L-type calcium channel

点击蓝字 关注我们 | 本文内容来源：征战AD 阿尔茨海默病 (AD) 是一种进行性的神经退行性疾病，其特征是认知功能逐渐下降，伴随大脑中β-淀粉样蛋白 (Aβ) 斑块的沉积和神经元损伤。近年来的研究表明，在AD早期，在神经元损伤之前，脑部血流 (CBF) 就已经出现下降，这种下降与认知功能的减退密切相关。 CBF的降低可能导致脑组织缺氧和营养供应不足，进而影响神经元的功能和生存。在AD的早期阶段，通过改善CBF可能有助于延缓疾病进展，保护认知功能。血管周细胞 (pericytes) 是包裹在脑毛细血管周围的特殊细胞，它们通过调节血管的收缩和舒张来控制CBF。在AD模型中，血管周细胞的异常收缩导致毛细血管血流阻力增加，CBF下降。因此，探索调节血管周细胞收缩的机制，寻找有效改善CBF的策略，对于AD的治疗具有重要的理论和实践意义。 基于此，Nils Korte 等研究学者在国际著名期刊 Nature Neuroscience 上发表题为 Inhibiting Ca2+ channels in Alzheimer’s disease model mice relaxes pericytes, improves cerebral blood flow and reduces immune cell stalling and hypoxia 的研究文章。旨在探究AD模型小鼠中血管周细胞收缩的调控机制，并研究钙离子通道阻断剂尼莫地平 (Nimodipine) 对血管周细胞收缩和CBF的影响。 通过活体双光子成像技术、激光多普勒流变测量和磁共振成像等先进技术，本研究揭示了L型电压门控钙通道 (CaVs) 在血管周细胞收缩中的关键作用，并发现尼莫地平能够通过阻断CaVs减轻血管周细胞的收缩，改善CBF，减少免疫细胞的停滞，并减轻脑组织缺氧。这些发现为AD的早期干预提供了新的潜在治疗策略，并为未来的临床研究和药物开发奠定了基础。 主要结果 1. L型钙通道 (CaVs) 和钙控氯通道TMEM16A调控血管周细胞张力： 实验数据显示，内皮素-1 (ET-1) 这类Gq蛋白偶联受体激动剂能够通过释放肌浆网中的钙离子，增加血管周细胞的钙离子浓度，并导致血管收缩。使用尼莫地平阻断CaVs或使用10bm阻断TMEM16A可以显著减轻这种钙离子浓度的上升和血管周细胞的收缩。通过双光子成像技术对NG2-CreERT2-GCaMP5g小鼠的大脑皮层切片进行观察，我们发现ET-1增加了血管周细胞的钙离子浓度，并在血管周细胞体处引起毛细血管收缩。此外，尼莫地平预处理能够减少ET-1引起的平滑肌细胞钙离子浓度上升，这与CaV1.2和TMEM16A在血管壁细胞中的高表达一致。研究模型展示了TMEM16A和CaVs如何控制血管周细胞的张力，这为开发针对AD早期阶段的治疗策略提供了新的见解。 2. CaVs在体内产生平滑肌细胞 (SMCs) 和肌源性张力： 通过在活体内使用激光多普勒流量测量和双光子成像技术，我们观察到，向野生型小鼠注入BBB可透过的CaV阻断剂尼莫地平后，CBF显著且持久地增加了28%。这种增加与血管直径的增加一致，包括皮质动脉、穿透动脉和1至3级分支顺序的毛细血管。尼莫地平引起的毛细血管扩张在血管周细胞体附近最为显著，并随着距离的增加而减少，表明血管周细胞介导了尼莫地平引起的毛细血管扩张。此外，我们同时测量了CBF和血压 (BP)，发现尼莫地平初始时会导致平均血压下降，但随着自动调节机制的恢复，CBF上升至尼莫地平处理前水平的25%以上，表明尼莫地平引起的局部血管阻力下降大于其对全身血压的降低效应。实验还证实了尼莫地平引起的血管壁细胞内钙离子浓度下降先于CBF的增加，并与血管舒张有关。因此，研究结果表明，CaVs在SMCs和1至3级分支顺序的血管周细胞中赋予了肌源性张力，这为理解CaVs在体内调控血管张力的作用提供了直接证据。 图1. CaVs在体内对SMCs和血管周细胞的调控作用 3. CaVs增强AD小鼠毛细血管床周细胞的收缩： 通过使用激光散斑成像技术，观察到AD小鼠的桶皮层毛细血管灌注显著减少。活体双光子成像显示，在与年龄匹配的野生型 (WT) 小鼠相比，成熟AD小鼠的1至3级毛细血管血管腔直径在血管周细胞体处狭窄了21%。经尼莫地平处理后，AD小鼠的毛细血管直径增加了9.6%，CBF提高了51%。此外，尼莫地平引起的血管扩张先于CBF的增加，并且与血管舒张有关。数据显示，尼莫地平通过减少血管周细胞和SMCs的钙离子浓度来增加CBF，且这种效应独立于尼莫地平对其他细胞的影响。 在1至3级分支顺序的血管周细胞中，AD小鼠的钙离子瞬变频率显著增加，而尼莫地平治疗可大幅恢复这些细胞的钙离子瞬变频率至WT水平，并减少瞬变幅度。此外，尽管在AD小鼠中>3级毛细血管的血管周细胞体和过程的钙离子瞬变频率升高，尼莫地平并没有调节这些细胞的钙离子瞬变频率，但确实减少了瞬变幅度。研究结果证实，>3级血管周细胞能够响应缺血损伤而收缩，这可能在AD和缺血性脑皮质中具有重要意义，其中血管收缩剂如活性氧 (ROS) 的水平升高。 总之，研究结果表明，通过使用尼莫地平阻断CaVs，可以在AD小鼠中逆转早期CBF下降，为AD的早期干预提供了潜在的治疗策略。 图2. 血管周细胞在AD中的收缩作用及其对CBF的影响 图3. 中间和静脉端血管周细胞在AD小鼠中的增强收缩作用 4. 免疫细胞ROS提高AD小鼠的Ca2+水平，并降低CBF： 研究人员通过活体双光子成像技术观察到，在外源性给予过氧化氢 (H2O2) 以产生氧化应激时，血管周细胞的钙离子浓度显著上升，钙通道阻断剂尼莫地平可以减轻此现象。此外，利用NOX2的阻断剂GSK2795039和临床批准的抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸 (NAC) 处理AD小鼠，可以显著增加CBF并降低血管周细胞和平滑肌细胞内的钙离子浓度。研究还发现，在AD小鼠中，与Aβ斑块相邻的小胶质细胞产生的ROS水平升高，而NAC预处理能够显著减少这种ROS的产生。此外，与WT小鼠相比，AD小鼠中小胶质细胞与血管周细胞之间的距离更近，这可能缩短了ROS扩散至血管并调节血管张力所需的距离。最后，通过活体成像技术，研究人员观察到AD小鼠小胶质细胞的累积像素监控（即小胶质细胞的活动）较WT小鼠显著减少，表明AD小鼠的小胶质细胞可能形态更不分支，与血管的交互作用减少。尽管小胶质细胞的监视活动减少，但AD小鼠的小胶质细胞/血管周围巨噬细胞体更接近血管，这可能影响血管周细胞的收缩。 综上所述，这些发现揭示了在AD小鼠中免疫细胞与血管周细胞之间的相互作用，以及这种相互作用如何通过影响钙离子浓度来调节脑血流，为未来AD的潜在治疗策略提供了新的见解。 图4. 免疫细胞ROS在AD小鼠中提高血管周细胞内钙离子浓度并减少脑血流 5. 静脉端周细胞介导AD小鼠白细胞停滞： 在AD小鼠模型中，血管周细胞诱导的毛细血管腔狭窄会导致血流在血管周细胞体附近停滞，特别是在毛细血管的静脉端。通过活体双光子成像技术，研究人员观察到AD小鼠的毛细血管阻塞百分比从WT小鼠的0.47%增加到5.2%。这些阻塞主要发生在远离动脉端的毛细血管分支，即毛细血管的静脉端，这里的毛细血管直径最小，在AD中进一步减小。研究人员还发现，循环中的单核细胞和中性粒细胞被招募到AD大脑中，并在毛细血管中引起阻塞。这些细胞比红细胞伸展性差且体积较大，导致它们在毛细血管中推动血管壁，可能增强了它们与内皮细胞上的ICAM-1和VCAM-1粘附分子的相互作用。使用尼莫地平处理后，AD小鼠的毛细血管灌注大部分恢复，停滞的白细胞和红细胞数量减少到低于WT小鼠的水平。 这些发现表明，尼莫地平通过多种方式增加AD小鼠的CBF：一是逆转毛细血管直径的减少，从而维持较低的血液粘度；二是减少随后由白细胞和红细胞引起的毛细血管阻塞。这些结果揭示了尼莫地平可能通过改善血管周细胞功能和减轻炎症反应来提高AD小鼠的CBF，为AD的潜在治疗提供了新的见解。 图5. CaV抑制剂减少AD小鼠血管周细胞引起的免疫细胞停滞 6. 尼莫地平改善AD小鼠的CBF并减少脑组织缺氧： 在AD小鼠模型中，为期1.5个月的尼莫地平治疗显著改善了小鼠的CBF，增加了皮层血管系统的毛细血管直径，并减少了血液在毛细血管中的停滞现象。此外，尼莫地平还显著降低了与Aβ斑块相关的缺氧细胞数量，表明其可能对改善AD小鼠的脑部缺氧状况具有积极作用。尽管长期尼莫地平治疗并没有调节血管内皮细胞的粘附分子表达，也没有影响FITC-右旋糖酐的渗出，但这些发现表明尼莫地平通过降低血管周细胞内的钙离子浓度，增加毛细血管直径，减少血液停滞和缺氧细胞数量，从而可能在AD早期治疗中发挥保护作用。然而，随着AD的进展，特别是在老年AD小鼠中，尼莫地平对CBF的改善作用可能会减少，这可能与血管周细胞的加速丧失和血脑屏障破坏有关。 上述结果表明，尼莫地平通过降低血管周细胞内的钙离子浓度，增加毛细血管直径，减少血液停滞和缺氧细胞数量，从而在AD早期治疗中可能发挥保护作用。 图6. 尼莫地平改善AD小鼠的脑血流并减少脑组织缺氧，逆转人类皮层组织中Aβ引起的血管周细胞收缩 7. 尼莫地平逆转人类皮质组织中Aβ引起的周细胞收缩： 在人类大脑皮层组织中，尼莫地平能够逆转由可溶性Aβ寡聚体引起的血管周细胞收缩。具体来说，研究发现在人工脑脊液 (aCSF) 中单独孵育的活体人脑皮层组织，与血管周细胞体相比，其周围的毛细血管直径显著扩张。而当加入Aβ寡聚体时，靠近血管周细胞体的毛细血管显著收缩，但在血管周细胞体远处的毛细血管直径没有显著变化。然而，在持续存在尼莫地平的情况下加入Aβ寡聚体，血管周细胞体附近的毛细血管直径与对照组相比没有显著差异。这表明在人类活体大脑组织中，Aβ引起的血管周细胞收缩是由L型钙通道（可能是在人血管周细胞中表达的CaV1.2亚型）的激活驱动的。 因此，尼莫地平有望在AD患者中增加毛细血管直径并减少缺氧，正如在小鼠模型中观察到的那样。 本研究揭示了尼莫地平这类药物可能成为改善AD早期脑血流减少的潜在治疗手段。通过在AD小鼠模型中使用尼莫地平，研究发现它能够显著增加毛细血管直径，减少血管周细胞收缩，改善脑血流，并减轻与AD相关的脑组织缺氧状况。此外，尼莫地平还能减少免疫细胞在毛细血管中的停滞，改善血液微循环。这些发现为AD的早期干预提供了新的治疗靶点，提示通过调节血管周细胞的功能，可能有助于延缓疾病进展，改善患者的认知功能。 科研启发： 本研究强调了血管周细胞在神经退行性疾病中的作用，并指出了L型钙通道 (CaVs) 和钙控氯通道TMEM16A作为治疗AD的新靶点。此外，研究还表明，通过降低血管周细胞内的钙离子浓度，可以减少血管周细胞的收缩，从而为开发新的药物提供了可能的分子机制。未来的研究可以进一步探索尼莫地平或其他CaVs阻断剂在临床上的应用，以及它们对AD病程的长期影响，为AD治疗提供更有效的策略。 喜鹊医药团队独家设计开发的创新化学药物MN-08，具有独特新颖的作用机理，既可通过拮抗NMDA受体抑制钙离子超载又能靶向NMDA受体释放NO扩张脑血管、改善脑血流，从而有效恢复脑部营养供给，起到治疗AD与血管性痴呆 (VD) 等神经退行性疾病的作用。临床1期研究证明MN-08具有良好的安全性与耐受性。目前，MN-08治疗中重度AD的2期临床试验正在进行，现有数据已初步显示出增加脑血流的积极效果，有望成为标本兼治的AD与VD的新一代治疗药物。 原文链接： 【1】Asllani, I. et al. Multivariate and univariate analysis of continuous arterial spin labeling perfusion MRI in Alzheimer’s disease. J. Cereb. Blood Flow Metab. 28, 725–736 (2008). 【2】Nortley, R. et al. Amyloid β oligomers constrict human capillaries in Alzheimer’s disease via signaling to pericytes. Science 365, eaav9518 (2019). 【3】https://doi-org.libproxy1.nus.edu.sg/10.1038/s41593-024-01753-w 声明： 本文内容来源：征战AD。内容仅供参考，不构成任何投资及应用建议，亦不代表任何治疗指导及用药建议。如稿件涉及版权等问题，请与我司联系，我们将在第一时间协调给予处理或删除。

摘要：合成生物学的目标是设计或组装现有的生物部件或生物组件，以获得有用的生物特性。在过去的几十年中，人们已经取得了进展，构建了精细的生物回路、标准化的生物学构建模块，并开发了各种基因组/代谢工程工具和方法。医疗和制药需求也推动了合成生物学的发展，包括将异源途径整合到设计好的细胞中，以高效生产医疗剂；在细胞生长介质中提高天然产物的产量，使其等同于或高于从植物或真菌中提取的产物；构建新的遗传回路以实现肿瘤靶向，可控释放治疗剂以响应特定生物标志物，以对抗糖尿病和癌症等疾病。此外，还开发了新策略来治疗传统方法难以治愈的复杂免疫疾病、传染病和代谢紊乱。总的来说，合成生物学为医疗和制药研究带来了新的能力。本综述总结了合成生物学发展的历程，合成生物学在微生物生产药物、配备合成DNA电路的工程细胞用于诊断和治疗、活体和自动组装的生物材料用于医疗治疗、无细胞合成生物学在医疗和制药领域的应用，以及具有生物医学应用潜力的DNA工程方法的过去和现在。 1.引言 合成生物学的概念最早由Stephane Le Duc在1910年代提出。在这个领域，研究策略已经从描述和分析生物事件转变为设计和操纵期望的信号/代谢途径，类似于已经定义好的有机合成。与19世纪初成功发展的有机合成不同，合成生物学受到生物系统内部DNA、RNA和蛋白质技术的复杂性的限制。如今，合成生物学已经得到了广泛的开发。它已经成为一个多学科领域，旨在基于现有知识开发新的生物部件、系统甚至个体。研究人员可以应用工程范式来生产具有可预测和健壮的系统，这些系统具有自然中不存在的新功能。合成生物学与生物技术、生物材料和分子生物学等多个学科紧密相连，为这些领域提供了方法论和学科。 合成生物学发展的时间线在这里进行了总结（图1）。总的来说，合成生物学的历史可以分为三个阶段。最初阶段贯穿了整个20世纪。尽管在20世纪，病毒颗粒、细菌、古菌和真菌等最简单的生物体很难被工程化，但在早期探索中仍然取得了一些成就，包括结晶牛胰岛素的合成、DNA和RNA的化学合成、遗传密码的破译以及分子生物学中心法则的建立。在这个时期，随着20世纪末基因组生物学和分子生物学的快速发展，合成生物学一直在积累力量（图1）。 图1 合成生物学主要里程碑的时间线。时间线从20世纪50年代开始，扩展到21世纪20年代。重要事件列在右侧面板中。 发展阶段始于21世纪。在新千年的第一个十年中，合成生物学已经成为每个生物学研究人员都知道的领域，包括生物开关、基于群体感应信号的基因回路、酿酒酵母细胞工厂合成变形螺烯、BioBrick标准化组装和iGEM会议的发明。在这个阶段，合成生物学设计中考虑了两个原则，包括瓶颈和自上而下的原则，分别指通过组装基本生物分子创造人工生命的新创举和工程改造自然存在的细胞以满足实际需求。然而，大多数回路设计得很好，但仍然不足以生产复杂的代谢物或感知多种信号，特别是应用尚未为医疗和制药用途做好准备。无论如何，合成生物学逐渐成为一个最热门的领域，在快速发展的前夕。 快速增长阶段始于2010年代，特别是CRISPR/Cas9基因组编辑技术、低成本DNA合成、下一代DNA测序和高通量筛选方法的出现，以及设计-构建-测试-学习（DBTL）的工作流程和工程生物学的进步，使合成生物学进入了快速发展时期，无论是在实验室规模的发现还是工业规模的生产。典型地，Venter等人组装了一个人工染色体的支原体并将其移植到M. capricolum中，创造了新的活细胞。此外，新方法加速了代谢生物合成途径的发现和工程，微生物合成青蒿酸已成为可能，这是第一种由微生物细胞生产的工业化植物代谢物。要实现设计生物系统的最终目标，就像设计电子或机械系统一样，这仅仅是个开始。需要更多的努力来生成复杂和稳定的生物回路，以满足当前合成生物学的各种应用。 除了科学家，投资者也意识到了这个领域的潜力。金融投资帮助建立了与合成生物学相关的公司，预计到2021年全球合成生物学市场价值95亿美元，包括合成生物学产品（例如，BioBrick部件、合成细胞、生物合成化学品）和使能技术（例如，DNA合成、基因编辑），预计到2026年将达到370亿美元。大多数投资都集中在医疗应用上。科学家和资本市场对未来都持乐观态度。 从化学生物合成开始，合成生物学已经扩展到医疗治疗、药物开发、化学工程、食品和农业以及环境保护等领域。本文重点关注合成生物学在医疗和制药领域的进展，包括细胞治疗、细菌活体诊断和治疗、治疗性化学品的生产、纳米技术及纳米材料应用以及靶向基因工程。 2. 基因工程治疗载体 2.1. 用于医疗应用的工程哺乳动物细胞 随着合成生物学的进步，研究人员利用现有信号网络合理设计出用于特定目的的活细胞载体，并为其创建新的结构，开发了各种新疗法，包括例如生产医用生物分子、用于传感或诊断的合成基因网络，以及可编程生物体，以处理疾病背后的机制和相关生物体/个体事件（图2）。在这里，我们重点介绍了哺乳动物细胞工程中的合成生物学策略，用于代谢紊乱、组织工程和癌症治疗，以及细胞治疗和基因回路设计的方法。 图2 基于合成生物学策略的智能活细胞的发展。智能细胞能够感应各种环境生物标志物，从化学物质到蛋白质。外部信号被转导到细胞内以触发下游反应。产品也以化学物质或蛋白质的形式存在，以满足定制需求。感应-反应系统赋予细胞新的或增强的能力。P代表启动子。 基于嵌合抗原受体（CAR）T细胞的疗法。CAR是包含抗原结合和T细胞激活域的工程受体。T细胞从患者体内获取并在体外进行工程化，以表达特定的CAR，然后转移回原始供体患者体内，在该患者体内消除表面展示目标抗原的癌细胞。CAR-T是一种始于2000年代的新型细胞疗法。第一代CAR是针对CD19的单链可变片段（scFv）。人工CAR的发展包括三代。第一代CAR仅包含CD3ζ细胞内域，而第二代CAR还具有共刺激域，例如4-1BB或CD3ζ（图3）。研究还在进行中，以开发具有多个共刺激信号域的第三代嵌合抗原受体（图3）。由于scFv具有识别细胞表面蛋白的能力，通过CAR-T细胞介导的肿瘤靶向既不受限制也不依赖于抗原的处理和呈递。因此，CAR-T细胞不仅限于MHC丧失的肿瘤逃逸。对于癌症免疫疗法，采用基于CAR的方法的主要优势归因于源自抗体的scFv，其亲和力比传统TCRs高几个数量级。此外，CAR可以靶向糖脂、异常糖基化蛋白和构象变体，这些通常不容易被TCRs识别。根据临床试验结果，越来越多的证据表明CAR-T细胞具有传递强大的抗肿瘤治疗效果的能力，从而导致最近FDA批准了针对CD19蛋白的CAR-T疗法，用于治疗急性淋巴细胞性白血病（ALL）和大B细胞淋巴瘤（DLBCL）。 图3 合成生物学在设计嵌合抗原受体（CAR）中的应用。a 人工CAR中使用的与门。从左到右展示了三种典型的CAR：基于共刺激域的第二代CAR、由synNotch受体辅助的具有多重识别机制的CAR以及基于嵌合共刺激受体（CCR）的CAR。b 配备有抑制性CAR（iCAR）系统的人工CAR。该系统可以防止识别体细胞上的自身抗原。c 感应不同肿瘤抗原的人工CAR。两个识别不同靶标的ScFv串联融合，工程化的CAR可以被多种抗原触发。 此外，CAR-T应用正在进入商业化阶段。首个获批的CAR T细胞疗法是Kymriah，这是由诺华公司和宾夕法尼亚大学开发的针对DLBCL的CD19靶向疗法。DLBCL是一种典型的非霍奇金淋巴瘤（NHL），占所有淋巴瘤的40%。FDA还于2017年批准了Yescarta（axicabtagene ciloleucel）用于DLBCL治疗。在临床研究中，DLBCL患者接受了CD19靶向CAR T细胞治疗，有25%的部分反应者和超过50%的完全反应者。观察到超过两年的持久反应，表明CAR-T细胞的治疗效果。然而，在Yescarta治疗的患者中观察到细胞因子风暴（13%），表明需要提高安全性。 在CAR-T细胞疗法中，目标抗原的选择是决定性的。如果CAR-T细胞能够识别非恶性细胞上表达的蛋白，可能会发生严重的细胞毒性，因为非靶向活性。最佳目标抗原是在癌细胞表面一致表达但不在正常细胞表面表达的抗原。多发性骨髓瘤很难通过化学疗法或干细胞移植治疗。CAR-T细胞疗法在多发性骨髓瘤的临床前研究中显示出有效性。然而，到目前为止，还没有发现任何抗原在多发性骨髓瘤细胞上强烈且恒定地表达，但在体细胞上没有表达。在迄今为止使用过的抗原中，TNF超家族蛋白之一，B细胞成熟抗原（BCMA），是多发性骨髓瘤细胞定向CAR-T疗法目标的最佳候选。BCMA在几乎所有多发性骨髓瘤患者的癌细胞中表达，这种抗原在体细胞上的表达仅限于浆细胞和一些B细胞。BCMA是第一个通过CAR-T细胞方法在多发性骨髓瘤患者中使用的抗原，导致这些癌症患者出现系统反应。在剂量梯度临床试验中，12名患者接受了BCMA CAR-T细胞。接受9 × 10^6 CAR-T细胞/kg体重治疗的两名患者获得了良好的缓解，尽管治疗与细胞因子风暴相关的毒性。目前正在进行或已完成许多临床试验，研究抗BCMA CAR-T细胞的安全性和/或有效性。 Idecabtagene vicleucel（Abecma，也缩写为Ide-cel）由Bristol-Myers Squibb开发，使用与NCI测试的11D5-3-CD828Z CAR相同的抗BCMA 11D5-3 scFv。然而，共刺激域不同，用于idecabtagene vicleucel的CAR是使用慢病毒载体传递的，并且具有4-1BB共刺激域而不是CD28域。在idecabtagene vicleucel的多中心I期试验中，该疗法对治疗多发性骨髓瘤患者非常有效。正在进行的KarMMa II期试验旨在进一步评估idecabtagene vicleucel的安全性和能力。KarMMa的初步结果表明，它在大量预处理的多发性骨髓瘤患者中显示出深入、持久的反应。有效性和安全性反映在早期报告中，支持idecabtagene vicleucel在主要临床结果中的目标剂量范围内具有良好的临床益处-风险概况。 在医疗疗法中的受体工程。SynNotch受体是一类在医学应用中使用的人工工程受体（图3）。Notch受体是参与信号转导的跨膜受体，包括一个细胞外域、一个跨膜和细胞内域。通常在SynNotch架构中保留跨膜和细胞内域，而信号输入的细胞外域被设计为感应scFvs和纳米体，为在活细胞中启动信号提供了可能性。 另外，基于SynNotch理念，开发了模块化细胞外传感器架构（MESA），旨在检测细胞外游离配体。MESA设计包含两个跨膜蛋白，每个蛋白都包含一个细胞外配体结合域，该域感应化学物质或蛋白质，可以是小分子结合域或基于抗体的感应模块，一个跨膜域，以及一个细胞内转录因子，该因子具有从复合体中释放的能力、蛋白酶识别序列或蛋白酶。配体结合到细胞外域后，MESA受体二聚化并诱导细胞内蛋白水解裂解，允许转录因子解离以进行下游调节。该方法允许更灵活的传感器设计，不仅限于Notch受体。这个系统最近也被改造为通过分裂蛋白酶或分裂转录因子模式进行信号转导。SynNotch设计已经构建了一系列名为合成内膜蛋白酶受体（SNIPRs）的受体，包含来自除小鼠Notch蛋白外的其他天然受体的域，这些域也可以被内源性蛋白酶裂解。与SynNotch类似，SNIPRs结合它们的抗原并通过解离转录因子来感应细胞和免疫因子。对于SynNotch、SNIPR和MESA，配体结合域和转录因子域的选择使得在使用这些系统时可以定制感应（信号输入）和功能（信号输出）步骤。SNIPR和MESA还丰富了人工受体效应器的可用工程工具。然而，仍然存在一些限制，如高背景信号、非靶向效应、来自小鼠Notch蛋白的免疫原性、人工受体和转录调节因子的大尺寸。需要许多努力来改进这个系统。 受体工程应用通常与CAR-T疗法相关。受体可以被设计为针对两个特定抗原，一个使用SynNotch，另一个通过传统的CAR。在临床前模型中，建立了针对双重抗原表达细胞的T细胞。TEV蛋白酶可以融合到MESA受体上，裂解转录因子以实现功能化。人源化的合成构建可以减少免疫原性并最小化非靶向效应。Zhu等人构建了一个人类SNIPRs的框架，未来应用于CAR-T疗法，防止CAR-T细胞通过非肿瘤信号被激活。除了上述合成受体外，基于相同理念，Engelowski等人设计了一种合成细胞因子受体，通过将GFP/mCherry纳米体融合到天然IL-23细胞内域来感应纳米体。另一种受体工程策略是将受体转导的信号重新连接到新的效应基因。使用与VEGF互补的scFv，工程化受体感应VEGF并释放dCas9蛋白，然后IL-2表达上调。该系统已成功在Jurkat T细胞中探索。 用于糖尿病治疗的HEK-β细胞。β细胞存在于胰岛中，合成并分泌胰岛素。作为哺乳动物唯一的胰岛素合成场所，β细胞通过包括糖酵解和刺激-感应-分泌耦合过程的信号转导途径来感应血糖。胰岛素的分泌包括以下步骤。血糖被输送到β细胞内，通过细胞内的糖酵解代谢，导致细胞膜去极化、能量产生和K+ATP通道关闭，激活钙通道Cav1.3以诱导钙内流和胰岛素颗粒的分泌。糖尿病患者过高的血糖浓度源于1型糖尿病胰岛素产生β细胞的缺乏，或2型糖尿病身体细胞对胰岛素敏感性低。使用基于合成生物学的多重筛选方法，Xie等人将人类肾脏细胞HEK-293工程化，以感应血糖水平进行胰岛素分泌。设计结合了糖尿病治疗中的自动诊断和治疗。研究人员证明，Cav1.3的过度表达为在体细胞中构建类似β细胞的葡萄糖感应模块提供了途径。Cav1.3控制的钙和合成Ca2+诱导型启动子的结合，允许使用调整后的体内转录反应来监测血糖水平。在构建人工HEK-293-β细胞后，通过将细胞植入小鼠腹腔内，这种细胞系HEK-293-β用于葡萄糖反应性胰岛素生产，维持了超过3周的血糖稳态，也在本研究中在1型糖尿病小鼠内3天内自我校正了高血糖。 HEK-293-β细胞的优势是明显的。与灵长类动物胰岛相比，HEK-293-β细胞在稳定1型糖尿病小鼠的餐后血糖代谢方面同样有效。此外，HEK-β细胞更容易在体外培养。预计工程化的人类细胞有望根据当前的制药生产规则和法规，容易、成本效益高且稳健地生产，允许生产具有良好产品纯度、稳定性和质量的即用型商业产品。这种高度创新的工程细胞提高了任何细胞类型都可以通过合理重编程实现定制能力的可能性，如血糖控制。 诱导多能干细胞（iPSCs）在医学应用中的作用。合成生物学还有助于通过过表达某些与去分化相关的基因来生成人类干细胞。其中一种应用是诱导多能干细胞。iPSCs是从体细胞中生成的多能干细胞。由山中伸弥实验室开创，引入包括Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4在内的四个转录因子，将成纤维细胞转变为类似胚胎干细胞（ES）的细胞，这些细胞可以重新分化为血细胞、骨细胞或神经元，用于可能治疗各种组织和器官的损伤。iPSCs不是使用人类胚胎创建的，避免了与ES细胞相比的伦理问题。此外，来自自体体细胞的iPSCs避免了免疫排斥。iPSCs具有自我更新能力，并具有持续的亚培养特性。来自患者的体细胞样本被诱导成iPSCs，能够作为医学研究的无限资源库。已经建立了唐氏综合症和多囊肾病的iPSC细胞系。一个名为StemBANCC的项目呼吁收集iPSC细胞系，用于药物筛选。结合治疗化学物质和iPSC细胞系的各种应用正在进行高通量药物筛选和分析。 iPSCs旨在用于组织再生和疗法开发。可以从iPSCs中衍生出O型红细胞，以满足输血需求。当癌症患者需要大量NK细胞进行免疫疗法时，可以使用iPSCs制造这些细胞，以解决它们的低可用性问题。在小鼠研究中观察到iPSCs的抗衰老效果。iPSCs的化学诱导分化为心肌细胞已被广泛使用。这些iPSC心肌细胞具有与患者衍生的遗传代码相同的特征，允许建立长QT综合征和缺血性心脏病的模型。可以诱导脐带血细胞成为多能干细胞，用于治疗小鼠视网膜功能障碍，重新分化的iPSCs被用来治疗小鼠的脑损伤，治疗后它们的运动能力得到恢复。 iPSCs已成功用于器官再生，例如，体外心肌细胞可以通过山中的方法用于将胎儿心脏再生为正常心脏。可以从包括iPSCs、内皮干细胞和间充质干细胞在内的三种不同的细胞中生成人类“肝脏芽”。生物模拟过程使肝脏芽自包装成一个复杂的器官，用于移植到啮齿动物中。它在药物代谢方面功能良好。 一些iPSC应用已进入临床阶段。例如，大阪大学的一组人员从iPSCs中制造了“心肌片”，将它们移植到严重心力衰竭的患者中，日本的临床研究计划已经获得批准，正在招募患者。此外，中国的两名男性接受了iPSC分化的心肌细胞治疗。据报道他们状况良好，尽管没有透露详细数据。来自六名患者的皮肤细胞的iPSCs被重新编程为视网膜上皮细胞（RPCs），以替换正在进行的I期临床试验中的退化RPCs。类似地，使用自体iPSCs分化的造血干细胞治疗地中海贫血的I期临床试验也在进行中，正在招募患者。 到目前为止，还没有进行过任何与干细胞治疗相关的III期研究。主要关注点是iPSCs的安全性，存在致癌可能性：在注射iPSCs的小鼠中观察到畸胎瘤，低诱导效率，基因组的不完全重编程，免疫原性和载体基因组整合也是令人关注的问题。需要更多的努力用于临床应用。 合成生物学在组织工程中的应用。组织工程旨在修复受损组织并恢复其正常功能。合成生物学在组织工程中的应用可以控制细胞行为。人工遗传构件可以通过重新连接细胞信号来调节细胞功能。作为具有特殊属性的组织工程中的构建块，以实现更智能的功能，合成生物学允许复杂的组织工程用于新的医学研究。 通过过表达功能基因或转录因子，干细胞可以成功分化生成特定组织细胞。这是基于干细胞的组织工程中一种简单而常见的方法。然而，基因过表达缺乏反馈控制机制，以避免过量营养消耗或细胞毒性。例如，抗凋亡因子Bcl-2的持续过表达导致肿瘤形成风险。CRISPR/dCas9生物开关或合成mRNA被发现能够通过时间和空间特异性的基因表达来解决问题。此外，引入感应小分子或细胞表面蛋白的遗传电路已经得到了深入研究，特别是基于四环素抑制子的系统。Gersbach等人设计了一个四环素关闭系统来控制Runx2因子，可以调节体内的成骨过程。