RNF31

这项研究发现了IFN感应性的丧失在多个动物模型中使得肿瘤对ICB更加敏感。这可以通过两种机制介导，第一是经典MHC-I类分子的上调能够抑制NK细胞，第二是非经典MHC-I类分子Qa-1b的上调可以通过 免疫检查点阻断（ICB）疗法在多种肿瘤中都取得了巨大成功。然而，仍有许多患者对ICB没有响应，不同肿瘤中的免疫逃逸机制也需要进一步探索。 近日，由布罗德研究所（Broad Institute）的Robert T. Manguso和Kathleen B. Yates带领的研究团队，在著名期刊Nature Immunology发表重要研究成果[1]。 为了发现肿瘤逃避免疫治疗的机制，他们在接受ICB治疗的癌症模型中，开展了基因组层面的CRISPR筛选。 他们的发现让他们大吃一惊：在多种肿瘤模型中，肿瘤细胞对干扰素（IFN）感应性的丧失，竟然使得肿瘤对ICB的响应更加敏感。 具体来说，肿瘤的IFN信号通过两种方式发挥免疫抑制的作用：第一，肿瘤IFN感应能够上调经典的第一类主要组织相容性复合体（MHC-I）抑制自然杀伤（NK）细胞；第二，肿瘤IFN感应通过上调非经典的MHC-I类分子Qa-1b抑制CD8+T细胞。 要知道，大量的研究表明IFN-γ在肿瘤的免疫监视中发挥重要作用[2-4]。这一发现可以说颠覆了我们对IFN-γ信号的认知。 论文首页截图 接下来我们就一起来看看这个研究是如何开展的。 研究团队利用代表了5种癌症类型（黑色素瘤、胰腺癌、肺癌、肾癌和结肠癌）的8个小鼠肿瘤模型，进行CRISPR体内筛选，找出ICB治疗后富集或清除的sgRNA，以鉴定与ICB抵抗性或敏感性相关的基因（指该基因缺失时分别与ICB抵抗性或敏感性相关）。 他们发现Nlrc5、Pten、Casp8、Ccar1、Ubr5、Dot1lh、Smg9和Pdcd10的缺失与ICB抵抗性相关，并对Ccar1缺失这一新发现的ICB抵抗机制进行体内实验验证。 在ICB敏感性方面，除了已报道的Ptpn2、Traf2、Ripk1、Serpinb9、Cd47、Atg7外，研究团队还发现了Calr、Rnf31、Vps45、Ilf2、Pnpo、Kcmf1、Fitm2、Morc2a和Thop1的缺失与ICB敏感性相关，并进一步对Calr、Med16和Rnf31缺失介导的ICB敏感机制进行体内实验验证。 CRISPR筛选发现的与ICB抵抗性或敏感性相关的基因 研究团队进一步对清除的sgRNA进行了通路富集分析，令人意外的是，MHC-I类抗原呈递信号通路相关的基因在除Lewis肺癌细胞（LLC）外的所有模型中都被清除，细胞因子响应、II型IFN和先天免疫相关的基因也在多个模型中被清除。这提示这些基因的缺失可以使得肿瘤细胞对ICB更加敏感。 我们都知道，IFN-γ可以上调MHC-I类分子的表达，从而促进细胞毒性CD8+T细胞（CTL）识别肿瘤细胞[4]。还有很多研究表明，IFN感应性的丧失与ICB的抗性相关[2,3,5,6]。在类似的小鼠肿瘤模型中进行体外CRISPR筛选，发现肿瘤细胞IFN和抗原呈递通路的丧失会引起肿瘤细胞对CTL杀伤的抵抗[7]。而本研究发现抗原呈递和IFN通路相关基因的清除竟然与ICB的敏感性相关，这似乎与上述研究结果相矛盾。 为了搞清楚矛盾背后的原因，Manguso团队进一步对比了他们的体内CRISPR筛选结果和前人的体外CRISPR筛选结果，结果发现了一些与IFN（如Jak1、Ifngr1、Ifngr2）和抗原呈递（如Tap1、Tap2、B2m）相关的基因，在体外和体内CRISPR模型中分别发生了富集和清除。 这一发现提示，在体外研究中，这些基因的缺失可能促进了肿瘤细胞对T细胞杀伤的抵抗；而在体内研究中，这些基因的缺失让肿瘤细胞对T细胞更敏感。 