活检的发展提供了新策略。董等人表明，蛋白质磷酸化状态的分析可能为癌症诊断提供新的可能性（见图5Db）。开发了一种类似蜂巢的Au包覆的TiO2大孔反蛋白石结构，用于在无需任何标记过程的情况下捕获和分析外泌体。1087 cm-1的SERS峰的强度指的是外泌体磷酸化蛋白中的P-O键，且峰强度至少是来自癌症患者的血浆的两倍。然而，上述两种检测方法都需要预先分离外泌体，这大大阻碍了快速分析。庞等人提出了一种简单的免疫分析方法，直接从血清样本中捕获和分析外泌体PD-L1。Fe3O4@TiO2纳米颗粒被设计用于分离外泌体，抗PD-L1抗体修饰的Au@Ag@MBA SERS标签被应用于外泌体PD-L1的标记和SERS检测。这种检测方法在40分钟内成功定量了4μL血清样本中的外泌体PD-L1。 8.6.CRISPR/Cas系统辅助检测 在CRISPR/Cas9系统中，Cas9核酸酶可以通过识别特定的互补双链DNA（dsDNA）含有PAM（protospacer adjacent motif）序列，并通过导向RNA（gRNA）的帮助，高效地剪切dsDNA序列。通过特异性靶向外泌体蛋白的核酸适配体，蛋白质的检测可以转化为核酸的定量。最近，赵等人报告了一种结合了基于核酸适配体的外泌体膜蛋白识别和CRISPR/Cas12辅助的荧光信号放大的检测方法。在这个系统中，CD63核酸适配体特异性地靶向外泌体膜蛋白，触发核酸适配体的构象变化并释放阻断链（与核酸适配体具有互补序列）。释放的阻断链随后被CRISPR/Cas12a识别，导致对TaqMan探针的转剪切，荧光报告团和猝灭团的分离，最终产生放大的荧光信号。结果，这种方法实现了103至107个粒子/μL的线性检测范围，并成功应用于直接检测血浆外泌体，无需超速离心。邢等人开发了一种apta-HCR-CRISPR检测方法，用于从50μL鼻咽癌患者血清中检测循环的核糖体蛋白+或PD-L1+外泌体。核糖体蛋白或PD-L1靶向核酸适配体首先通过HCR（杂交链反应）放大，产生长重复的CRISPR可靶向DNA单元。通过收集CRISPR-Cas12a的旁路剪切活性诱导的荧光信号，该检测方法实现了102个粒子/μL的检测限。李等人进行了类似的检测，用于超灵敏检测CD109+和EGFR+外泌体。CRISPR/Cas系统预计将成为识别和定量外泌体蛋白的敏感工具，并可能有助于癌症的诊断和治疗监测。 8.7.单个外泌体检测 内在异质性是阻碍体液中外泌体分析的主要因素之一。单个外泌体检测可能提供更准确的肿瘤进展信息（见图5E）。郭等人提出了一个ssDNA辅助的单个外泌体检测平台。滚环放大（RCA）有助于从表面蛋白产生放大的荧光信号，使单个外泌体容易可视化，检测限为82个囊泡/μL。此外，刘等人开发了一种λ-DNA和核酸适配体介导的方法，允许通过大小和肿瘤相关标记表达对外泌体进行二维分析。 由于纳米尺寸的外泌体不能通过常规流式细胞术敏感地识别，因此醛/硫酸盐乳胶珠被用来与囊泡结合，然后被荧光抗体染色并对其蛋白标记进行表征。例如，抗GPC-1抗体和Alexa-488标记的二抗被引入到附着外泌体的珠子上，阳性珠子的百分比在此被称为GPC-1+外泌体的百分比。此外，外泌体中表达的EpCAM、HER2和EGFR的检测表明了它们在癌症诊断中的潜在作用（见图5Ea）。此外，纳米流式细胞术的发展为单颗粒的多参数分析提供了新的选择。通过纳米流式细胞术使用免疫荧光标记测量单个外泌体的CD9、CD63、CD81、CD235a、CD45、CD41a和CD144的表达，以评估通过六种不同方法分离的外泌体制备的质量。刘等人使用纳米流式细胞术分析泪液衍生外泌体中CD9、CD63、CD81、CD47、CD45、CD24和EpCAM的表达，并发现泪液中外泌体浓度大约是血浆外泌体的100倍。 9.传统的核酸分析 除了蛋白质载体外，外泌体中也包裹有核酸。RNA是外泌体中主要的核酸载体，已显示出作为癌症诊断和预后预测的特定生物标志物的潜力。然而，检测外泌体核酸的准确性和可行性常受到其低丰度的阻碍。为了定量外泌体核酸的表达水平，已使用了如qRT-PCR（实时定量逆转录PCR）、微阵列和下一代测序（NGS）等技术。尽管qRT-PCR具有高灵敏度，但它只能用于检测已知序列的核酸。NGS有利于高通量发现和定量未知的外泌体RNA转录本。然而，需要解决的不足之处包括高成本、大量数据和构建文库的复杂性。通过杂交探针和目标基因的互补组合，微阵列可以一次分析外泌体中的数千种核酸，但存在灵敏度低的缺点。为了克服这些限制，正在投入更多努力开发高灵敏度和便捷的外泌体核酸检测方法（见表3）。 10.新的核酸检测技术 10.1.ddPCR 液滴数字PCR（ddPCR）是一种技术，其中PCR反应混合物被分成油包水乳液中的数万个水性液滴（见图5F）。每个单独的液滴包含不超过一个目标基因的副本，并根据荧光幅度被标记为阳性或阴性。然后通过泊松分布和阳性液滴的比例估计目标核酸的浓度。ddPCR与qPCR的比较表明，ddPCR在分析尿液外泌体miRNAs方面具有更高的准确性和灵敏度。Chen等人使用ddPCR从胶质母细胞瘤（GBM）患者的血清或脑脊液（CSF）衍生的外泌体中识别IDH1（异柠檬酸脱氢酶1）转录本。在携带突变型IDH1胶质母细胞瘤患者的CSF衍生外泌体中鉴定出突变型IDH1 mRNA，并且在来自肿瘤患者的外泌体中发现IDH1 mRNA的水平高于健康对照组。Sun等人最近使用ddPCR从肝癌（HCC）患者的血浆样本中定量10种HCC特异性mRNA（见图5Fa）。通过计算数字评分评估了HCC外泌体衍生mRNA签名的诊断价值。此外，通过ddPCR检测外泌体miR-15a-5p以区分子宫内膜癌（EC）患者和健康受试者。Shen等人报告说，在与良性肺肿瘤相比，从恶性肺癌患者的EpCAM特异性外泌体中通过ddPCR定量了更多的lncRNAs RP11-77G23.5和PHEX-AS1的拷贝数。 10.2.分子信标 分子信标（MB）是一种发夹状的寡核苷酸，两端分别标记有荧光染料和猝灭剂（见图5G）。MB设计用于与目标序列自发杂交，从而破坏发夹环结构并诱导荧光出现。Lee等人观察到，分子信标与癌细胞和人血清中外泌体中的miRNA-21的杂交获得了高荧光信号（见图5Gb）。此外，通过基于MB的生物传感器从人尿液中外泌体中检测到miR-375和miR-574-3p。人血清中外泌体中miR-21、miR-375和miR-27a的表达水平被检测出来（见图5Ga）。Oliveira等人利用CPP（细胞穿透肽）将MB传递穿过血浆膜，然后检测红细胞（RBC）衍生外泌体中的miRNA-451a。Chen等人设计了一个2'-O-甲基化和硫代磷酸酯修饰的分子信标，用于定量分析人血浆中外泌体miRNA-1246。使用Triton X-100破坏外泌体膜后，探针可以特异性地靶向内部的miRNA-1246并显示定量荧光信号。Zhang等人开发了一个集成的外泌体分离和检测系统，其中外泌体可以通过微流控技术使用少量样本分离。同时，纳米孔检测技术有效地提高了无需放大和荧光标记的肿瘤相关miRNA的检测效率。基于分子信标的生物传感器具有简单程序、无需外泌体预分离和核酸提取的优势，显示出它们在癌症诊断和预后液体活检中的巨大潜力。 10.3.DNA四面体探针 DNA四面体是一种具有高可控性的DNA纳米结构，可以通过化学修饰和DNA自组装提供多样化的放大信号标签。Gao等人进行了一个基于DNA四面体纳米探针的FRET传感平台，用于灵敏地检测不同细胞系中的miR-146b-5p。Chen等人报告了一个发夹四面体纳米探针，用于人血清中外泌体miR-21的定量测量。在没有miR-21的情况下，荧光供体-猝灭剂对的结构导致了低FRET效应，而目标miRNA的存在诱导了干环结构的破坏和强FRET的发生。因此，该检测方法在1×10-12至10×10-9M（摩尔/升）的范围内获得了良好的线性，并检测限为45.4×10-15M。Zhang等人提出了一个类似的基于两个多功能DNA四面体辅助催化发夹组装的电化学生物传感器。通过利用局部反应和级联放大，该传感器能够在30分钟内灵敏地检测肿瘤相关外泌体miRNA，低至7.2 aM。 10.4.局域表面等离子共振 局域表面等离子共振（LSPR）发生在入射光频率与贵金属纳米颗粒或金属导电电子的整体振动频率相匹配时（见图5H）。Joshi等人开发了一种基于LSPR的生物传感器，用于无标记和非破坏性测量外泌体miR-10b。金纳米棱柱通过化学合成到硅烷化的玻璃基底上，然后功能化HS-C6-ssDNA和PEG6-SH。目标miR-10b和HS-C6-ssDNA的直接杂交诱导双链DNA的形成，这可以增加纳米棱柱的折射率并改变LSPR偶极峰的波长（λLSPR）。miR-10b的浓度可以通过ΔλLSPR来评估。该平台足够灵敏，即使在亚阿摩尔浓度范围内，也能区分miR-10b和miR-10a（仅一个核苷酸差异）。Wu等人开发了一种基于SPRi的生物传感器，用于准确诊断NSCLC的多种外泌体miRNAs，其中Au-Ag异质结构和DNA四面体框架被用来增强SPR信号，每种外泌体miRNA都可以被不同SPR信号超灵敏地识别（见图5Ha）。 10.5.基于TIRF的单囊泡成像 作为单外泌体分析方法，全内反射荧光（TIRF）已经出现，为提供有关外泌体异质性的额外信息（见图5E）。He等人提出了一个基于TIRF的单囊泡成像检测方法，该方法将分子信标探针送入外泌体，从而诱导目标miRNA的放大荧光（见图5Eb）。他们对单个囊泡进行了直接可视化和人血清样本中miR-21的原位定量分析，发现这种检测方法在区分癌症患者和健康受试者方面比传统PCR检测方法表现更好。 10.6.热泳辅助检测 Zhao等人开发了一种热泳传感器，用于无需RNA提取或目标放大即可原位检测外泌体miRNA（见图5F）。修饰在纳米孔中的核酸适配体能结合目标外泌体miRNA，诱导荧光的出现。经过热电泳积累后，荧光信号被放大，允许在少量血清样本中灵敏地检测0.36 fM外泌体miRNA。此外，Han等人提出了一种基于DNA四面体的热泳检测（DTTA），实现了血清外泌体中14 aM mRNA的检测限。DNA四面体的两个荧光标记的识别序列被外泌体内化后，可以结合目标mRNA，导致FRET信号增加。热泳效应被应用于进一步放大FRET信号，实现了对外泌体中PSA mRNA的高灵敏度检测。DTTA检测显示，外泌体PSA mRNA在区分前列腺癌和良性前列腺增生方面比血清PSA蛋白表现更好（AUC：0.93对比0.74），为精确检测前列腺癌提供了一种新方法。 10.7.CRISPR/Cas系统辅助检测 最近，CRISPR/Cas系统为开发用于检测和定量外泌体中核酸的分析方法提供了新机会。已经提出了将核酸放大与CRISPR/Cas整合的策略，以提高分析特异性和灵敏度。例如，Wang等人进行了一种名为滚动循环放大辅助CRISPR/Cas9切割（RACE）的平台，用于检测多种外泌体miRNA。在RCA过程中，Padlock探针在HiFi Taq DNA连接酶的存在下识别单碱基差异。由大量重复目标序列和PAM结构组成的长ssDNA的放大产物被Cas9核酸酶特异性识别。因此，与ssDNA杂交的TaqMan探针被Cas9蛋白完全切割，允许“开启”荧光变化，可以方便地通过光谱测量。结果，这种RACE平台可以用于高度特异性地检测人血浆中的单一或多种外泌体miRNA。然而，基因组中大量的天然PAM结构可能增加非目标效应的风险，极大地损害分析的特异性。 11.机器学习 机器学习指的是一种技术，它通过构建已知数据的模型来预测和分析未知数据。作为人工智能的关键分支，机器学习已被广泛用于外泌体生物标志物的多重分析。已经开发了诸如线性判别分析（LDA）、主成分分析（PCA）、神经网络（NN）、支持向量机（SVM）和随机森林（RF）等算法，将多变量数据分类为典型的分类模型，然后应用于未知生物数据的预测和分组。