Yao等人使用了一个四环素开启系统，在工程化的大鼠软骨细胞中特异性表达Sox9，Sox9是维持软骨细胞活性的关键因子，激活软骨组织中II型胶原蛋白和聚合蛋白的蛋白表达。在植入的细胞支架中注射Dox（四环素系统诱导剂）后，软骨细胞降解被抑制。四环素开启系统也被用于在软骨修复过程中过度表达白细胞介素-1受体拮抗剂（IL-1Ra）基因，以调节炎症细胞因子（表2）。四环素开关有助于组织工程中的时间控制基因表达。 表2. 哺乳动物细胞基础治疗中的合成生物学 光遗传诱导系统也用于控制组织工程中的细胞行为。光诱导蛋白能够响应紫外线和远红外光，使光诱导成为可能。通过将光敏感基序融合到特性良好的转录因子中，构建了各种光遗传电路。成功地使用空间特异性基因激活来指导细胞的排列。Sakar等人使用蓝光诱导的通道视紫红质-2实现了组织的动态和区域特异性收缩。光遗传控制工程化的小鼠来源肌肉细胞提供了通过光敏感膜Na+通道和离子诱导的下游元素进行远程基因激活或沉默，用于组织工程。 受到CAR-T细胞成功的启发，G蛋白偶联受体（GPCRs）被工程化以感应人工配体，用于组织工程。Park等人成功设计并使用了GPCR感应氯氮平-N-氧化物（CNO）在原代细胞中控制细胞迁移，响应CNO浓度梯度。这项技术可以成为创伤愈合和细胞再生的宝贵模块。 合成生物学使得将细胞编程到多细胞结构以自组装方式成为可能。Toda等人使用synNotch方法在一群小鼠成纤维细胞中工程化细胞粘附信号，这些细胞根据synNotch受体类型变成了多层并极化。 除了细胞，生物材料在组织工程中也常用作支架和仿生器官。生物材料的自调节特性，响应刺激或化学物质，对基于生物材料的组织工程非常有用。Baraniak等人通过RheoSwitch配体1（RSL1）诱导的绿色荧光蛋白（GFP）报告基因工程化B16细胞系，RSL1涂覆在聚酯脲烷膜上，允许在膜上激活GFP长达300天。Deans等人在中国仓鼠卵巢（CHO）细胞中构建了一个异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导的Lac-off系统，IPTG被封装在聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）支架或PEG珠子中，并以可持续的方式释放。报告基因显示，在小鼠模型中，通过背部皮下植入，诱导持续了10天以上，GFP荧光水平被观察到受其位置的控制。空间诱导的基因表达调控已成为许多应用中的概念验证，如软骨修复和体内3D细胞支架。 总之，生物回路的表达可以为组织工程生成功能化的细胞。多种合成生物学设计，例如时间和空间依赖的基因表达、诱导和自调节系统以及智能生物材料，在这一领域都是可用的。尽管最先进的发展仍然存在许多障碍，将真正的合成组织真正地应用到临床，但至少为未来的研究奠定了一些基础。 2.2. 工程化细菌细胞在治疗应用中的作用 合成生物学方法促进了基因工程细菌作为新型活体治疗剂的开发（图2）。包含合成基因回路的细菌可以控制细菌治疗活动的时机、定位和剂量，感应特定的疾病生物标志物，从而开发出一种强大的新方法来对抗疾病。基于合成生物学的工程方法允许将活细菌细胞与独特的治疗功能编程，提供灵活性、可持续性和可预测性，为传统疗法提供新的设计和工具包。这里介绍了一些进展，包括能够感应和转导来自细胞内或细胞外生物标志物信号的基因回路的工程化细菌细胞，以及基于这些信号通路的治疗和诊断。基于细菌细胞的活体治疗和诊断的概念是快速增长的策略，为有效治疗各种人类疾病提供了希望。 工程化细菌细胞在癌症诊断和治疗中的应用。一些厌氧/兼性厌氧细菌细胞是肿瘤治疗的良好候选者。它们可以靶向肿瘤的厌氧微环境，它们还具有诱导肿瘤溶解和触发炎症的能力，有助于对抗实体瘤。工程化微生物可以成为癌症体内诊断的合适工具。Danino等人将含有LacZ报告基因的大肠杆菌工程化，当细菌与肿瘤细胞接触时，产生LacZ。随后，小鼠被注射了LacZ的化学发光底物（表3）。尿液中的发光在富含时呈现红色。该方法比显微镜更敏感，可以检测到小于1厘米的肿瘤。同样，Royo等人构建了一个由水杨酸诱导的回路，将5-氟胞苷转化为毒性产物，用于杀死肿瘤的减毒沙门氏菌。注射沙门氏菌后，沙门氏菌在肿瘤组织中定位，通过额外提供水杨酸（诱导剂）和5-氟胞苷（底物），肿瘤细胞通过细菌细胞形成5-氟尿嘧啶而被消除。 表3. 微生物基础疗法中的合成生物学 为了提高基于细菌的癌症治疗效果，一些研究旨在进一步提高细菌对肿瘤的趋向性。一些细菌对实体肿瘤的厌氧环境具有天然亲和力，如大肠杆菌或减毒的霍乱弧菌、鼠伤寒沙门氏菌和单核细胞增生李斯特菌。然而，这种亲和力对于靶向治疗来说还不够，体内的细菌细胞仍然普遍分散。通过引入合成表面粘附素，可以增强与肿瘤特异性分子（如新抗原）或其他在癌细胞中富集而不是在体细胞中积累的化学物质或蛋白质的结合。粘附素工程已被证明在增强细菌对肿瘤的反应方面是有效的。粘附素是具有细胞外免疫球蛋白结构域的膜展示蛋白，可以通过库定向进化筛选进行工程化。Piñero-Lambea等人在大肠杆菌中构建了一个构成型遗传回路，其中包含一个人工粘附素，靶向绿色荧光蛋白（GFP）作为概念验证的证据，证明了工程化细菌细胞膜与GFP表达的HeLa细胞的结合在体外和小鼠中都成功。重要的是，这种工程化细菌的静脉注射到小鼠体内，在HeLa细胞的异种移植实体瘤中实现了有效和高效的定植，剂量比表达不相关对照粘附素的细菌株或野生型菌株低100倍，表明类似的工程化细菌可以用来在低剂量和边际潜在系统基础毒性的情况下将治疗剂运送到肿瘤。然而，很少有针对肿瘤的细菌进入了临床阶段。兼性厌氧的鼠伤寒沙门氏菌VNP2000已经在临床前研究中进行了安全性工程化，并具有抗肿瘤能力，但在I期临床试验中失败了，因为其抗肿瘤效果边缘化和剂量依赖的副作用。一些其他基于细菌Clostridia novyi-NT或Bifidobacterium longum APS001F的临床研究正在进行或招募进行I期试验。 工程化细菌细胞在糖尿病诊断和治疗中的应用。细菌已被工程化以检测糖尿病的葡萄糖浓度。Courbet等人描述了一种在人类尿液样本中感应异常葡萄糖浓度的方法。他们将细菌传感器封装在水凝胶珠中，尿液中的葡萄糖将珠的颜色变为红色。体外细菌血糖仪发现，尿液试纸的检测限低了一个数量级。 一些蛋白质和肽在工程化肠道细菌中生物合成，用于糖尿病治疗。工程化益生菌L. gasseri ATCC 33323产生GLP-1蛋白，细菌口服给糖尿病大鼠，证明了血糖水平降低到33%。同样，工程化L. lactis FI5876被重建为在高葡萄糖浓度条件下生物合成并递送肠促胰岛素激素GLP-1以刺激β细胞分泌胰岛素。结果表明，高脂饮食小鼠的葡萄糖耐量得到改善。工程化益生菌L. paracasei ATCC 27092被设计为分泌血管紧张素（1-7）[Ang-(1-7)]，增加Ang-(1-7)（一种抗炎、血管舒张和血管生成肽类药品）的浓度，并减少了糖尿病小鼠视网膜和肾脏的副作用，因为口服细菌后胰岛素产量增加。按照设计，口服工程化B. longum HB15产生穿透素（一种具有增强胰岛素递送能力的细胞穿透肽），和GLP-1融合蛋白也增强了结肠中GLP-1的产生。L. paracasei BL23也成功设计为通过将GLP-1与肽聚糖锚蛋白PrtP融合，将单体GLP-1类似物展示在细菌膜上，工程化细菌增强了糖尿病大鼠的血糖控制。然而，效果仍然有限，需要进一步研究。除了GLP-1，一些其他蛋白质，如免疫调节细胞因子IL-10和人类胰岛素原，同时被引入到工程化L. lactis MG1363中，与低剂量系统性抗-CD3的联合治疗允许逆转非肥胖糖尿病小鼠中失调的自身免疫触发的糖尿病。这个设计可能对人类1型糖尿病的治疗有效。 工程化细菌细胞在胃肠道疾病的诊断和治疗中的应用。益生菌可用于治疗炎症性肠病（IBD）。IBD 是消化道组织慢性炎症，包括溃疡性结肠炎和克罗恩病。患者遭受腹泻、疼痛和体重减轻的折磨。合成生物学方法和理念帮助细菌获得了对抗胃肠道疾病更强大的能力。Praveschotinunt 等人设计了一种工程化的大肠杆菌 Nissle 1917（EcN），它能产生胞外纤维基质，增强肠道粘膜愈合能力，以缓解小鼠的 IBD。通过将卷曲蛋白（CsgA）与三叶因子（TFF）结构域融合，促进细胞表面重建，细菌能够通过修饰的卷曲蛋白的原位蛋白自组装产生纤维基质。结果表明，设计的 EcN 显著抑制了促炎细胞因子的产生，缓解了小鼠的体重减轻，维持了结肠长度，证明了其在葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的急性结肠炎小鼠模型中的抗炎能力。该设计可扩展为基于益生菌的 IBD 治疗的通用方法。 细菌工程化后可望直接消除病原体，预防消化道传染病。铜绿假单胞菌是一种常见的多重耐药病原体，难以治疗。工程化的 EcN 已被用于检测、预防和治疗 P. aeruginosa 引起的肠道感染。设计的 EcN 能够感应 P. aeruginosa 产生的生物标志物 N-酰基高丝氨酸内酯，并且自溶释放生物膜降解酶分散素和 pyocin S5 细菌素，以消除肠道中的病原体。此外，重新编程的细菌显示出长达 15 天的预防 P. aeruginosa 的能力，并且在小鼠模型中比治疗已建立的感染更有用。3-羟基丁酸（3HB）是具有治疗结肠炎效果的人类酮体成分。Yan 等人构建了一个过表达 3HB 生物合成途径的 EcN。与野生型 EcN 相比，工程化大肠杆菌在小鼠体重、结肠长度、潜血水平、肠道组织髓过氧化物酶活性和促炎细胞因子浓度方面显示出更好的效果。然而，这些研究是小鼠中的初步结果，尚未进入临床试验。需要进一步努力以评估它们在人类中的应用。 工程化细菌细胞在代谢紊乱中的应用。工程化肠道微生物也已被用于针对代谢紊乱。设计了大肠杆菌来治疗肥胖，在高脂饮食的小鼠中合成厌食脂质前体。一些努力通过活细菌降解在患者中积累的有毒化合物。Kurtz 等人设计了大肠杆菌 Nissle 1917 菌株，在肠道中将氨转化为 L-精氨酸，减少系统性高血氨症，在小鼠和猴子模型中。Isabella 等人重新编程大肠杆菌 Nissle 1917 以过表达苯丙氨酸降解途径，以代谢苯丙酮尿症（PKU）患者中过量的苯丙氨酸。在 Pahenu2/enu2 PKU 小鼠模型中，口服工程化细菌显著降低了血液中苯丙氨酸浓度 38%。 酒精性肝病是肝病的主要原因，普遍危及重度饮酒者的健康。工程化的枯草杆菌和乳杆菌可用于表达乙醇降解途径（酒精脱氢酶和乙醛脱氢酶），以解毒酒精并减轻酒精过量摄入引起的肝损伤。此外，在慢性饮酒期间，胃肠道中的凝集素再生胰岛衍生 3 γ（REG3G）蛋白减少。乳杆菌 reuteri 被设计为过表达白细胞介素-22（IL-22）基因，这增加了肠道中 REG3G 的丰度，减少了使用酒精性肝病小鼠模型的炎症和肝损伤。 合成生物学方法已允许构建和设计工程化活体生物治疗剂。许多案例针对未来的临床应用。这里讨论的示例表明，随着电路设计和微生物宿主理解的发展，研究人员可以构建活体生物治疗剂，以精确、系统、可诱导和稳健的方式发挥作用。然而，仍需付出许多努力以降低细菌毒性并增加体内可控性。 3. 合成生物学在新兴治疗材料的制造中 除了工程化细胞外，工程化纳米材料也在医疗领域中得到广泛应用。纳米生物技术旨在解决重要的生物学问题，如基于其独特的物理、化学和生物学性质的微纳尺度材料的药物递送、疾病诊断和治疗（图4）。纳米材料具有独特的机械、磁性和电子性质，能够响应外部信号，控制其下游电路。然而，传统的纳米材料是通过物理和化学过程产生的，溶剂和修饰分子经常引起生物安全问题。最近，生物纳米材料在合成生物学的指导下得到了发展，展现出其在环保、增强生物相容性和生物活性以及低组织毒性方面的优势。基于合成生物学的概念和方法，基因工程细菌、酵母和烟草花叶病毒（TMV）可以作为纳米材料的生物工厂。哺乳动物细胞衍生的囊泡和纳米颗粒具有适宜的生物相容性，也常用作纳米药物。生物材料可以在合成生物学的帮助下进行构建和工程化，扩大其在现代疾病治疗中的应用场景。 图4 合成材料生物学中的设计与应用。通常，构建一个遗传电路来合成生物材料或感应环境。工程化细菌被赋予了新的特性，如颜色变化和独特的表面特性。具有细胞外基质的细胞应用多样，包括磁场诱导治疗、新型药物载体的开发或通过复杂的生物制造过程进行健康监测。 3.1.合成生物学在人工细胞器中的应用 遵循合成生物学的原则，生物催化或触发感应模块的纳米颗粒可以被加工成自组装细胞器，这些细胞器模仿活细胞的特征，如酶反应的分隔和刺激响应（图4）。这种设计还为构建人工细胞提供了新的输入。此外，人工细胞器与工程化活细胞载体的结合，包括CAR-T细胞和工程化细菌，纳米活体混合系统可以发挥其双重效应，以增强治疗效果或更严格地控制人工系统。 聚合物体是由两亲性聚合物制成的人工空心囊泡，用作人工细胞器的外壳。van Oppen等人使用了一个聚合物体系统，其外膜上锚定了细胞穿透肽。人工细胞器内部含有过氧化氢酶，允许降解外部活性氧分子，作为合成细胞器，保护细胞免受H2O2触发的活性氧损伤，这在人原代成纤维细胞和人胚肾细胞中显示出摄取能力。一个类似的设计依赖于聚合物体配备了两种酶和相关的跨膜通道，被用来模拟细胞过氧化物酶体。这些细胞器能够处理H2O2和超氧自由基。结果进一步证明了具有过氧化氢酶活性的人工细胞器的可行性。基于类似的想法，工程化聚合物体可能在治疗帕金森病、阿尔茨海默病、亨廷顿病、代谢疾病、癌症和无过氧化氢酶症等医疗状况中发挥作用，通过在人工细胞器内装载各种治疗蛋白。 此外，纳米生物技术和合成生物学的融合可能实现新功能。首先，研究人员可以通过遵循“封闭”原则组装纳米颗粒来创造“人工生命”。这个想法可以应用于使用无机支架和纳米颗粒内部的核酸和蛋白质构建生物组件。“自上而下”的原则，或为实际需求工程化自然细胞，可以作为使用纳米材料在活细胞中的指导，以增加特定医疗应用中的稳健性、稳定性和灵敏度。 3.2.构建纳米颗粒介导的遗传电路 通过内部环境刺激实现自动响应，可以诱导遗传开关开启/关闭（图4）。然而，遗传开关的不可逆情况是一个常见且难以解决的问题。为了规避遗传结构的弱点，纳米颗粒被用来感知体内信号并进行转导。光、声、热和磁刺激对纳米颗粒来说容易响应，它们可以用作实体肿瘤和糖尿病治疗的诱导系统。然而，物理刺激的空间特异性诱导很难实现。总体而言，通过结合遗传传感器和纳米颗粒的优势，通过引入纳米颗粒进行信号转导，将物理刺激转换为具有特定输入信号的遗传开关是可行的，并且通过这种方式实现了基因表达的时间空间控制。 近红外（NIR）光响应基因电路对于体内治疗应用是可行的，因为它们更好的NIR光传输能够穿透组织并降低毒性。NIR感应蛋白在植物和细菌中被发现，如细菌光敏色素（BphPs）。然而，NIR感应蛋白通常亮度较低。此外，缺乏结构信息阻碍了它们的合理工程化。为了规避NIR光响应蛋白的缺点，研究人员使用纳米材料将NIR光转换为可见光。例如，Chen等人使用掺杂了镧系元素的纳米颗粒将980 nm NIR光转换为可见光，控制小鼠模型中表达光敏蛋白的神经元的遗传门。另一种设计使用等离子金纳米棒或光热响应纳米颗粒将NIR光转换为温度上调，然后热休克蛋白的启动子被激活以进行下游基因表达。纳米颗粒的一个缺点是它们必须注入人体，这可以通过开发基因工程化纳米颗粒来解决。类似于磁遗传学，生物合成的铁蛋白可以用作准备外源顺磁性纳米颗粒的工具。然而，这些样品的穿透深度需要大大改进（不到1厘米），这不足以满足人类细胞治疗应用的需求。一些研究人员将光产生微设备与光敏感工程治疗细胞配对来解决这个问题（图4），患者可以通过自己的智能手机应用程序控制药物释放或实时监测他们的健康状况。此外，一些遗传编码的发光模块可以在现场产生光，使用各种荧光素酶等蛋白质，所有这些都在相应的底物下发出所需的波长。体内光诱导光敏感蛋白触发定制需求的转基因表达。 除了光遗传学，磁遗传学也出现了，用于调节细胞活动，并已应用于远程和非侵入性控制纳米材料治疗（图4）。磁场可以穿透人体而无损失，这是深层组织靶向治疗的首选特征。以前的磁遗传学工具主要是外部注射的磁性纳米颗粒。纳米颗粒通常半径小于10纳米，无毒且水溶性。使用远程磁场加热纳米颗粒可以激活细胞中的温度敏感阳离子通道。下一代工具是在工程化细胞中异源表达受体靶向铁蛋白蛋白，以纳米颗粒（铁载颗粒）的形式，这些可以感应并转导磁性信号到细胞膜锚定受体，如瞬时受体电位通道1（TRPV1）或TRPV4。膜受体是允许钙离子流入的离子通道，具有磁刺激。所述基因电路可以被操纵以控制NFAT依赖的转录调节因子，用于下游功能基因。植入的工程治疗细胞可以在磁场下实现目标特异性治疗和精确控制治疗剂量、时间和位置。 然而，磁性激活传感器通道的机制仍然不清楚，长期以来提出的理论一直存在争议。TRPV通道被各种信号激活，包括但不限于机械力和热量。最近，提出了一种新机制来解决射频弱磁场（1 mT）如何触发带有铁蛋白锚定的TRPV通道的活细胞中的瞬态响应的问题。机制是铁蛋白蛋白中游离Fe3+的解离，导致通过增加活性氧（ROS）的产生来增强膜脂的氧化。这些氧化脂质有能力激活TRPV通道，导致钙离子内流。最近，ROS被报道参与了在2型糖尿病小鼠中结合电场和静态磁场治疗的研究，以增加它们的胰岛素敏感性。在这项研究中，低能场可以诱导表达核因子红细胞2相关因子2（Nrf2），这是一种控制ROS水平的转录调节因子。此外，局部ROS积累在小鼠中没有副作用，通过电磁场介导的氧化还原状态诱导基因表达是有希望的。磁遗传学在远程控制和靶向治疗方面展现出潜力。然而，需要更多的努力来建立磁遗传平台。尽管近年来有所改进，细胞毒性和生物相容性是磁性纳米颗粒的两个主要障碍，仍然挑战它们在体内的应用。 3.3.合成生物学在药物递送中的应用 合成生物学构建物通常被封装在载体中，以实现其在体内的功能。病毒载体的安全性问题限制了它们在编辑人类基因组中的应用。因此，非病毒载体越来越受到关注。纳米技术可以帮助递送治疗剂，包括遗传电路和基因组工程工具。随着纳米技术的进步，有更多的选择可用于DNA/RNA递送系统的靶向和可控释放。 其中一个例子，基于脂质体纳米材料的DNA/RNA递送系统，已成为一种有效且有潜力的基因疗法方法，有多种人工脂质载体被批准用于临床用途。例如，由Alnylam Pharmaceuticals开发的RNAi治疗剂Onpattro。该药物于2018年获得批准，用于治疗多发性神经病。脂质体是小的脂质囊泡，大小在50纳米和1微米之间。脂质体通常是两亲性的，由疏水尾部和亲水头部组成，用于在各种治疗中递送药物。由于脂质体降低药物毒性，通过特异性注射直接将药物递送到目标，并通过封装药物免受降解，它们在递送方面比传统药物治疗具有优势。CRISPR/Cas9辅助的基因疗法通常使用基于脂质的纳米颗粒，通过静电相互作用将带负电荷的mRNA、gRNA支架和CRISPR基因与带正电荷的脂质体整合。Felgner等人首次设计并使用脂质体，通过将DNA封装并递送到质膜中的目标哺乳动物细胞，导致其内吞后DNA表达。脂质体载体不仅帮助治疗DNA通过细胞膜屏障，而且保护它们免受DNase降解和免疫反应，以维持它们的活性。部分受到脂质体可以应用于人类治疗的启发，脂质体还作为疫苗将编码SARS-CoV-2抗原的mRNA递送到人类。Moderna mRNA-1273和BioNTech/Pfizer BNT162b2疫苗都被封装在脂质体中，并获得了它们的临床使用批准。 纳米技术也可以帮助合成生物学递送化学物质。纳米载体递送化学物质最小化了非靶向效应，与传统药物递送相比，增强了治疗效果。外部物理刺激也可以启动化学物质的释放，使系统可持续和可控。这里，我们讨论合成生物学引导的生物化学载体的应用。 遗传编码的翻译后修饰蛋白可以自组装携带疏水药物。具有不同结构和材料性质的蛋白质可以在氨基酸序列水平上轻松操纵。基于合成生物学方法，Mozhdehi等人设计并共表达了大肠杆菌中的弹性蛋白样多肽和N-肉豆蔻酰转移酶。 N-肉豆蔻酰转移酶酶在细菌中修饰多肽，生成肉豆蔻基团，产生温度诱导的自组装行为。纯化的重组蛋白的脂质核心可以携带疏水化合物，延长药物半衰期。该蛋白可以形成复杂的组装系统，包裹化学物质。Li等人使用设计好的阳离子嵌合体近红外荧光蛋白和阴离子羧基末端PEG，准备蛋白质-PEG纳米载体。纳米蛋白是两亲性的，导致在水溶液中聚集和相分离形成纳米颗粒。工程化纳米颗粒实现了体内实体肿瘤和转移的成像，无需转染即可利用蛋白质的荧光特性，同时，纳米蛋白作为长期药物载体，可以显著提高IL1-Ra的半衰期和治疗效果。 3.4.工程化细菌外膜囊泡（OMVs）作为纳米载体 细菌外膜囊泡（OMVs）是来自革兰氏阴性细菌外膜的脂质球，它们可以用于将生化物质运输到环境中的其他细胞。合成生物学的基因操作方法可以提高生物起源纳米颗粒的能力，扩大外膜囊泡（OMV）和工程化细胞的应用场景。 带有重组蛋白的工程化OMVs潜在地用于医疗和临床领域（图4）。在OMV工程中表面展示蛋白的一般策略是在OMV表达系统中将它们的基因融合在一起。许多研究已经使用大肠杆菌溶素A（ClyA）蛋白作为融合载体，将外源蛋白锚定到OMV膜上。最近的研究表明，ClyA已成功融合到炭疽杆菌保护性抗原的域4、流感A病毒基质蛋白2（M2）的细胞外域以及GFP上，而不影响OMV形成。另一种策略是将蛋白表达到周质中，并在融合步骤妨碍蛋白功能时组装到OMV中。然而，异源蛋白被包裹在OMV内部，这是策略的主要缺点。 Bartolini等人还使用该方法将沙眼衣原体蛋白HtrA携带在OMVs中，作为针对沙眼衣原体感染的疫苗。一些链球菌蛋白使用大肠杆菌OmpA信号肽表达到周质中，并将它们打包到OMVs中。即使这些蛋白位于OMV内部，它们也能够激活免疫反应，在小鼠模型中产生的IgG抗体对特定病原体具有很强的活性。结果表明，抗原位置不是OMV诱导的免疫反应的决定性因素。 除了蛋白质，OMVs可以被工程化以携带化学物质。LPS和装饰在病原体细胞膜上的荚膜多糖（CPS）也是疫苗候选物。然而，多糖除了T细胞外还能触发免疫反应，无法建立免疫记忆。为了规避这个问题，将多糖锚定到纳米载体上以引发免疫记忆。多糖和荚膜合成基因在大肠杆菌中表达，使用上述方法打包到OMVs中。设计的OMVs经过进一步优化后，可用作疫苗。Chen等人使用了弗朗西斯杆菌O-抗原多糖，基因在大肠杆菌中异源表达，产生糖基化修饰的OMVs。注射工程化OMVs的小鼠对弗朗西斯杆菌菌株具有保护作用。另一个类似的设计使用肺炎链球菌CPS（Sp-CPS）生物合成基因。它们在大肠杆菌中过表达，位于工程化OMVs和细菌细胞的膜上。注射这些收集的OMVs进行疫苗接种后，疫苗在吞噬作用测定中有效，并且针对Sp-CPS触发了IgG抗体。总的来说，合成生物学方法已经开发了更好的工程化OMVs用于免疫疗法，在药物靶向递送和联合治疗方面前景光明。 3.5.生物模拟医用粘合材料 传统的医用粘合材料在水下使用受到限制，这限制了它们在体液中的应用。最近，基于合成生物学理念，进行了一些生物模拟设计来解决这个问题（图4）。许多海洋生物（例如贻贝和藤壶）具有非凡的粘附能力，能够粘附在岩石表面， 这是因为它们产生L-3,4-二羟基苯丙氨酸（DOPA），作为水下表面粘附蛋白的重要组成部分。Zhong等人报道了通过融合CsgA菌毛蛋白和贻贝足蛋白制造出一种强大的水下粘合剂。这种出色的设计结合了生物相容性和粘附活性，有希望用于体内应用，如组织修复。Zhang等人受到骨骼和贻贝足等天然生物材料的启发，他们开发了一种基于Bacillus spp.胞外基质的活性胶。这种活材料具有粘附性和再生能力。工程化哺乳动物细胞可以构建具有粘附蛋白，作为体内活功能胶。如上所述，新型活医用生物医学粘合剂是医学合成生物学的热点。然而，大多数研究集中在材料属性上，而不是它们的生物相容性和生物可降解性，需要充分的努力来推动材料用于临床应用。 3.6.医学应用中的基因编码点击化学 受点击化学启发，为建立蛋白质-蛋白质链接，工程化了异肽键。与传统点击化学相比，基因编码点击化学在活体生物中更适用。SpyTag/SpyCatcher系统是革兰氏阳性菌毛中天然类似点击反应的应用，使用生物学方法在氨基酸之间形成稳定的化学键，在点击化学导向的蛋白质中不需要额外修饰生物大分子（图4）。基因编码点击化学（或Spy化学）是通过合成生物学制造材料的强大工具。 水凝胶是交联的亲水聚合物网络，由于其生物相容性和类似细胞外基质（ECM）的属性，作为生物大分子和干细胞的载体。通过化学聚合合成的水凝胶材料面临生物活性问题。蛋白质特性由氨基酸序列决定。蛋白质水凝胶更容易使用不同的DNA序列进行合成和控制。Yang等人利用SpyTag/SpyCatcher系统合成了一种四臂星状光敏蛋白。该蛋白质可以分别响应AdoB12和光迅速形成溶胶-凝胶和凝胶-溶胶相变。生物膜降解糖苷水解酶PslG可以封装到水凝胶中，赋予材料对抗慢性感染中多重耐药细菌的能力。Sun等人设计了一个含有多个SpyTags和SpyCatchers的Spy网络，包含在弹性蛋白和白血病抑制因子中。这些蛋白质变成了一种高强度水凝胶，允许小鼠胚胎干细胞在不添加其他细胞因子的情况下保持多能性。 基因编码点击化学也在疫苗开发中使用。一些设计蛋白可以自组装成类似病毒颗粒（VLPs），以在表面展示抗原，模仿病原体。合成疫苗因其效率和安全性而越来越受到关注，与传统的死菌或减毒微生物疫苗相比。基因编码点击化学是修改表面以增强免疫原性的有用方法。基于Spy化学的化学键容易形成，为设计合成疫苗提供了定制和方便的方法，通过编码蛋白自组装。Liu等人使用SpyCatcher/SpyTag化学通过共价连接特定抗原和化学物质开发了一种合成疫苗。结果表明，这种工程化疫苗成功地靶向了树突状细胞。产生的蛋白质-化学混合疫苗保持了各自的功能，并具有触发B细胞和T细胞反应的能力。Brune等人通过在材料表面展示SpyCatcher，进一步使VLPs与SpyTag表达的疟疾抗原结合，开发了新的疫苗。VLP-抗原疫苗可以通过仅一次免疫迅速有效地触发免疫反应，表明这种有效、简单、模块化的修改方法的潜力。 3.7.医学和制药应用中的遗传密码扩展 一种蛋白质通常由20种天然氨基酸组成。为了将非典型氨基酸（ncAAs）添加到蛋白质中，已经开发了遗传密码扩展技术。ncAAs可以通过与肽或化学物质的结合来修饰蛋白质，根据实际需求。使用终止密码子（UAG/UGA/UAA），异源生物正交氨酰-tRNA合成酶（aaRS）-tRNA对可以将ncAAs添加到蛋白质的任何位点。已经开发了许多不同的aaRS/tRNA对。高效的遗传密码扩展装置允许生产含有ncAA的蛋白质和多个插入ncAA的蛋白质。ncAA插入在所有主要模型生物中都已成功。遗传密码扩展系统在医学领域的应用在这里总结。 遗传密码扩展用于抗体-药物偶联物。抗体-药物偶联物（ADC）结合了抗体的抗原识别能力和化学物质的肿瘤杀伤能力，通常用于肿瘤治疗。传统的ADC药物是抗体中半胱氨酸或赖氨酸的化学修饰，这可能会影响免疫原性、稳定性和半衰期。随着遗传密码扩展技术的发展，抗体中引入功能性ncAA是可行的。抗体和化学物质之间的位点特异性、高效共轭是可以实现的。Oller-Salvia等人开发了一种新的遗传密码扩展系统，将赖氨酸的环丙烯衍生物并入抗体中。抗体通过快速Diels-Alder反应与单甲基auristatin E (MMAE)偶联。得到的ADC在血清中稳定有效。Wang等人使用遗传密码扩展方法将Lck抑制剂dasatinib偶联到单克隆抗体CXCR4上。ADC避免了化学修饰过程中的副反应。得到的dasatinib-抗体偶联物以低EC50抑制T细胞激活，对细胞活性影响可忽略不计。 遗传密码扩展在双特异性抗体中的应用。双特异性抗体（BsAb）具有两个特定的抗原结合位点，具有增强的杀伤肿瘤能力。一些BsAb已经获得FDA的批准。传统的BsAb生产方法依赖于蛋白质的融合，导致配体结合域的立体位阻。此外，抗体的产量低，半衰期短。通过化学修饰合成BsAb会遇到与ADC生产类似的问题。遗传密码扩展方法可以通过PEG链接剂将两个抗体偶联起来，以规避这些挑战。Kim等人在抗HER2和抗CD3抗体的抗原结合片段Fab区域引入了一个非典型氨基酸（pAcF），通过两步反应形成BsAb。BsAb在皮摩尔浓度下诱导体外效应细胞介导的细胞毒性。利用含四嗪的非典型氨基酸和含双环庚炔的非典型氨基酸之间的Diels-Alder反应，开发了一种靶向BCMA的BsAb，用于治疗多发性骨髓瘤，成功克服了多发性骨髓瘤患者的耐药性。 遗传密码扩展用于工程化腺相关病毒（AAV）。AAV是人类和灵长类动物的小病毒。AAV通常用于基因治疗，以实现非致病性、宿主范围广和高转染及表达效率。然而，它们的可控性和靶向能力有限，限制了它们的应用。Zhang等人使用遗传密码扩展技术增强了AAV的靶向能力，将环状精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（cRGD）偶联到AAV的壳蛋白上，以靶向整合素。Erickson等人工程化AAV以实现感染的光控制。AAV2的vp1蛋白中的R585和R588残基被替换为光敏感的非典型氨基酸，这阻碍了vp1和HSPG蛋白的相互作用，从而抑制了AAV的感染。暴露于UV光会移除光敏基团，恢复AAV的感染能力。该方法提高了AAV载体的时间空间可控性。 遗传密码扩展用于延长蛋白质半衰期。PEG通常用于延长治疗蛋白的半衰期。然而，随机修饰的PEG通常会影响治疗剂的结合位点。因此，遗传密码扩展在修饰蛋白质方面可能具有优势。Cho等人使用遗传密码扩展在人类生长激素中位点特异性地修饰PEG，这种激素在临床应用中非常不稳定。修饰后的生长激素在生产过程中也具有良好的批次重复性。一些非典型氨基酸本身可以增加蛋白质的稳定性。Xuan等人证明将反应性异硫氰酸酯基团并入蛋白质可以提高肌红蛋白的热稳定性。类似地，使用长链含硫或氟化非典型氨基酸的设计也得到了验证。 遗传密码扩展用于开发新型疫苗。非典型氨基酸为潜在的疫苗候选物提供了广泛的抗原修饰。Gauba等人在小鼠TNF-α蛋白中插入含有硝基苯基的非典型氨基酸，即使有佐剂也能引起强烈的抗体反应。含有非典型氨基酸的基因修饰生物（GMO）对疫苗开发很有用。灭活或减毒病原体基疫苗通常效果降低。构建依赖非典型氨基酸存活的GMO菌株以放大活病毒疫苗。通过在流感A病毒、HIV-1或乙型肝炎病毒的基因组中引入终止密码子，病毒只能在具有特定aaRS/tRNA对和非典型氨基酸的工程细胞中复制。Si等人在流感A病毒的NP蛋白中插入了终止密码子，导致更强的免疫原性并触发更广泛的免疫反应。基于相同理念，越来越多的活细菌疫苗正在开发中。然而，与病毒相比，细菌更为复杂。许多突变机制可以帮助细菌逃脱表达终止。