WNT5A

2025年1月8日，北京协和医院妇产科冷金花教授团队在期刊《Cell Genomics》上发表了题为“Single-cell and spatial transcriptomic profiling revealed niche interactions sustaining growth of endometriotic lesions”的研究论文。团队发现异位的子宫内膜基质（EnS）细胞保留了异位细胞的周期性基因表达模式，同时表现出独特的基因表达，这有助于子宫内膜异位症的发病机制。团队还发现了两种不同的卵巢基质细胞（OSCs），它们分别位于病变的不同区域，显示出与纤维化和炎症相关的不同基因表达谱。团队还在子宫内膜基质细胞中发现了WNT5A的上调和非经典WNT信号的异常激活，这可能有助于病变的形成，为治疗干预提供了新的靶点。 2025年1月8日，北京协和医院妇产科冷金花教授团队在期刊《Cell Genomics》上发表了题为“Single-cell and spatial transcriptomic profiling revealed niche interactions sustaining growth of endometriotic lesions”的研究论文。 团队发现异位的子宫内膜基质（EnS）细胞保留了异位细胞的周期性基因表达模式，同时表现出独特的基因表达， 这有助于子宫内膜异位症的发病机制。团队还发现了两种不同的卵巢基质细胞（OSCs），它们分别位于病变的不同区域，显示出与纤维化和炎症相关的不同基因表达谱。 团队还在子宫内膜基质细胞中发现了WNT5A的上调和非经典WNT信号的异常激活， 这可能有助于病变的形成，为治疗干预提供了新的靶点。 https://www-cell-com.libproxy1.nus.edu.sg/cell-genomics/fulltext/S2666-979X(24)00366-5 https://www-cell-com.libproxy1.nus.edu.sg/cell-genomics/fulltext/S2666-979X(24)00366-5 单细胞RNA测序与子宫内膜异位症 单细胞RNA测序与子宫内膜异位症 01 01 最近，单细胞转录组测序被用于分析子宫内膜异位症部位内和部位间的细胞异质性，以及整个月经周期中子宫内膜的动态重塑。然而，异位子宫内膜细胞在月经周期中对激素的反应，仍是一个重要的知识空白。目前还不清楚这些异位细胞与周围生态位细胞之间发生了哪些相互作用，从而使异位病灶得以持续生长。 最近，单细胞转录组测序被用于分析子宫内膜异位症部位内和部位间的细胞异质性，以及整个月经周期中子宫内膜的动态重塑。然而，异位子宫内膜细胞在月经周期中对激素的反应，仍是一个重要的知识空白。目前还不清楚这些异位细胞与周围生态位细胞之间发生了哪些相互作用，从而使异位病灶得以持续生长。 在这项研究中，团队对13个异位子宫内膜和8个卵巢子宫内膜瘤进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq），分析结果表明，异位壁龛中的基质细胞在病变形成时是特化的，形成了不同的促纤维化区和促炎症区，这在空间转录组分析中可以观察到。异位子宫内膜细胞和卵巢基质细胞之间，存在非经典WNT信号介导的强烈相互作用。这种信号通路可能是驱动子宫内膜细胞异位生长的关键，并为更有效的子宫内膜异位症治疗提供了潜在靶点。 在这项研究中，团队对13个异位子宫内膜和8个卵巢子宫内膜瘤进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq），分析结果表明，异位壁龛中的基质细胞在病变形成时是特化的，形成了不同的促纤维化区和促炎症区，这在空间转录组分析中可以观察到。异位子宫内膜细胞和卵巢基质细胞之间，存在非经典WNT信号介导的强烈相互作用。 这种信号通路可能是驱动子宫内膜细胞异位生长的关键， 并为更有效的子宫内膜异位症治疗提供了潜在靶点。 图形摘要 图形摘要 子宫内膜瘤中异位的EnS细胞，通过WNT5A-FZD1信号与OSCb相互作用 子宫内膜瘤中异位的EnS细胞，通过WNT5A-FZD1信号与OSCb相互作用 02 02 在异位EnS细胞中，40.7%的细胞在增殖期、25.4%的细胞在分泌期检测到WNT5A的表达，但表达水平较低。然而，在子宫内膜异位症患者的异位EnS细胞中，WNT5A在增殖期和分泌期均明显过表达。在月经流出物中脱落的子宫内膜细胞的scRNA-seq数据集中，团队发现子宫内膜异位症患者或报告有子宫内膜异位症症状的患者的月经基质细胞中WNT5A表达明显升高。