Kawakami等人证明，机器学习算法在预测和诊断上皮性卵巢癌方面比传统的逻辑回归分析表现更好。Wu等人使用尿液衍生外泌体的荧光信号作为输入数据，应用KNN（K-最近邻）和SVM作为机器学习模型，进行外泌体生物标志物分析。通过引入机器学习算法，诊断模型能够对多种疾病进行准确诊断和分类。刘等人使用LDA确定了七个外泌体生物标志物的总签名，这在区分前列腺癌和良性疾病方面取得了高准确性。田等人通过LDA分析了1μL血浆中外泌体的八个与癌症相关的蛋白质的加权和。PCA是一种算法，它通过正交变换将一组可能相关的变量转换为一系列线性无关变量。Shin等人使用PCA探索了细胞外泌体和人血浆外泌体的特征。结果表明，机器学习模型能够以95%的准确率对正常和肺癌细胞系衍生的外泌体进行分类，并在预测整个队列的肺癌方面获得了0.912的AUC。刘等人采用RF、NN和SVM分析了乳腺癌患者的多种外泌体衍生mRNAs，与单一标志物相比，表现出改善的诊断性能。这些研究表明，将外泌体分析与机器学习相结合在癌症液体活检中具有巨大潜力。值得注意的是，典型的机器学习方法需要大型数据集，而临床样本数量有限和数据不足可能导致准确性和可靠性差。更强大机器学习算法的出现将有利于液体活检中外泌体的分析。 12.外泌体在癌症液体活检中的意义 近期研究表明，外泌体在早期诊断、疾病监测和预后预测方面优于CTCs和ctDNA。在此，我们总结了外泌体在多种癌症液体活检中的应用（见图6，表4）。 图6 外泌体在癌症液体活检中的应用。癌症衍生的外泌体富集了差异表达的蛋白质和核酸，并且已被测试作为不同癌症早期诊断、分期分类和预后预测的新生物标志物，突显了它们在癌症液体活检和精准医疗中的重要价值。 12.1.HCC 肝细胞癌是癌症相关死亡的第四大原因。装载在HCC衍生外泌体中的分子签名可用于诊断。发现外泌体miR-21能够抑制HCC细胞的凋亡，并在HCC患者中上调。诸如CEA和GPC-3等外泌体蛋白能够区分HCC患者和健康受试者，可能作为无创癌症诊断的有希望的生物标志物。在包含158个样本的研究中，收集血浆用于检测10个HCC特异性基因，包括甲胎蛋白（AFP）、GPC3、白蛋白、载脂蛋白H等。观察到与非癌症队列相比，通过ddPCR在HCC队列中获得了更高的荧光信号。这10个基因签名通过机器学习进一步计算，显示出在区分早期HCC和有风险的肝硬化方面具有巨大潜力，AUC为0.93。Nakano等人比较了接受肝移植的HCC患者中外泌体miR-92b和循环AFP的表达水平。揭示了外泌体miR-92b能够预测HCC的早期复发，AUC为0.925，而AFP的AUC为0.651。Zhu等人整合了血浆外泌体RNA序列、无细胞RNA序列和TCGA组织RNA序列数据集，以识别5个非编码RNA（circ-0073052、circ-0080695、SNORD3B-1、LINC01226和HULC）作为肝癌的潜在生物标志物。此外，SNORD3B-1、circ-0080695和miR-122的组合面板在将肝癌患者与健康捐赠者分类方面显示出最高的AUC（89.4%），与其他标志物面板相比。通过所选的面板，在测试和验证集中，79.2%的AFP阴性样本和77.1%的早期肝癌样本被成功检测，这表明外泌体RNAs小组在早期诊断肝癌方面的潜力。 12.2.PDAC 作为与胰腺癌进展相关最公认的指标之一，miRNA-10b目前正在被广泛研究用于胰腺导管腺癌（PDAC）的早期诊断。Joshi等人指出，胰腺癌患者、患有慢性胰腺炎（CP）的高危患者和健康个体之间外泌体miR-10b的水平显著不同，这表明miR-10b在诊断胰腺癌和预测可能发展为PDAC的CP患者方面的潜力。Pang小组使用双SERS生物传感器进行一步检测外泌体中的mRNAs，也得出了相同的结论。Melo等人发现，GPC-1+循环外泌体（GPC-1+crExos）在识别PDAC患者与健康个体和慢性胰腺炎方面表现出高特异性和敏感性（AUC=1.0），优于CA199（AUC=0.739）。此外，GPC-1+crExos的水平与手术前后患者的肿瘤负担和生存相关，表明GPC-1作为治疗反应和预后监测的可靠生物标志物的潜力。此外，GPC-1和CD63的组合被证明在将PDAC患者与健康受试者区分开来方面显示出99%的敏感性和82%的特异性。此外，迁移抑制因子（MIF）被报道在区分胰腺癌的不同阶段方面比GPC-1和EGFR表现更好。 12.3.CRC 结直肠癌（CRC）是最常见的恶性肿瘤之一，发病率和死亡率都很高。外泌体中的环状RNA与癌症的发生和发展有关。由于其环状结构，它提供了一个稳定的癌症诊断生物标志物。发现环状RNA-0004771在CRC患者血清外泌体中上调。外泌体circ-0004771的AUC用于从健康对照中识别CRC为0.88，用于区分I和II期患者与其他良性肠道疾病为0.816，这表明circ0004771可以作为结直肠癌的潜在诊断标志物。Wei等人探索了新的外泌体生物标志物，用于结直肠癌的早期诊断和预后。对血浆样本的检测显示，与健康和良性对照相比，CRC患者中CD9、CD63和EpCAM的表达显著更高（分别为0.90和0.96的AUC）。此外，miR-15b、miR-21和miR-31被报道在CRC患者血清外泌体中高度表达。ROC曲线显示miR-15b的AUC为0.86，组合的miR-15b、miR-21和miR-31小组展现出81.21%的敏感性和81.03%的特异性。 12.4.NSCLC 非小细胞肺癌占肺癌引起的死亡的80%以上。与正常人相比，NSCLC患者血清外泌体中PD-L1的水平较高。Pang等人在一个更大的患者队列中进一步证实了外泌体PD-L1的诊断价值，AUC为0.97。Ma等人发现，与健康个体相比，复发性NSCLC患者中外泌体miR-21的表达更高。然而，在外泌体中也发现了高水平的miR-21在其他癌症中，如结直肠癌、乳腺癌和肝癌。因此，检测多种miRNAs可能对NSCLC诊断更有价值。Wu等人证明miR-21、miR-378、miR-139和miR-200在NSCLC患者和健康捐赠者之间差异表达，为NSCLC早期诊断提供了更多可选的生物标志物。值得注意的是，实验结果表明，与血浆和支气管肺泡灌洗液相比，NSCLC患者尿液衍生外泌体中外泌体RNAs的数量更多，这可能为选择样本分析外泌体提供了新的方向。 12.5.乳腺癌 乳腺癌（BC）是女性癌症相关死亡的最常见原因。早期诊断可以有效降低死亡率并取得更好的治疗效果。尽管作为广泛使用的生物标志物，CA15-3（碳水化合物抗原15-3）对于诊断原发性和转移性乳腺癌（MBC）的敏感性还不够。Lee等人证明，癌细胞衍生的外泌体miR-21、miR-222和miR-200c可在体液中量化，并用于乳腺癌诊断。Lu等人报道，RDW（红细胞分布宽度）、MPV（平均血小板体积）和CA15-3的组合显示出比单一生物标志物更好的特异性和敏感性，用于识别乳腺癌。此外，通过机器学习计算八个生物标志物（CA15-3、CA125、CEA、HER2、EGFR、PSMA、EpCAM和VEGF）的加权和，鉴定出一种外泌体签名。结果，该签名显示出高度的区分准确性，用于区分MBC与非转移性肿瘤和年龄匹配的健康捐赠者（91.1%）。此外，据报道，外泌体签名能够准确监测MBC治疗反应，并作为MBC患者无进展生存的独立预后因素。 12.6.前列腺癌 PSA是检测前列腺癌的广泛使用的生物标志物。然而，增加的PSA也出现在如良性前列腺增生（BPH）等炎症性疾病中。因此，迫切需要开发敏感和特异性生物标志物，以早期诊断患者并监测癌症进展。Li等人报道，外泌体ephrinA2具有比血液中循环PSA更好的能力，以区分前列腺癌患者和BPH患者，AUC为0.906。此外，发现血清外泌体中EpCAM和PSMA增加。此外，据报道，外泌体TUBB3 mRNA的表达与转移性去势抵抗性前列腺癌患者阿比特龙治疗的无进展生存期差有关。 12.7.外泌体在临床试验和癌症液体活检中的应用 由于与CTC和ctDNA相比，外泌体具有活细胞分泌、大量存在和稳定循环的优势，基于外泌体的液体活检已在临床试验中进行了测试，其中一些已经获得批准并进入市场。2016年，Exosome Diagnostics提出了世界上第一个基于外泌体的液体活检，ExoDx™ Lung (ALK)，用于从血样中分离和分析外泌体RNA。在CLIA认证实验室中，ExoDx™ Lung (ALK)被证明是一种准确、实时的工具，用于检测NSCLC患者中的EML4-ALK突变，敏感性为88%，特异性为100%，这比cfDNA提供了一种更直接和敏感的检测基因融合的方法。此外，ExoDx Prostate IntelliScore (EPI)已获得FDA认证。基于对外泌体中ERG、PCA3和SPDEF RNA的检测，EPI提供了一个风险评分，以预测PSA在2到10ng/mL之间的患者是否有可能发展为高级别前列腺癌。根据ExoDx，前瞻性研究中达到了93%的敏感性，并且当EPI阈值设定为15.6时，避免了26%的不必要的针刺活检。三个独立的、前瞻性的、多中心的临床试验宣布EPI的表现优于标准护理，并且可以用来协助早期诊断前列腺癌和消除不必要的前列腺活检。此外，MedOncAlyzer 170是一种新开发的液体活检系统，能够一次性检测外泌体RNA和ctDNA。它可以从小量（0.5ml）的患者血液或血浆中识别多种癌症类型中的显著和功能性突变。由于外泌体和ctDNA的独特形成方式，MedOncAlyzer 170在检测癌症进展和治疗的所有阶段的突变方面准确且高度敏感。尽管临床应用价值已经得到验证，但仍然需要更大的临床样本、人群和试验来确认基于外泌体的液体活检在癌症诊断和治疗中的作用。 13.结论和展望 目前，在精准医疗领域，组织活检的局限性已逐渐被认识到。相反，液体活检具有微创性、易于获取样本和动态分析的优势。外泌体已被证实在体液中稳定循环，并包含反映肿瘤进展状态的多样化信息。外泌体作为诊断和预后生物标志物的潜力已在多种癌症中进行了研究。然而，外泌体的高异质性和纳米尺寸为获取其分子信息和相互作用带来了巨大的技术挑战。在这篇综述中，我们总结了传统和新型技术隔离、表征和检测外泌体的优点和缺点。基于物理或生物学特性的技术正在被广泛开发用于外泌体分离，微流控设备的应用在超快速分离高产量的纯外泌体方面具有巨大潜力。尽管取得了革命性的进展，但目前尚无标准化方法用于从细胞培养基和人体体液中高通量、高纯度、最小损伤分离外泌体。循环外泌体中包含的多种分子突显了外泌体在液体活检中的潜力。需要更快、更便捷的方法来验证外泌体货物作为癌症诊断中的生物标志物。大多数新的检测平台虽然优于传统方法，但仍面临低灵敏度和不同外泌体亚群的高异质性挑战。单外泌体检测和分析技术可能揭示特定外泌体的独特分子轮廓，并提供一种可行的策略来获取准确的癌症相关信息。对外泌体异质性的进一步探索将解决当前外泌体研究中的许多挑战。改进开发新策略，从体液中分离外泌体并以快速和敏感的方式分析外泌体内容物，将促进基于外泌体的液体活检在癌症精准医疗中的实践应用。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