终止逃逸限制了遗传密码扩展在细菌中的进一步应用。Mandell等人构建了一种细菌，代谢上依赖于非典型氨基酸生存。这种细菌表现出前所未有的抗进化逃逸能力，为活细菌疫苗的开发提供了线索。 遗传密码扩展的其他医学应用。遗传密码扩展技术可以应用于构建可控的CAR-T细胞。将p-叠氮苯丙氨酸（pAzF）并入Fab中，允许识别和偶联荧光素异硫氰酸酯（FITC），激活抗体进行癌症治疗。将诱导剂FITC改为短肽在癌症治疗中也证明是可行的。FITC或肽被用作CAR-T细胞的诱导剂，为免疫疗法提供了更安全控制的方法。遗传密码扩展也已应用于肽类天然产物的生物合成。Nisin是一种具有广泛抗细菌活性的复杂兰肽。Zambaldo等人将多种非典型氨基酸引入nisin中，赋予其新的大环拓扑结构和增强的活性。 遗传密码扩展方法正在快速发展，体内和位点特异性地修饰蛋白质。这种方法最复杂的生物是斑马鱼和小鼠。该方法应该改进，以应用于更多的高等物种。尽管已有200多种不同的非典型氨基酸用于遗传密码扩展，但大多数非典型氨基酸基于相似的结构单元。丰富结构类型是发展的另一个方向。未来，遗传密码扩展技术将为人类带来更多精细的治疗方法。 4.合成生物学在治疗药物的生物合成中 近年来，合成生物学方法在药物的可持续和成本效益生产中展现出前景。合成生物学设计（图5）构建了包括细菌、酵母、细胞培养或整个植物在内的生物电路或底盘，用于有效生产高附加值的制药产品或制药中间体。它提供了一种可扩展且可持续的生产生物产品的方式，使用基于CO2的基质，生产过程快速且稳健，适用于大规模工业生产，可以在不过度种植和收获药用植物的情况下生产生物产品（表1）。 表1. 生物合成药物的应用和产量 作为合成生物学的一个经典领域，药物合成与其他医疗应用不同。它通常使用酵母或细菌作为生产底盘。合成生物学概念在微生物中得到广泛应用，特别是DBTL（设计-构建-测试-学习）（图5）。DBTL循环包括最初的分子生物学设计和构建，实验结果为新的设计周期提供基础。单细胞系统比哺乳动物细胞更容易操作，在哺乳动物系统中，DBTL周期可能很长，这也是哺乳动物合成生物学的障碍之一。在药物的微生物合成中，高通量筛选和定向进化常用于加速实验步伐。微生物中的合成生物学在某种意义上指向了哺乳动物合成生物学的发展方向。 图5 合成生物学中常用的技术。为了推动细胞工厂构建的设计-构建-测试-学习循环，已经开发了各种合成生物学方法和工具，这些技术正在改革合成生物学在医学应用中的使用。路径设计是第一步，通过构建的遗传电路获得初步结果。在下一轮测试之前需要进行一些优化，并且从初步数据中更好地理解系统的特性。设计-构建-测试-学习循环是提高合成生物学系统稳健性和有效性的迭代过程。 4.1.萜类药物的生物合成 萜类化合物是5碳化合物异戊二烯衍生物，也是植物次级代谢产物中最大的一类，约占已鉴定天然产物的60%。它们中的许多是具有生物活性的医疗成分。抗疟药青蒿素是一种含有内过氧化物桥的倍半萜内酯。最初，青蒿素从植物青蒿中提取，含量非常低（0.01%-1%），远低于实际医疗需求。通过化学途径合成青蒿素是困难且效率低下的，主要是由于该分子的多个手性中心。微生物合成青蒿素前药降低了药物成本。合成 amorpha-4,11-diene 是合成生物学中的一个里程碑。最初重组大肠杆菌合成的量仅为24µg caryophyllene equivalent/ml。9经过持续优化，另一种青蒿素前药，即青蒿酸，通过工程化酵母生产，产量达到了25 g/L。青蒿酸的生物合成是合成生物学成功的一个例子。 紫杉醇是一种从太平洋紫杉树中提取的二萜，用作抗癌剂。其生产主要依赖于费力且效率低下的植物细胞培养。Ajikumar等人通过工程化大肠杆菌细胞生产紫杉醇前体taxadiene，产量为1 g/L。人参皂苷是存在于人参属植物中的三萜皂苷，具有预防癌症和抗衰老作用。利用酵母细胞工厂，合成了包括人参皂苷Rh2和人参皂苷化合物K在内的各种人参皂苷，产量分别为2.2 g/L和5.0 g/L。微生物方法减少了人参皂苷用于临床的短缺。 4.2.生物碱类药物的生物合成 生物碱是一类至少含有一个氮原子的有机化合物。作为天然产物，生物碱通常因其具有药理活性而被使用。生物碱的生物合成绕过了种植某些植物（如罂粟和大麻）的禁令。在生物合成过程中形成的手性中心也使大多数手性生物碱化合物的化学合成相形见绌。Galanie等人利用工程化酵母细胞生产thebaine和hydrocodone。过表达21个基因（用于thebaine）或23个基因（用于hydrocodone）导致它们的产量分别为6.6 × 10^−5 g/L和3 × 10^−7 g/L。Nakagawa等人改进了使用大肠杆菌底盘的过程。324thebaine和hydrocodone的产量分别提高到2.1 × 10^−3和4 × 10^−5 g/L。阿片类药物的生产达到了毫克级。需要进行后续的代谢工程以促进生物合成的阿片类药物满足市场需求。 类似青蒿酸的生物合成，大麻素是大麻中的天然产物，通常用于止痛和抗焦虑作用。(S)-四氢棕榈酸和cannabigerolic acid是两种难以从植物中提取的著名大麻素。Luo等人建立了cannabigerolic acid的生物合成过程。酵母的产量达到了0.1 g/L。Hafner等人通过酵母生物合成的(S)-四氢棕榈酸达到了3.6 × 10^−6 g/L，这是微生物生产复杂大麻素的成功概念验证。 4.3.氨基酸衍生药物的生物合成 氨基酸衍生物使用氨基酸作为构建块，在人类健康中也扮演着重要角色。这类化合物通常通过生物途径而不是化学合成进行合成，因为它们具有多个手性部分。与生物碱和萜类化合物相比，氨基酸衍生物结构更简单，但多样性更大。Psilocybin是L-色氨酸衍生物，具有抗药物成瘾、缓解抑郁和抗创伤后应激障碍的作用。大肠杆菌或酿酒酵母已被工程化以异源表达合成途径，分别形成1.2 g/L和0.6 g/L的psilocybin。Dencichine，也称为β-N-草酰基-L-α,β-二氨基丙酸（β-ODAP），是从蚕豆种子中首次分离出的植物代谢物。Dencichine可以在人体血液中诱导血小板聚集，是中药云南白药的主要成分。作者优化了大肠杆菌中的代谢通量，使dencichine的产量达到了最终滴度1.29 g L−1和产量0.28 g g−1甘油。微生物生产dencichine是利用人工酶和途径在合成生物学应用中生产所需化学物质的一个例子。 4.4.不对称合成的生物催化 合成生物学可以协助多个手性中心化学发展。Sitagliptin（Januvia）是一种常用的糖尿病治疗药物，通过竞争性方式抑制DPP-4酶，减少GLP-1的裂解，增加胰岛素的分泌。到2021年，Januvia市场达到了14亿美元。对于sitagliptin的化学合成，手性胺通过基于铑的手性催化剂转移，立体选择性低，产品被铑污染。利用转氨酶和基于同源建模和饱和突变的合成生物学工程方法，开发了一种显著提高sitagliptin合成效率和纯度的过程。 5.无细胞合成生物学在医学应用中 迄今为止，合成生物学的努力主要集中在重新编程生物体、开发遗传电路和生物模块上。然而，由于我们对生命运作方式的了解有限，生物体的复杂性阻碍了合成生物学的进展。用户定义的系统可以解决这个问题。无细胞系统是准备好的，在没有活细胞的情况下执行体外生物活动（例如转录和翻译）。由于它是开放的、易于控制、灵活的，并且对细胞毒性具有高耐受性，该系统已被用于合成难以表达或在细胞中有毒的蛋白质（图6）。此外，无细胞系统非常适合高通量筛选。最近，随着无细胞生物传感诊断的发展和冻干技术的进步，无细胞合成生物学的应用已经扩展到医学和制药领域。 图6 无细胞合成生物学的特点。这张图总结了无细胞系统的类型、优势、产品和瓶颈。通常，无细胞系统用于生产药物或作为体外传感器。主要优势是方便、灵活和对细胞毒性的高耐受性。在解决了高成本和不稳定等问题之后，该系统在实际医疗应用中具有前景。 5.1.无细胞合成生物学在药物蛋白合成中 蛋白质和肽类药物大多数具有目标特异性，具有高活性和低毒性，适用于医疗用途。许多知名药物是蛋白质或肽，如曲妥珠单抗（赫赛汀）、阿达木单抗（修美乐）、甘精胰岛素（来得时）和13价肺炎球菌结合疫苗（PCV13）。70%的蛋白质药物是使用CHO细胞生产的。然而，有些蛋白质对细胞宿主的生长是有毒的。无细胞蛋白质合成（CFPS）为毒性问题提供了解决方案。此外，CFPS系统中的细胞内蛋白质筛选是可行的，而且冻干技术允许无细胞系统在一年保存后仍保持高度活性。 基于细胞裂解物和纯化组分系统的CFPS系统是两种常用的CFPS系统。理论上，任何生物体都可以作为基于细胞裂解物系统的来源。最常见的细胞提取物来自大肠杆菌、小麦胚芽和酵母。大肠杆菌裂解物通常用于蛋白质合成，小麦胚芽裂解物用于构建蛋白质阵列，酵母裂解物用于合成糖蛋白。纯化组分系统包括所有纯化的翻译元素。Shimizu等人使用36种与转录/翻译相关的酶和高度纯化的核糖体开发了一种无细胞系统。该系统虽然最小化，但效率很高。然而，纯化组分的高成本限制了其应用。基于细胞裂解物的系统是CFPS系统的首选。 疫苗接种是预防大流行最有效的方法。无细胞系统为快速生产疫苗提供了平台。Kanter等人开发了一种无细胞系统，高效生产一种由单链Fv抗体片段（scFv）连接到粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）的融合蛋白，这是一种B细胞淋巴瘤疫苗。Lu等人描述了一种CFPS，过度表达大流行H1N1流感病毒的一个域，用于潜在的广泛保护性流感疫苗。除了细菌系统，真核无细胞系统可以表达复杂的疫苗。Tsuboi等人在基于酵母裂解物的无细胞系统中成功表达了三种疟疾蛋白，这在重组细胞中很难生产。 抗体对于疾病治疗和诊断很重要。CFPS通常用于抗体的合成。Ryabova等人在基于大肠杆菌裂解物的无细胞系统中成功生产了功能性scFv片段。翻译后修饰（PTM）是蛋白质的最终成熟步骤。糖基化是PTM的主要形式，对于维持蛋白质药物的半衰期和活性很重要，包括一些抗体。CFPS也可以向蛋白质引入功能性PTM。Jaroentomeechai等人使用CFPS在大肠杆菌无细胞系统中合成N-糖基化scFv。总的来说，无细胞系统是有用的补充，用于重组表达系统，因为它们快速且按需。 5.2.无细胞合成生物学用于诊断 通常，病原体的检测基于生物传感器。传感元件包括酶、转录因子、抗体、细胞器、全细胞和组织。尽管许多生物传感器快速且敏感，但缺点包括酶的不稳定性、全细胞生物传感器的生物安全性问题以及微流控传感器制备的复杂性。因此，开发了无细胞传感器。Pellinen等人使用荧光素酶作为报告基因，Tet阻遏蛋白和MerR调节蛋白作为传感元件，在无细胞系统中检测四环素和有毒的汞。Davies等人构建了一个无细胞蛋白质阵列，筛选病毒感染后人类血清中的高免疫原性蛋白质，用于预防性使用和诊断。在偏远地区或恶劣环境中，无细胞系统冻干并附着在纸张上（或其他基质）是方便和稳定的。Pardee等人使用冻干的无细胞传感器快速检测埃博拉和寨卡病毒。未来的无细胞合成生物学可能会导致更复杂的治疗剂的复杂设计和合成，或者用于慢性疾病诊断的快速和敏感的生物传感器。 6.讨论与未来展望 自十多年前开始迅速发展以来，合成生物学已经取得了显著增长，并在科学和应用方面取得了许多成就（图1）。在这篇综述中，我们总结了合成生物学在传统制药和医疗应用方面的先进策略和设计，例如工程智能细胞（图2）、活体益生菌治疗、诊断、干细胞、药物生产、纳米载体和人工疫苗开发。这种新方法将丰富临床方案，缩短药物开发周期并降低制药价格。 合成生物学方法最有可能带来（或已经带来）生物医学领域巨大变化的包括：使用光进行时间-空间可控的精确细胞治疗（光遗传学）、设计细菌靶向癌细胞、工程细胞重构人体代谢通量或肠道-大脑-肝脏轴（工程活体治疗）。近期研究表明，上述生物系统在哺乳动物中运行良好，并在动物模型甚至志愿者中显示出相当的治疗效果。然而，它们仍处于早期发展阶段。仍需付出许多努力，将实验室发现转化为商业产品，供患者使用。 个性化工程药物是未来治疗策略的下一代。基于能够将环境信号解释为效应器活动的遗传编码电路的智能治疗将被广泛使用。自动调节的治疗细胞，能够感应诊断输入以进行治疗效果，是诊断、疾病预防和治疗的一站式解决方案（图2）。一些应用，如CAR-T疗法，已经进入临床阶段，但大多数智能细胞尚未进入。许多尝试在早期临床阶段失败，主要原因是人类治疗能力低和意外的副作用。未来的工作应该强调其安全性以及治疗中的有效性和稳定性。 合成生物学与人工智能（AI）的结合有望加速医疗和制药领域的进展，尽管该领域仍处于初期阶段。AI不仅在计算机科学中取得了巨大成功，也在生物学研究中取得了突破。AI预测蛋白质结构被评为2021年十大科学突破之一。AI和大数据时代已经到来，深度学习技术在表征复杂对象、融合多模态特征和自动样本生成方面具有优势。AI可以应用于合成生物学领域。目前，AI与合成生物学的结合应用主要集中在以下三个方面：首先，预测未来研究方向；收集相关合成生物学数据，然后区分因果关系，分析和评估应用和发展方向。这在分析大量临床数据集时非常有帮助。其次，在制药应用中，基于AI和生物信息学大数据筛选有效药物，测试候选化学物质，并在疾病模型中模拟治疗过程。这是一种节省人力的高通量方法。第三，通过深度AI学习模型重建或修改基因组，开发新化合物用于药物发现。未来，AI有望协助医疗合成生物学根据实际需求设计更复杂的系统（工程细胞或组织），大幅减少研究人员的工作量。 图7 合成生物学基础基因治疗的现状、技术瓶颈及未来发展。目前，通过重新连接代谢和（或）信号通路，合成生物学已经提供了一些诊断和治疗方法。然而，仍需解决安全性、多功能性和有效性等瓶颈问题。此外，像AI辅助合成生物学和合理构建的活体生物和蛋白质等新设计正在进展中。 然而，医疗合成生物学仍需解决一些短板和瓶颈问题。尽管基于遗传电路的工程细胞是近几十年来最令人兴奋的设计之一，它们在实际应用中存在局限性，包括细胞外、信号转导自由疾病，这些疾病可以通过传统方式治疗。组织特异性工程治疗至今尚未成功。哺乳动物代谢的干扰仍然未知。解决这些问题将有助于合成生物学的临床应用。 大多数合成生物学仍应用于微生物。然而，解决人类健康问题的大部分重大问题需要哺乳动物系统。因此，必须付出巨大努力，推动哺乳动物合成生物学发展到下一代治疗，包括工程合成基因网络用于疾病治疗、组织工程或干细胞的生成和分化。 此外，基于合成生物学的治疗仍面临与转基因食品和干细胞治疗类似的社会问题，如伦理和法律领域，尽管它们可以通过严格的途径获得更好的控制。 即便如此，基于合成生物学的治疗前景光明，在二十一世纪的生物医学领域开发了新的工具和应用，并在高效微生物制药生产方面取得了进展。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 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同写意20周年大会：中国医药创新未来之路！“意”同创新，穿越周期，赢取未来。7月中旬，苏州金鸡湖畔，让我们与“新药写意人”一起为中国医药创新“同写意”！ 安全药理学研究药物和生物制品对核心生理器官功能造成不良药效学影响的可能性。重点是研究这些产品类型（在非临床开发过程中可能以治疗浓度或高于治疗浓度给药）的药理学如何影响三个重要器官系统的功能--心血管（Cardiovascular CV）系统、呼吸系统和中枢神经系统（Central Nervous System，CNS）。对这三个重要器官系统的研究共同构成了安全药理学核心课程。次级器官系统包括胃肠道系统、肾脏系统、泌尿系统和自主神经系统以及其他系统等，在必要时也可进行评估。 不良药效学效应可能是由于受试产品的靶向一级药效学效应，可能与给药剂量、给药途径和频率以及全身暴露量有关，也可能是由于称为二级药效学的脱靶效应。安全药理学核心组合（core battery）包括的三个主要重要器官系统在生理上相互关联，这意味着在一个系统中出现的效应可能会在其他系统中引起适应性反应。因此，解读安全性药理学数据通常需要对器官功能的整体影响进行综合风险评估，并考虑目标临床人群、临床试验计划和安全系数。本章将讨论安全性药理学研究的时间安排，这与预期的患者人群相一致。 安全药理学已成为一门学科，在对新产品进行首次人体试验之前，通过开展核心组合研究来预测不良药效学风险。安全药理学研究有助于从效益风险较低的药品中筛选出安全性较高的药品，此类药品或很少或没有潜在的心血管、呼吸或中枢神经系统影响，或具有足够的安全系数。值得注意的是，如果在临床试验中出现不良反应，或者如果已上市产品被重新用于新的适应症、患者人群，或者以新的制剂或途径给药，而在此之前不需要进行安全药理学评估，那么处于开发后期的产品也可能需要进行安全药理学评估。 本章提供的信息主要基于美国食品药品管理局（FDA）、欧洲药品管理局 （EMA）和人用药品委员会（CHMP）的文件，这些文件讨论了国际人用药品技术要求协调理事会（ICH）关于人用药品安全药理学研究的安全 （S）指南7A。ICH S7A指导方针规定，所有人用药品（小分子、生物技术衍生药物或生物制品）在首次人体临床试验期间的用药安全性应达到合理水平。 因此，根据良好实验室规范（GLP）进行的安全性药理学研究的评估，在治疗范围及以上，人体首次用药预计不会对重要器官的生理功能产生任何不良的药效学影响。安全药理学研究的时间安排与FDA和EMA/CHMP就 ICH M3（R2）关于开展人体临床试验和药品上市许可的非临床安全性研究的指导意见相一致。目前，细胞和基因治疗产品或组织工程产品在安全药理学指南中没有专门论述。 本章还将讨论最近批准并实施的ICH E14/S7B Q&A指南，该指南概述了如何接受体外hERG（人类ether-a-go-go相关基因，human ether-a-go-go related gene）和体内QT间期研究数据（即：非临床、双阴性），均根据Q&A最佳实践建议进行，以支持两种临床场景（E14 Q&A 5.1和6.1），以申请豁免全面QT（TQT）研究。本章末尾提供了案例研究，以展示如何在实践中开展安全药理学研究。 1 安全药理学试验的一般原则和重要性 安全药理学指南于2000年首次制定，以应对抗组胺药物特非那定对心血管系统影响的不良报告。特非那定于1985年由Hoechst-Marion Roussel公司（现赛诺菲-安万特公司）引入市场，在美国以Seldane、英国以 Triludan和澳大利亚以 Teldane 等名称销售，用于治疗过敏性鼻炎。后来发现特非那定是钾离子通道（IKr 或 hERG）的强效抑制剂，会导致QT间期延长。这有可能发展为多形性室性心动过速，即Torsades de Pointes（TdP），字面意思是心电图等电位线周围的点或峰（R 波或 QRS 波群）扭曲。 在临床试验之前，特非那定的心脏毒性潜能尚未被发现，因为这种药物完全由肝酶细胞色素P450 3A4（CYP3A4）代谢，因此在血浆中的浓度未被检测到。此外，其代谢物特非那定羧酸盐（也称作非索非那定）对钾离子通道没有抑制作用，即使其浓度比特非那定的hERG IC50高30倍。然而，当患者患有影响 CYP3A4酶的肝病或正在服用抑制CYP3A410的其他药物时，原药特非那定的促心律失常潜能就会在高剂量下显现出来，因为这会导致代谢降低，从而使特非那定的血浆浓度升高，而非索非那定的浓度降低。 非索非那定的疗效与特非那定相似，但由于它只对hERG通道有轻微抑制作用，因此诱发心律失常的可能性要低得多。1996年，非索非那定以Allegra13的名称上市，用于治疗过敏性鼻炎和慢性荨麻疹等疾病，并被列入世界卫生组织的基本药物清单，而特非那定则因可能导致心律失常而于1997年退出市场。 因此，小分子或生物制品对所有三个核心器官系统(心血管、呼吸、中枢神经系统)的潜在不良影响必须在进行首次人体研究之前进行。虽然ICH S7A提供了核心组合研究的指导和收集的功能终点，但它没有概述研究设计本身。下一节将讨论体外和体内研究的安全药理学研究设计，并提供示例，可以根据评估中的药物或生物药物的药理学（或化合物类别）、途径和剂量、适应症和预期患者群体准确地应用或修改。 2 核心组合研究设计和终点 在测试新产品的安全药理学时，首先需要测试三个核心器官系统的潜在不良药效学效应：心血管系统、呼吸系统和中枢神经系统（CV system, the respiratory system, and the CNS）。 3 心血管系统 评估对心血管系统影响的研究类型包括： ▪ 体外研究（如心脏离子通道研究） ▪ 体外研究（如 Langendorff 技术） ▪ 体内研究（如啮齿和非啮齿动物模型遥测技术） 4 体外心血管研究 体外心血管检测大多涉及心脏离子通道的研究，法规要求进行hERG检测（Table 5-1）。其中一种检测方法是自动hERG检测，用于确定药物抑制 hERG 钾通道的潜力。在药物开发的早期阶段，使用单一浓度的供试品，这种检测法可作为筛选工具，在结构-活性关系研究过程中和确定先导化合物之前，识别出具有潜在hERG倾向的化合物。对发现(有倾向)的hERG试验进行后续跟进，使用剂量递增的供试品浓度来估算其IC50，即抑制生物效应50%所需的药物浓度。然后再按照GLP规定进行严格的手动膜片钳hERG试验。 最近发布的S7B Q&A要求跟进体外hERG试验。然后在过表达人心肌离子通道（S7B Q&A 2.1）的人类胚胎细胞或中国仓鼠卵巢细胞上进行实验因素的最佳实践，其中包括钾、钙和钠通道。ICH指南中有关实验因素的最佳实践问答要点包括： ▪ 在接近生理温度（35-37°C）下进行手动膜片钳实验； ▪ 测量心室动作电位电压方案； ▪ 监测过表达心脏通道细胞的健康状况； ▪ 记录密封电阻质量；以及 ▪ 报告 IC50 值和希尔系数 此外，经过验证的分析方法应支持浓度验证，并应将多非地利、昂丹司琼和莫西沙星这三种阳性对照品中的一种作为参照药物进行评估。关于后者，应进行重复评估，每次实验应使用两种或两种以上浓度的供试品，每种浓度至少包括四个细胞。 在考虑了血浆蛋白结合和使用血浆中的游离药物浓度后，计算出的IC50抑 制浓度的安全系数应大于预期临床暴露浓度的50倍。本章稍后提到的 "体外原发性心律失常综合分析"（CiPA）计划建议并纳入了对其他心脏离子通道的评估。 在评估肿瘤产品时，由于肿瘤产品的收益风险比可能高于其他药品，因此可以在不遵守GLP法规的情况下进行hERG和心脏离子通道抑制测定。对于生物制品或生物技术产品，靶点特异性通常很高（target specificity is usually very high），因此不需要但建议（not required but are recommended）进行体外 hERG 检测。在评估这些生物制品时，可将体内心血管终点整合到使用非侵入性遥测技术进行的重复给药毒理实验中（Table 5-2）。 5 体外朗根多夫技术 朗根多夫技术是一种体外试验，即用含氧缓冲克雷布斯溶液灌注动物离体心脏，在其中加入或不加入待测药物。其目的是观察药物对心电图参数、心率、左心室力学和冠状动脉血流估计值的影响。通常使用豚鼠或兔子心脏，因为它们的心脏具有IKr钾离子通道，而这是人类心室复极化（即心电图的QT间期）的主要心脏离子通道。研究表明，使用体外检测法，QT延长药物对人体的影响是一致的。将离体灌注豚鼠（啮齿动物）心脏测定法转化为大型动物QTc测定法，用于测定已知可延长QTc的药物和 13种已知对QTc间期无影响的药物的QTc变化。 实施该技术时，先移除动物的心脏，然后以逆行方式通过主动脉导入灌注液；这样就能通过冠状动脉输送含有载体或药物的富氧、营养灌注液。记录的终点包括从放置在心外膜表面的导联II配置电极上记录的心电图参数、心率、左心室收缩参数（如心室压力的最大上升率和最大下降率）以及平均冠脉流量。 通过检查心肌、平滑肌和冠状动脉血管内皮，可以检测试验药物对心肌功能（电活动和收缩活动）和冠状动脉血管的影响。尽管朗根多夫技术有一些局限性（如无法评估代谢物、分离超过4至6小时的心脏功能活力等），但它既可作为心血管疾病筛查试验提供快速信息，也可在需要对早期发现试验的结果（如心脏受体的受体结合试验或hERG结果）进行进一步检查时提供快速信息，因为该试验可生成心电图，用于评估间期（如：RR、PR、QRS、QRS）、 RR、PR、QRS、QT和计算出的QTc间期、心律和左心室压力曲线。 6 体内心血管研究 体内心血管研究包括通过手术植入遥测装置对自由活动（非啮齿类动物，如犬、非人灵长类或小型猪）动物的心血管系统进行评估。此类装置有多种生物电位和压力导管配置，也有用于测量呼吸功能的阻抗导线可供选择。有多种遥测装置可供选择，既可用于短期研究，也可用于长期研究，还可在多项研究中重复使用（有足够的洗脱期），通常以发射器的电池寿命为基础。植入式遥测使用血管内放置的实心心电图电极，具有高分辨率或低信噪比。这样就可以在采集后的分析过程中准确地在心电图间隔上放置信托标记。 其他选择包括非侵入性外套式体外遥测（JET），该方法将表面电极与小型植入式遥测装置配对，用于收集动脉血压（符合ICH S7A CV 研究要求），其中电气元件固定在外套口袋。Table 5-2列出了这些研究中收集的CV终点。使用内置仪器对动物进行遥测研究非常方便，因为动物可以自由移动，而且一旦手术植入并恢复，只要之前的测试材料已从动物体内清除，且研究之间有足够的洗脱期，动物就可以在多项CV试验中重复使用。 当植入的遥测设备同时记录ICH安全指南7A中规定的心血管和呼吸参数时，研究被称为心肺研究。独立的心血管或心肺功能研究通常在非啮齿类动物中进行，采用4 x 4拉丁方交叉设计，即在洗脱期（通常为3-7天）后，以随机方式给每只动物以对照品和低、中、高剂量的三个剂量水平的试验药物。该设计的统计效力优于平行或递增剂量设计，因为每只动物都是自己的对照组，而且每次试验都包括所有剂量水平，从而减轻了序列效应（表5-3）。这种设计使用的动物数量最少（总共四只），符合动物使用的3R原则--替代（replace）、优化（refine）、减少（reduce）--并可根据分组饲养选择或提高统计能力而进行修改。 半衰期较长的供试品(如寡核苷酸、单克隆抗体和生物制剂)洗脱期超过7天时，可采用平行研究设计。该设计由四组（每组4 - 6只）动物组成，可纳入独立遥测研究(安全药理学环境)，或者将CV安全药理评估整合到平行的重复给药毒理实验中（毒理学环境）。只有在暴露量没有性别差异的情况下，才可以使用雄性;否则，需同时使用雄性和雌性。恢复组通常只有对照组和高剂量组，因此使用4只动物，在低剂量组和中剂量组中没有恢复期动物。 考虑因素包括植入式遥测术的手术安排和植入成本。在某些情况下，基于总体方案考虑，逐步升级的研究设计也可以适用于动物依次接受载体对照、低、中、高剂量选择（表5-4）。安全药理学评估供试品的急性效应，因此建议在单次给药后第1天收集CV参数，如果将其整合到重复给药毒理实验中。如果供试品的动力学允许，当第1天的所有活动完成后，可以在第2天收集CV参数，因为第1天给药和所有其他活动（如毒代动力学采血、临床病理学和临床观察）会对CV参数造成不利影响。 心血管研究测量动脉血压（收缩压、舒张压和平均动脉压）、心率（次/分）、第二导联心电图参数（心电图间期和节律）和体温。定性心电图分析包括波形形态（P 波、QRS 波和 T 波）和任何心律失常的描述，定量测量包括心电图间期持续时间（RR、PR、QRS和QT）。应使用单独的心率校正方法对QT间期进行心率校正（QTc）。 CV遥测技术的优势在于，它通过收集每次心跳的数据来生成一个强大的数据集，而且从用药前至少1小时到用药后22小时都会对动脉血压进行连续监测。收集逐次心跳的CV数据可捕捉药效学效应（如果存在），包括起效、Cmax和恢复期。收集到的逐次心跳数据可分为1分钟数据，用于数据处理。可测量每次正常心跳的定量心电图间期（PR、QRS和QT），心率可表示为两个连续RR间期之间的间隔或每次血压脉冲的计数。心电图遥测研究按照GLP法规进行。 可在独立的心血管安全药理学研究中增加一个可选的毒代动力学阶段，在心血管阶段洗脱后在相同的动物中进行，采用重复拉丁方形设计，以剂量递增（低、中、高）的方式进行，并在两次剂量之间进行洗脱，或在心血管阶段洗脱后对所有四只动物一次给药（低、中、高）。毒代动力学研究也可在单独的一组动物中进行，在这种情况下，应进行单次毒代动力学数据收集，作为CV研究的一部分，用于确认浓度，但不用于Cmax，以避免在CV遥测数据收集期间干扰动物。也可考虑在CV监测期间增加一次毒代动力学数据采集。如果要收集数据，应计划在Tmax之后进行，以便将CV监测过程中的暴露量与完整的暴露概况联系起来。 7 呼吸系统评估 核心呼吸系统研究将呼吸频率、潮气量和每分钟呼吸量作为主要研究终点进行评估，因为它们不仅能捕捉到对肺力学的直接影响，还能捕捉到可能来自中枢神经系统呼吸中枢的间接呼吸影响（Table 5-2）。当确定或怀疑存在呼吸系统倾向时，可评估的其他终点包括氧饱和度和气管支气管树的气流（阻力、气流、气流持续时间）、肺运动和充盈的难易程度（顺应性、弹性）以及肺泡气体扩散。 大多数呼吸系统研究包括评估药物对通气模式的影响，有时还包括血氧饱和度。当预计会对呼吸系统产生直接影响时，可考虑采用核心组合以外的先进监测方法，如胸膜压力-容积环路，以量化支气管收缩可能导致的气道阻力变化。 啮齿类动物（大鼠比小鼠更常用）最常用于呼吸安全药理学研究。这些研究使用胸透法测量气道中的容积变化。在啮齿类动物中可考虑使用几种胸透仪配置，包括全身型、头外型和仅鼻型。所有这些配置都可用于测量呼吸频率和潮气量，但全身胸透的优点是不需要束缚动物。胸透法需要一个适应期，要么适应全身腔室，要么适应束缚期，通常在给药后4个小时才能收集数据。大多数小分子药物的典型研究设计是在独立的呼吸研究中进行一次给药，采用平行设计，分四组，每组至少八只动物，分别给予低、中或高剂量的供试品或对照品（Table 5-5）。为减少动物用量，啮齿动物呼吸试验也可采用拉丁方交叉设计。 这些研究中的基线数据应在首次给药前收集，给药后数据应在给药后4小时内立即收集。如果评估供试品的药代动力学需要更长的时间，则可使用全身胸透法收集啮齿动物用药后24小时内的额外时间点数据。 啮齿类动物的呼吸系统研究也可整合到重复给药毒理试验中，即指定研究动物的一个小组，并在给药第一周的指定一天（即第3天）用于测量呼吸系统终点（Table 5-6）。