这些发现有力地表明，WNT5A阳性细胞在异位病灶中聚集，并通过WNT5A-FZD1信号诱导改变，从而促进子宫内膜异位症患者的异位种植。 在异位EnS细胞中，40.7%的细胞在增殖期、25.4%的细胞在分泌期检测到WNT5A的表达，但表达水平较低。然而，在子宫内膜异位症患者的异位EnS细胞中，WNT5A在增殖期和分泌期均明显过表达。在月经流出物中脱落的子宫内膜细胞的scRNA-seq数据集中，团队发现子宫内膜异位症患者或报告有子宫内膜异位症症状的患者的月经基质细胞中WNT5A表达明显升高。这些发现有力地表明， WNT5A阳性细胞在异位病灶中聚集，并通过WNT5A-FZD1信号诱导改变， 从而促进子宫内膜异位症患者的异位种植。 子宫内膜瘤中异位的EnS细胞。通过WNT5A-FZD1信号与OSCb相互作用 子宫内膜瘤中异位的EnS细胞。通过WNT5A-FZD1信号与OSCb相互作用 总结 总结 03 03 1. 异位EnS细胞在不同月经期发生周期性基因表达变化，其基因表达减弱导致对激素反应异常，蜕膜化基因标志物如DKK1和IL15升高但未达到正常水平，显示孕酮抗性；同时，促炎细胞因子如CXCL8和CXCL2上调，可能造成局部慢性炎症环境，破坏正常孕酮信号传导，维持异位EnS细胞的激素抗性。 1. 异位EnS细胞在不同月经期发生周期性基因表达变化，其基因表达减弱导致对激素反应异常，蜕膜化基因标志物如DKK1和IL15升高但未达到正常水平，显示孕酮抗性；同时，促炎细胞因子如CXCL8和CXCL2上调，可能造成局部慢性炎症环境，破坏正常孕酮信号传导，维持异位EnS细胞的激素抗性。 2. 空间转录组学揭示了异位病变的独特空间组织，存在两种不同的异位胚层细胞亚群，OSCb细胞围绕异位EnS细胞，表达与伤口愈合、成纤维细胞迁移和结缔组织发育相关的基因，可能导致纤维化；炎症细胞尤其是T细胞在EnS区域大量聚集，巨噬细胞偏向M2表型，促进组织修复、血管生成和免疫耐受，使异位组织逃避免疫清除，支持病变生长和存活。 2. 空间转录组学揭示了异位病变的独特空间组织，存在两种不同的异位胚层细胞亚群，OSCb细胞围绕异位EnS细胞，表达与伤口愈合、成纤维细胞迁移和结缔组织发育相关的基因，可能导致纤维化；炎症细胞尤其是T细胞在EnS区域大量聚集，巨噬细胞偏向M2表型，促进组织修复、血管生成和免疫耐受，使异位组织逃避免疫清除，支持病变生长和存活。 3. 研究发现异位EnS细胞和OSCs之间存在重要信号传导，异位子宫内膜中的WNT5A配体上调，非经典WNT通路被异常激活，可能参与调节血管生成、肿瘤转移和炎症，促进异位病灶的形成，表达WNT5A的细胞在月经期间回流时更有可能成功附着并异位生长。 3. 研究发现异位EnS细胞和OSCs之间存在重要信号传导，异位子宫内膜中的WNT5A配体上调，非经典WNT通路被异常激活，可能参与调节血管生成、肿瘤转移和炎症，促进异位病灶的形成，表达WNT5A的细胞在月经期间回流时更有可能成功附着并异位生长。 4. WNT5A在子宫内膜异位症患者体内上调及其在移植的人类子宫内膜交界处的富集，强调了其作为治疗靶点的潜力，但需考虑潜在的脱靶效应；目前手术干预仍是治疗子宫内膜异位症的重要方法，但术后复发风险高，根据分子研究开发有针对性的非激素治疗方法，如调节WNT5A信号转导的靶向疗法，有望对手术方法起到补充作用，改善患者的长期治疗效果。 4. WNT5A在子宫内膜异位症患者体内上调及其在移植的人类子宫内膜交界处的富集，强调了其作为治疗靶点的潜力，但需考虑潜在的脱靶效应；目前手术干预仍是治疗子宫内膜异位症的重要方法，但术后复发风险高，根据分子研究开发有针对性的非激素治疗方法，如调节WNT5A信号转导的靶向疗法，有望对手术方法起到补充作用，改善患者的长期治疗效果。 参考资料： 参考资料： 1.Wang, Y. ∙ Nicholes, K. ∙ Shih, I.M. 1.Wang, Y. ∙ Nicholes, K. ∙ Shih, I.M. The Origin and Pathogenesis of Endometriosis The Origin and Pathogenesis of Endometriosis Annu. Rev. Pathol. 2020; 15:71-95 Annu. Rev. Pathol. 2020; 15:71-95 2.Saunders, P.T.K. ∙ Horne, A.W. 2.Saunders, P.T.K. ∙ Horne, A.W. Endometriosis: Etiology, pathobiology, and therapeutic prospects Endometriosis: Etiology, pathobiology, and therapeutic prospects Cell. 2021; 184:2807-2824 Cell. 2021; 184:2807-2824