摘要：癌症治疗中最大的挑战是以最小的损伤正常细胞来根除癌细胞。靶向治疗已经发展起来以应对这一挑战，与传统癌症治疗相比，显示出显著增加的治疗指数。由于其对目标抗原的非凡高特异性，抗体成为靶向治疗代理家族中的重要成员。治疗性抗体使用一系列机制直接或间接杀死癌细胞。早期的抗体被开发出来直接对抗癌细胞上的目标。随后是连接技术的进步，使得抗体-药物偶联物（ADCs）的生产成为可能，这些偶联物将细胞毒性有效载荷引导到癌细胞。我们对T细胞生物学的理解的提高，导致了免疫检查点抑制抗体的生产，这些抗体通过激活T细胞间接杀死癌细胞。甚至最近，双特异性抗体被设计合成，以重定向患者的T细胞杀死癌细胞。在这篇综述中，我们总结了治疗性抗体用来靶向癌细胞的不同方法。我们讨论了它们的作用机制、目标特异性的结构基础、临床应用以及正在进行的研究以提高疗效和减少毒性。 1. 引言 在过去的一个世纪中，发展了诸如化疗和放疗等有效的治疗手段来治疗癌症。不幸的是，这些方法通常缺乏足够的特异性，无法在不引起难以忍受的毒性的情况下，使用足够高的剂量来根除癌细胞。单克隆抗体可以提供所需的特异性水平，从而大幅扩大治疗窗口，有些抗体甚至能够区分相差一个氨基酸或经过翻译后修饰的两种抗原。20世纪70年代发展的杂交瘤技术首次允许生产和筛选针对人类抗原的高度特异性小鼠单克隆抗体。其次，将人类抗体恒定区嫁接到小鼠抗体可变区的能力，产生了具有更好治疗效果和较少副作用的嵌合抗体（图1）。第三，20世纪90年代转基因小鼠模型和噬菌体展示系统的应用，使得能够针对癌症靶点产生全人源抗体。随着这些技术进步和临床需求的增加，过去25年见证了基于抗体治疗的爆炸性增长。自1997年以来，已有50多种基于抗体的肿瘤治疗药物获得了美国食品药品监督管理局（FDA）和欧洲药品管理局（EMA）的批准（补充表1）。除了基于抗体的治疗外，抗体片段也被用来生成嵌合抗原受体（CARs）进行T细胞工程。在这篇综述中，我们专注于FDA和EMA批准的基于抗体的治疗以及正在临床前和临床开发中进展的抗体。我们讨论了用于产生嵌合、人源化和人源抗体的相继使用的方法的演变。我们详细说明了正在开发用于靶向癌细胞的一系列格式，如单特异性抗体、免疫检查点抑制剂、双特异性抗体和偶联抗体。最后，我们总结了为应对当前癌症靶向抗体开发中的挑战而进行的新兴研究。 2. 抗体生成 用于识别针对肿瘤抗原的治疗性单克隆抗体或抗体片段的一系列技术。这些技术包括使用目标抗原对啮齿动物进行免疫、噬菌体或酵母展示技术、从人类和小鼠中克隆单B细胞，以及从骆驼科动物中识别单域抗体（称为纳米抗体）。抗体的进一步临床应用开发涉及抗体工程，使其与人类免疫系统越来越兼容。 2.1 嵌合抗体和人源化抗体 单克隆抗体传统上是通过1975年Cesar Milstein和Georges Kohler开发的杂交瘤技术生产的。在这个过程中，B细胞是从免疫特定抗原的小鼠脾脏或淋巴结中分离出来的，然后与Sp2/0这样的骨髓瘤细胞系融合，形成称为杂交瘤细胞系的杂交细胞。通常通过酶联免疫吸附测定（ELISA）筛选杂交瘤克隆以检测蛋白结合，并通过流式细胞术检测细胞结合。杂交瘤技术能够稳健且成本有效地生成一系列小鼠单克隆抗体。然而，注入人体的小鼠抗体会产生人抗鼠抗体（HAMA）免疫反应，限制了它们的疗效并增加了不良反应。因此，获得监管批准的大多数小鼠抗体后来都被撤回（图1）。Blinatumomab（一种双特异性T细胞激活剂，靶向CD19），使用两个小鼠衍生的单链可变片段（scFv）格式，缺乏可结晶片段（Fc），是唯一在临床上广泛采用的小鼠抗体。 为了减少在患者中诱导免疫反应，小鼠抗体的恒定区被替换为人类恒定区，以产生嵌合抗体（图1）。利妥昔单抗（抗CD20）和西妥昔单抗（抗表皮生长因子受体（EGFR））（表1）是最早通过将小鼠抗体2B8和225的可变区连接到人类免疫球蛋白G1（IgG1）重链和人类κ轻链恒定区而产生的嵌合抗体之一。然而，带有小鼠可变区的嵌合抗体仍可被识别为外来物质，导致可能清除治疗性抗体的人抗嵌合抗体（HACA）免疫反应。这可能限制了嵌合抗体的重复应用并阻碍了它们的临床开发。为了进一步减少不必要的免疫反应，通过1980年代开发的称为“人源化”的过程增加了小鼠单克隆抗体的人类含量。人源化涉及将小鼠抗体的互补决定区（CDR）仅嫁接到人类抗体的框架区域（图1）。曲妥珠单抗是通过将小鼠人类表皮生长因子受体2（HER2）抗体mumAb4D5的CDR移植到人类抗体框架中而开发的首批人源化抗体之一，类似的策略被用于开发奥比妥珠单抗（抗CD20）、帕博利珠单抗（抗程序性细胞死亡蛋白1（PD1））和阿特珠单抗（抗PD1配体1（PDL1））（表1）。 除了小鼠杂交瘤技术外，还开发了兔杂交瘤技术，用于生产针对肿瘤抗原（如间皮素）的兔单克隆抗体。CDR嫁接方法已被调整以人源化兔单克隆抗体，如针对间皮素的YP218，用于临床开发。监管机构批准的大多数治疗性抗体是使用杂交瘤方法生成的，随后工程化成嵌合或人源化形式，并广泛用于癌症治疗（图1）。 2.2 全人抗体 1990年代开发的两种技术使得生成全人抗体成为可能：人类抗体噬菌体展示和表达人类抗体的转基因小鼠模型。为了生成产生人类抗体的转基因小鼠，人类Ig基因座或可变区被插入到小鼠基因组中，同时破坏小鼠Ig基因。从小鼠中分离出免疫目标抗原的B细胞，用于单B细胞克隆和测序。转基因小鼠平台XenoMouse（Abgenix/Amgen）、VelocImmune（Regeneron）和HuMab（Medarex/Bristol Myers Squibb）产生了9种获批的针对癌症靶标的人类抗体：daratumumab（抗CD38）、ipilimumab（抗细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4（CTLA4））、nivolumab（抗PD1）、ofatumumab（抗CD20）、panitumumab（抗EGFR）、durvalumab（抗PDL1）、cemiplimab（抗PD1）、tisotumab（抗组织因子（TF））和relatlimab（抗淋巴细胞激活基因3（LAG3））（表1）。这些抗体的成功临床开发导致了KyMouse（Kymab）、OmniRat（Ligand）、H2L2 Mouse（Harbour Antibodies）、Trianni Mouse（Trianni Inc/AbCellera）和RenMab（Biocytogen）等多个转基因小鼠平台的快速崛起。 图1 | 抗体组分。a, 抗体由两个相同的轻链和重链组成，它们通过二硫键连接在一起，呈现出Y字形结构。每个轻链和重链都包含一个可变区（VL和VH），负责抗原结合，以及恒定区（CL和CH），决定抗体的半衰期和效应功能。酶促处理可以将抗体分解成两个片段，分别命名为片段抗原结合（Fab）和可结晶片段（Fc）。轻链和重链的可变区共同构成可变片段（Fv），是保留抗原结合能力的最小片段。制造的Fv片段通过柔性肽连接起来，形成一个称为单链可变片段（scFv）的单一链。根据来自每个物种的肽序列量，抗体被分为小鼠、嵌合、人源化和人类抗体。a Belantamab mafodotin 被撤回，但可能会根据正在进行的试验重新获得批准。Teclistamab（一种人源化和人类抗体的组合）在此图中被视为人源化抗体。CDRs，互补决定区。 展示技术为人类抗体开发提供了另一种平台。使用噬菌体展示，可以从多样性超过10^10的大型文库中分离出人类单链可变区（scFv）或片段抗原结合（Fab）片段（图1）。噬菌体展示技术通常使用M13丝状噬菌体来表达与噬菌体pIII外壳蛋白融合的抗体片段，如scFv。噬菌体文库用固定在微孔板或珠子上的目标抗原进行筛选。非特异性噬菌体结合物被洗去，剩余的特异性结合物被收集用于下一轮筛选。通常需要3到5轮筛选来分离特异性结合物。这个过程称为噬菌体淘选，它模仿体外免疫选择。使用下一代测序的新方法有助于快速识别稀有结合物。Dyax生产的噬菌体展示系统产生了三种获得监管批准的全人抗体：ramucirumab（抗血管内皮生长因子受体2（VEGFR2））、necitumumab（抗EGFR）和avelumab（抗PDL1）（表1）。此外，由Dyax、Cambridge Antibody Technology、MorphoSys等产生的多个噬菌体展示衍生的人类抗体目前正在进行临床试验。转基因小鼠和噬菌体展示技术都有其独特的优势。通常，转基因小鼠平台倾向于产生具有更理想生物物理特性和在临床试验中表现更好的抗体，而噬菌体展示允许选择针对特定表位的抗体。除了噬菌体展示，细胞表面展示（酵母、细菌和哺乳动物）、核糖体展示和mRNA展示技术已被用于抗体生成。酵母和哺乳动物细胞表面展示允许在真核细胞的细胞表面表达重组抗体片段。这使得可以通过流式细胞术分离抗原特异性细胞，并发现高亲和力结合物。Sintilimab，一种特异性针对PD1的人类IgG4抗体（表1），是通过酵母细胞表面展示分离的，目前正在接受FDA监管审查以获得批准。 2.3 比较嵌合、人源化和全人抗体 生产嵌合、人源化或全人抗体的目标是减少针对抗体的免疫反应，这种反应带有中和风险和不良反应（例如，输注反应和过敏反应），并随着重复给药而增加。对各种抗体治疗的人类临床试验的大规模分析显示，使用嵌合、人源化和全人抗体时，免疫原性逐渐下降。然而，该研究没有检查较低的免疫原性是否会导致更好的肿瘤消退或患者生存。几种FDA批准和EMA批准的嵌合、人源化和全人抗体针对常见的癌症抗原，如CD20、HER2和EGFR，尽管它们在不同的表位上具有不同的结合特性（表1）。 ADCC，抗体依赖性细胞介导的细胞毒性；ADCP，抗体依赖性细胞介导的吞噬作用；ASPS，肺泡软组织肉瘤；BCC，基底细胞癌；CDC，补体依赖性细胞毒性；dMMR，错配修复缺陷；HCC，肝细胞癌；HNC，头颈癌；IgG，免疫球蛋白G；MCC，默克尔细胞癌；MSI-H，微卫星高度不稳定性；NA，数据不可用；PMBCL，原发性纵隔大B细胞淋巴瘤；RCC，肾细胞癌；SCC，鳞状细胞癌；TNBC，三阴性乳腺癌。 比较针对CD20（利妥昔单抗与奥比妥珠单抗或利妥昔单抗与奥法木单抗）、HER2（曲妥珠单抗与马格图珠单抗）和EGFR（西妥昔单抗与帕尼图珠单抗）的抗体的III期临床试验已经证明，总生存率相似，治疗相关治疗中断的比率也相似，表明具有等效的治疗效力。然而，大量的HAMA免疫反应阻碍了针对二唾液神经节苷GD2的小鼠抗体的开发，并且在使用利妥昔单抗治疗自身免疫性疾病的患者中观察到了强烈的HACA免疫反应。对HACA免疫反应的担忧，加上简化了人源化和全人抗体生成的技术进步，增加了这两种格式的使用。进入当前临床试验的抗体要么是人源化的，要么是全人产品（图1和补充表2），根据以前的试验结果，人源化和全人抗体在患者中倾向于展示相似的治疗效力。 2.4 不同格式的抗体治疗 根据它们的结构和功能机制，抗体治疗可以分为三种主要格式——单特异性抗体、双特异性抗体和与有效载荷（如药物、毒素或放射性同位素）偶联的抗体（图2）。 2.5 单特异性抗体格式 单特异性抗体格式涉及全长免疫球蛋白，它们结合到目标抗原上。在五种免疫球蛋白亚型（IgG、IgM、IgA、IgE和IgD）中，只有IgG能够结合到新生儿Fc受体（FcRn），从而带来长半衰期（大约21天）。针对癌症的抗体利用IgG亚型来利用这一延长的半衰期，通常每21天给药一次。大多数FDA批准和EMA批准的抗体以及正在开发的抗体都使用单特异性IgG抗体格式（见图1自然发生的IgG抗体的基本结构）。IgG抗体有四个亚类（IgG1、IgG2、IgG3和IgG4），大多数治疗性抗体使用IgG1亚类。单特异性抗体格式的目标抗原是细胞表面蛋白，主要是在实体癌中过度表达的生长因子受体（例如，在乳腺癌、胃癌和胃食管癌中过度表达的HER2；在结肠癌中过度表达的EGFR；在肺癌中过度表达的MET）。对于血液恶性肿瘤，抗体通常针对由不同免疫细胞亚群表达的细胞表面糖蛋白（也称为簇分化（CD）标记），例如B细胞恶性肿瘤中的CD19和CD20；T细胞恶性肿瘤中的CD52和CC基序趋化因子受体4（CCR4；也称为CD194）；浆细胞恶性肿瘤中的CD38和B细胞成熟抗原（BCMA；也称为TNFRSF17）。目标及其相应的抗体列在表1中。 2.5.1 作用机制 抗体与癌细胞结合通过多种机制导致癌细胞死亡。直接阻断生长因子的生存信号和阻断血管生成导致肿瘤血液供应中断是这些抗体对实体肿瘤消退的两个主要机制。