体外模型与体内模型中CRISPR筛选得到的sgRNA对比 为了进一步探究IFN诱导肿瘤细胞对ICB抵抗的机制，Manguso团队对比了ICB治疗后的清除的sgRNA与IFN-γ刺激后改变的IFN刺激基因（ISG）。结果显示，抗原呈递相关基因（H2-T23、B2m、Tap1、Tap2、Tapbp和Erap1）在ISG中富集，这些基因同样在ICB治疗后清除的sgRNA中富集，这提示这些基因能够被IFN-γ刺激诱导上调，并与ICB治疗的抵抗性相关。 体外实验也说明，在IFN-γ或IFN-β刺激后，经典MHC-I类分子H-2K、H-2D，非经典MHC-I类分子Qa-1b以及PD-L1的表达会发生上调。这些结果提示IFN诱导的ICB抵抗机制可能是由MHC-I类分子的上调所介导的。 IFN-γ刺激能够诱导多种发挥ICB抵抗性的基因上调 为了验证这一假设，研究团队设计了一种体内竞争性实验，以检测IFN-γ感应基因和MHC-I类抗原呈递途径相关基因的遗传上位性。 他们将对照sgRNA和靶向Ifngr1或Jak1（IFN-γ感应基因）的sgRNA转染的KPC细胞（这些细胞分别是对照sgRNA背景、Tap1敲除背景和B2m敲除背景，Tap1和B2m为MHC-I类抗原呈递途径相关基因）1：1混合，然后将这些细胞分别在NSG鼠，WT鼠和接受ICB治疗的WT鼠体内成瘤，对比不同组中转染对应sgRNA的细胞的富集与清除。 结果显示，在对照sgRNA背景的细胞中，Ifngr1或Jak1敲除的细胞被清除；而在Tap1和B2m敲除背景的细胞中，Ifngr1或Jak1敲除的细胞没有发生显著清除。这提示相比于对照细胞，IFN感应性缺陷的细胞具有依赖于MHC-I类的竞争劣势，即IFN感应性通路发挥功能依赖于MHC-I类分子的表达。 IFN-γ感应基因发挥功能依赖于MHC-I类抗原呈递途径相关基因 在人类基因组中，6p21.3基因座编码MHC-I类分子表达相关的基因，如TAP1、TAP2、TAPBP、PSMB8和PSMB9等[8-10]。TCGA中多种癌种都有超过10%的肿瘤发生了6p21.3缺失，然而6p21.3缺失与绝大多数肿瘤患者的生存无关。 在接受抗PD-1治疗的肾透明细胞癌患者队列中，当肿瘤为6p21.3两倍性时，高ISG特征与患者更差的生存相关。然而在6p21.3缺失的肿瘤中，高ISG特征不再与患者更差的生存相关。这提示肾透明细胞癌中，IFN介导的ICB抵抗作用依赖MHC-I类分子。 肾透明细胞癌中高ISG特征仅在6p21.3两倍性肿瘤中与患者差的预后相关 研究团队为进一步鉴定体内杀伤IFN感应性缺陷肿瘤的免疫细胞，分别在ICB治疗时使用抗体清除CD8+T细胞、NK细胞和CD4+T细胞，结果显示NK细胞和CD4+T细胞的清除影响了对Jak1缺陷肿瘤细胞的杀伤，而清除CD8+T细胞对Jak1缺陷肿瘤细胞的杀伤没有影响。由于NK细胞不表达PD-1，而CD4+T细胞表达PD-1，研究团队推测ICB治疗后，CD4+T细胞辅助NK细胞发挥肿瘤细胞杀伤作用。 为进一步在体外验证NK细胞对IFN感应性缺陷肿瘤的杀伤能力，他们将Jak1缺陷和对照肿瘤细胞，分别与IL-12/18激活的NK细胞共培养，结果显示活化的NK细胞能够杀伤Jak1缺陷肿瘤细胞，而肿瘤细胞中Tap1或H2-K1的缺失可以逆转这一效应。这提示肿瘤IFN感应性可以通过上调经典的MHC-I类分子，在体内和体外抑制NK细胞的毒性。 Manguso团队进一步探究了哪些MHC-I类抗原呈递途径的基因发挥功能依赖于NK细胞，他们对比了NK细胞清除与不清除时，ICB治疗清除的sgRNA。结果显示，尽管Ifngr1、Ifngr2、Stat1、Jak1、Jak2和H2-K1的清除表现出NK细胞依赖性，靶向Tap1、Tap2、H2-D1和H2-T23这几个抗原呈递基因的sgRNA在NK细胞存在与不存在时都会发生清除。这说明部分MHC-I类抗原呈递分子的缺失，所引起的肿瘤细胞杀伤是非NK细胞依赖性的。 