关注小药说药，一起成长！ 前言  抗体偶联药物（ADCs）是一种通过一个合理构建的连接子将细胞毒性小分子药物偶联到单克隆抗体上的复合物，可以向肿瘤内选择性地输送有效的细胞毒性药物。经过几十年的深入研究和开发，该领域取得了重大进展，自2000年美国食品和药物管理局（FDA）批准第一个ADC药物Mylotarg治疗CD33+急性髓系白血病（AML）以来，全球共有16个ADC获得批准。 值得注意的是，在2020年第四季度，有三项重磅交易涉及针对同一抗原ROR1的ADC。首先，CStone Pharmaceuticals和LegoChem Biosciences签订了ROR1 ADC“LCB71（CS5001）”的全球许可协议。然后默克收购了VelosBio及其ROR1 ADC“VLS-101”，勃林格殷格翰分别以27.5亿美元和14.5亿美元（合并预付款和里程碑付款）收购了NBE Therapeutics及其ROR1 iADC“NBE-002”，这些收购突显了ROR1在肿瘤学中的重要性及其作为ADC靶点的良好前景。 ROR1的结构和表达  ROR1是一种跨膜受体，包含细胞外部分、跨膜区和细胞内区域。细胞外部分包括免疫球蛋白样结构域（IG）、富含半胱氨酸结构域（CRD）和Kringle结构域（KD）。CRD通过与配体Wnt5a结合来调节非经典WNT信号，KD介导ROR1与其他受体的相互作用，如ROR2。 细胞内部分包括一个酪氨酸激酶结构域、两个富含丝氨酸/苏氨酸的结构域和一个富含脯氨酸的结构域。富含脯氨酸的结构域通过招募包含SH3结构域的蛋白质，包括HS1、DOCK2和cortactin，负责激活细胞迁移和增殖信号。富含丝氨酸/苏氨酸的结构域与衔接蛋白（如14-3-3 zeta）发生物理相互作用，导致对凋亡的抵抗。 ROR1主要在胚胎发生过程中表达，ROR1基因敲除对胚胎是致命的，表明ROR1在胚胎发生中起着关键作用。ROR1在大多数成人组织中不表达，除了一些高表达ROR1的脂肪组织、内分泌腺、胃肠道和未成熟B淋巴细胞，ROR1在这些成人组织中的功能目前尚不清楚。  ROR1在恶性肿瘤中的作用  许多研究表明，ROR1在恶性肿瘤细胞中高表达，其最初被鉴定为血液系统恶性肿瘤中的肿瘤胚胎基因。除了血液系统恶性肿瘤外，ROR1的异常表达也作为生物标记物和治疗靶点在多种实体瘤中被发现。 ROR1在乳腺癌中高表达，其与上皮间质转化（EMT）、肿瘤转移和侵袭性疾病有关。ROR1在肺癌细胞中的表达水平也很高，可作为肺腺癌患者的预后生物标志物。ROR1的沉默导致代表人肺腺癌的细胞系中的生长抑制。此外，还有关于ROR1在其他类型癌症中表达的报道，包括卵巢癌、结直肠癌、子宫内膜癌、胃癌、黑色素瘤和胰腺癌。 ROR1不仅在恶性细胞中异常表达，还参与对细胞增殖、存活和迁移重要的信号蛋白的激活。在CLL中，Wnt5a/ROR1通过ARHGEF家族衔接蛋白激活Rho GTPase RhoA和Rac1，Wnt5a还诱导HS1的酪氨酸磷酸化，导致ROR1依赖的细胞迁移。此外，Wnt5a/ROR1诱导NF-κB信号通路的激活，导致促炎症细胞因子如IL-6的自分泌调节。ROR1的表达水平与CLL的进展密切相关，使其成为预后的良好生物标志物。在肺癌中，ROR1参与c-Src和MET的激活，导致肿瘤细胞凋亡的抑制，ROR1还被发现是cavin-1和caveolin-1的支架蛋白，可激活肺腺癌中的AKT。在乳腺癌中，ROR1促进了PI3K/AKT通路的激活，高ROR1表达与疾病更严重的进展相关。总之，在许多类型的恶性肿瘤中观察到ROR1的异常表达和相关的促生长信号事件，使ROR1成为抗癌药物开发的一个有吸引力的治疗靶点。 ROR1靶向ADC的研究进展 鉴于ROR1在多种癌症中高表达，而在普通组织不表达或低表达的特性，药物研发人员开发了多种靶向ROR1的抗肿瘤治疗策略，其中ADC药物的进展较快，并且表现出良好的应用前景。 NBE-002 目前，大多数经批准的ADC都是通过赖氨酸或半胱氨酸残基将有效载荷与单克隆抗体化学偶联而产生的药物异质混合物。