相比之下，血液恶性肿瘤中针对的CD标记通常在促进癌细胞存活方面没有重要作用，尽管一些研究表明针对CD20或CD52的抗体可以诱导非caspase依赖性的程序性细胞死亡。相反，抗体通过招募和激活免疫效应细胞来诱导细胞毒性。每个IgG抗体亚类赋予抗体不同的效应功能。IgG1亚类Fc片段对巨噬细胞和自然杀伤（NK）细胞表达的激活Fcγ受体（FcγRs；FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIIa和FcγRIIIb）有很强的亲和力。FcγR结合导致巨噬细胞和NK细胞介导的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）和抗体依赖性细胞吞噬作用（ADCP），直接杀死癌细胞（见图2）。最早获得FDA批准的两种抗体是针对恶性B细胞表达的CD20的利妥昔单抗和针对过度表达HER2的乳腺癌细胞的曲妥珠单抗，这两种抗体都使用常见的IgG1亚类。IgG1诱导ADCC和ADCP的能力最终导致癌细胞死亡，并且可以通过Fc工程进一步增强。支持这一作用机制的是，例如携带FcγRIIIa等位基因中纯合子158缬氨酸/缬氨酸的患者对利妥昔单抗和曲妥珠单抗的反应更高。IgG1亚类还结合补体蛋白C1q，导致通过补体依赖性细胞毒性（CDC）的癌细胞死亡。 图2 | 抗体格式和作用机制。a, 根据结构和作用机制，治疗性抗体可以分为三种不同的格式：单特异性抗体、双特异性抗体，以及与药物、毒素或放射性同位素偶联的抗体。b, 单特异性抗体结合癌细胞上的抗原，通过多种机制导致细胞死亡，包括破坏生长因子受体（如人类表皮生长因子受体2（HER2））的生存信号，激活免疫细胞（如通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）的自然杀伤（NK）细胞介导的杀伤和通过抗体依赖性细胞吞噬作用（ADCP）的巨噬细胞介导的杀伤），以及通过激活补体级联反应（补体依赖性细胞毒性（CDC））。免疫检查点阻断抗体结合并激活免疫细胞，如T细胞，导致免疫介导的癌细胞死亡。双特异性抗体结合两种不同的抗原。大多数双特异性抗体设计为结合T细胞（T细胞激活剂）和癌细胞，并将T细胞重定向以杀死癌细胞。非T细胞激活的双特异性抗体结合癌细胞表面的两种不同抗原，导致直接杀死癌细胞。抗体-药物偶联物（ADCs）、免疫毒素和放射性同位素偶联抗体携带有毒载荷，增强了抗体杀死癌细胞的能力。BCMA，B细胞成熟抗原；EGFR，表皮生长因子受体；gp100，糖蛋白100；GPRC5D，G蛋白偶联受体家族C组5成员D；FcγR，Fc γ受体；PD1，程序性细胞死亡蛋白1；PDL1，PD1配体1；scFv，单链可变片段；TCR，T细胞受体。 尽管大多数直接介导癌细胞死亡的癌症靶向抗体更倾向于使用IgG1亚类（见表1），但一个例外是帕尼图珠单抗，一种IgG2 EGFR抗体。IgG2抗体只能弱激活NK细胞和补体，而是通过招募髓系细胞来介导癌细胞死亡。目前市场上的单克隆抗体主要是IgG1。除了效应功能外，IgG亚类的选择还基于结构稳定性、循环半衰期、制造经验以及监管批准、缺乏免疫原性或意外副作用，以及公司开发组合中特定IgG亚类的可用性。 研究了曲妥珠单抗的Fab片段与HER2胞外域复合物的结构，为治疗机制提供了首个结构基础。曲妥珠单抗结合HER2的第四个亚域，阻止其同源二聚体形成，进而减少细胞增殖（蛋白质数据银行（PDB）：1N8Z；见图3a）。结构技术的进步促成了首个应用冷冻电镜（cryo-EM）技术获得的HER2与两种靶向HER2的抗体曲妥珠单抗和帕妥珠单抗复合物的结构[61]。与曲妥珠单抗不同，帕妥珠单抗通过与HER2的第二亚域相互作用，抑制HER2与HER3配体诱导的异源二聚体形成，破坏下游信号传导（见图3a）。曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的结合表位相隔约60埃（Å），HER2-曲妥珠单抗-帕妥珠单抗复合物结构指导了双特异性抗体Zanidatamab的设计，该抗体与两种HER2表位相互作用，具有改善的治疗效力。 结构生物学技术也被用来理解利妥昔单抗的治疗机制；具体来说，利妥昔单抗如何促进CD20的聚集。在最初的高分辨率结构中，似乎CD20形成了同源二聚体，利妥昔单抗的Fab片段结合到每个CD20单体的胞外区域（PDB：6VJA；见图3b）。利妥昔单抗两个Fab片段之间的距离表明单一利妥昔单抗IgG分子无法结合CD20同源二聚体。使用全长IgG利妥昔单抗进行的额外电子显微镜研究提供了首个证据，表明利妥昔单抗交联两个CD20同源二聚体，结果形成一个大的超分子复合物，确立了利妥昔单抗的结合机制。 2.5.2 单特异性抗体Fc工程 大多数IgG1抗体的效应功能由Fc域介导。数十年的研究增进了我们对Fc域与不同Fc受体相互作用的理解，并协助工程化具有理想效应功能的抗体。在临床前研究中显示增加活性的常见Fc域修饰包括去岩藻糖基化（从Fc区域去除岩藻糖以增加FcγRIIIa结合）或关键残基的氨基酸替代（例如S239D和I332E，增加与Fc受体的结合），两者都导致增强的ADCC和ADCP。两种在临床使用的抗体具有去岩藻糖基化的Fc（靶向CD20的奥比妥珠单抗和靶向CCR4的莫加木单抗）以增强它们的免疫效应功能（见表1）。随机临床试验（GALLIUM和GOYA研究）评估了利妥昔单抗（未经Fc修饰的CD20抗体）或奥比妥珠单抗（Fc去岩藻糖基化的CD20抗体）在不同淋巴瘤亚型中的益处。在GOYA研究中，两组患者的结果相似。GALLIUM研究显示接受奥比妥珠单抗治疗的患者有更好的无进展生存期（PFS），但未能证明总体生存益处，这是肿瘤学中的重要基准。此外，GALLIUM研究也因使用比利妥昔单抗更高剂量的奥比妥珠单抗而受到批评，这可能混淆了PFS结果。两种在Fc域具有氨基酸替代以增加ADCC的抗体已获得FDA批准：HER2抗体Margetuximab和CD19抗体Tafasitamab（见表1）。III期试验比较了Margetuximab与曲妥珠单抗（Fc未经修饰的HER2抗体）在乳腺癌患者中的疗效。尽管早期分析显示Margetuximab减少了癌症进展，但最终分析中两组的总体生存率相同。基于这些临床试验结果，Fc工程化抗体治疗癌症患者的益处仍然不清楚。 2.5.3 免疫检查点抑制剂 在过去十年中，另一组靶向免疫细胞调节检查点的单特异性抗体对癌症患者显示出显著的临床疗效。目前11种FDA批准和EMA批准的免疫检查点抑制抗体现在被用于治疗20多种不同类型的癌症，包括肺癌、黑色素瘤、肾细胞癌、头颈鳞状细胞癌（见图4a,b），预计近期将有更多的这些抑制性抗体获得批准（见表1）。免疫检查点抑制剂在大多数癌症类型中显示出20-30%的响应率。然而，某些恶性肿瘤如霍奇金淋巴瘤和皮肤癌、微卫星高度不稳定性（MSI-H）癌症、PDL1表达升高的癌症、突变负担高（每兆碱基≥10个突变），以及与病毒相关的一些癌症的响应率显著更高。 2.5.4 作用机制 免疫检查点阻断抗体抑制了对T细胞起负向调节作用的途径，从而重新激活细胞毒性T细胞以杀死癌细胞（见图2）。在临床试验中正在研究的20多个免疫检查点中，治疗性抗体已经获得FDA或EMA批准的三个蛋白或途径是CTLA4、PD1-PDL1和LAG3。免疫检查点抑制剂的作用机制已在其他综述文章中广泛讨论，因此这里只简要提及。CTLA4、PD1和LAG3的表达是在T细胞刺激后诱导的，其主要目的是限制T细胞激活的程度。PD1与其配体PDL1和PDL2相互作用，这在癌细胞表面经常过度表达。PD1与其配体的结合导致招募酪氨酸磷酸酶，该磷酸酶去磷酸化T细胞受体（TCR）下游的信号分子。这阻止了TCR介导的T细胞增殖（信号1），并减弱了T细胞对癌细胞的响应，使肿瘤能够逃避免疫系统。CTLA4与T细胞共刺激受体CD28竞争结合抗原呈递细胞（APCs）上的CD80和CD86。CTLA4与这些配体的结合阻止了CD28共受体信号传导（信号2），从而抑制T细胞激活并损害对癌症的免疫反应。同样，当LAG3与主要组织相容性复合体（MHC）II类分子或纤维蛋白原样蛋白1（FGL1）结合时，LAG3表达对T细胞和NK细胞功能的负向调节作用。破坏这些相互作用的抗体通过降低激活阈值允许增强的T细胞激活，使耗尽的T细胞“重新激活”，并将新的T细胞克隆招募到肿瘤中。免疫检查点抑制剂也可能对调节性T细胞（Treg细胞）有不同的影响，这是一群在肿瘤微环境中抑制免疫活动的T细胞亚群。一些使用小鼠模型和人类体外模型的研究表明，PD1和CTLA4阻断可以选择性地耗尽Treg细胞并增强抗肿瘤免疫。然而，在接受免疫检查点抑制剂治疗的患者中并未观察到这种Treg细胞耗竭，因此，与Treg细胞失活相比，细胞毒性T细胞的压倒性重新激活可能是推动免疫检查点抑制剂介导的肿瘤回归。 图3 | 抗体-抗原相互作用的结构基础。a, 针对人表皮生长因子受体2 (HER2) 的抗体结合不同的HER2表位。冷冻电镜 (cryo-EM) 结构显示了与曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的片段抗原结合 (Fab) 域结合的HER2胞外域 (ECD)（PDB ID: 8Q6J）。b, CD20同源二聚体与两个利妥昔单抗Fab域复合物的冷冻电镜结构（PDB ID: 6VJA）显示每个CD20分子与一个利妥昔单抗Fab结合。利妥昔单抗通过交联CD20二聚体形成大的超分子复合物来促进CD20的聚集。c, 针对程序性细胞死亡蛋白1 (PD1) 的抗体结合不同的PD1表位。Pembrolizumab Fab（橙色和金色；PDB ID: 5GGS）和Nivolumab Fab（洋红色和粉色；PDB ID: 5GGR）与PD1配体1 (PDL1)（白色）在PD1（青绿色）上的结合位点重叠，阻止了PD1-PDL1相互作用。所有蛋白质分子都显示了表面表示。d, PD1-PDL2（PDB ID: 6UMT）和PDL1抗体Atezolizumab（PDB ID: 5XXY）结构的对齐。结构分析表明，PDL2的残基Trp100适合PD1内部的口袋并有助于PD1-PDL2结合。PDL2中同样的残基（Trp100）扰乱了Atezolizumab与PDL2的结合。e, Ipilimumab（PDB ID: 5TRU）和Tremelimumab（PDB ID: 5GGV）Fab域与细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4 (CTLA4)的复合物结构显示出具有大的埋藏表面积的类似结合表位，有效地竞争天然配体CD80和CD86的结合。f, p53(R175H)多肽-主要组织相容性复合物 (MHC) 结合抗体平行于MHC分子内部的肽结合槽结合（PDB ID: 6W51）。相比之下，p53(R175H)特异性T细胞受体 (TCR) 垂直于肽结合槽结合（PDB ID: 6VQO）。 PD1阻断抗体是目前使用最广泛的免疫检查点抑制剂。七种获批的PD1阻断抗体（nivolumab、pembrolizumab、cemiplimab、dostarlimab、retifanlimab、tislelizumab和toripalimab）和两种目前正在临床试验中的抗体（见表1）使用IgG4格式，该格式不能有效地激活补体级联反应，并且与IgG1亚型相比具有较弱的Fc受体结合。因此，IgG4格式可能保护表达PD1的效应T细胞不被意外地通过ADCC或CDC杀死。针对LAG3的抗体relatlimab也使用类似的IgG4格式。所有IgG4抗体都带有S228P突变以防止Fab臂交换（见表1）。在获批的PD1抗体中，只有pembrolizumab的全长结构已被确定。该结构揭示了Fc域内CH2域旋转，完全暴露了糖蛋白。