动物可以是单性别的，每组8只雌性动物，以避免超过胸透室的容纳量（中枢神经系统用6只雄性动物）；如果由于暴露量的性别差异则雌雄动物都需包括在内，则每种性别5只动物。 对于急性给药效应，在第1天进行安全药理学评估；如果对长效药物或生物制品进行评估，则在第1周和给药的最后一周进行安全药理学评估。不对恢复期动物进行评估。与独立的呼吸安全药理学研究类似，重复给药毒理试验中呼吸评估将在试验动物适当适应后使用胸透法，收集给药前至给药后4小时的数据。在非啮齿类动物研究中，主试验动物将使用配备呼吸电感胸透（JET-RIP）波段的非侵入性外套式体外遥测装置进行评估，或在动物体内通过外科手术植入心肺遥测装置。在重复给药毒理试验中，可选择在给药结束时和恢复期结束时收集数据。 在啮齿动物呼吸安全药理学研究中，提高灵敏度的关键因素是剂量。按升序（从对照组到高剂量组）和降序（从高剂量组到对照组）给每组一半的动物加药，这样所有的动物组都能暴露在给药室的技术人员面前，并有时间在胸透室中从加药期间的应激反应中恢复过来。 如心血管研究所示，对于持续时间较长的评估，建议在大动物（即非人灵长类和犬，小型猪较少）中进行心肺联合研究。研究期间测量的参数包括呼吸频率（呼吸频率）、潮气量、分钟量（呼吸频率与潮气量的乘积，也是总通气量的测量值）、吸气峰值流量、呼气峰值流量、增强暂停以及吸气和呼气时间。后续研究已经建立，并可根据需要对气道阻力、顺应性、肺动脉压、血气、血液 pH 值等进行评估。 8 中枢神经系统评估 药物对中枢神经系统的影响通常采用功能观察组合（Functional Observation Battery，FOB）或改良 Irwin 评估进行测量。中枢神经系统核心安全药理学试验可使用与毒理试验一致的啮齿动物物种单独进行，或将啮齿动物中枢神经系统安全药理学研究整合到重复给药毒理试验中（表5-5和5-6）。FOB和Irwin是符合ICH S7A要求的首选检测方法，但这些检测方法的主要问题在于其主观性和定性性，这一点与行为测试一样。如果有迹象或观察到对中枢神经系统的不良影响（如癫痫发作），则可能需要进行定量中枢神经系统安全性药理学后续研究，在这种情况下，可能需要进行脑电图（EEG）检查。 FOB和Irwin观察评估旨在评价运动活动、行为变化、协调性、感觉运动活动、感觉运动反射反应和体温。大多数小分子供试品的典型研究方法是单次给药、平行分组设计、独立的中枢神经系统研究，每组至少有六只大鼠（单一性别；如果没有暴露量性别差异，则为雄性），分低、中、高剂量给对照组或试验组。动物采用群居饲养，根据剂量组的分配情况，每个笼子最多可饲养三只动物。训练有素的中枢神经系统技术人员在进行FOB或改进的Irwin评估时，通常会对治疗方法设置盲区。数据应在给药前一天（即预处理）或给药当天（基线）收集。用药时间要错开，以便同一技术人员有时间在用药后的选定时间点进行FOB或改进的 Irwin 评估。 FOB评估与改进后的欧文评估之间的差异在于观察期间如何处理动物的细微差别。FOB通常会在Cmax前后和用药后24小时内进行评估，而改进后的Irwin可能会在Cmax前后和用药后5小时内进行多达五次观察，如果在用药后5小时仍检测到影响，则会在24小时内进行观察。 FOB和Irwin评估也可纳入重复给药毒理试验，以评估剂量范围、持续时间、行为可逆性和生理功能。根据目标人群的不同，研究中可使用不同年龄（新生儿、幼年、成年）或怀孕状态的啮齿类动物，每组六只主要动物（单一性别）或每种性别五只主要动物。如果将这些评估作为重复给药毒理试验的一部分来进行，通常会将雄性啮齿动物分配到中枢神经系统研究中，而将雌性啮齿动物分配到呼吸系统研究中（Table 5-6）。 同样，在对动物进行随机分组之前，首先要让动物适应实验室；这通常是毒理试验方案的一部分。在毒理试验的某一天安排进行FOB或Irwin评估，并在指定的基线时间点给动物注射对照物质和三个剂量水平的供试品，然后将动物放回笼子里；然后在选定的时间点观察动物，直至用药后24小时。在评估过程中，可交错给药，以便一名观察者在每个时间点收集和记录多个动物和处理组的所有参数。目的是确定动物可耐受且未观察到不良影响的最高剂量，以及确定对动物行为造成明显不良影响的最低剂量。 在Irwin评估中，包括几项观察： • 群养笼边观察，包括姿势、异常行为（如抽搐、颤抖、发声、刺激和刻板行为）；操作观察，如移出的难易程度、操作反应、体温、流涎、流泪或皮脂分泌； • 在开阔地带的运动活动，包括自发运动活动、步态异常、刻板行为、易激惹、排尿或叛逃；以及 • 自主神经活动评估，如触觉反应、惊吓反应、向右/睑/抓握反射、捏尾、热痛觉、共济失调、体温和瞳孔反应。 • 此外，还会记录临床症状和体重。 在进行FOB评估时可发现的症状包括： • 共济失调 • 反应性 • 催眠（对外界刺激缺乏反应）； • 被动（缺乏反应或不挣扎）； • 自发的运动活动（运动、饲养、梳理）； • 社会互动； • 刻板行为（重复、无目的的行为，如摇头、摇晃、啃咬、舔食）； • 死亡率； • 眼球突出（目测眼球突出）； • 步态（肌张力低下或肌张力亢进--肌肉无力导致的姿势歪斜）； • 抓握反射（通过有线操作测量抓握能力）； 握力 • Straub 尾部反应（尾部从水平线上抬起）； • 震颤（对立肌群交替收缩引起的不自主运动）； • 抽搐（自主肌肉剧烈的不自主收缩，可以是肌肉交替收缩和放松的阵挛性收缩，也可以是持续收缩的强直性收缩、痉挛样收缩或阵挛性和强直性混合收缩）； • 腹泻 • 流泪； • 瘙痒（毛发蓬乱）； • 上睑下垂（由于上眼睑下垂、瞳孔缩小而导致部分或全部闭眼）； • 直肠温度 • 流涎 • 排尿； • 角膜反射（眨眼反应）； • 直立反射（身体恢复正常直立姿势的能力）； • 松果体反射（缩回或抽动耳朵的反应）； • 夹尾巴；以及 • 热板反应 在ICH S7A中，通过FOB或Irwin评估筛选和监测候选新药对中枢神经系统的潜在不良影响，是评估中枢神经系统安全或人体安全风险的第一步，尽管这些测试取决于进行观察的人员的技能。可能需要综合各种终点来检测潜在的不良事件，而不仅仅是单个参数。有些终点不能直接转化为人体中枢神经系统不良事件，因此无法确定完全一致。 如果在FOB或Irwin试验、重复给药毒理试验或临床试验中发现了对中枢神经系统的不良影响，则可能需要进行后续研究（如认知和学习、恐惧和焦虑等）以及使用脑电图（EEG）进行癫痫发作责任评估，以进一步阐明中枢神经系统不良影响的性质和作用机制，然后再继续药物开发。在啮齿类动物中观察到的异常现象（如摇头、抓挠、过度梳理和舔食）往往发生在惊厥之前，可能是阵挛性或强直性的。 9 生物制品或生物技术衍生药品的安全药理学 ICH S6（R1）涵盖了生物制药（即生物制品或生物技术衍生药品）的安全药理学测试。 生物制品以其选择性（如抗体结合或受体配体）著称，预计不会影响CV或呼吸系统或中枢神经系统。然而，它们可能具有靶标放大药理学效应，或潜在的脱靶次生药理学活性，可能对构成安全药理学的重要器官产生不利影响。对于大多数生物制药（大分子或生物技术衍生产品）而言，根据ICH S6（R1），安全药理学终点被纳入重复给药毒理试验中。但是，如果生物制药对受体结合的选择性不高，代表一种新型或一流产品，或两者兼而有之，则可能需要进行独立或后续研究，以进行更广泛的安全药理学评估（即根据ICH S7A）。 对于在啮齿动物中具有活性的生物制品，中枢神经系统不良反应的安全药理学终点（即使用 FOB 或改进的Irwin评估）在单次给药或重复给药后进行评估；这取决于供试品的给药途径、给药方案。如果生物制品对非人灵长类动物和啮齿类动物都有活性，则可在啮齿类动物和非人灵长类动物中评估不良反应，但如果只对后者有活性，则只在非人灵长类动物重复给药试验中纳入安全性药理学终点。 在某些情况下，体外中枢神经系统安全性研究是在进行体内研究之前进行的，以指导选择安全药理学终点，并酌情纳入重复给药试验和随访研究（即根据ICH S6(R1)指南）。 10 肿瘤产品安全药理学 肿瘤产品的安全药理学已纳入ICH S9。对于专为晚期癌症设计的肿瘤产品，有必要加快候选药物的临床开发，以便患者能够及时获得这些药物。根据ICH S9，虽然无需进行独立的（即ICH S7A规定的）安全药理学研究，但可将对三个重要器官系统（心血管、呼吸和中枢神经系统）的不良影响评估纳入重复给药毒理试验中，或仅限于评估从大动物（如犬、非人灵长类或迷你猪）毒理学研究中收集的心电图（有科学依据）。 评估安全药理学核心组合中三个重要器官系统的重复给药毒理试验应按照GLP 法规进行，并进行详细的临床观察。在啮齿动物（通常是大鼠）中，重复给药毒理试验通常包括FOB或Irwin评估，28天毒理试验中一半的主试验动物（如10只雄性动物中的5只）在第1天接受评估，以及详细的呼吸系统观察（如10只雌性动物中的5只），给药组与对照组进行比较。 在非啮齿动物重复给药毒理试验中，除详细观察外，还要收集心电图和血液动力学测量数据（心率、血压和体温）；这些数据在基线（即给药前）、第1天（给药第一天）和给药最后一周（即第28天或第90天）收集，如果有必要，还包括在研究中期收集。给药组的测量结果将与对照组结果进行定量比较，并评估显著变化，将其与剂量水平、毒代动力学暴露量或两者相关联。如果在给药最后一周的评估中发现影响，一般会在恢复期增加CV、呼吸和中枢神经系统评估，以评估可逆性。 由于潜在的收益风险比更大，人们希望加快肿瘤产品的开发，监管部门不要求进行单独的安全药理学研究。由于安全药理学评估被整合到重复给药毒理试验中，因此患者安全问题可以得到充分解决，同时也符合ICH S9规定的动物使用3Rs要求。 在设计肿瘤产品的后续安全药理学研究时，需要考虑药理学和临床适应症，并根据具体情况进行此类研究（Table 5-7）。根据ICH S645和ICH S946，这些研究应予以精简，以减少动物数量，尤其是生物制品和肿瘤药物，而且还应根据具体情况对这些重要器官和其他器官进行补充试验（Figure 5-1）。 11 体外原发性心律失常综合测定 体外原发性心律失常综合分析法（CiPA）由FDA于2013年开发，旨在改进原发性心律失常标志物的评估，并提供更相关、可靠和全面的临床前体外心脏筛选工具。这一举措是基于某些药物（如维拉帕米）有可能阻断hERG通道，但在人体中不会导致心律失常。 顾名思义，CiPA包括对参与心室动作电位的心肌离子通道的全面评估，因此它的使用支持了对hERG评估的要求。CiPA的第一步是对转染hERG的细胞进行六种心脏离子通道的膜片钳检测：hERG、Nav1.5（晚期钠）、Cav1.2（钙）、KvLQT1（慢延迟整流钾电流；IKs）、Kir2.1（负责膜电位的内向整流钾通道；IK1）和Kv4.3（快速瞬时外向钾电流；Ito）。 这些膜片钳测定的数据随后被用于提供人体心室动作电位的计算机模拟模型，从而提供有关早期心脏潜在损伤的信息。驱动计算机模型的算法可以预测心室动作电位的变化（如延长）以及任何早期后极化的产生。早期后极化是导致心律失常风险的早期诱因。硅学模型，如O'Hara Rudy模型，是健康人心室动作电位的精确模型，能够评估延长QT间期的化合物，而这些化合物与前心律失常风险无关（如维拉帕米）。最后，通过硅学建模获得的膜片钳数据将被评估是否可转化为诱导多能干细胞衍生的心肌细胞（iPSc-CM）。 CiPA还包括使用人类诱导多能干细胞衍生的心肌细胞（hiPSC-CM）。利用多电极阵列技术对这些细胞进行评估，测量化合物的细胞外场电位，帮助确定对心血管电生理学有潜在不利影响的化合物。记录到的场电位波形的变化是心室动作电位变化的基础，可能表明hERG或其他离子通道（如钠通道Nav1.5，负责动作电位的上冲，或钙通道Cav1.2，负责动作电位的持续时间）受阻。 因此，场电位持续时间的延长可能导致心室动作电位的延长，并可能显示心电图上记录的QT间期的延长。药物引起的动作电位延长应与细胞间搏动的可变性引起的动作电位延长区分开来，并使用阳性和阴性对照化合物。如上所述，在CiPA期间还研究了除hERG之外的其他钾通道，如Kir2.1、Kv4.3、KCNQ1/KvLQT1_mink。 12 其他器官的安全药理学 根据治疗适应症和毒性研究中的不良反应结果，还可对核心组合以外的器官系统进行安全药理学研究。这包括肾脏或泌尿系统、胃肠道系统和自主神经系统等。此类研究的终点将取决于所测试的系统，但可能包括排尿量和电解质排泄量、胃肠道转运时间和胃排空、免疫细胞表型等免疫学参数、激素水平等内分泌参数以及正压性低血压。这些参数可用于评估这些其他器官系统的功能变化。 所有候选药物或生物制品都应在非临床药物开发期间或临床开发II期之前，根据具体情况，采用适合目的的研究设计，对这些其他器官系统进行必要的安全药理学测试。 • ICH E14/S7B Q&As - 临床 TQT 研究对非临床研究的需求 ICH E14指南和ICH S7B问答涵盖了临床TQT研究对非临床研究的需求。ICH S7B于2005年实施，旨在指导开展非临床安全药理学研究，评估新药在首次人体试验前延长心室复极化（QT间期）的可能性。同年，ICH E14获得通过，概述了开展临床研究的必要性，以评估这些新药对延迟心脏复极化潜能的影响。 FDA公布了2016年至2020年进行的TQT研究数量数据，发现32%的研究未能达到E14 Q&A 5.1的两倍高临床暴露阈值。此外，另有24%的临床研究采用了替代研究设计（其中 82% 用于肿瘤适应症），由于无法进行TQT研究，导致标注为  “QTc 影响较小"。为了减少临床TQT研究的数量，E14/S7B Q&As指导原则于2022年2月获得批准，2022年7月定稿，并于 2022 年8月实施。非临床双阴性结果（即 hERG和体内QT/QTc研究结果均为阴性），并结合临床E14 Q&A 5.1（当临床暴露量未达到2倍临床高水平时，支持TQT豁免）或E14 Q&A 6.1（支持 "延迟再极化导致促心律失常效应的可能性较低 "的依据）。 假设ICH S7B hERG和体内QT研究的结果显示心室复极化没有延迟，其将使监管机构和临床医生确信，实验药品不会对参与首次人体研究的健康志愿者造成风险要使用非临床 hERG和体 QT结果（双阴性）作为临床TQT研究的替代方法（E14 Q&A 5.1）或替代物（E14 Q&A 6.1），应具备以下条件： • 统一标准方案； • 实验条件遵循S7B Q&A 中概述的最佳实践（Q&A 2.1；hERG和3.1-3.5体内QT检测）；以及 • 监管审查报告的一致性。 S7B的体外hERG问答（用于膜片钳的问答2.1）提供了以下方面的指导： • 记录生理温度（35-37 °C）、应遵循的电压协议； • 记录 hERG 电流质量的测量方法； • 测量或计算的主要终点（如IC50、希尔系数和置信区间）；浓度验证；以及 • 阳性和阴性对照的使用。 S7B的体内QT检测问答（问答3.1至3.4）提供了以下方面的指导： • 种属选择与ICH S7B一致，选择与毒理试验一致的适当的、可自由活动的非啮齿动物物种； • 超过预期治疗浓度--倍数越高，对 E14 Q&A 6.1 中 QTc 检测灵敏度的依赖性越小（即 QTc 变异性的统计测量；以毫秒为单位检测 QTc 变化的最小显著差异，包括浓度 QTc 分析，E14 Q&A 6.1 要求，Q&A 5.1 建议）； • 使用个体动物心率校正方法--包括 QTc/RR 散点图，评估检测灵敏度和实验室历史灵敏度（最小可检测差异）。 只有在问答6.1中才要求检测QTc（最小显著性差异）与临床研究中测得的阈值之间变化的化验灵敏度。最佳做法是报告体内QT化验的QTc最小显著性差异，以支持问答5.1，但没有最小阈值，该值仅用作衡量研究中QTc的变异性。最后，S7B Q&A 3.5是报告结果时应考虑的要点。 因此，非临床双阴性数据现在可以通过首次人体监管审查，以ICH E14 Q&A 5.1或6.1作为原发性心律失常的非临床-临床风险评估。预计这将增加TQT豁免申请的数量，并减少所需的临床TQT研究数量。ICH S7B最佳实践（Q&A 2.2-2.5）使用心肌细胞和前心律失常模型（Q&A 4）对心室再极化进行了后续体外评估（参考ICH E14/S7B Q&A）。 13 付诸实践：安全药理学案例研究 案例研究5-1和案例研究5-2重点介绍了如何将本章提供的信息付诸实践。 案例研究 5-1 对具有纳摩尔hERG抑制作用的小分子应进行哪些安全性药理学研究？ • 研究背景 一种小分子（新分子实体）正被开发为治疗神经退行性疾病的全身用药。该药物将作为口服片剂，每天服用一次。在非临床开发过程中，该分子在非人灵长类动物体内表现出对hERG通道的纳摩尔抑制作用（IC50 <100 nM）。 • 解决方案 对于这种针对神经退行性疾病开发的小分子药物，需要进行核心的安全药理学研究。由于该分子是作为每日口服片剂开发的，因此药物开发计划包括两项CV研究，以解决重复给药问题，并将药代动力学与CV测量相关联。此外，本着3R的精神，大动物CV研究与通过遥测技术收集呼吸信息相结合。在中枢神经系统方面，将FOB纳入为期28天的啮齿动物重复毒理学研究。 初步心肺研究采用非GLP方法，使用递增剂量设计（药效剂量和高于首剂的两个剂量水平（2倍和6倍）），使用三只非新药遥测仪器的非人灵长类动物。关键的GLP心肺功能研究是使用未经药物测试的非人灵长类动物进行的，这些灵长类动物通过手术植入了遥测仪器。 研究采用平行分组设计，共分四组（每组三只动物）；第一组动物服用对照组（载体）药物，其他三组动物服用递增剂量的试验药物，最低有效剂量为第二组。最低有效剂量（第2组），以及比最低有效剂量高2倍和6倍的剂量（第3组和第4组）。该研究设计根据表5-4所示进行了修改。 非人灵长类动物每天用药一次，并在第-1、1、2、4和第7天收集CV和呼吸功能遥测数据。第8天，动物再服药一次，以便在第8天和第9天（服药后24小时）采血进行药代动力学分析。 这些心肺功能研究（包括非GLP和GLP）的结果表明，在每天一次、连续7天服用6倍有效剂量的情况下，该分子在体内没有心血管风险，因此支持其继续开发。 案例研究 5-2 对于有癫痫发作风险的小分子药物，应该进行哪些安全性药理学研究？ • 研究背景 一种需要每天口服两次的小分子钠通道阻断药物正在作为镇痛药进行开发。在开发过程中对大鼠和犬进行研究，发生惊厥的血浆暴露量高于患者可能出现的暴露量，犬的暴露量约为临床有效剂量的10倍，大鼠的暴露量约为临床有效剂量的45倍。 • 解决方案 需要进行适当的体外研究，以评估已观察到的抽搐的潜在机制。 可能需要进行犬脑电图研究，记录大脑的自发电活动，以便 • 确认中枢神经系统不良反应的性质，并确定抽搐是由于癫痫发作还是其他毒理效应（如晕厥或明显的运动障碍）引起； • 在观察到抽搐和其他中枢神经系统症状（如肌阵挛）时，确认血浆暴露量； • 确定可能是惊厥或癫痫发作前兆的临床表现，这些临床表现可作为临床试验的终点指标；以及 • 确认在未观察到惊厥的较低剂量下无脑电图异常。 脑电图研究通常包括视频脑电图和从用药前至少24小时到最后一次用药后至少24小时的连续记录。研究开始前72小时，将对所有犬进行连续脑电图记录和分析筛查，以评估是否存在异常脑电图形态，然后再分配到研究中。研究组的最小动物数为8人（通常为4雄4雌）。选择的剂量水平将包括尽可能高的脑电图 "未观察到效应水平 "（no observed effect level）和观察到抽搐的较高剂量水平，以确认中枢神经系统事件的性质。 研究设计可能具有适应性，一些研究组的剂量水平将根据之前实验组的结果进行选择。虽然这不是研究的主要目的，但研究还将确认惊厥是否具有自限性，并对治疗任何药物诱发的惊厥的紧急药物（如地西泮、苯妥英或丙泊酚）进行潜在评估。 当观察到严重的中枢神经系统临床症状时，将在计划外的时间点采集毒代动力学样本（包括重要的代谢物），以精确量化这些事件期间的血浆暴露量，并同时分析脑电图痕迹。重复给药的持续时间将超过重复剂量一般毒理学研究中诱发惊厥所需的持续时间。为避免速发型过敏症，将包括 1 个月的洗脱期。 鉴于大鼠脑电图研究的安全系数较高，而且犬的数据将说明这种责任的特征，因此可能不需要进行大鼠脑电图研究。 14 摘要和结论 多年来，安全药理学研究不断发展，以跟上不断变化的药物类型。尽管如此，安全药理学研究仍然侧重于在临床试验中首次给药前对潜在的不良药理作用进行评估。 安全药理学界已经产生了高质量的功能数据，用于评估药物的安全性，这些数据可以单独使用，也可以与重复给药毒理试验结合使用。过去二十年来的改进主要集中在最佳实践（如使用数字数据收集、适应和改进技术以降低压力）、致力于 3Rs 原则以减少动物和笼具的使用、单个动物心率校正、QTc/RR散点图等方面。 尽管如此，大多数这些细节的评估在整个行业中并不统一，也没有系统地纳入研究报告中。随着ICH S7B Q&As的发布，这些细节、统计测量和校正以及更多内容需要纳入最终报告中。为了实现这一单一目标，核心组合安全药理学研究一直侧重于首次人体试验，通常是单剂量和小样本量研究，并持续收集数据。根据所测试的药品或生物制药的药理学，可对研究进行修改，以适应后续研究中的其他设计。 在候选药物筛选阶段进行的各种安全药理学研究--体外hERG研究、CiPA计划中检测hERG阻滞和QT延长的能力，以及体内测试--避免了药物在临床开发后期因前心律失常而暂停。这就需要整合体外hERG和体内QT检测的非临床数据以及临床数据，以便对QT/QTc延长进行综合风险评估，如果在控制良好的非临床研究中未观察到hERG阻滞或QT/QTc延长，则有可能放弃或减少彻底的TQT临床研究。 对心血管系统的评估，单独的安全药理学研究是黄金标准，而不是整合在毒理试验中，但整合的安全药理学研究将继续用于小分子和大分子药物，以符合3Rs的要求，只要以严格和可解释的方式收集安全药理学终点，以阐明药物对结构和生理功能的影响。对于大多数CV研究而言，具有体温采集和呼吸功能的植入式遥测设备现在已被接受，而且比外套式遥测设备更为普遍，这为收集更可靠、更一致的心电图和呼吸波形铺平了道路，从而可进行更准确的分析，便于与毒性研究相结合。目前，S7A和S7B/E14指南中没有具体涉及细胞和基因治疗，因为它们正在迅速发展，但不久后可能也需要纳入指南范围。有必要继续评估安全药理学研究数据的转化效果，以减少临床试验中的失败。 英文版原文 （上下滑动查看更多）  Chapter 5 Safety Pharmacology Studies  Adverse pharmacodynamic effects may be due to the on-target primary pharmacology effects of the product being tested, which could be related to the given dose, the route and frequency of administration, and systemic exposures, or due to off-target effects termed as secondary pharmacology. The three primary vital organ systems included in the safety pharmacology core battery are physiologically correlated, meaning that effects seen in one system may induce an adaptative response in the others. As such, interpretation of safety pharmacology data typically requires an integrated risk assessment of the totality of effects on organ functions that considers the targeted clinical population, clinical trial plans, and safety margins. The timing of safety pharmacology studies, which are aligned with the intended patient populations, will be discussed in this chapter. Safety pharmacology has emerged as a discipline to predict risk of adverse pharmacodynamic liability3 through the conduct of core battery studies before performing the first-in-human studies with a new product. These have helped to separate out safer pharmaceuticals with either little or no potential for CV, respiratory, or CNS effects or which have adequate safety margins from those which have a less favorable benefit-risk profile. It should be noted that safety pharmacology assessments may also be required for products in the late stages of development if adverse effects arise in clinical trials or if a marketed product is being repurposed for a new indication, patient population, or administered in a new formulation or route which previously did not require safety pharmacology assessments. The information presented in this chapter is largely based on US Food and Drug Administration (FDA),1 European Medicines Agency (EMA), and Committee for Medicinal Products for Human Use (CHMP) documents that discuss the International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use (ICH) Safety (S) guideline 7A on safety pharmacology studies for human pharmaceuticals. The ICH S7A guidance states that all human pharmaceuticals (small molecules, biotechnology-derived, or biologics) should be reasonably safe to be given to humans during first-in-human clinical trials. As such, the first dose in humans is not expected to have any undesirable pharmacodynamic effects on the physiological function of vital organs at the therapeutic range and above, as evaluated by safety pharmacology studies conducted in accordance with good laboratory practice (GLP) regulations.4 The timing of the safety pharmacology studies is aligned with the guidance from FDA and EMA/CHMP on ICH M3(R2) on nonclinical safety studies for the conduct of human clinical trials and marketing authorization for pharmaceuticals.5,6 Currently, cell and gene therapy products or tissue-engineered products are not specially addressed in the Safety Pharmacology guidelines. This chapter also will discuss the more recently approved and implemented ICH E14/S7B Q&A guidance, which outlines the acceptance of in vitro hERG (human ether-a-go-go related gene) and in vivo QT interval study data (i.e., nonclinical, double negative), both conducted under the Q&A best practice recommendations in support of two clinical scenarios (E14 Q&A 5.1 and 6.1), to apply for a thorough QT (TQT) study waiver.7,8 Case studies are provided at the end of this chapter to demonstrate how safety pharmacology studies may be conducted in practice. 