相比之下，针对下一代ADC，NBE-002的ROR1是通过人源化抗体（huXBR1-402）与蒽环类药物PNU-159682在预先设定的药物抗体比（DAR）下通过sortase a介导的位点特异性转肽反应进行酶结合而产生的，产生更纯净、更同质的药物，具有更稳定的生物物理和药代动力学特征。 SMAC技术利用Sortase A，一种源自金黄色葡萄球菌的转肽酶，可以催化含有寡甘氨酸的分子连接到具有序列基序的蛋白质（LPXTG）。PNU-159682是奈莫霉素的肝脏代谢物，可抑制DNA拓扑异构酶II，其效力比亲本分子高三个数量级。有趣的是，与其他有效载荷相比，基于蒽环类的连接子有效载荷通过SMAC技术的共轭效率更高，DAR在3.7到3.9之间，通过简单的链霉素亲和层析步骤可以有效地将DAR增加到4。 除了观察到NBE-002的直接抗肿瘤活性外，NBE-002能够增加T细胞对肿瘤的浸润，并将“冷”肿瘤转化为“热”肿瘤，使它们对针对PD-1和CTLA-4的检查点抑制剂产生反应。因此，NBE Therapeutics的ADC被称为免疫刺激ADC或IADC。为了测试NBE-002的效力，已经在不同的临床前癌症模型中评估了这种iADC，发现NBE-002在每个适应症中都显示出显著的抗肿瘤活性。NBE-002目前正在进行1/2期临床试验（NCT04441099），以评估晚期实体瘤，尤其是三阴性乳腺癌患者的安全性和耐受性。 VSL-101 与Adcetris、Polivy和Padcev类似， VLS-101利用蛋白水解可切割的连接子mc vc PAB，将靶向ROR1的单克隆抗体UC-961与微管蛋白聚合抑制剂单甲基auristatin E（MMAE）进行偶联。UC-961是一种人源化抗体，以高亲和力（Kd=2nM）结合到ROR1的域内表位，并通过阻断Wnt5a与ROR1的结合，对各种ROR1阳性肿瘤细胞具有直接细胞毒活性。 由于UC-961识别独特的表位，这种抗体在结合时会触发ROR1的明显内化，有利于向ROR1阳性肿瘤细胞传递细胞毒性有效载荷。VLS-101在体外模型中被证明能有效诱导细胞周期阻滞和凋亡，并在异种移植物模型中有效阻断体内肿瘤生长。在血液系统恶性肿瘤的一期研究（NCT03833180）中，VLS-101耐受良好，对晚期套细胞淋巴瘤（MCL）或弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）患者有效，MCL组的ORR达47%（7/15），包括3例CR和4例PR；DLBCL组的ORR达80%（4/5），包括2例CR和2例PR。目前，一项针对实体瘤（包括乳腺癌和肺癌）患者的2期研究（NCT04504916）正在进行中。 LCB71（CS5001） LCB71是另一种抗ROR1 ADC，由LegoChem Biosciences和ABL Bio两家韩国生物制药公司共同开发，基石药业获得了在韩国境外开发和商业化LCB71的专有权。LCB71使用了另一种酶介导的位点特异性偶联技术，这种偶联方法利用法尼基转移酶，该酶天然催化CaaX基序中存在的半胱氨酸残基的异戊二烯基化。 该技术利用法尼基转移酶的底物混杂性，引入香叶基酮焦磷酸（GKPP）基团，用于随后的烷氧基胺衍生物的化学选择性偶联。通过偶联β-葡萄糖醛酸键的吡咯苯二氮卓二聚体（dPBD），利用β-葡萄糖醛酸酶在肿瘤细胞和肿瘤微环境中的高表达，允许选择性切割和释放细胞中的游离PBD，最终导致DNA损伤和细胞死亡。 LCB71在Jeko-1（人套细胞淋巴瘤）和MDA-MB-231（人乳腺癌细胞）异种移植瘤模型中均表现出显著的抗肿瘤活性，且呈剂量依赖性。LCB71是一款有望在ROR1高表达的血液肿瘤和恶性实体瘤中都具有精准治疗潜力的候选ADC药物。 小结 ROR1在各种实体和血液肿瘤细胞中广泛表达，使其作为AD 药物开发的极具吸引力的重要靶点。由于独特的位点特异性偶联策略，NBE-002和LCB71都是具有给定DAR的同质ADC，这有利于生产制造。此外，两种ADC中的稳定连接子也提供了更好的药代动力学特征。尽管VLS-101的产品不是同质性的，可能存在类似于Adcetris、Polivy和Padcev的稳定性问题，但一项1期研究已经证明了MCL和DLBCL患者的安全性和临床疗效，是目前处于2期临床试验中的最领先的抗ROR1 ADC。无论如何，所有3个抗ROR1 ADC看起来都非常有前景，而最近的3个主要商业交易可能会促进针对ROR1的多种治疗方式的快速发展。 参考文献：1.Tyrosine Kinase ROR1 as a Target forAnti-Cancer Therapies. Front Oncol. 2021; 11: 680834. 2. Perspectives on the development of antibody-drug conjugates targeting ROR1 for hematological and solid cancers. AntibTher. 2021 Oct; 4(4): 222–227. 公众号内回复“ADC”或扫描下方图片中的二维码免费下载《抗体偶联药物：从基础到临床》的PDF格式电子书！ 公众号已建立“小药说药专业交流群”微信行业交流群以及读者交流群，扫描下方小编二维码加入，入行业群请主动告知姓名、工作单位和职务。