与其他报道的Fc域结构相比，这种CH2域构象是这些IgG亚类的分子灵活性的新描述，并且可以进一步研究以了解这种构象如何有助于较弱的Fc受体结合。相比之下，PDL1和CTLA4阻断抗体使用IgG1格式。尽管atezolizumab和durvalumab使用修饰过的Fc域限制了FcR介导的效应功能，avelumab和ipilimumab使用未修饰的Fc域保留了CDC和ADCC活性。尽管在临床试验中没有PD1和PDL1阻断抗体的直接比较以确定它们的效力，但对PD1途径阻断抗体的临床试验的荟萃分析得出结论，PD1抗体比PDL1抗体略为有效，可能是因为PD1抗体阻断了PD1与PDL1和PDL2的相互作用。值得注意的是，使用具有功能性Fc区域的IgG1格式的avelumab在肺癌、卵巢癌、胃癌和头颈癌患者中未能表现出益处，尽管其他免疫检查点抑制剂在这些相同癌症类型的患者中表现出成功。因此，使用IgG1格式及其介导效应T细胞杀伤的潜力可能导致其次优的试验结果。 已经确定了本文描述的几种免疫检查点抑制剂抗体与其目标蛋白复合物的结构基础。这些结构揭示了表位界面的多样性、复合物的埋藏表面积以及抗体结合后目标蛋白的构象变化。两种PD1阻断抗体，pembrolizumab（PDB ID：5GGS）和nivolumab（PDB ID：5GGR），尽管每种抗体与PDL1配体结合位点广泛重叠，但它们在不同的表位结合PD1（见图3c）。PDL1靶向抗体（atezolizumab、durvalumab、avelumab）与PDL1和PDL2复合物的晶体结构鉴定了一个关键残基PDL2（Trp100），它阻碍了抗PDL1抗体与PDL2的结合，并提供了PDL1和PDL2之间选择性的机制[92,95,96]（PDB ID：5XXY）（见图3d）。PDL1中相应的残基是丙氨酸，允许PDL1与atezolizumab结合。与PD1结合抗体相比，两种CTLA4靶向抗体，ipilimumab（PDB ID：5XJ3）和tremelimumab（PDB ID：5GGV），共享类似的结合表位，有效地与天然配体CD80和CD86竞争（见图3e）。与CD86相比，抗体与CTLA4复合物更大的埋藏表面积（约600 Ų）有助于这种作用机制。 2.5.5 免疫检查点抑制剂的毒性 免疫检查点阻断抗体通过普遍的免疫激活介导癌细胞的死亡，但有时这种激活可能会错误地针对健康组织。免疫检查点抑制抗体具有非常明显的不良反应谱，被称为免疫相关不良事件（irAEs）。这些irAEs包括各种表现，如皮肤、胃肠道、肝脏、内分泌、肺和心脏事件。尽管不常见，但严重的甚至可能致命的毒性偶尔可能会由于免疫检查点抑制而产生。在许多情况下，需要暂时使用糖皮质激素、肿瘤坏死因子（TNF）拮抗剂、麦考酚酸莫非尔或其他免疫调节剂进行免疫抑制以管理irAEs。 2.6 双特异性抗体格式 第二种格式包括多样化的双特异性抗体类别。与单特异性抗体不同，双特异性抗体结合两种不同的抗原或表位。这些抗原可以位于相同的目标细胞上，也可以位于不同的细胞上。针对两种不同细胞的双特异性抗体主要是T细胞激活剂，将癌细胞与效应T细胞交联；因此，它们被称为T细胞激活剂（TCE）双特异性抗体。在交联后，效应T细胞被激活，通过释放细胞毒性颗粒和淋巴因子来杀死结合的目标癌细胞（见图2）。另一类双特异性抗体作用于同一目标细胞表达的不同抗原，如两种不同的生长因子受体。这样的双特异性抗体通过阻断目标生长因子受体的增殖信号，并通过激活NK细胞和巨噬细胞对抗癌细胞来杀死目标细胞。 2.6.1 双特异性T细胞激活剂 2014年Blinatumomab的监管批准导致这种基于抗体治疗的类别爆炸性增长。原型TCE双特异性Blinatumomab是一种小型54-kDa融合蛋白，大约是IgG抗体的三分之一大小（见表2）。Blinatumomab由双特异性抗体所需的最小元素组成；一个针对癌症的scFv（抗CD19）通过甘氨酸-丝氨酸肽连接与一个T细胞结合scFv（抗CD3）连接。Blinatumomab通过抗CD19 scFv结合B细胞，并同时通过抗CD3 scFv连接并激活T细胞，导致B细胞死亡（见图2）。Blinatumomab在一系列B细胞恶性肿瘤中显示出活性（见图4c,d），并获得批准用于治疗B细胞前体急性淋巴细胞性白血病（B-ALL）。随后获得监管批准的TCE双特异性抗体采用了Blinatumomab的基本设计（见图5a）。 图4 | 使用免疫检查点抑制剂或双特异性抗体重新激活或重新定向T细胞对癌细胞的治疗效果。a,b, 来自一位患有头颈鳞状细胞癌（HNSCC）并涉及左侧舌边缘的个体的氟脱氧葡萄糖（FDG）-正电子发射断层扫描（PET）图像（a）和用苏木精和伊红（H&E）染色的肿瘤切片（b）。该患者接受了免疫检查点抑制剂nivolumab和ipilimumab的治疗，并经历了肿瘤负担的大幅减少。治疗中的H&E切片显示角蛋白碎片（KD）和周围的多核巨细胞（箭头）以及治疗中的FDG-PET图像显示舌边缘FDG摄取的减少。c, 一位患有B细胞淋巴瘤的患者的CT扫描，在治疗前和接受靶向CD19的双特异性抗体T细胞激活剂blinatumomab治疗4周后。该患者对blinatumomab有部分反应。箭头指向纵隔中受累的淋巴结肿瘤。d, 另一位患有B细胞淋巴瘤的患者的骨髓活检样本，在治疗前和接受blinatumomab治疗15天后。肿瘤细胞以蓝色显示（苏木精染色），T细胞以棕色显示（CD3染色）。部分a和b改编自，Springer Nature。部分c和d经，AAAS许可转载。 制药公司经常为使用不同架构和组装双特异性抗体的方法的独特TCE格式注册商标。常见的格式包括双特异性T细胞激活剂（BiTE）（Amgen）、Duobody（Genmab）、DART（MacroGenics）和Xmab（Xencor），Blinatumomab使用BiTE格式。Tebentafusp是一种独特的TCE双特异性格式，名为ImmTAC，它将针对黑色素瘤细胞中表达的糖蛋白-100（gp100）-人类白细胞抗原（HLA）-A02复合物的亲和增强型TCR与抗CD3 scFv连接。Tebentafusp在转移性葡萄膜黑色素瘤患者中显示出优越的总生存率，导致其在2022年获得批准。在过去的2年中，有六种针对血液恶性肿瘤的新型双特异性抗体获得了监管批准。这些包括teclistamab和elranatamab（BCMAxCD3），以及talquetamab（G蛋白偶联受体家族C组5成员D（GPRC5D）xCD3）用于多发性骨髓瘤，以及mosunetuzumab、epcoritamab和glofitamab（CD20xCD3）用于B细胞淋巴瘤（见表2）。然而，TCE双特异性抗体在实体瘤中的批准落后。然而，针对实体恶性肿瘤的TCE双特异性抗体的临床试验激增，让人们看到了这一策略将增加其效用的广度的希望。最近有关针对小细胞肺癌中delta样蛋白3（DLL3）的TCE双特异性抗体的I期试验的积极报告令人鼓舞，并表明实体瘤障碍将被突破。 2.6.2 双特异性抗体靶向同一细胞上的不同抗原 双特异性抗体也被设计为结合目标癌细胞上的两种不同的抗原或表位，而无需与效应T细胞结合。它们的抗癌效果是通过阻断两条增殖信号通路来介导的，从而最大化了抗肿瘤活性。除了它们的受体阻断活性外，这些双特异性抗体还可能被设计为包含一个功能性的IgG1 Fc域，使它们能够通过非T细胞的免疫效应途径如ADCC、ADCP和CDC杀死癌细胞。Amivantamab是首个靶向癌细胞表达的EGFR和MET（表2）的受体阻断双特异性抗体，并获得监管批准用于治疗带有外显子20插入突变的非小细胞肺癌。Amivantamab阻断了EGFR和MET通路的信号传导，这些通路驱动了一部分肺癌，比单一受体结合抗体的组合更有效。此外，Amivantamab的IgG1 Fc域被设计为低岩藻糖水平，这增强了FcγRIIIa的结合和NK细胞介导的ADCC。Zanidatamab采用了类似的双特异性设计，它用每个Fab臂结合两种不同的HER2表位（表2）。这些臂针对HER2的第二个和第四个亚域，分别是已批准用于治疗HER2阳性乳腺癌的HER2靶向抗体帕妥珠单抗和曲妥珠单抗的结合位点。临床前研究表明，与曲妥珠单抗、帕妥珠单抗或曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的组合相比，Zanidatamab增强了HER2聚集、受体下调，并增加了CDC介导的HER2阳性癌细胞的杀伤。在I期临床试验中，Zanidatamab对一系列HER2阳性实体瘤显示出令人鼓舞的活性。 ADCC，抗体依赖性细胞介导的细胞毒性；ALL，急性淋巴细胞性白血病；CRS，细胞因子释放综合征；Ig，免疫球蛋白；irAEs，免疫相关不良事件；IV，静脉注射；kDa，千道尔顿；scFv，单链可变片段；TLS，肿瘤溶解综合征。带有Fc的双特异性抗体还带有Fc突变，这些突变使得异源重链能够配对（未显示）。 2.6.3 双特异性抗体Fc工程 Blinatumomab的血清半衰期很短，大约为2小时，因为这种小多肽可以快速被肾脏清除，并且缺乏FcRn介导的循环所需的Fc域。由于其半衰期短，Blinatumomab通过连续静脉输注给药，以维持一致的血清浓度。连续输注装置需要额外的医疗资源，增加成本，并且与间歇输注相比，对患者来说不够方便。在Blinatumomab之后获得监管批准的双特异性抗体具有更高的分子量，大多数包含一个延长半衰期的Fc域（见表2）。具体来说，Tebentafusp的分子量约为75kDa，高于肾脏滤过的截止值，因此不会被肾脏快速清除。然而，Tebentafusp缺乏Fc域，因此具有相对较短的半衰期为7.5小时。Mosunetuzumab、Teclistamab、Epcoritamab、Glofitamab和Elranatamab包含IgG1、IgG2或IgG4 Fc域（见表2），这增加了它们的分子量超过Tebentafusp（约145kDa），并使FcRn能够结合。这些修改延长了血清半衰期，并允许间歇（每周）剂量。添加这样的Fc域倾向于被包括在所有即将到来的双特异性抗体设计中。由于IgG1 Fc片段对巨噬细胞和NK细胞上的Fcγ受体有很强的亲和力，带有IgG1 Fc片段的TCE双特异性抗体可能通过抗CD3 scFv与巨噬细胞或NK细胞（通过IgG1 Fc片段）交联，导致巨噬细胞或NK细胞无意中杀死T细胞，反之亦然。已经在Fc域引入了氨基酸替代（例如，在Mosunetuzumab中的N297G或在Glofitamab中的P329G、L234A和L235A）以消除FcγR结合并减少无意中的免疫细胞杀伤（见表2）。使用IgG2或IgG4 Fc域的TCE双特异性抗体可能不需要这样的Fc域沉默，因为它们与FcγRs的相互作用较弱。 2.6.4 双特异性抗体的毒性 TCE双特异性抗体由于使用相同的抗癌机制——通过T细胞激活来杀死目标细胞（表2），因此具有类似的不良反应。毒性水平与携带TCE双特异性抗体靶标的细胞（肿瘤或正常细胞）的总身体负担有关。TCE双特异性抗体可诱导全身性炎症，特征为发热、不同程度的缺氧、低血压，偶尔多器官衰竭，统称为细胞因子释放综合征（CRS）。神经毒性是与TCE双特异性抗体相关的另一种独特的不良反应，表现为意识混乱和震颤，以及言语和行为的改变。CRS和神经毒性的病理生理学尚不完全清楚，可能与干扰素γ（IFNγ）、白细胞介素-6（IL-6）、IL-1和IL-10等细胞因子水平升高有关。接受TCE双特异性抗体治疗的患者需要密切监测，可能需要使用糖皮质激素或抗细胞因子药物如IL-6中和抗体tocilizumab进行免疫抑制。此外，为预防或减少CRS和神经毒性，已实施了几种策略，包括逐渐增加TCE双特异性抗体剂量、预防性糖皮质激素，以及在开始TCE双特异性抗体治疗前使用化疗减少肿瘤负担。受体阻断双特异性抗体无法激活T细胞，因此不会引起TCE双特异性抗体通常观察到的CRS或神经毒性。