1.General Principles and Importance of Safety Pharmacology Testing Safety pharmacology guidelines were first developed in 2000 in response to the adverse reports of the effects of the antihistamine terfenadine on the CV system. Terfenadine, which had been introduced into the market by Hoechst-Marion Roussel (now Sanofi-Aventis) in 1985, was marketed as Seldane in the US, Triludan in the UK, and Teldane in Australia as a treatment for allergic rhinitis, among others.3 In the 1990s, however, some people taking terfenadine presented to the hospital with syncope, and in some instances, died. 3,9,10 It was later found that terfenadine is a potent inhibitor of the potassium ion channel (IKr or hERG) resulting in prolongation of the QT interval. 9-11 This had the potential to develop into a polymorphic ventricular tachycardia termed Torsades de Pointes (TdP), which literally means twisting of the points or peaks (R wave or QRS complex) around the ECG isoelectric line. The cardiotoxic potential of terfenadine was not detected prior to clinical trials because the drug was completely metabolized by the liver enzyme cytochrome P450 3A4 (CYP3A4), so levels went undetected in the plasma. Moreover, its metabolite terfenadine carboxylate (also called fexofenadine), did not inhibit the potassium ion channel even when levels were at 30 times higher concentrations than the hERG IC50 of terfenadine.11,13 The proarrhythmic potential of the prodrug terfenadine was revealed at very high doses, however, in patients with liver disease affecting the CYP3A4 enzyme or when patients were taking other medications that inhibited CYP3A410,13,14as this resulted in reduced metabolism and thus higher plasma levels of terfenadine and lower concentrations of fexofenadine. Fexofenadine had similar efficacy to terfenadine, but since it only slightly inhibited the hERG channel, it had much lower potential to induce arrhythmia. Fexofenadine was marketed in 1996 under the name Allegra13 for allergic rhinitis and chronic urticaria, among others, and was listed in the WHO Essential list of Medicines,15 while Terfenadine was withdrawn from the market in 1997 due to its potential to cause cardiac arrhythmia. Hence, the potential adverse effects of small molecules or biopharmaceuticals on all three core organ systems (CV, respiratory,CNS) must be conducted before performing first-in-human studies.1,2 While ICH S7A provides guidance on the conduct of the core battery studies and the functional endpoints to collect, it does not outline the study designs themselves. Safety pharmacology study designs for both in vitro and in vivo studies are discussed in the next section and are provided as examples which may be judiciously applied or modified according to the pharmacology (or class of compound), route and dose, indication and intended patient population of the pharmaceuticals or biopharmaceuticals under evaluation. 2.Core Battery Study Designs and Endpoints When testing the safety pharmacology of a new product, the potential adverse pharmacodynamic effects need to be tested first on the three core organ systems: the CV system, the respiratory system, and the CNS. 3.Cardiovascular System Types of studies that may be performed to assess the effects on the CV system include: • In vitro studies (e.g., cardiac ion channel studies) • Ex vivo studies (e.g., Langendorff technique) • In vivo studies (e.g., telemetry in rodent and non-rodent models) 4.In Vitro Cardiovascular Studies In vitro CV assays mostly involve the study of cardiac ion channels, with the regulatory requirement to conduct a hERG assay7,8,17 (Table 5-1). One such assay is the automated hERG assay to determine the potential of pharmaceuticals to inhibit the hERG potassium channel. Using a single concentration of the test article, this assay is used as a screening tool early in drug development to identify compounds with potential hERG liability during structure-activity relationship research efforts and before leadnomination.  Discovery hERG assays are followed up by using escalating dose concentrations of the test article to get an estimation of its IC50, which is the concentration of the drug that is required to inhibit a biological process by 50%. This is then followed by a rigorous manual patch clamp hERG assay in accordance with GLP regulations. The recently released S7B Q&As request following up the in vitro hERG assay. Best practices for experimental factors are then conducted on human embryonic cells or Chinese hamster ovary cells overexpressed with human cardiac ion channels (S7BQ&A 2.1)21,22, which includes potassium, calcium, and sodium channels. Highlights of the Q&A best practices for experimental factors set out in ICH guidance include: • Conducting manual patch clamp experiments at near physiological temperature (35-37°C); • Measuring the ventricular action potential voltage protocol; • Monitoring health of the cells overexpressing the cardiac channels; • Recording seal resistance quality; and • Reporting the IC50 value and Hill coefficient Moreover, a validated analytical method should support concentration verification, and one of the three positive controls –dofetilide, ondansetron, and moxifloxacin – should be evaluated as a reference drug. Regarding the latter, repeated evaluations should be done with two or more concentrations of the test article being used for each experiment and including at least four cells at each concentration. After consideration of protein binding and using free drug concentrations in plasma, the calculated IC50 concentration inhibition should have greater than 50-fold safety margin over that of anticipated clinical exposures. Assessment of additional cardiacion channels is recommended and included in the Comprehensive in vitro Proarrhythmia Assay (CiPA) initiative, mentioned later in this chapter. When evaluating oncology products, hERG and cardiac ion channels inhibition assays can be conducted without compliance to GLP regulations because of the likely greater benefit to risk ratio of oncology products versus other pharmaceuticals. For biologics or biotechnology products, the target specificity is usually very high, and so in vitro hERG assays are not required but are recommended. When evaluating these biopharmaceuticals, CV endpoints can be incorporated in vivo in to repeat-dose toxicity studies conducted using non-invasive telemetry (Table 5-2). 5.Ex Vivo Langendorff Technique The Langendorff technique is an ex vivo assay in which the isolated heart of an animal is perfused with oxygenated, buffered Krebs solution, with and without the drug to be tested. The aim of this is to observe the effects of the drug on ECG parameters, heart rate, left ventricular mechanics, and estimates of coronary blood flow.26,27 Usually, the heart of a guinea pig or rabbit is used, as their hearts possess the IKr potassium ion channel, which is the primary cardiac ion channel responsible for ventricular repolarization (i.e., the QT interval of the ECG) in humans. Studies have demonstrated concordance to human effects of QT prolonging drugs using the ex-vivo assay. Translation of the isolated perfused guinea pig (rodent) heart assay to large animal QTc assay for determination of QTc changes with drugs known to prolong QTc and 13 drugs known to have no effect on the QTc interval was demonstrated. To perform the technique, the animal’s heart is removed, and the perfusate is introduced via the aorta in a retrograde fashion; this delivers the oxygenated, nutrient-rich perfusate containing either the vehicle or drug through the coronary arteries. Endpoints recorded include ECG parameters recorded from electrodes placed on the heart’s epicardial surface in a Lead II configuration, heart rate, left ventricular contractile parameters (e.g., the maximal rate of rise and maximum rate of fall in ventricular pressure), and mean coronary flow. The effect of the test drug on the function of the myocardium (electrical and contractile activity) and the coronary vessels can be examined by examining the myocardium, smooth musculature, and the endothelium of coronary vessels. Despite having some limitations (e.g., inability to assess metabolites, functional viability of the heart performance isolated for greater than 4 to 6 hours, etc.), the Langendorff technique can provide rapid information as both a CV screening assay and when further interrogation of results from earlier discovery assays (e.g. receptor binding assay on cardiac receptors or hERG results) is needed, as this assay generates an ECG for evaluation of intervals (e.g., RR, PR, QRS, QT and calculated QTc intervals), rhythm and left ventricular pressure curve. 6.In Vivo Cardiovascular Studies In vivo CV studies involve the evaluation of the CV system in free-moving (non-rodents like canine, non-human primates or minipig) animals via surgically implanted telemetry devices 30,31. Such devices are available with several biopotential and pressure catheter configurations as well as options for impedance leads for measurement of respiratory function 32,33. There are telemetry device options for use in both short and long term studies, as well as reuse of animals on multiple studies (with sufficient washout period), typically based on the battery life of the transmitter. Implanted telemetry, which uses solid tip ECG electrodes that are placed intravascularly, provides high resolution or low signal to noise ratio. This allows for accurate placement of fiduciary marks on the ECG intervals during post-acquisition analysis. Additional options include non-invasive jacketed external telemetry (JET), which pairs surface electrodes with a small, implanted telemetry device for collection of arterial blood pressure (required for compliance with ICH S7A CV studies) where the electrical components are secured in a jacket pocket.34 It should be noted that the small (rodent) telemetry device lacks the ability to collect continuous body temperature. CV endpoints collected in these studies are listed in Table 5-2. Telemetry studies using internally instrumented animals are convenient to perform, as the animals can move freely, and once surgically implanted and recovered, the animal can be re-used in several CV studies provided the previous test material has already cleared from their system and sufficient washout periods are allowed between studies. When the implanted telemetry device records both CV and respiratory parameters as set out in the ICH safety guideline 7A, the studies are termed cardio-respiratory studies. Stand-alone CV or cardio-respiratory studies are usually conducted in non-rodents in a 4 x 4 Latin square cross-over design, where each animal is dosed with the vehicle control and three dose levels of the test drug at low, mid, and high doses, in a random fashion following a washout period (typically 3-7 days). The statistical power of this design is superior to parallel or escalating dose designs as each animal serves as its own control, and any sequence effect is mitigated by the inclusion of all dose levels at each session (Table 5-3). This design uses the least number of animals (four in total) which is in keeping with the 3Rs of animal use – replace, refine, reduce – and can be modified for group housing options or to increase statistical power. Test articles with long half-lives (e.g., oligonucleotides, monoclonal antibodies, and biologics) where a washout period exceeds 7 days can use a parallel study design. This design consists of four groups of four to six animals that can be included in a stand-alone telemetry study (safety pharmacology environment), or alternatively, the CV safety pharmacology assessment can be incorporated in the parallel repeat dose toxicology study (toxicology environment). Males only can be used if there is no difference in exposures; otherwise, use both males and females. Recovery groups are often only in control and high-dose groups, so use four animals with no recovery animals in the low- and mid-dose groups. Considerations include scheduling of surgery for implanted telemetry and costs of implants. In some cases – and based on overall program considerations – escalating study designs can also be appropriate where animals receive a vehicle control, low-, mid-, and high-dose option sequentially (Table 5-4). Safety pharmacology evaluates the acute effects of the test article, hence the recommendation to collect CV parameters on Day 1 following a single dose if integrated in a repeat dose toxicology study. If the kinetics of the test article allow, CV parameters can be collected on Day 2 when all Day 1 activities are done because the excitement generated by Day 1 dosing and all the other activities, such as blood collection for toxicokinetics, clinical pathology, and clinical observations can have undue effects on CV parameters. CV studies measure arterial blood pressure (systolic, diastolic, and mean arterial pressure), heart