在上述基因中，H2-T23引起了Manguso团队的关注。因为H2-T23编码非经典MHC-I类分子Qa-1b（相当于人类中的人类白细胞抗原HLA-E），而Qa-1b能够结合抑制性受体NKG2A/CD94。这些结果提示尽管NK细胞介导了对IFN感应性丧失的细胞的杀伤，但是某些MHC-I类分子（如Qa-1b）的表达可能会抑制其他的效应性细胞群。 某些MHC-I类分子（如Qa-1b）的表达可能会抑制除NK细胞外的效应性细胞 为了探究Qa-1b表达抑制了哪些效应性细胞群，研究团队首先检测了Qa-1b的缺失是否会增强ICB响应。结果显示，Qa-1b的缺失会增强ICB响应，而Qa-1b的过表达能抑制ICB响应。 当在接受ICB治疗的小鼠胰腺导管腺癌（KPC）肿瘤模型中敲除HT-T23后，分别清除NK细胞和CD8+T细胞，结果显示NK细胞清除对于Qa-1b缺陷型肿瘤的ICB响应没有影响，而CD8+T细胞清除抑制了Qa-1b缺陷型肿瘤的ICB响应。这提示Qa-1b主要通过抑制CD8+T细胞发挥作用。 单细胞测序数据也提示，ICB治疗后引起效应、耗竭和增殖的CD8+T细胞亚群扩增。而效应、耗竭和增殖CD8+T细胞亚群高表达NKG2A（Klrc1）和CD94（Klrd1），这提示肿瘤细胞的Qa-1b表达可能通过与CD8+T细胞的NKG2A/CD94抑制性受体结合发挥作用。 ICB治疗时CD8+T细胞发挥杀伤Qa-1b缺陷肿瘤作用 由于IFN能够诱导Qa-1b的表达，Manguso团队假设肿瘤的IFN感应性可以通过Qa-1b抑制CD8+T细胞。然而由于肿瘤IFN感应性丧失可能引起经典的MHC-I类分子下调，导致对CD8+T细胞的抗性，从而掩盖IFN可能介导的抑制作用。为解决这个问题，利用嵌合抗原受体（CAR）T细胞进行杀伤试验，由于CAR-T细胞的识别不依赖于MHC-I类分子，可以避免IFN-γ处理后MHC-I类分子上调带来的影响。 他们首先检测了CD19 CAR-T细胞对Qa-1b缺陷型CD19+KPC细胞的杀伤能力，结果显示CD19 CAR-T显著杀伤Qa-1b缺陷型肿瘤细胞，提示Qa-1b能够抑制CAR-T的杀伤能力。 为探讨Qa-1b上调是否是由IFN介导的CAR-T细胞杀伤抵抗机制，Manguso团队将CD19 CAR-T细胞分别与IFNγ刺激的对照和Jak1（IFN-γ感应基因）敲除CD19+KPC细胞的混合物1:1共培养。结果显示，CAR-T细胞对于这2类细胞的杀伤能力没有显著差异，这表示CAR-T细胞消除了Jak1敲除肿瘤细胞的生存优势。 为了探究IFN诱导的PD-L1上调是否抑制CAR-T的杀伤能力，他们检测了CAR-T联合抗PD-1单抗时两组细胞的存活情况。结果显示当CAR-T联合抗PD-1单抗时，Jak1敲除肿瘤细胞存活增多，这提示PD-L1上调对T细胞杀伤能力发挥抑制作用，联用抗PD-1单抗能够杀伤更多对照组肿瘤。 当Manguso团队使用Qa-1b缺陷型KPC细胞或联用抗NKG2A抗体时，结果显示Jak1敲除肿瘤细胞存活显著增多。这些结果提示CD8+T细胞优先杀死具有完整IFN感应能力的肿瘤细胞，而Qa-1b的上调抑制这种杀伤能力。至于背后的机制，Manguso团队认为这可能是因为IFN能够诱导粘附分子（如ICAM-1）的表达[11]，进而促进CD8+T细胞的杀伤。 在体内实验模型中，Manguso团队发现CAR-T对Jak1缺陷型肿瘤杀伤作用明显，而这种杀伤能力在Qa-1b缺陷的肿瘤中消失。这些结果提示IFN信号可以通过上调Qa-1b来抑制CAR-T细胞毒性。 IFN信号通过上调 Qa-1b来抑制 CAR-T 细胞毒性 最后，Manguso团队探讨了IFN信号对于免疫治疗响应预测的能力。 他们分析了一组接受抗PD-1单抗治疗的黑色素瘤患者队列（6p21.3两倍性），发现ISG的表达与更好的响应相关，这一结果与前述的ccRCC患者队列中的结果相反。 