受体阻断双特异性抗体的不良反应与它们的单特异性抗体类似，如amivantamab引起的皮疹（也见于靶向EGFR的抗体cetuximab和panitumumab）和zanidatamab引起的心力衰竭（也见于靶向HER2的抗体trastuzumab）（表2）。 图5 | 双特异性抗体和偶联抗体的发展时间线。a, 双特异性抗体的时间线。b, 药物偶联、免疫毒素偶联和放射性同位素偶联抗体的时间线。a Catumaxomab，一种上皮细胞黏附分子(EpCAM)xCD3双特异性抗体，于2009年获得欧洲药品管理局(EMA)批准用于治疗恶性腹水，但后来因商业原因被制造商撤回。ADC, 抗体-药物偶联物；ALL, 急性淋巴细胞性白血病；B-ALL, B细胞前体急性淋巴细胞性白血病；BCMA, B细胞成熟抗原；AML, 急性髓系白血病；CEA, 癌胚抗原；EGFR, 表皮生长因子受体；FDA, 美国食品药品监督管理局；gp100, 糖蛋白100；HCL, 毛细胞白血病；MRD, 最小残留病；NHL, 非霍奇金淋巴瘤；NSCLC, 非小细胞肺癌；OS, 总生存期；PFS, 无进展生存期；TCR, T细胞受体。 2.7 偶联抗体格式 第三种主要格式涉及与有毒载荷连接的抗体，如细胞毒素（抗体-药物偶联物（ADCs））、细菌或植物毒素（免疫毒素）或放射性同位素，这增强了抗体杀死癌细胞的能力。在这一组中，ADCs迄今为止是最广泛使用的形式，而毒素偶联和放射性同位素偶联抗体尚未得到广泛采用（见图5b）。 2.7.1 抗体-药物偶联物 ADCs是通过将肿瘤靶向抗体与细胞毒素连接而构建的（见图2）。ADC分子与细胞表面抗原的结合导致它们的内化，随后在细胞内释放细胞毒素。这允许选择性地将细胞毒素输送到癌细胞，同时保留大部分健康组织。ADC的关键组成部分包括肿瘤靶向抗体、细胞毒素和连接抗体与细胞毒素的连接子（表3）。ADC的成功取决于这些关键组成部分的最佳选择，以及用于将连接子连接到抗体的偶联方法，这通常决定了药物-抗体比率（DAR）。 大多数ADC使用人源化或人类IgG1作为肿瘤靶向抗体（除了brentuximab使用嵌合IgG1，以及gemtuzumab和inotuzumab使用人源化IgG4）。如上所述，使用IgG1的普及是由于其长的血浆半衰期约为21天（例如，与IgG3的半衰期为7天相比），以及其能够结合Fc受体，通过ADCC和ADCP增强靶细胞的杀伤（例如，与在ADCC和ADCP中效率较低的IgG2和IgG4相比）。两种ADC，gemtuzumab和inotuzumab，使用IgG4，其对FcγRII和FcγRIII的亲和力较低，从而限制了ADCP，同时可能由于减少了ADC通过Fc受体进入免疫细胞的非特异性吸收，而减少了毒性。 大多数连接子将细胞毒素连接到IgG1抗体主链上的随机赖氨酸或半胱氨酸残基上。一个有效的连接子在血液中最小化细胞毒素的早期释放，同时促进在首选目标位置的活性药物的控制释放。连接子通常被分类为可裂解和不可裂解。十二种获批的ADC中有十种使用可裂解连接子，如肽连接子、腙连接子、二硫键连接子或CL2A连接子（表3）。最早开发的用于药物附着的连接子之一是使用腙键的可裂解连接子。这种连接子用于将抗肿瘤抗生素calicheamicin连接到gemtuzumab和inotuzumab ADCs。腙键设计为在靶细胞溶酶体内部的酸性条件下分解，以释放calicheamicin。然而，腙键可能在血浆中发生水解，导致药物分子的非预期释放，从而引起系统毒性。第二种可裂解连接子是肽连接子，需要在溶酶体内部通过cathepsin B选择性裂解。四种ADC使用mc-VC-PABC二肽连接子，由Seagen首次开发用于生成使用CD30靶向抗体连接到微管抑制剂单甲基auristatin E (MMAE)的ADC brentuximab（表3）。Brentuximab与化疗结合在几种不同类型的淋巴瘤患者中显示出显著的疗效，并被认为是霍奇金淋巴瘤和CD30+外周T细胞淋巴瘤的一线治疗标准。Brentuximab的成功导致了mc-VC-PABC二肽连接子的广泛采用。Seagen与Roche、Astellas和Genmab合作，分别使用mc-VC-PABC二肽连接子开发了靶向CD79B、nectin-4和TF的ADC。第三种可裂解连接子是二硫键连接子，其中连接子裂解是通过细胞内部高浓度的谷胱甘肽介导的。带有二硫键连接子的ADC包括mirvetuximab，在卵巢癌患者的III期临床试验中显示了生存益处。与可裂解连接子相比，不可裂解连接子对各种分解机制都有抵抗力。有效载荷在靶细胞的溶酶体内降解抗体后释放。两种ADC，trastuzumab emtansine和belantamab mafodotin使用不可裂解连接子进行药物附着。临床前研究表明，由于不可裂解连接子的血浆稳定性增加，对非靶细胞的毒性较低。然而，可裂解和不可裂解连接子尚未在临床试验中直接比较，一个比另一个的优势仍然不清楚。 肿瘤细胞杀伤过程由附着在肿瘤靶向抗体上的细胞毒素执行。药物通常是一种具有高细胞杀伤效力的小分子（半数最大抑制浓度（IC50）≤5纳摩尔），通过三种机制之一诱导细胞死亡——直接DNA损伤、破坏微管网络或抑制拓扑异构酶活性（表3）。目前使用的药物IC50差异很大，从5纳摩尔（Dxd，一种拓扑异构酶抑制剂）到5皮摩尔（pyrrolobenzodiazepines (PBDs)，一类DNA损伤剂）。然而，ADC的效力取决于药物的IC50和DAR。因此，带有强效PBD载荷和相对较低DAR约2.3的loncastuximab tesirine，以及带有效力较低的载荷Dxd但相对较高DAR约8.0的trastuzumab deruxtecan，都能在几种体内模型中诱导完全的肿瘤回归。在临床试验中也观察到了带有高DAR的ADC结合新型连接子设计的益处。Trastuzumab emtansine和trastuzumab deruxtecan共享相同的HER2靶向抗体。然而，尽管trastuzumab emtansine携带微管抑制剂DM1（IC50为2纳摩尔，DAR 3.5）通过不可裂解连接子结合，trastuzumab deruxtecan使用药物Dxd（IC50为5纳摩尔，DAR 8.0）与可裂解连接子结合。在比较两种ADC的III期临床试验中，trastuzumab deruxtecan显示出更高的反应率（79.7%对34.2%）和总生存率（94.1%对85.9%，在12个月时）。此外，trastuzumab deruxtecan延长了表达低水平HER2的乳腺癌患者的生存期，使其成为第一种在HER2低表达乳腺癌中有效的ADC。最近，fam-trastuzumab deruxtecan在一系列高HER2表达的实体瘤中显示了肿瘤回归，并获得了FDA对肿瘤不可知论HER2导向治疗的首次批准。 2.7.2 ADCs 的毒性 ADCs被认为是靶向药物，比传统的细胞毒素化疗药物有更好的耐受性。然而，大多数患者在使用ADCs时会经历某种形式的毒性。大多数ADCs共有的毒性包括输液反应、细胞减少症、感染、肝酶升高、胃肠道症状（腹泻、呕吐和便秘）和胚胎-胎儿毒性（表3）。 DM1和DM4是美登素1的衍生物。DXd是Exatecan的衍生物，用于ADC。SN38是伊立替康的活性代谢产物。ADC，抗体-药物偶联物；ALL，急性淋巴细胞性白血病；AML，急性髓系白血病；BCMA，B细胞成熟抗原；DAR，药物-抗体比率；FRα，叶酸受体α；GSK，葛兰素史克；HER2，人表皮生长因子受体2；mc，马来酰亚胺己酰；mc-VC-PABC，马来酰亚胺己酰-缬氨酸-对氨基苄氧羰基；MMAE，单甲基奥瑞他汀E；MMAF，单甲基奥瑞他汀F；PBD，吡咯并苯并二氮杂环；PTCL，外周T细胞淋巴瘤；SMCC，琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚甲基)环己烷-1-羧酸酯；TF，组织因子；TNBC，三阴性乳腺癌。 a 2023年，FDA撤销了belantamab mafodotin的生物制品许可，EMA建议不更新其市场授权，因为确证性DREAMM-3试验未能证明无进展生存期的改善。正在进行的试验表明，belantamab可能会重新获得批准。b Trastuzumab deruxtecan获得FDA批准用于HER2低表达乳腺癌（免疫组织化学评分1+）和所有高HER2表达的实体瘤（免疫组织化学评分3+）。 某些毒性与使用特定有效载荷有关，例如与微管抑制剂（MMAE、DM1、DM4）相关的周围神经病变和与calicheamicin相关的肝毒性。其他毒性是针对共同抗原的ADCs共有的。例如，靶向HER2的ADCs可能导致心力衰竭和介导间质性肺病。 2.7.3 免疫毒素偶联物或免疫毒素 免疫毒素有两个组成部分，一个靶向抗体或抗体的Fv片段，以及通常来自细菌或植物毒素的细胞毒素。靶向抗体或Fv片段结合到目标细胞，允许选择性地输送毒素。毒素来自细菌，如假单胞菌外毒素A（PE）和白喉毒素（DT），或来自植物，如蓖麻毒素。从理论上讲，任何用于生成ADC的靶向抗体都可以用于免疫毒素。然而，尽管在过去几年中有12种ADC获得批准，只有一种免疫毒素，moxetumomab pasudotox，获得了FDA和EMA的批准，用于治疗毛细胞白血病（图2和5b）。Moxetumomab是一种融合蛋白，结合了CD22结合Fv与截断的假单胞菌外毒素A（PE38），由国家癌症研究所（NCI）的I. Pastan开发。当进入目标细胞时，PE38毒素与延伸因子2（EF2）结合并阻断蛋白质合成。Moxetumomab在毛细胞白血病患者的临床试验中展示了41%的高完全反应率，并在2018年获得监管批准。然而，由于临床采用率低，moxetumomab的生产在2023年停止。Moxetuzumab和其他研究性免疫毒素面临了几个挑战，包括高免疫原性导致治疗效力丧失和狭窄的治疗窗口导致毒性，如毛细血管渗漏综合征（CLS）和溶血性尿毒症综合征（HUS）。Moxetumomab的低采用率也可能是由于其复杂的管理过程，包括毒性预防、预处理和后处理水化、需要安全监测以避免不良反应以及在毛细胞白血病中有替代疗法的可用性。尽管过去几年的几项临床试验已经评估了靶向BCMA、间皮素和其他与癌症相关的抗原的免疫毒素的疗效，但目前没有一种正在进行监管审查，也没有预计将在不久的将来获得批准。 2.7.4 抗体-放射性同位素偶联物 抗体-放射性同位素偶联物由一个靶向抗体与一个放射性同位素链接而成。放射性同位素发射α粒子或β粒子，导致目标细胞DNA链断裂，从而导致细胞死亡。抗体-放射性同位素偶联物不需要内化就能诱导细胞死亡，这提供了与ADCs和免疫毒素相比的独特优势，包括旁观者效应。α粒子是大型带正电荷的粒子，由两个质子和两个中子组成，具有相对短的有效范围约为50-100微米。相比之下，β粒子是小型带负电荷的电子（比α粒子小约8000倍），具有较长的有效范围约为0.5-10毫米，但具有较少的DNA损伤能量。β粒子发射体的例子包括碘-131、镥-177和钇-90。两种获得FDA批准和/或EMA批准的抗体-放射性同位素偶联物，90Y-ibritumomab和131I-tositumomab，将β粒子发射放射性核素连接到靶向CD20的抗体上（图2和5b），用于治疗B细胞淋巴瘤。90Y-ibritumomab和131I-tositumomab在临床试验中展示了65-80%的总反应率和20-30%的完全反应率。两项研究都观察到了一些可预测的治疗相关不良效果，包括由于健康骨髓暴露于辐射而导致的长期严重细胞减少症，131I-tositumomab的放射性碘引起的甲状腺功能减退症，以及继发性恶性肿瘤，如骨髓增生异常综合征（MDS）和白血病。