rate (beats/min), Lead II ECG parameters (ECG intervals and rhythm) and body temperature. Qualitative ECG analysis includes a description of waveform morphology (for P, QRS, and T waves) and any arrhythmias, and quantitative measurements include ECG interval durations (RR,PR, QRS, and QT). The QT interval should be corrected for heart rate (QTc) using an individual heart rate correction method. The advantage of CV telemetry is that it generates a robust dataset by collecting data on every heartbeat and the arterial blood pressure is monitored continuously from at least 1-hour predose through to 22 hours postdose. Collecting beat-to-beat CV data captures pharmacodynamic effects, if present, at onset through Cmax and to recovery. The beat-to-beat data that is collected can be categorized into 1-minute means for data processing. Quantitative ECG intervals (PR, QRS, and QT) are measured for each normal heartbeat and heart rate can be expressed either as the interval between two consecutive RR intervals or from a count of each blood pressure pulse. CV telemetry studies are conducted according to GLP regulations. An optional toxicokinetic phase can be added to a stand-alone CV safety pharmacology study, in the same animals following a washout from the CV phase, as a repeat Latin square design, conducted as a dose escalation (low, mid and high) with washout between doses, or as a single dose (low, mid or high) administered once to all four animals after washout from the CV phase. The toxicokinetic study can also be performed in a separate group of animals and in this option, a single toxicokinetic data collection should be conducted as part of the CV study, for confirmatory concentration but not at Cmax to avoid disturbing the animals during CV telemetry data collection. The addition of a single toxicokinetic collection during CV monitoring can also be considered. When done, this collection is planned after Tmax to correlate exposure from the CV session with full exposure profile. 7.Respiratory System Assessment Core respiratory studies include measures of the respiratory rate, tidal volume, and minute volume as the major study endpoints assessed because they capture direct effects on lung mechanics but also indirect respiratory effects which may originate from CNS respiratory centers, based on ICH S7A guidance 1,2 (Table 5-2). Additional endpoints that can be assessed when a respiratory liability is identified or suspected are oxygen saturation and airflow to the tracheobronchial tree (resistance, airflow, flow durations), the ease of lung motion and filling (compliance, elasticity), and alveolar gas diffusion.1,2,40 Visual observations of the respiratory rate are not sufficient to meet ICH S7A guidance critera1,2 and respiratory parameters should be quantified with fully characterized methodologies. Most respiratory studies include evaluation of the effects of pharmaceuticals on ventilation patterns and in some cases blood oxygen saturation. When direct effects on the respiratory system are expected, advanced monitoring methodologies beyond the core battery may be considered such as pressure-volume loops of pleural pressures to quantify changes in airway resistance which can be caused by bronchoconstriction. Rodent species (rats are used more than mice) are most often used for respiratory safety pharmacology studies. These studies use plethysmography to measure changes in volume in the airways.40 Several plethysmograph configurations can be considered for use in rodents including whole body, head-out, and nose-only. All these configurations can be used to measure the respiratory rate and tidal volume, but the whole-body plethysmography has the advantage of not requiring the animals to be restrained. Plethysmography requires an acclimation period either to the whole-body chamber or to the restraint period typically for up to 4 hours postdose for data collection. A typical study design for most small molecules is a single administration in a stand-alone respiratory study, using a parallel design with four groups of animals of at least eight animals per group which are given a single low, mid or high dose of the test substance or a control substance (Table 5-5). To reduce the use of animals, the rodent respiratory study can also be conducted using the Latin square cross over design. Baseline data in these studies should be collected before the first dose is given and postdose data collected immediately post dose up to 4 hours later. If the assessment of the test article’s pharmacokinetics requires a longer duration, whole-body plethysmography can be used to collect data at additional timepoints up to 24 hours postdose in the rodent. Respiratory studies in rodents can also be incorporated in repeat-dose toxicity studies whereby a subset of the study animals is assigned and a designated day during the first week of dosing (i.e., Day 3) is reserved to measure respiratory endpoints (Table 5-6). Animals could either be single-sex, with eight (8) females per group to keep from exceeding the plethysmography chamber (and 6 males used for CNS) or 5 per sex if both sexes are included due to sex differences in exposures. Safety pharmacology assessments are conducted on Day 1 for acute dosing effects or during Week 1 and last week of dosing if conducting assessments of long-acting pharmaceuticals or biologics. No assessments on the recovery animals are done. Similar to a stand-alone respiratory safety pharmacology study, a respiratory evaluation within a repeat-dose toxicity study will use plethysmography following appropriate acclimation of the study animals, with data collected pre- to 4 hours postdose. In non-rodent studies, the main study animals will be evaluated using non-invasive jacketed external telemetry equipped with respiratory inductance plethysmography (JET-RIP) bands, or in animals that have a cardio-respiratory telemetry device surgically implanted. Optional data collections can be performed at the end of dosing for repeat-dose toxicity studies and at the end of recovery period. A key component to improve sensitivity in a rodent respiratorynsafety pharmacology study is dosing. Dosing half the cohort of animals per group in ascending order (from control to high dose) and the other half in descending order (from high dose to control) will allow all animal groups to be exposed to the technicians in the room administering the dose and have time in the plethysmography chamber to recover from the stress of being handled during dosing. As indicated for CV studies, and for longer durations of assessment, a combined cardio-respiratory study in a large animal (i.e., non-human primates and dog, less so in minipig) is recommended. Parameters measured during the study can include breathing frequency (respiratory rate), tidal volume, minute volume (the product of respiratory rate and tidal volume and the measure of total ventilation), peak inspiratory flow, peak expiratory flow, enhanced pause, and inspiration and expiration times. Follow-up studies are established and may be performed to evaluate airway resistance, compliance, pulmonary arterial pressure, blood gases, blood pH, among others as warranted. 8.Central Nervous System Evaluation The effects of pharmaceuticals on the CNS are usually measured using a functional observation battery (FOB)41 or modified Irwin42 assessment. CNS core safety pharmacology studies can be conducted as standalone using a rodent species consistent with the toxicology studies, or rodent CNS safety pharmacology studies are also often incorporated in repeat-dose toxicity studies (Tables 5-5 and 5-6). FOB and Irwin are good first assays to comply with ICH S7A requirements, but the main concern with these assays is their subjective and qualitative nature, as might be expected with behavioral testing. Follow-up safety pharmacology studies with quantitative CNS measures may need to be performed if there are signs or observations of adverse effects on the CNS, such as seizure liabilities, in which case, an electroencephalogram (EEG) may be necessary. FOB and Irwin observational assessments aim to evaluate motor activity, behavioral changes, coordination, sensory-motoractivity , sensory-motor reflexes responses, and body temperature. A typical study for investigating most small molecule test articles is a single administration, parallel group design, stand-alone CNS study, with four groups of at least six rats per group (single sex; males if no exposure differences are anticipated) which are administered the control or test substance at low, mid and high doses. Animals are socially housed, with up to three animals per cage based on their dose group allocation. The trained CNS technician conducting the FOB or modified Irwin assessment is typically blinded to the treatment. Data should be collected prior to dose administration, either the day before (i.e., pretreatment) or on the day of dosing (baseline). Dosing is staggered to allow time for the same technician to conduct the FOB or modified Irwin assessments at select time points postdose. The differences between the FOB and modified Irwin assessments are the subtleties in how the animals are handled during the observational battery. The FOB typically will have an assessment around Cmax, and 24 hours postdose, whereas the modified Irwin may have up to five observations up to and including Cmax to 5 hours postdose, or 24 hours if effects are still detected at 5 hours postdose. The FOB and Irwin assessments also can be incorporated in repeat-dose toxicity studies to assess dose range, duration, reversibility of behavior, and physiological functions. Depending on the intended human population, rodents of different ages (neonatal, juvenile, adult) or pregnancy status can be used in the study, with six main animals (single sex) per group or five main animals per sex. If conducting these assessments as part of repeat dose toxicology studies, males are typically assigned to the CNS study while the females are assigned to the respiratory study (Tables 5-6). Again, animals are first acclimatized to the experimental room prior to being randomized and distributed in groups; this is usually done as part of the toxicity study protocol. A particular day within the toxicity study is scheduled for the FOB or Irwin assessments to be carried out, and the animals are dosed with the control substance and three dose levels of the test article at a designated baseline time point and then placed back in their home cage; the animals are then observed at selected time points up to 24 hours postdose. Dosing can be staggered during the evaluations so that a single observer can collect and record all parameters from several animals and treatment groups at each timepoint. The objective is to determine the highest dose that is tolerated with no observed adverse effect and determine the lowest dose that causes noticeable adverse effect on the behavior of the animals. In the Irwin assessment, several observations are included: · Socially housed home cage observations which include posture, unusual behaviors such as convulsion, shivering, vocalization, stimulation, and stereotypy; · Handling observations, such as ease of removal, handling reactivity, body tone, salivation, lacrimation or piloerection; ·  Motor activity in open field including spontaneous motor activity, gait abnormalities, stereotypic behavior, irritability, piloerection, urination or defection; and · Autonomic activity assessment such as touch response, startle response, righting/palpebral/ grasping reflexes, tail pinch, thermal nociception, ataxia, body temperature and pupil response. · Clinical signs and body weights are also recorded. Observations that can be identified during FOB assessments include: · Ataxia; · Reactivity; · Catalepsy (lack of response to external stimuli); · Passivity (lack of response or absence of struggle); · Spontaneous motor activity (locomotor, rearing, grooming); · Social interaction; · Stereotypy (repetitive, purposeless behavior such as head bobbing, shaking, gnawing, licking); · Mortality; · Exophthalmia (protrusion of the eyeball assessed visually); · Gait (hypotonic or hypertonic- splayed posture to muscle weakness); · Grasping reflex (measured by wired maneuver which measures ability to grasp); · Grip strength; · Straub tail reaction (elevation of tail from horizontal); · Tremor (involuntary movements caused by alternating contractions of opposing muscle groups); · Convulsions (violent involuntary contractions of voluntary muscles which can be clonic with alternating contraction and relaxation of muscles, or tonic, which are sustained contractions, cramp-like or mixed clonic and tonic); · Diarrhea; · Lacrimation; · Piloerection (ruffling of fur); · Ptosis (partial or full eye closures due to drooping of upper eyelids, pupil size); · Rectal temperature;  Salivation; · Urination; · Corneal reflex (eye blink response); · Righting reflex (ability to rest or the body to its normal upright position); · Pineal reflex (response to retract or twitch the ear); · Tail pinch; and · Hot plate response In ICH S7A, screening and monitoring for potential adverse CNS effects by new pharmaceutical candidates with FOB or Irwin assessments is the first step in assessing CNS safety liabilities or risk to human safety, even though these tests are dependent on the skills of the person conducting the observational battery. The conglomeration of endpoints may need to be integrated to detect potential adverse events and not just individual parameters. Some endpoints do not translate directly to CNS adverse events in humans, and complete concordance cannot be ascertained. If an adverse effect on CNS is identified during an FOB or Irwin test, during a repeat-dose toxicity study or in clinical trials, follow-up studies (e.g., cognition and learning, fear and anxiety, etc.) and seizure liability assessments using electroencephalogram (EEG) may be needed to elucidate further the nature and mechanism of action of adverse CNS effect before continuing drug development. Observations in rodents such as sterotypies (i.e., head bobbing, scratching, excessive grooming and licking) often precede convulsions, and could be clonic or tonic. 