这提示利用IFN特征预测ICB响应需要考虑CD8+T细胞和NK细胞的响应优势，在NK细胞响应占优时，IFN特征与接受抗PD-1治疗差的响应相关；而在CD8+T细胞响应占优时，IFN特征与接受抗PD-1治疗好的响应相关。 高IFN特征在不同肿瘤微环境中与不同的ICB响应相关 Manguso团队还评估了1个接受ICB治疗的202名黑色素瘤患者的队列，分别在基线、治疗后6周和治疗后6个月时间点取样，检测血清中ISG蛋白的水平。 结果显示，在治疗后6周时，响应和无响应患者血清ISG蛋白含量都会增加。而治疗后6个月时，无响应患者血清ISG蛋白含量显著增加。并且，在这2个时间点，血清ISG的变化都与患者更差的无进展生存相关。因此，接受ICB治疗过程中，对于ICB的抵抗可能与IFN和ISG的水平升高有关。 ICB治疗后血清ISG蛋白水平升高与治疗抵抗有关 总的来说，这项研究发现了IFN感应性的丧失在多个动物模型中使得肿瘤对ICB更加敏感。这可以通过两种机制介导，第一是经典MHC-I类分子的上调能够抑制NK细胞，第二是非经典MHC-I类分子Qa-1b的上调可以通过NKG2A/CD94抑制CD8+T细胞。 既往研究往往关注IFN感应性的丧失会引起对ICB的抵抗，这项研究提示了IFN感应性功能的复杂性，IFN介导的MHC-I类分子上调可以发挥促进对CD8+T细胞抗原呈递和抑制NK细胞的双重作用。在高表达NK配体（MICA和MICB）的肿瘤中，由于IFN驱动的MHC-I类分子上调可以抑制NK细胞，高ISG特征与差的响应相关。而在T细胞高度克隆扩增的肿瘤中，由于IFN能够促进对T细胞的抗原呈递，高ISG特征与好的响应相关。因此，ISG特征在肿瘤中的作用可能取决于肿瘤中的免疫效应主要由NK细胞还是CD8+T细胞介导。 除此之外，这项研究中发现非经典MHC-I类分子Qa-1b（HLA-E）可以发挥免疫抑制作用，非经典MHC-I类分子如HLA-F、HLA-G可能发挥的免疫抑制作用也值得进一步探索。

2022年8月2日维泰瑞隆完成了2亿美金B轮融资，基于RIPK1的多款产品是其目前进展最快的管线。维泰瑞隆官网在此之前，5月2日，德纳利(DNLI）与 赛诺菲(Sanofi）合作开发的用于治疗肌萎缩侧索硬化症（ALS）的SAR443820（DNL788）开始了Ⅱ期临床研究。SAR443820 是RIPK1的中枢神经系统 (CNS) 渗透性小分子抑制剂。RIPK1是炎症和死亡信号传递的重要介质，是神经退行性疾病、自身免疫性疾病和炎症等多种疾病治疗的有效靶点之一。RIPK1简介RIPK1是人类疾病中对刺激做出反应的调节因子，它能够在细胞生存与死亡之间做出决定，参与调控细胞炎症、凋亡、坏死过程。通路：在TNFα的刺激下，RIPK1与TRADD、TNFR1死亡结构域结合，迅速被招募到复合体1（Complex 1）中，通过泛素化、磷酸化等一系列PTM，激活下游NF-κB的生存或者死亡信号。RIPK1蛋白结构分为三个部分：C端死亡域：介导与其他含有死亡结构域的蛋白质，如FADD，TNFR1和Fas的同源二聚和异源二聚。N端激酶域：末端激酶结构域介导反式蛋白的自磷酸化以促进其自身的激活。中间域：包含RIP同型相互作用基序（RHIM）。功能：RIPK1具有双向作用：一方面，RIPK1作为结构支架，能够促进NF-κB通路激活，促进细胞生存、抑制凋亡；而另一方面作为激酶，可以促进细胞死亡和炎症。相关疾病RIPK1及其调控基因突变会导致多种疾病，包括自身免疫疾病、自体炎症、神经退行性疾病等。以下基因直接参与调控RIPK1活性，在自身免疫和自体炎症中发生突变。TNFAIP3：编码A20，通过调节RIPK1、TRFF6、NEMO等关键信号的泛素化，限制TLR和TNF诱导的炎症反应。