尽管有高反应率，这些药物并未得到广泛的临床使用，2012年只有75名患者接受了131I-tositumomab治疗。因此，131I-tositumomab在2013年自愿撤回。90Y-ibritumomab仍然适用于复发或难治性低级别B细胞淋巴瘤患者，但报告表明只有少数患者正在接受这种治疗。批准数量有限和临床采用率低可能是因为需要一个多学科团队，包括医学肿瘤学家、放射肿瘤学家、药理学家和物理学家，来开发并在临床上部署这些分子。很少有中心具备这样的能力，因此，抗体-放射性同位素偶联物的使用落后于ADCs。 3. 挑战与未来展望 肿瘤药物开发是一个艰难的过程，成功率为3-7%。目前尚缺乏针对肿瘤学中抗体基础治疗的成功率数据，但大约18%进入I期临床试验的治疗性抗体（包括肿瘤学在内的所有适应症）会继续进行药物上市146。这些低数字反映了药物开发过程中遇到的众多障碍。治疗性抗体的开发是一个资源密集型的多步骤操作。它需要针对目标抗原生成一定数量的抗体，然后选择几个具有理想结合和生物物理特性的领先候选物。然后，领先的抗体会在体内使用小鼠模型进行有效性测试，使用非人灵长类动物进行毒性和药代动力学测试，随后进行人体首次临床试验。尽管在小鼠模型中显示出有希望的有效性，但多种抗体由于在非人灵长类动物或人体首次临床试验中的毒性而未能通过临床开发。尽管存在这些障碍，但以下描述的几种抗体显示出令人鼓舞的临床前和临床数据，可能会在未来几年改变患者护理。 3.1 新靶点  实体瘤构成了新癌症患者的大多数。与实体瘤相关的患者中有相当一部分以转移性疾病出现，需要系统性治疗，这种治疗很少是治愈性的。因此，转移性肺、结肠、胰腺、乳腺、前列腺、肝脏和胆管癌共同导致了大多数癌症死亡（见图6）。然而，与血液恶性肿瘤相比，实体瘤的抗体开发滞后主要是因为缺乏可靶向的抗原。不同的淋巴瘤亚型约占所有癌症死亡的3%，并且有五种肿瘤抗原（CD19、CD20、CD79b、CD30、CCR4和PD1）被治疗性抗体靶向。相比之下，约占癌症死亡21%的肺癌只有一个可靶向的肿瘤抗原（EGFR-MET）。此外，约占癌症死亡8%的胰腺癌、6%的前列腺癌和3%的脑癌完全没有FDA批准和/或EMA批准的治疗性抗体。这种差异很大程度上是因为淋巴瘤和骨髓瘤起源于正常的B细胞，这些细胞表达明显的可靶向抗原（见图6）。此外，正常的B细胞可以在不产生不可忍受的后果的情况下被根除。不幸的是，在实体瘤中，目标抗原的发现很少带来线索。因此，新的靶点鉴定可能需要涉及对大量患者样本进行单细胞测序，以寻找在癌症和正常组织中差异表达的抗原。 图6 | 常见实体瘤和血液瘤的抗体靶点。这些图表显示了美国前15位癌症类型的死亡百分比与批准的抗体及晚期临床试验中的抗体所靶向的独特抗原数量。抗原靶点在每种癌症组织旁边展示。注意，非小细胞和 小细胞肺癌被归类在“肺”下；霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病（CLL）和中枢神经系统（CNS）淋巴瘤被归类在“淋巴瘤”下；急性髓系白血病（AML）、急性淋巴细胞白血病（ALL）、慢性髓系白血病（CML）和其他白血病被归类在“白血病”下。不论组织类型，微卫星高度不稳定（MSI-H）癌症都有资格接受免疫检查点抑制剂治疗，HER2阳性实体瘤有资格接受HER2导向治疗的trastuzumab deruxtecan，并未包括在分析中。镥Lu177 vipivotide tetraxetan用于前列腺癌的治疗没有被包括在内，因为靶向部分不是抗体。癌症死亡百分比和批准的靶点数量的数据分别来自 https://www.cancer.org/research/cancer-facts-statistics/all-cancer-facts-figures/2023-cancer-facts-figures.html 和抗体协会。a 程序性细胞死亡蛋白1（PD1）治疗仅在霍奇金淋巴瘤中获批。b B7-H3被认为是肿瘤相关抗原，可能是免疫检查点抗原。 此外，最近针对claudins、HER3、成纤维细胞生长因子受体2B (FGFR2B)、DLL3、结缔组织生长因子（CTGF，亦称CCN2）和前列腺六跨膜上皮抗原1 (STEAP1)的临床试验显示出令人鼓舞的结果。目前正在II/III期临床试验中的抗体靶点列在图6和补充表2中。最后，一种创新的方法来绕过缺乏肿瘤特异性抗原是通过多种抗原的组合靶向。大多数癌症缺乏在健康组织中不存在的真正特异性抗原的表达。因此，靶向只在肿瘤中共同表达而不在健康组织中表达的抗原组合，可能提供一条可行的治疗途径。利用布尔逻辑AND门的临床前研究，需要两个或三个目标激活细胞毒性机制，已经展示了肿瘤回归，但它们尚未在临床试验中得到测试。 一些细胞表面蛋白聚糖，如软骨素和肝素，是癌症和其他人类疾病中信号通路的重要调节因子。软骨素蛋白聚糖已被证明促进肿瘤血管化，并调节与肿瘤生长相关的信号传导途径，它们在多种癌症类型中表达。糖磷脂酰肌醇 (GPI) 锚定的细胞表面HSPGs，如glypicans，在癌症中过度表达，表明它们是潜在的肿瘤相关抗原。已经开发了针对GPC1、GPC2和GPC3的抗体和CAR T细胞，分别用于治疗胰腺癌、神经母细胞瘤和肝癌。 3.1.1 肿瘤特异性抗原 大多数目前批准的基于抗体的治疗针对肿瘤相关抗原或组织特异性抗原。肿瘤相关抗原，如HER2，在癌细胞中过度表达，但也由正常组织的一个亚群表达，尽管表达水平较低。癌症和正常组织之间表达水平的差异提供了治疗窗口。组织特异性抗原，如CD20，在癌细胞（B细胞淋巴瘤）和正常细胞（B细胞）中表达水平相似。针对这类组织特异性抗原的治疗旨在同时消除正常细胞和癌细胞，因为正常B细胞的耗尽可能在临床上是可以接受的。针对B细胞谱系癌症的CD19、CD20、CD38和BCMA的治疗代表了组织特异性治疗性抗体最成功的例子。对于起源于较少可有可无的组织如T细胞的癌症，针对TCR β链恒定区 (TRBC) 和TCR β链可变区 (TRBV) 的抗体已经开发出来，以靶向所有克隆性癌细胞，但只针对正常T细胞的一部分，从而保留足够的正常组织以执行其功能。一些新兴的抗体靶点包括肿瘤特异性抗原，这些抗原仅由癌细胞表达，不由正常细胞表达。肿瘤特异性抗原的主要例子是新抗原，它们是由MHC分子呈递的突变肽。这些突变肽是携带来自癌症细胞标志性突变（点突变、小插入/删除、移码突变、融合和剪接变体）的蛋白质的氨基酸变化的短蛋白质水解产物。来自诸如BRAF、RAS、PIK3CA、TP53和异柠檬酸脱氢酶（IDH）等突变癌症驱动基因的公共新抗原，为癌细胞提供了极其独特的靶点，可以用来造福患者。这些公共新抗原目前正在被双特异性抗体靶向，并且在针对携带TP53和RAS突变的癌症的临床前研究中显示出令人鼓舞的活性。已经有多方面的努力描述了抗体识别新抗原的结构基础。p53(R175H)突变肽-MHC与p53(R175H)特异性TCRs和抗体复合物的晶体结构已经确定。TCRs共享一个明显的“规范”垂直结合取向至肽-MHC分子，偏向突变位点。相比之下，p53(R175H)新抗原特异性抗体使用一种非规范的并行结合模型沿肽的长度（见图3f）。此外，抗体对p53(R175H)新抗原的亲和力比相应的TCR高约100倍。不同的结合模式可能有助于抗体的特异性和高亲和力。 3.1.2 细胞内抗原 抗体无法穿透细胞膜，因此只能靶向细胞表面抗原。细胞内抗原可以与MHC分子相关联地呈现在细胞表面，使它们成为可靶向的。以这种方式，tebentafusp靶向细胞内抗原gp100，该抗原在黑色素瘤中过度表达，并与HLA-A*02:01相关联呈现在细胞表面。目前正在开发抗体以靶向诸如人类端粒酶逆转录酶（hTERT）、MUC1、NY-ESO1、TCR γ替代阅读框蛋白（TARP）、p53、WT1和黑色素瘤优先表达抗原（PRAME）等癌细胞特异性过度表达的细胞内蛋白，其中针对PRAME的靶向在临床试验中显示出令人鼓舞的初步结果。 3.1.3 肿瘤微环境中的抗原 癌症发展于一个复杂的免疫细胞、成纤维细胞和细胞外基质的混合物中，这被称为肿瘤微环境。早期基于抗体的针对癌症相关成纤维细胞或细胞外基质的靶向尝试未能产生临床效益。目前的研究表明，肿瘤微环境中的免疫细胞如肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）、树突细胞和骨髓源抑制细胞（MDSCs）是众所周知的驱动对免疫检查点抑制剂的抗性的因素。因此，耗尽或阻断这些免疫抑制细胞的功能可能使肿瘤对免疫检查点抑制剂敏感。早期阶段的临床试验已经证明了通过靶向巨噬细胞集落刺激因子1受体（CSF1R）、髓细胞表达触发受体1（TREM1）和TREM2的抗体介导的TAMs抑制的安全性和可行性。临床前研究也表明，使用激动性CD40单克隆抗体增强肿瘤微环境中树突细胞的功能可以增强T细胞介导的肿瘤回归。针对胰腺癌患者的CD40抗体的临床试验患者耐受性良好，并已显示出增强的T细胞激活和渗透到肿瘤中。T细胞免疫球蛋白结构域和黏蛋白结构域3（TIM3）受体由一系列免疫细胞如淋巴细胞、树突细胞、单核细胞和巨噬细胞表达，TIM-3拮抗性抗体同样可以通过调节肿瘤微环境促进肿瘤杀伤。TIM-3拮抗性抗体与目前批准的免疫检查点抑制剂联合在实体瘤患者中展示了可控的安全概况。所有这些抗体抵消肿瘤微环境中的免疫抑制状态，目前正在进行II/III期试验，将确定它们的最终效用。 3.2 针对低密度抗原 目前批准的ADCs和双特异性抗体靶向相对丰富的抗原，如CD19、CD20和BCMA，每个癌细胞上有大约1,000到50,000份拷贝。针对新抗原的主要挑战来自于它们在癌细胞表面的低丰度，有些细胞表达的靶标抗原只有1-10份拷贝。除了新抗原，有效的靶向肿瘤相关或组织特异性抗原也可能因为它们可变的细胞表面密度而受到影响。此外，治疗压力也可能选择表达靶标抗原低的癌细胞克隆。临床前研究表明，双特异性抗体能够杀死每个细胞表达低至1-10个抗原的癌细胞，而ADCs需要1,000份或以上才能杀死细胞。未修饰的全长抗体可能需要更高目标抗原表达。针对这种低密度抗原仍然是一个挑战，优化的抗体工程使得在临床前研究中有效地靶向个位数水平的新抗原成为可能。 3.3 新型免疫检查点抑制剂 2011年ipilimumab的批准标志着免疫疗法时代的到来。免疫检查点阻断剂具有在一些复发的实体瘤患者中诱导长期缓解的前所未有的能力，这导致了大量临床试验的开展。FDA和EMA已经批准了11种不同的针对CTLA4、PD1和PDL1的抗体，用于20多种癌症类型的65多个不同的适应症。继CTLA4、PD1和PDL1靶向初步成功后，还有许多其他免疫检查点如LAG3、T细胞免疫受体含有免疫球蛋白和ITIM结构域(TIGIT)、V型免疫球蛋白抑制T细胞激活(VISTA)、TIM3、PVRIG、自然杀伤组2A(NKG2A)和OX40等被探索它们在多种癌症类型中诱导缓解的能力。除了针对黑色素瘤的LAG3的relatlimab外，其他都尚未在III期试验中展示所需的治疗活性以获得监管批准。同样，针对CD47的巨噬细胞检查点抑制剂magrolimab在早期试验中显示出令人鼓舞的活性，但在MDS和急性髓系白血病(AML)患者的III期试验中因缺乏效力而停止。目前新型免疫检查点阻断剂的表现低于预期，导致制药行业专注于PD1-PDL1领域，除了现有的九种抗体外，还有五种新的药物正在进行监管审查。尽管PD1-PDL1靶向取得了成功，但只有少数(~20%)的患者对免疫检查点阻断剂有反应，甚至更少的比例(~13%)实现持久缓解。此外，目前的免疫检查点抑制剂与相当大的并发症相关，其中约1%是致命的，约40%是慢性毒性。因此，我们需要超越PD1-PDL1抑制。这将需要改变癌症生物学研究方向和监管机构对抗体药物的批准方法。我们应该优先考虑针对新型免疫检查点调节剂的基础和转化研究，如B和T淋巴细胞衰减剂(BTLA)、B7-H3(亦称CD276)、CD27和4-1BB，而不是重新审视已经广泛探索的PD1-PDL1轴和联合疗法。