9.Safety Pharmacology for Biologics or Biotechnology-derived Pharmaceuticals Safety pharmacology testing for biopharmaceuticals (i.e., biologics or biotechnology-derived pharmaceuticals) is covered by ICH S6(R1). Biopharmaceuticals are known for their selectivity (like antibody binding or ligands for receptors), and they are not expected to affect the CV or respiratory systems, or the CNS. However, they may have on-target exaggerated pharmacology, or potential off-target secondary pharmacology activity that may contribute to adverse effects on the vital organs that make up safety pharmacology. For the majority of biopharmaceuticals (large molecules or biotechnology-derived products), safety pharmacology endpoints are incorporated in the repeat dose toxicology studies according to ICH S6(R1).45 If, however, biopharmaceuticals are not highly selective for receptor binding, represents a novel or first-in-class product, or both, then stand-alone or follow-on studies for more extensive safety pharmacology evaluations (i.e., as per ICH S7A) may be necessary. For biopharmaceutical products which are active in rodents, safety pharmacological endpoints for CNS adverse effects (i.e., using FOB or modified Irwin assessments) are evaluated after a single dose or repeated dose administration; this depends on the test article’s route. of administration, dosing regimen. If the biopharmaceutical is active in non-human primates and rodents then adverse effects can be evaluated in both rodents and non-human primates, but if it is only active in the latter, then safety pharmacology endpoints are only incorporated into non-human primate repeat-dose studies. In some cases, in vitro CNS safety studies are conducted before in vivo studies are carried out,44 guiding the selection of safety pharmacology endpoints to include in repeat-dose studies and follow-up studies as appropriate (i.e., as per ICH S6(R1) guidance). 10.Safety Pharmacology for Oncology Products Safety pharmacology for oncology products is covered by ICH S9. For oncology products that are designed for late-stage cancers, there is a need to accelerate the clinical development of the drug candidate so they can be accessible to patients without undue delay. While no stand-alone (i.e., per ICH S7A) safety pharmacology studies are necessary, the assessment of adverse effects on the three vital organ systems (CV, respiratory, and CNS) can be incorporated in repeat-dose toxicity studies or limited to the assessment of ECGs (with scientific justification) collected from a large animal (e.g., dog, non-human primate, or minipig) toxicology study, according to ICH S9. Repeat-dose toxicity studies evaluating the three vital organ systems from the safety pharmacology core battery should be conducted in accordance with GLP regulations and with detailed clinical observations. In rodents (usually rats), repeat-dose studies usually incorporate the FOB or Irwin assessments, with half of the main study animals in the 28-day toxicity study (e.g., five of 10 males) undergoing assessment on Day 1, as well as detailed respiratory observations (e.g., five of 10 females), with treated groups being compared with the vehicle control group. In a non-rodent repeat-dose toxicity study, ECG and hemodynamic measurements (heart rate, blood pressure, and temperature) are collected in addition to detailed observations; these are collected at baseline (i.e., predose), on Day 1 (the first day of dosing) and during the last week of dosing (i.e., Day 28 or Day 90), including interim collection mid-study if warranted. Measurements from treated groups will be compared quantitatively with the control vehicle group and significant changes will be assessed and correlated with dose levels, toxicokinetic exposures, or both. If effects are identified during evaluations on the last week of dosing, CV, respiratory and CNS evaluations will generally be added to the recovery period to assess reversibility. The desire to accelerate the development of oncology products due to the potentially greater benefit to risk ratio is aligned with the lack of regulatory requirement for stand-alone pharmacology studies. As safety pharmacology assessments are incorporated in repeat-dose toxicology studies, patient safety can be adequately addressed while also adhering to the 3Rs of animal use according to ICH S9. When designing follow-up safety pharmacology studies for oncology products, the pharmacology and the clinical indication need to be considered and such studies are performed on a caseto-case basis (Table 5-7). They should be streamlined to reduce the number of animals especially for biopharmaceuticals and oncology drugs according to ICH S645 and ICH S946 and supplemental tests on these vital organs as well as other organs should also be done on a case-by-case basis (Figure 5-1). 11.Comprehensive in vitro Proarrhythmia Assay The Comprehensive in vitro Proarrhythmia Assay (CiPA)47,48 was developed in 2013 by the FDA with the goal of improving the assessment of proarrhythmic markers and to provide more relevant, reliable and comprehensive preclinical in vitro cardiac screening tools. This initiative was based around the potential for some pharmaceuticals (e.g., verapamil) to block the hERG channel however not to be proarrhythmic in humans. As its name suggests, CiPA includes an assessment of comprehensive list of cardiac ion channels that are involved in the ventricular action potential, and as such its use supports the requirement for hERG evaluation.49,50 The first step of CiPA is to conduct patch clamp assays on hERG transfected cells for six cardiac ion channels: hERG, Nav1.5 (late sodium), Cav1.2 (calcium), KvLQT1 (slow delayed rectifying potassium current; IKs), Kir2.1 (inward rectifying potassium channel responsible for membrane potential; IK1) and Kv4.3 (fast transient outward potassium current; Ito). The data from these patch clamp assays are then used to supply computer-simulated models of the human ventricular action potential that can provide information on potential early cardiac liabilities. The algorithms driving the computerized models can predict changes in the ventricular action potential (e.g., prolongation) as well as generation of any early afterdepolarizations. Early afterdepolarizations are the early triggers of proarrhythmic risk. The in silico models, such as the O’Hara Rudy model, which is an accurate model for healthy human ventricular action potential, are capable of assessing compounds that prolong the QT interval that is not associated with proarrhythmic risk (e.g., verapamil).51 Lastly, the patch clamp data through in silico modeling are assessed for translation against induced pluripotent stem cells-derived cardiomyocytes (iPSc-CM). CiPA also includes the use of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CM). These cells are assessed using multi-electrode array technology to measure the extracellular field potential of compounds, helping to identify those with potentially adverse effects on CV electrophysiology. Changes in the recorded field potential waveforms underlie changes in the ventricular action potential and could indicate blockage of the hERG or other ion channels, such as the sodium channel Nav1.5, which is responsible for the upstroke of the action potential or calcium channel Cav1.2, which is responsible for the duration of the actional potential. Hence a prolonged field potential duration could result in the prolongation of ventricular action potential and could indicate a prolongation of the QT interval recorded on the ECG. Drug-induced action potential prolongation should be distinguished from prolongation arising from the variability of cell-to-cell beating with the use of positive and negative control compounds.55 As indicated above, other potassium channels in addition to hERG, like Kir2.1, Kv4.3, KCNQ1/KvLQT1_mink) are also investigated during CiPA. 12.Safety Pharmacology for Other Organs Safety pharmacology studies for organ systems other than those included in the core battery can also be evaluated depending on the therapeutic indication and adverse findings in the toxicity studies. This includes the renal or urinary systems, the gastrointestinal system, and the autonomic nervous system, among others. Endpoints of such studies will depend on the system being tested, but may include the volume of urine excreted and electrolyte excretion, gastrointestinal transit time and gastric emptying, immunological parameters such as immune cell phenotyping, endocrine parameters such as hormone levels, and orthostatic hypotension. These parameters could be used to assess functional changes in these other organ systems. All pharmaceutical or biopharmaceutical drug candidates should be tested for safety pharmacology of these other organ systems as necessary, and on a case-by-case basis, with a fit-forpurpose study design, either during nonclinical drug development or before Phase 2 of clinical development. ICH E14/S7B Q&As - The Need for Nonclinical Studies for Clinical TQT Studies The need for nonclinical studies for clinical TQT studies is covered by ICH guidance E14 and the ICH S7B Q&As. ICH S7B was implemented in 2005 to guide the conduct of nonclinical safety pharmacology studies assessing the potential of new agents to prolong ventricular repolarization (QT interval) before first-in-human studies. That same year, ICH E14 was adopted, outlining the need to conduct a clinical study to assess the effects of these new agents on the potential to delay cardiac repolarization. The FDA has published data on the number of TQT studies conducted from 2016 through 2020 and found that 32% of studies failed to reach the E14 Q&A 5.1 threshold of 2X high clinical exposures. Additionally, another 24% of clinical studies had alternate study designs (82% of these were for oncology indications) where no TQT study could be conducted, therefore resulting in a label of “no large QTc effects.” In an effort to reduce the number of clinical TQT studies, E14/S7B Q&As were approved in February 2022, finalized in July 2022, and were implemented in August 2022.7,8 This guidance provides the opportunity to review the double negative nonclinical results (i.e., both hERG and in vivo QT/QTc studies are negative) in combination with clinical E14 Q&A 5.1 (in support of TQT waiver when clinical exposure does not reach 2x high clinical) or E14 Q&A 6.1 (to support labeling of “low likelihood of proarrhythmic effects due to delayed repolarization”). Assuming the results from ICH S7B hERG and in vivo QT studies show no delay to ventricular repolarization, they will give confidence to regulators and clinicians that the tested compounds do not pose a risk to healthy volunteers participating in first-inhuman studies. In order to use the nonclinical hERG and in vivo QT results (double negative) as an alternative (E14 Q&A 5.1) or as a substitute (E14 Q&A 6.1) for a clinical TQT study, there should be: · Alignment of standard protocols; · Experimental conditions that follow the best practices as outlined in S7B Q&As (Q&A 2.1; hERG and 3.1-3.5 in vivo QT assay); and · Consistency of reports for regulatory review. The in vitro hERG Q&As of S7B (Q&A 2.1 for patch clamp) provide guidance on:65 · Recording temperature (35-37 °C), voltage protocol to follow; · Measures of recording hERG current quality; ·  Primary endpoints to measure or calculate (e.g., IC50, Hill coefficient, and confidence intervals); Concentration verification; and · Use of positive and negative controls. The in vivo QT assay Q&As of S7B (Q&A 3.1 to 3.4) provide guidance on: · Species selection consistent with ICH S7B for appropriate, freely moving, non-rodent species consistent with toxicology studies; · Exceeding anticipated therapeutic concentrations – the higher the multiple, the less reliance on assay sensitivity for QTc under E14 Q&A 6.1 (i.e., statistical measure of QTc variability; least significant difference to detect changes in QTc in milliseconds, inclusion of concentration QTc analysis, required for E14 Q&A 6.1 and recommended for Q&A 5.1); · Use of an individual animal heart rate correction method -including QTc/RR scatter plots, assessing assay sensitivity and laboratory historical sensitivity (minimal detectable difference). The assay sensitivity to detect changes in QTc (least significant difference) to the threshold measured in clinical studies is only required under Q&A 6.1. It is best practice to report the least significant difference for QTc for the in vivo QT assay in support of Q&A 5.1, however, there is no minimal threshold and the value is used only as a measure of variability for QTc within a study. Finally, S7B Q&A 3.5 are points to consider for reporting the results. Thus, the nonclinical double negative data can now be advanced past first-in-human regulatory review for consideration with ICH E14 Q&As 5.1 or 6.1 as the nonclinical-clinical risk assessment for proarrhythmia. This is anticipated to increase submissions for TQT waivers and reduce the number of required clinical TQT studies. Follow-up in vitro assessments on ventricular repolarization are included in the ICH S7B best practice(Q&A 2.2-2.5) using cardiomyocytes and  proarrhythmia models (Q&A 4) (ICH E14/S7B Q&A reference). 