文章解读+创新点拓展，为您带来科研新体验～ 导读 在生物学研究中，理解细胞间的通信机制对于揭示复杂生物过程至关重要。近日，《Nature Methods》上发表的一项突破性研究《Inferring pattern-driving intercellular flows from single-cell and spatial transcriptomics》引入了一种名为FlowSig的新方法，该方法通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）和空间转录组学（ST）数据推断由通信驱动的细胞间信息流。这项技术不仅为科学家们提供了深入洞察细胞内部运作的新视角，也为临床医生带来了探索疾病发生发展机制的新工具。 研究背景 细胞通过生化信号相互交流以组织生物活动，这些时空流动的“因果”关系推动着每一个生物学进程。然而，传统的分析方法往往将细胞间通信视为独立事件，忽略了其与细胞内基因调控模块之间的关联。为了填补这一空白，研究人员开发了FlowSig，这是一种基于图形因果模型和条件独立性的新方法，它能够从scRNA-seq或ST数据中推断出由通信驱动的细胞间信息流。 研究设计与结果 FlowSig的核心在于建模细胞间信息流动，即从流入的细胞间信号到捕捉细胞内调节响应的基因表达模块（gene expression module，GEM），再到流出的细胞间信号。具体而言，FlowSig利用额外的扰动数据和下游转录因子靶点路径知识来学习准确的细胞间流动。当处理难以精确推断配体-受体相互作用的数据时，FlowSig结合“对照vs.扰动”实验提供的信息，使用差异表达分析和条件不变性测试推断最可能驱动细胞间流动的输入输出变量集合。此外，FlowSig还支持从空间转录组学数据直接推断每个空间位置接收到的流入信号量，从而无需额外的扰动数据即可推断细胞间流动。 在验证过程中，研究人员首先使用合成数据集进行测试，确保FlowSig能正确反映数学模型模拟出的细胞间流动特征。随后，他们应用FlowSig分析了新生成的皮质类器官实验数据，展示了该方法捕捉刺激诱导变化、展现因COVID-19严重程度增加而引起的细胞间流动转变以及重建小鼠胚胎发育中形态发生素驱动激活剂-抑制剂模式的能力。 图1：对FlowSig模型的描述 研究者开发了FlowSig模型，用于描绘细胞间信息流动的方向性。该模型包含从流入信号（受体基因表达量与下游转录因子基因集平均表达量的乘积Ri×TFi）到基因表达模块（即细胞成员归属至潜在GEM因子GEMi），再到流出信号（信号配体基因表达Li）的有向边（图1a）。在“对照vs.扰动”实验中，系统可能因外部刺激、疾病或时间变化而改变。FlowSig通过差异表达分析和条件不变性测试，识别出分布显著变化的流入和流出变量，以确定最有可能驱动细胞间流动的因素，从而减少数据生成的所有可能网络的数量，并构建更精确的完全部分有向无环图（completed partial directed acyclic graph，CPDAG）（图1b）。 对于难以准确推断配体-受体相互作用的情况，FlowSig能从空间转录组学数据中更精准地估算每个位置接收到的流入信号量，使得即使没有额外的扰动数据，也能推断细胞间的流动（图1c）。具体来说，FlowSig使用COMMOT推断接收的信号配体量（rec. Li），并结合空间解析的GEM（GEMi），最终关联到流出变量（Li）。 图2：FlowSig的合成验证 为了验证FlowSig的有效性，研究人员生成了基于数学模型的模拟实验数据集，用以模拟真实的细胞间流动情况。结果表明，FlowSig能够准确恢复预期的细胞间流动网络结构，证明其算法设计合理且可靠。 研究进一步探讨了SHH信号诱导的单向细胞间流动（图2a）及其对组织模式化的影响（图2b），以及SHH与BMP4之间的竞争关系（图2c）。通过量化FlowSig的真阳性率（TPR）和真阴性率（TNR），研究人员发现：在所有场景中（图2d-f），结合受体表达作为信号流入或引入扰动数据并不会改变平均TPR。