监管机构可能考虑修订批准流程，使新的PD1-PDL1阻断剂在初步III期试验中展示与竞争产品相当的疗效和毒性概况后，获得所有现有适应症的批准。 3.4 新型抗体格式 3.4.1 IgM抗体 所有全长治疗性抗体使用IgG亚型。临床前研究和早期试验正在探索五聚体IgM格式，与IgG格式中可用的两个结合位点相比，它有十个抗原结合位点。这比针对同一表位的IgG抗体提供了更高的结合亲和力。一个例子是IGM-8444，一种高亲和力的五聚体IgM激动剂抗体，针对死亡受体5 (DR5)，在小鼠模型中展示了肿瘤回归，并已进入I期试验。 3.4.2 新型双特异性格式 TCE双特异性格式不断发展，旨在提高疗效，同时减少不良反应。现在有200多种双特异性抗体正在进行临床开发，大多数使用TCE方法针对实体瘤。Glofitamab(一种CD20xCD3双特异性抗体，用于淋巴瘤)和xaluritamig(亦称AMG 509)(一种STEAP1xCD3双特异性抗体，用于前列腺癌)在临床试验中都显示出疗效，并共享一个独特的2:1 T细胞结合双特异性格式，对目标双价结合，对CD3单价结合。这种格式可能比传统的1:1目标至CD3结合设计提供增加的肿瘤细胞杀伤能力。IgM格式的TCE双特异性抗体由于使用五聚体IgM，有一个更令人印象深刻的10:1目标至CD3结合比率。高目标至CD3结合比率设计允许高亲和力目标结合，可能引发增加的目标细胞毒性，同时减少细胞因子分泌。Imvotamab(亦称IGM-2323)，一种CD20xCD3 IgM双特异性抗体的I期试验，在晚期B细胞恶性肿瘤患者中展示了几个完全反应。 3.4.3 双特异性免疫检查点阻断剂 双特异性格式也被用于同时抑制两个免疫检查点，以增强T细胞激活，超出两种单一免疫检查点阻断剂组合所能实现的。针对PD1xLAG3、PD1xCTLA4和PDL1xCTLA4的双特异性免疫检查点阻断剂在早期临床试验中显示出令人鼓舞的疗效。尽管最初的双特异性免疫检查点阻断剂组专注于抑制临床确立的免疫检查点，临床前研究正在调查是否类似的双特异性免疫检查点阻断剂可以通过靶向新型免疫受体如OX40、TIGIT和C型凝集素结构域家族9成员A (CLEC9A)来诱导抗肿瘤免疫。 3.4.4 三特异性抗体 三特异性抗体具有同时与三种不同抗原相互作用的能力。这一功能使三特异性抗体能够与两种不同的癌症相关抗原，如B细胞恶性肿瘤背景下的CD19和CD20，同时通过第三个结合域结合CD3，与细胞毒性T细胞相互作用。这种创新方法有助于减轻由于单一抗原如CD19或CD20的丢失而引起的治疗抗性，因为癌细胞必须同时下调两种抗原才能逃避杀伤。或者，三特异性抗体被设计为与两种T细胞受体，如CD3和CD28相互作用，从而对癌细胞提供更强的激活信号。 3.4.5 纳米抗体 可能引领抗体工程领域重要范式转变的一个研究领域是单域抗体（也称为纳米抗体）的开发。纳米抗体主要来源于驼类重链抗体，它们体积小、易于生产、稳定，并且能够穿透肿瘤或病毒抗原中的隐蔽位点。纳米抗体通常从驼类衍生的噬菌体展示库中分离出来，最近也从转基因小鼠如RenNano和nanomouse中分离得到。纳米抗体有一个长的CDR3环，可以穿透抗原表面的空腔。首个基于纳米抗体的靶向BCMA的CAR T细胞已获得FDA批准，并与基于抗体的CAR T细胞相比显示出改善的疗效。针对CD19或CD20和HER2的纳米抗体衍生药物目前正在临床试验中，分别用于治疗淋巴瘤和乳腺癌患者。纳米抗体是否会提供比当前基于抗体的药物更好的疗效，还有待观察。 3.4.6 可激活抗体 肿瘤微环境通常表现出较低的pH值，含有活跃的蛋白酶酶，并具有在正常组织中缺乏的特定抗原组合。这些独特的属性被用来利用可激活抗体选择性地靶向癌细胞，这些抗体会根据其环境条件的变化而获得或失去功能。在抗体序列的特定位置添加组氨酸残基，使其能够根据pH值的变化与其目标抗原结合。这一原理被用来生成一种靶向HER2的抗体，与正常组织相比，在实体肿瘤的酸性微环境中与HER2的结合更强。类似的工程导致了在酸性溶酶体内从目标抗原（HER2和CTLA4）增加抗体解离，从而促进抗原再循环和在细胞膜上的呈现，并增强抗肿瘤效果。可激活抗体还使用蛋白酶可切割的掩蔽基团来阻断表位结合位点。在肿瘤微环境中掩蔽基团的切割使抗体-抗原结合和抗肿瘤活性成为可能。具有这种掩蔽机制的抗体通常被称为前体疗法，并且正在被用来改善PDL1、CTLA4、EGFR、CD166和CD71在多种实体瘤和血液瘤中的靶向。 最后，癌细胞经常显示一种独特的抗原组合，可以区分癌细胞和非癌细胞组织。正在设计一系列抗体或类似抗体的肽，以实现针对半相合骨髓移植后产生的CD45+ HLA-A2+癌症，以及EGFR+ HER2+乳腺癌的组合性抗原靶向。 3.5 新型偶联抗体 提高ADCs的效力。目前的研究正集中在改进ADC的组成部分（靶向抗体、连接子和药物载荷），以提高ADC的疗效。临床前研究表明，IgG抗体的大分子量（约150 kDa）可能会降低组织穿透力。因此，使用缺少Fc片段的抗体或用小肿瘤靶向肽替换抗体，可能提高ADC的活性。调节连接子设计和增加药物-抗体比率（DAR）可能增强治疗效益。例如，针对细胞表面糖蛋白TROP2（sacituzumab govitecan）的ADC，由于具有高DAR，是首个提高三阴性乳腺癌患者生存率的ADC。Daiichi Sankyo开发的创新四肽连接子，用于trastuzumab deruxtecan，掩盖了载荷DXd的疏水性，并允许均匀连接大量药物，同时保持有利的药代动力学，并最小化药物过早释放到血浆中。这种连接子-载荷组合现在正被几个即将获批的ADC（datopotamab deruxtecan和patritumab deruxtecan）或正在进行临床试验的ADC（ifinatamab deruxtecan）采用。针对叶酸受体α（FRα）的Rinatabart sesutecan，也使用一种新型可裂解连接子来掩盖更具疏水性的有效载荷，即拓扑异构酶-1抑制剂exatecan，从而允许生成更强效的ADC。正在进行晚期临床试验的ADC列在补充表2中。预计这种连接子-载荷组合可以改善对肺癌和结直肠癌患者的HER2靶向，这些患者对HER2靶向ADC trastuzumab deruxtecan的反应率较低。最后，新的药物载荷，如蛋白质降解剂、RNA聚合酶抑制剂、BCL-xL抑制剂、Toll样受体（TLR）激动剂和干扰素基因刺激因子（STING）激动剂，预计将通过使用新的杀伤机制来改进ADC。连接子和偶联技术的进步有助于推动ADC相对于其他偶联格式（如毒素或放射性同位素偶联物或双特异性TCE格式）在临床上的更多采用。目前正在进行临床试验，测试新型ADCs作为单一药物或与化疗或免疫疗法联合使用，其中一些已经取得了有希望的结果。 3.5.1 免疫毒素偶联物 免疫毒素的一个明显限制是产生针对毒素的免疫反应，这降低了半衰期和效力。目前的工作集中在通过去除被宿主免疫细胞识别的表位来减少假单胞菌外毒素的免疫原性。这样的改良免疫毒素可能会提高效力，并允许免疫毒素靶向多种恶性肿瘤。白介素-毒素偶联物的产生是该领域的另一个发展，它利用癌细胞中白介素受体的过度表达。白介素-毒素偶联物的行为类似于抗体-毒素偶联物。Tagraxofusp是一种针对白介素-3受体亚单位α（IL3RA；亦称为CD123）的细胞毒素，由IL-3与白喉毒素融合而成，已被证明对患有浆细胞样树突状细胞肿瘤（BPDCN）的患者有效。同样，denileukin diftitox（2014年撤回以进行制造改进），一种针对IL-2R的细胞毒素，由IL-2与白喉毒素融合而成，对患有皮肤T细胞淋巴瘤（CTCL）的患者有效。然而，这些IL-毒素偶联物不被视为基于抗体的药物，因为它们使用受体配体而不是scFv进行肿瘤靶向。 3.5.2 放射性同位素偶联物 在小分子偶联和肽偶联放射性同位素在实体瘤中的成功后，对放射性同位素偶联物重新产生了一些兴趣。将镥-177与一种结合前列腺特异性膜抗原（PSMA）的小分子或与生长抑素受体结合的肽类似物偶联，在前列腺癌和神经内分泌肿瘤患者中展示了显著的肿瘤回归，分别获得了FDA的批准。这种肿瘤靶向小分子-放射性同位素或肽-放射性同位素偶联物的行为类似于抗体-放射性同位素偶联物，但具有不同的结构和药代动力学特征。目前正在进行临床试验，测试针对肾细胞癌患者的碳酸酐酶IX（CAIX）的肽-放射性同位素偶联物，以及针对脑肿瘤患者的GD2、AML患者的CD33、前列腺癌患者的PSMA以及血液恶性肿瘤患者的CD45和CD37的抗体-放射性同位素偶联物。其他方法涉及将肿瘤靶向抗体与α粒子发射体如锕-225（225Ac）偶联。α粒子具有更高的DNA损伤能量加上较短的范围，可能会增加肿瘤特异性细胞毒性，同时限制对周围健康组织的辐射引起的不良反应。 3.6 选择最佳格式 目前批准的基于抗体的治疗针对由癌细胞和正常细胞亚群表达的肿瘤相关抗原。这些抗体需要一个治疗窗口，允许杀死癌细胞，同时限制对正常细胞的非肿瘤毒性。需要谨慎选择抗体格式来利用这个治疗窗口，使用不当的格式可能由于降低的治疗效力或不可接受的毒性而无效。尽管缺乏明确的定量研究和直接比较，但人们普遍认为未经修饰的抗体杀死细胞需要高抗原表达（每个细胞>10,000份拷贝），而ADCs（每个细胞>1,000份拷贝）和TCE双特异性抗体或CAR T细胞（每个细胞>10-100份拷贝）可以杀死表达较低抗原的细胞。因此，对于给定目标，从未修饰的抗体转换为ADC或TCE双特异性抗体格式可以提高效力，但也可能同时增加毒性。这种效应在HER2靶向上得到了体现。HER2由一部分乳腺癌和小胃癌以及一系列正常人类组织表达。使用裸抗体（曲妥珠单抗和帕妥珠单抗）以及后来的ADC（曲妥珠单抗emtansine）对HER2进行靶向治疗，患者耐受性良好，并在HER2高表达的患者中导致肿瘤回归。最近，trastuzumab deruxtecan，一种具有高DAR的HER2靶向ADC，甚至在对以前的HER靶向抗体无反应的低HER2表达癌症中诱导了肿瘤回归。然而，进一步降低HER2靶向阈值的抗HER2 CAR T细胞由于对肺部低HER2表达细胞的靶向、非肿瘤毒性，导致致命的呼吸衰竭。抗HER2 CAR T细胞的致命毒性提出了可能性，即可以类似地靶向低水平HER2表达细胞的HER2靶向TCE双特异性抗体，也可能带来不可接受的毒性。因此，通过双特异性抗体zanidatamab进行HER2靶向采用了双HER2结合策略，而不是TCE方法，并已证明在没有致命毒性的情况下有效。因此，“干净”的目标，即在至关重要的组织中表达最小非肿瘤（如CD19）和低密度目标（如肽-MHC分子）是TCE基础治疗的最佳选择。在非可有可无组织中有一定水平的非肿瘤表达（如HER2）的目标，最好通过未修饰的抗体、ADCs或非TCE双特异性抗体进行靶向。 需要注意的是，特定设计的非肿瘤毒性和效力也取决于目标和药物载荷。例如，DLL3由一部分小细胞肺癌患者表达。在这种情况下，由于与PBD载荷相关的高水平毒性和缺乏生存益处，rovalpituzumab tesirine，一种DLL3靶向ADC的临床开发被停止。然而，I期试验表明，通过TCE双特异性抗体tarlatamab进行DLL3靶向会导致肿瘤回归，并且患者耐受性良好。最终，选择的目标及其抗原密度可能对最佳治疗格式至关重要。 4. 结论 总结来说，由于抗体在与其目标结合时可以提供精确度，基于抗体的治疗在肿瘤领域具有巨大前景。尽管仍存在重大挑战，但新目标以及各种新设计和工程策略预计将为这些挑战提供许多解决方案。更有效的基于抗体的治疗获得监管批准的爆炸性增长可能会继续遵循过去25年的趋势。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。