13.Summary and Conclusion Safety pharmacology studies has evolved over the years to keep up with the changing modalities of pharmaceuticals. Nonetheless, they have remained focused on the assessment of potential adverse pharmacological effects prior to the first human dose being given in clinical trials. The safety pharmacology community has produced high quality functional data to assess drug safety, either as stand alone or in combination with repeat dose toxicology studies. The refinements over the past two decades have focused on best practices (e.g., using digital data collection, acclimation and refinement techniques to lower stress), and a commitment to the 3Rs principles to reduce the use of animals and social housing, individual animal heart rate correction, QTc/RR scatter plots, among others. That said, the assessment of most of these details is not standardized across the industry and are not systematically included in study reports. With the publication of the ICH S7B Q&As, those details, statistical measures and corrections and more need to be in the final reports. Towards this singular goal, core battery safety pharmacology studies have been focused on first-in-human studies, usually single dose and small sample size studies, with continuous data collection. Based on the pharmacology of the pharmaceutical or biopharmaceutical being tested, studies may be modified to accommodate other designs in follow-up studies. The conduct of various safety pharmacology studies – in vitro hERG studies, the ability to detect a hERG block and QT prolongation in the CiPA initiative, in addition to in vivo testing– which are undertaken at the screening stage of drug candidate selection, has staved off drug attrition due to proarrhythmia at the later stages of clinical development. This necessitated integrating the in vitro hERG and in vivo QT assay nonclinical data as well as clinical data for integrated risk assessments of QT/QTc prolongation, and the potential waiver and reduction of thorough TQT clinical studies if there is no observed hERG block or QT/QTc prolongation in well-controlled nonclinical studies. For CV assessments, stand-alone safety pharmacology studies are the gold standard rather than combination toxicology studies, but combination safety pharmacology studies will continue to be used for both small and large molecules, in keeping with the 3Rs and as long as safety pharmacology endpoints are collected in a rigorous and interpretable manner to elucidate effects of the pharmaceutical on both structural and physiological functions. For most CV studies, implanted telemetry devices with body temperature collection and respiratory capabilities are now acceptable and more prevalent than jacketed telemetry, paving the way to collect more reliable and consistent ECG and respiratory waveforms, leading to more accurate analysis that facilitate combination with toxicity studies. Currently, cell and gene therapy are not specifically addressed in the S7A and S7B/E14 guidance as they are rapidly evolving, but soon they may need to be included in the scope of the guidelines as well. There is a need to continue to assess the effects of translating the data garnered from the safety pharmacology studies to limit failures during clinical trials. Case Study 5-1 What safety pharmacology studies should be conducted for a small molecule that has nanomolar inhibition of hERG? • Background A small molecule (new molecular entity) is being developed as a systemic drug for neurodegenerative disease. The intention is that it will be administered as an oral tablet to be taken once daily. During nonclinical development, the molecule exhibited nanomolar inhibition of the hERG channel (IC50 <100 nM) in nonhuman primates. • Solution The core battery of safety pharmacology studies is required for this small molecule being developed for a neurodegenerative indication. As the molecule was being developed as a daily oral tablet, the drug development plan accounted for two CV studies to address repeat-dosing and correlate pharmacokinetics with CV measurements. In addition, in the spirit of the 3Rs, the large animal CV study was combined with respiratory collection via telemetry. For the CNS, FOB was integrated into the 28-day rodent repeat toxicology study. The preliminary cardio-respiratory study was conducted non-GLP using an escalating dose design (at pharmacologically efficacious dose and two dose levels (2X and 6X) above the first dose using three non-naïve telemetry instrumented nonhuman primates. The pivotal GLP cardio-respiratory study was conducted using drug-naïve nonhuman primates, which were surgically implanted with a telemetry device. A parallel group study design was used, with four groups of animals (three animals per group); animals in Group 1 were given a control (vehicle) substance and the animals in the other three groups received escalating doses of the test drug, at the lowest efficacious dose (Group 2), and at 2X and 6X above the lowest efficacious dose (Groups 3 and 4, respectively). This study design is modified from that shown in Table 5-4). Nonhuman primates were dosed once daily, and telemetry data for CV and respiratory function were collected on Days -1, 1, 2, 4 and Day 7. On Day 8, the animals were dosed one more time to enable blood collection for pharmacokinetic analysis on Days 8 and 9 (24 hours postdose). The results of these cardio-respiratory studies (both non-GLP and GLP) indicated no in vivo CV risk of the molecule at 6X the efficacious dose when administered once-daily for 7 days, supporting its continued development. Case Study 5-2 What safety pharmacology studies should be conducted for a small molecule that has a seizure liability? • Background A small molecule sodium-blocking drug that needs twice-daily oral administration is under development as an analgesic. Rat and dog studies have been used in its development but convulsions have been observed. The convulsions occurred at plasma exposures that are estimated to be higher than those likely to be seen in patients, at approximately 10X the efficacious clinical dose in dogs and 45X of the efficacious clinical dose in rats. • Solution Appropriate in vitro studies need to be conducted to evaluate potential mechanisms for the convulsions that have been observed. A dog EEG study which records spontaneous electrical activity of the brain68,69 will likely be required to: · Confirm the nature of the adverse CNS effects and establish if the convulsions were due to seizure or another toxicological effects (e.g., syncope or overt movement disorder); · Confirm the plasma exposure when the convulsion and other CNS signs (e.g., myoclonus) are observed; · Identify clinical signs that may be a precursor to the convulsions or seizures and that could be used as stopping criteria in clinical trials; and · Confirm the absence of EEG abnormalities at lower doses where no convulsions were observed. The EEG study will typically involve video-EEG68-70 and continuous recording from at least 24 hours prior to dosing until at least 24 hours after the last dose. All dogs will be screened with continuous EEG recorded and analyzed for 72 hours prior to study start to evaluate for the presence of abnormal EEG morphologies prior to assignment on study. The minimum group size is eight (typically four males and four females). The dose levels will be selected to include an EEG ‘no observed effect level’ ideally as high as possible and a higher dose level at which convulsions were observed to confirm the nature of the CNS events. The study design may be adaptative, with dose levels for some study groups being selected based on the outcome from the results with the previous experimental groups. Although not a primary objective, the study will also confirm if convulsions are self-limiting and potentially evaluate emergency drugs (e.g., diazepam, phenytoin, or propofol) to treat any drug-induced seizures. Toxicokinetic sample collections (including important metabolites) will be used at unscheduled timepoints when severe CNS clinical signs are observed to precisely quantify plasma exposure during those events and with concurrent analysis of EEG traces. The duration of repeat administration will be selected to exceed the duration that was required to induce convulsions in the repeated dose general toxicology study. To avoid tachyphylaxis, a 1 month wash-out period will be included. A rat EEG study will likely not be required given the higher safety margins in this species and the data from the dog that will characterize this liability. Chapter 6 Pharmacokinetic and Toxicokinetic Studies The goal of preclinical development is to generate sufficient data to allow an estimation of the benefit/risk profile of a new drug product prior to its use in patients. In general,the benefit(s) are ascertained from a combination of discovery phase studies in cells (i.e., in vitro) or animal-based (i.e., in vivo) models, and from reports in the scientific literature. The risk(s) are determined through a battery of nonclinical safety assessments. Pharmacokinetic (PK) and toxicokinetic (TK) studies – often simplified as a description of ‘what the body does to the drug’– are invaluable for this process as they provide a quantitative connection between the dose administered, and the amount of drug that is subsequently present internally at various times following dosing. When paired with a specific assessment of benefit (e.g., a reduction in cholesterol) or toxicity (e.g., cardiovascular dysfunction, such as evidence of QT interval prolongation on an electrocardiogram, ECG), this information can ultimately be used to develop and justify a clinical dosing regimen that maximizes the benefits of the drug, while minimizing its risks. This chapter will start with a brief overview of PK/TK itself, including an introduction to drug disposition and several other key background concepts. This will be followed by a discussion of the specific global regulatory recommendations/requirements pertaining to the conduct and interpretation of PK/TK analyses, largely from the International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use(ICH). Finally, the chapter will end with a description of how the results of PK and TK analyses should be presented in marketing and pre-marketing submissions to global regulatory bodies. 参考文献：（上下滑动查看更多） All references verified 16 February 2023. 1. US Food and Drug Administration. Guidance for Industry: S7A safety pharmacology studies for human pharmaceuticals. Current as of July 2001. https://www.fda.gov/media/72033/download 2. International Council for Harmonisation. ICH harmonized tripartite guideline. Safety pharmacology studies for human pharmaceuticals. S7A. Current as of 8 November 2000. https://database.ich.org/sites/ default/files/S7A_Guideline.pdf 3. Pugsley MK, Authier S, Curtis MJ. Principles of safety pharmacology. British J Pharmacol. 2008;154(7):1382-99. https://bpspubs. onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1038/bjp.2008.280 4. 21 CFR Part 58: Good Laboratory Practice. Current as of 24 October 2022. https://www.ecfr.gov/current/title-21/chapter-I/subchapter-A/part-58 5. 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