使用结合受体进行流入测量显著提高了平均TNR，尤其是在复杂的多方向流动模型中，如SHH驱动的模式化以及SHH与BMP4的竞争关系（图2e,f）。 通过条件不变性测试整合扰动数据，可以减少TNR值的变化，包括四分位数范围和异常值，从而获得更精确的细胞间流动估计。这些结果显示，FlowSig有效地减少了基线GSP和UT-IGSP算法推断中的假阳性数量，提升了细胞间流动预测的准确性。 图3：使用皮层样器官模型验证FlowSig的实验验证 研究者使用皮层发育的类器官模型进一步验证了FlowSig的有效性。从人类胚胎干细胞中生成皮层类器官，并在培养第18天（D18）和第35天（D35）收集样本进行scRNA-seq分析。在该模型中，皮层身份的细胞命运于D18确定，而FGF和BMP信号响应则在D35建立。研究者将D35的数据视为对D18“对照”数据的“扰动”，模拟了这些信号通路的影响。 通过CellChat分析，识别出77个独特的配体-受体相互作用，这些相互作用在细胞间流动中扮演不同角色。FlowSig进一步筛选出26种流入的差异信号（图3a）和16种流出的差异信号（图3b），包括关键的FGF和BMP信号。研究者利用pyLIGER从2,793个高度可变基因中构建了20个GEM，并基于此构建了用于推断细胞间流动的62个变量（图3c）。 为了确定主要驱动因素，研究者根据信号流入变量的总边频次进行了排序，发现FGF、MK（中胚层因子）、PTN（多效生长因子）和NRG（神经调节素）是细胞间流动的关键驱动者。特别是FGF流入通过多个GEM驱动了BMP4、IGF-II、NGF、NRG1和NRG3等信号的流出（图3d）。此外，EOMES被确定为潜在的FGF流入调控候选者。相比之下，BMP流入通过较少的GEM被调节，且可能由PAX6或NR2F1介导（图3e）。 为了验证FlowSig分析结果，研究者在D15-D21期间分别添加FGF8b和BMP4激活相应的信号通路，并在D35时收集样品进行RT-qPCR分析。结果显示，激活FGF信号显著下调了EOMES的表达（图3f），而激活BMP信号则下调了PAX6并上调了NR2F1的表达（图3g），证实了FlowSig预测的准确性。 图4：FlowSig在胰岛扰动非空间scRNA-seq中的应用 为了验证FlowSig在恢复由外部扰动驱动的细胞间流动方面的能力，研究者分析了干扰素-γ（IFN-γ）刺激的人胰岛scRNA-seq数据。使用pyLIGER构建了10个GEM，这些模块与独立识别的5个细胞类型簇（alpha、beta1-3和delta）对齐（图4a）。基于这些细胞类型注释，CellChat推断出各细胞组之间显著的成对配体-受体相互作用。 IFN-γ刺激显著改变了多个信号通路的流入量：通过FGFR1增加了FGF信号通路的流入，通过IL-6R和IL-6ST增加了IL-6的流入，通过CD74和CD44增加了MIF的流入，通过NCL增加了MDK的流入，并通过SSTR2增加了SST的流入（图4b）。同时，IFN-γ刺激还影响了流出信号，增加了GCG、INHBA和NAMPT的流出量，减少了ANGPTL2、SPP1、TGFβ1、TNFSF12和UCN3的流出量（图4c）。FlowSig识别出FGF、IL-6、MDK和SST是主要驱动细胞间信息流动的因素，这些信号驱动了GCG、INHBA、NAMPT、SPP1、TGFβ1、TNFSF12和UCN3的流出（图4d）。 为了进一步探索IFN-γ刺激的影响，研究人员将全局细胞间流动网络分为两个子网络：上调子网络：对应于IFN-γ刺激上调的流出信号，连接到这些流出变量的GEM及相关的流入节点（图4e）。下调子网络：对应于IFN-γ下调的流出信号，以类似方式构建（图4f）。 这两个子网络共享相似的流入节点和GEM，但GEM-3仅存在于“上调”网络中，这表明它在IFN-γ刺激下具有专门的作用。GEM-3主要富集在α细胞内，表明刺激驱动了来自α细胞的GCG和NAMPT流出。其他流入信号和GEM则在两种条件下共享，显示了它们的双重调控功能。 图5：FlowSig在中度或重度COVID-19患者取样的人类BALF的scRNA-seq中的应用 为了验证FlowSig处理多个扰动的能力，研究者分析了健康对照组、中度和重度COVID-19患者支气管肺泡灌洗液（BALF）细胞的scRNA-seq数据。使用CellChat结合原始研究中的细胞类型注释，推断出显著的配体-受体相互作用，结果显示健康对照组、中度和重度COVID-19组分别有46个、55个和54个活跃信号通路。 