IKBKG：编码的NEMO是IKKα、IKKβ组成的支架亚单位，在NF-κB通路的激活中起关键作用。TNIP1：编码的ABIN1与线性泛素链结合，与A20相互作用，通过NF-κB通路调节先天免疫反应。TNIP1突变会造成炎症反应，通过抑制RIPK1能够减轻炎症反应而不影响宿主正常免疫功能。OTULIN：是一种M1泛素链的去泛素化酶，OTULIN突变患者会有强烈的炎症特性，最终会激活细胞程序性坏死。LUBAC复合体：由HOIP、HOIL1、Sharpin组成，LOF和HOIP、HOIL1亚型突变会出现免疫缺陷和自身免疫炎症性疾病。基因突变造成的疾病：IBD：炎症性肠病A20表达升高和减少都与IBD相关，同时ATG16L1也是IBD危险因素。银屑病：银屑病中TNFAIP3和A20蛋白水平的降低可能与疾病严重程度降低相关，同时也可作为预测TNF治疗疗效临床标志物。RA：类风湿关节炎患者TNFAIP3表达降低。MS：多发性硬化症TNFAIP3高表达。SLE：系统性红斑狼疮存在TNFAIP3和TNIP1的多个独立的核苷酸多态性。介于RIPK1在细胞凋亡中的作用，神经退行性疾病也与RIPK1高度相关：ALS：脊髓侧索硬化症FTD：额颞叶痴呆存在OPTN、TBK1两个基因LOF (loss-of-function) 突变。OPTN缺失或功能减弱，导致RIPK1降解减少；TBK1单倍剂量不足，导致RIPK1过度激活。AD：阿尔兹海默病观察到RIPK1/RIPK3-MLKL激活增加，可能引起AD中的神经炎。RIPK1可能控制多种神经退行性疾病和衰老相关的神经炎性通路。PD：帕金森LRRK2表达上调，通过RIPK1依赖机制导致细胞凋亡。多种疾病都与RIPK1激酶属性的异常激活相关，因此RIPK1抑制剂就成为人类疾病治疗中的开发靶点。药物研发进展RIPK1抑制剂已进入人体临床试验，用于神经退行性疾病、自身免疫病、溃疡性结肠炎、类风湿等疾病治疗。相比TNFα抑制剂，RIPK1在CNS中的安全性高、参与更广泛的促炎症活性、各药物研发时间表GSK'772是第一个进入Ⅰa期临床研究的RIPK1激酶抑制剂，在溃疡性结肠炎、类风湿关节炎、银屑病的Ⅱ期临床完成后，目前正在进行更高剂量的银屑病临床试验。DNL104是第一款能够透过血脑屏障的RIPK1抑制剂，试验中展示出在CNS中抑制RIPK1具有很高的安全性。随后DNLI公司进行了DNL747、DNL758、DNL788开发。小结RIPK1抑制剂在患者身上的临床试验仍处于早期阶段，开发选择性、高效和安全的RIPK1小分子抑制剂，并可靠地衡量RIPK1激酶抑制的临床疗效和患者分层仍然是未来临床发展面临的关键挑战。参考资料https://www.globenewswire.com/news-release/2022/05/02/2433539/0/en/Denali-Therapeutics-Announces-Achievement-of-RIPK1-Milestone-for-Phase-2-Clinical-Trial-Initiation-in-ALS-by-Sanofi.htmlYuan J et al. Necroptosis and RIPK1-mediated neuroinflammation in CNS diseases. Nat Rev Neurosci. 2019 Jan;20(1):19-33. Zhang X et al. RIPK1 can mediate apoptosis in addition to necroptosis during embryonic development. Cell Death Dis. 2019 Mar 13;10(3):245. https://denalitherapeutics.com/investors/press-release?id=626