通过pyLIGER构建了20个GEM，这些GEM捕捉了不同条件下的差异（图5a）以及细胞类型间的差异（图5b）。FlowSig识别出每种COVID-19状态相对于健康对照组特有的流入和流出信号变化（图5c）。 为了深入分析这些流出信号驱动的细胞间流动，研究者提取了每个不同流出信号集上游的流入信号及相应的GEM（图5d-f）。尽管随着COVID-19严重程度增加，不同流出信号数量增多，但推断的流入信号数量却从健康对照组的37个减少到中度患者的32个，再到重度患者的25个。类似地，调节性GEM的数量也从健康对照组的16个减少到中度患者的13个，再到重度患者的8个。这表明随着疾病进展，某些特定的细胞间通信路径逐渐丧失。 进一步分析显示，在所有三种条件下共有20个信号流入，而没有发现仅在中度或重度COVID-19中特有的流入信号。TNFRSF12A（由TNFSF12驱动）以及ITGAX和ITGB2 （由C3驱动）的流入信号仅在健康对照组中存在。CAP（来自RETN1）的流入信号则仅在中度和重度COVID-19之间共享（图5g）。 观察到的GEM趋势相似，共享程度最高的GEM是在健康和中度COVID-19群体中的7个GEM，以及在所有三个条件下的5个GEM。GEM-4和GEM-10仅在健康个体中驱动信号流出，而GEM-7（与嗜碱性粒细胞相关）仅在中度和重度COVID-19群体中共享（图5h）。 图6：FlowSig在E9.5小鼠相关性空间立体序列数据中的应用 研究者利用FlowSig对胚胎发育阶段E9.5的鼠胚进行了ST-seq数据分析，揭示了Shh（Sonic Hedgehog）和Wnt5a信号通路之间的复杂双向流动。通过非负空间分解法，研究者从712个空间可变基因中构建了20个高分辨率的空间GEM，这些GEM捕捉了细胞间通信的关键特征（图6a）。 FlowSig识别出多个Shh外流的上游驱动因子，这些因子通过特定的GEM调节Shh外流，并推断出接收的Shh内流（r-Shh）驱动多个信号配体的外流途径，涉及多个GEM（图6c）。为了进一步确定Shh外流的上游调控TF，研究者使用随机森林模型分析了前10个TF的重要性，最终识别出Foxa2、Foxp2、Myc、Zc3h7a和Foxa1为Shh外流的主要上游调控TF（图6d）。 为了识别r-Shh流入的下游靶标，研究者使用pyGAM拟合每个推断出的下游基因表达网络中前10个r-TF的表达与r-Shh流入之间的关系，并根据Spearman相关系数排序。结果显示，Barhl1、Nkx2-1、Meox1、Tcf21和Foxp2与r-Shh的相关性较低，而Foxe1、Nkx2-2、Pou3f1、Tlx2和Nkx2-4等已知靶点表现出显著相关性（图6e）。 研究者观察到Shh和Bmp4、Cxcl12、Igf2、Mdk以及Wnt5a之间可能存在双向流动。为了验证这一假设，研究者分析了各配体与其下游r-Shh流入的关系。结果显示，只有Wnt5a通过GEM-5的转录因子显著受r-Shh流入调节（图6f）。此外，研究者发现r-Wnt5a流入通过空间扩散下调Myc介导的Shh流出，形成一个激活抑制系统（图6g）。这种激活抑制系统的三个关键特征如下：1）信号传播：Shh和Wnt5a配体都能扩散；2）自我上调：Shh通过Foxa2上调自身，Wnt5a通过Foxa1、Nkx6-1 和Sox21上调自身；3）抑制机制：Wnt5a通过下调Myc来抑制Shh。 这些观察结果表明，Shh和Wnt5a之间的双向流动类似于Turing模式生成系统，该系统在发育过程中驱动细胞命运图案化。因此，在E9.5时，Shh和Wnt5a信号通路可能共同作用于胚胎发育中的细胞命运决定过程（图6h）。 综上所述，FlowSig是一款强大的细胞间通信和信息流分析工具，对于分析发育过程中以及强烈单因素（比如药物）或多因素（比如病理微环境）扰动带来的细胞间信息流变化有着非常积极的作用，有助于推动对生命科学和生物医学复杂系统过程的动态理解。 拓展延伸 FlowSig技术在其他科研领域的广泛应用前景： ● 肿瘤微环境与癌症治疗 在肿瘤学领域，单细胞RNA测序（scRNA-seq）和空间转录组学（ST）结合FlowSig方法的应用具有巨大的潜力。肿瘤不仅仅是单一类型的细胞集合，而是一个复杂的生态系统，包括癌细胞、免疫细胞、基质细胞等多种成分。通过scRNA-seq可以揭示肿瘤内部不同细胞亚群的异质性，以及它们之间的相互作用网络。例如，在乳腺癌研究中，科学家们利用scRNA-seq发现了多种肿瘤相关巨噬细胞（TAMs），这些细胞不仅促进了肿瘤生长，还影响了化疗药物的效果。借助FlowSig，研究人员能够更加细致地描绘出TAMs与其他细胞类型间的通信路径，从而找到新的治疗靶点或预测患者的预后。 此外，空间转录组学数据提供了额外的空间维度信息，这对于理解肿瘤组织内的结构特征至关重要。比如，某些类型的免疫检查点分子表达可能集中在特定区域，形成所谓的“免疫冷区”。通过整合ST和FlowSig分析，可以精准定位这些冷区，并探索其形成的分子机制，进而开发更有效的免疫疗法策略。这种多模态的数据融合为个性化医疗方案的选择提供了科学依据。 ● 再生医学与干细胞研究 再生医学旨在修复受损组织器官的功能，而干细胞则是实现这一目标的关键角色之一。scRNA-seq和ST技术可以帮助科学家深入了解干细胞分化过程中的基因调控变化，确保生成的组织具备正确的细胞组成。以心脏再生为例，心肌梗死后的心脏修复需要诱导内源性干细胞向心肌细胞方向分化。然而，实际操作中往往面临效率低下等问题。FlowSig可以通过构建详细的细胞间通信模型，指导优化培养条件，提高干细胞定向分化的成功率。 同时，对于移植后的干细胞存活率低的问题，scRNA-seq和ST有助于识别影响细胞存活的关键因素。例如，在骨髓移植过程中，宿主微环境中存在的炎症因子可能会抑制新植入干细胞的增殖。利用FlowSig解析这些不利信号通路，研究人员可以采取措施减少负面影响，改善移植效果。总之，scRNA-seq和ST结合FlowSig的方法为解决再生医学面临的挑战提供了强有力的支持。 ● 神经科学研究 神经系统由高度特化的神经元构成，每个神经元之间通过突触连接传递信息。scRNA-seq和ST技术使得我们能够在单细胞水平上研究神经元及其支持细胞（如星形胶质细胞、小胶质细胞等）之间的交流模式。这对于理解大脑发育、学习记忆等生理过程非常重要。例如，FlowSig已被用于分析皮质类器官中的细胞间流动，揭示了Wnt5a-Shh双向流动关系，其中Shh促进自身及Wnt5a的表达，而Wnt5a则抑制Shh的表达，形成了一个潜在的Turing模式。这种反馈机制有助于解释某些特定的空间结构形成，并可能成为未来研究的重点方向之一。 此外，scRNA-seq和ST还可以帮助探究神经系统疾病的发生机制。阿尔茨海默病是一种常见的神经退行性疾病，其病理特征之一是β-淀粉样蛋白斑块沉积。通过scRNA-seq分析患者脑组织样本，发现了一些参与清除这些有毒蛋白质的免疫细胞类型。结合FlowSig，可以进一步探讨这些细胞如何响应损伤信号，并寻找增强其功能的方法，最终达到延缓疾病进展的目的。 ● 免疫学与感染性疾病 免疫系统负责保护机体免受外来病原体入侵。scRNA-seq和ST技术为解析免疫反应提供了前所未有的机会。特别是在病毒感染的情况下，了解宿主细胞对病毒复制的反应至关重要。例如，在新冠病毒（SARS-CoV-2）感染期间，肺泡灌洗液（BALF）中存在大量的免疫细胞。通过scRNA-seq分析，研究人员能够区分不同的免疫细胞亚群，并追踪它们随时间的变化情况。FlowSig则可用于推断这些细胞间的相互作用，特别是那些对抗病毒至关重要的细胞通讯。 另一个重要应用是在疫苗研发方面。为了评估疫苗诱导的免疫应答，通常需要监测接种者体内抗体水平和T细胞活性。scRNA-seq不仅可以检测到抗原特异性B细胞和T细胞的存在，还能提供关于它们克隆性和表型特征的信息。结合FlowSig分析，可以从整体上把握免疫系统的动态变化，为优化疫苗配方提供参考。此外，这种方法也有助于发现新型免疫调节剂，提升现有疫苗的效果。 临床应用与展望 FlowSig作为一种强大的数据分析工具，在转化医学领域具有广泛的应用前景。例如，在肿瘤学方面，了解肿瘤微环境中不同细胞类型的互动可以帮助识别新的治疗靶点；而在再生医学领域，FlowSig可以协助优化干细胞分化策略，提高组织工程产品的质量。此外，随着单细胞技术和空间转录组学技术的发展，FlowSig将帮助临床医生更深入地理解病理状态下细胞群体的行为变化，进而指导个性化医疗方案的选择。 注：本文旨在介绍医学研究进展，不做治疗方案推荐。如有需要，请咨询专业临床医生。 参考文献： Almet AA, Tsai YC, Watanabe M, Nie Q. Inferring pattern-driving intercellular flows from single-cell and spatial transcriptomics. Nat Methods. 2024 Oct;21(10):1806-1817. 点击下方「阅读原文」，前往梅斯官网查询更多相关课程和实验技术服务支持~