PABP

2024年4月4日，叶飞教授等人在Journal of Medicinal Chemistry上发表题为“Development of (2-(Benzyloxy)phenyl)methanamine Derivatives as Potent and Selective Inhibitors of CARM1 for the Treatment of Melanoma”的文章。在这篇文章中，作者等人设计了一系列高效和高选择性的CARM1抑制剂；其中，化合物17e展现出非凡的药效和选择性（IC50 = 2 ± 1 nM），同时对黑色素瘤细胞系有显著的抗增殖活性。此外，化合物17e在黑色素异种移植模型中有良好的抗肿瘤活性，这意味着该化合物作为一种潜在的抗癌药物值得进一步研究。蛋白质精氨酸甲基化是由精氨酸甲基转移酶（PRMTs）催化的一种重要的翻译后修饰。PRMTs利用S-腺苷甲硫氨酸（SAM）作为甲基供体去执行这一催化过程，从而产生S-腺苷-l-高半胱氨酸（SAH或AdoHcy）和甲基化底物。PRMT有9个成员：PRMT1到9，根据其甲基化不同可分为I型，II型和III型。I型PRMTs（PRMT1、2、3、4、6和8）催化单甲基化和不对称甲基化，产生ω-NG-单甲基精氨酸（MMA）或ω-NG和Ng-不对称二甲基精氨酸（aDMA）；II型PRMTs（PRMT5和9）催化单甲基化和对称二甲基化，产生MMA或ω-NG和NG对称二甲基精氨酸（sDMA）；III型PRMT（PRMT7）是只能催化单甲基化，专门产生MMA。与大多数的PRMTs相比，PRMT4又称为共激活因子相关的精氨酸甲基转移酶1（CARM1），表现出一个松散的作用基序，不会轻易被其他PRMTs识别，因此这是CARM1在其底物识别方面具有独特性的原因。另外，在胚胎的发育过程中，CARM1耐受性缺失意味着与靶向PRMT1或PRMT5抑制剂相比，CARM1抑制剂可能提供更广泛的治疗窗。这独特方面突出了CARM1作为治疗干预靶点的潜在优势。CARM1能够甲基化各种组蛋白和非组蛋白底物，包括H3R2、H3R17、H3R26、7RUNX1、BAF155、8PABP1、和TARPP。值得注意的是，组蛋白H3R17和H3R26的甲基化是CARM1的一个特殊的特点。因此，CARM1在多种细胞过程中发挥作用，包括细胞自噬、代谢、早期发育和mRNA的预剪接。由于其重要的生物学功能，越来越多的证据表明CARM1的过表达与多种癌症有关，包括乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、结直肠癌、肺癌、肝癌、胃癌、白血病和黑色素瘤。另外，Kumar等人发现抑制CARM1可以通过对肿瘤细胞和T细胞的双重作用对耐药肿瘤进行免疫治疗。因此，CARM1是癌症治疗的一个潜在靶点，特别是对耐药肿瘤。作者提出目前大多数具有肿瘤抑制作用的CARM1抑制剂主要是针对血液肿瘤，而针对实体肿瘤的抑制剂却很少，其疗效也有限。因此，文章重点致力于更有效的CARM1抑制剂的开发，特别是提高对实体肿瘤的选择性和疗效。在前期研究工作中，作者报告了ZL-28-6 (6)对CARM1表现出强效的抑制作用，但其选择性没有明显提高（图1）。因此，对化合物6进行结构修饰旨在进一步提高该化合物的选择性和抑制活性。图1 化合物6的结构及生物活性作者把化合物6的化学结构分为三个部分。首先，N, N-二甲基乙二胺的尾部基团插入入口通道，模拟底物精氨酸的侧链，与残基E257和E266形成氢键和盐桥，这对CARM1的催化活性至关重要。第二，中间的苯环与保守的疏水界面相互作用。第三，位于非保守区域的头部基团。此外，该化合物两个芳环之间的乙氧基增加了两个芳香环之间的灵活性，导致π−π与F152的相互作用；头部基团的氯原子与Q148形成卤素键，从而增加了对CARM1的抑制活性。（图2）图2 化合物6与CARM1的相互作用因此，作者以化合物6作为先导化合物，针对头部和尾部进行结构修饰得到一系列衍生物，评价了合成衍生物对CARM1和PRMT1的抑制活性。其中与先导化合物相比，化合物14g、14h、17e、17g和17h对CARM1抑制作用更好，同时对PRMT1抑制活性较弱（表1）。初步评价了这五个化合物在浓度为1 μM和10 μM下在A375和A2058黑色素瘤细胞系中的抗增殖活性，结果发现这些化合物在黑色素瘤细胞系中均表现出显著的增殖抑制作用，超过了已报道的阳性CARM1抑制剂EZM2302（表2）。随后，作者评价了这些化合物在小鼠肝微粒体中的代谢稳定性，化合物17e具有较低的体外清除率（CL = 132 mL/min/kg）以及半衰期延长（T1/2 = 41.55 min），展现出较高的微粒体代谢稳定性（表3）。因此，基于酶活性、细胞活性和体外代谢稳定性的评估，作者最终选择了化合物17e进行进一步的研究。表1衍生物对CARM1和PRMT1的抑制作用表2 选定的潜在CARM1抑制剂对两种细胞系的抗增殖活性表3 化合物在小鼠肝脏微粒体中的代谢稳定性首先，评估了化合物17e对不同癌细胞和正常乳腺细胞MDA-KB2的抑制作用。结果发现该化合物对黑色素瘤细胞A375具有特异性的抗增殖作用。此外，化合物17e抑制MDA-KB2细胞生长（IC50= 6.60 μM），但比A375的抗增殖半抑制浓度值大12倍，表明其有良好的安全性。图3 化合物17e对7种细胞系的抗增殖作用接下来评价了化合物17e对不同PRMTs的选择性。结果表明该化合物对不同的PRMTs表现出良好的选择性，PRMT1超过100倍，PRMT3超过450倍，PRMT6和PRMT8的选择性均超过30倍。此外，在浓度为100 μM时，17e对PRMT5和PRMT7均无抑制作用，这些结果表明该化合物具有显著的选择性。图4 化合物17e的选择性评价随后分析了化合物17e与CARM1的结合模式，利用分子对接技术预测了CARM1/17e复合物的结构，并进行了200 ns的分子动力学（MD）模拟，结果显示化合物17e在150 ns后达到平衡（图5 A）。紧接着利用MM-PBSA方法进行MD模拟，对相对结合能进行残基分解，研究与17e结合的关键氨基酸残基。Y149、F152、Y153、Q446氨基酸与化合物17e头部的苯和噻唑环形成π−π堆叠和疏水作用；氨基酸E257、M259、E266、H414和W415与化合物17e的尾部形成氢键相互作用（图5 B-D）。值得注意的是，F152和Q446在I型PRMT中是不保守的，表明它们与化合物17e的高选择性有潜在的关键作用（图5 E）。图5 （A）蛋白质和化合物17e的RMSD运动轨迹；（B-D）化合物17e与氨基酸的相互作用模式；（E）CARM1与PRMT1、3、6和8的序列比对随后，使用细胞热位移试验（CETSA）测定化合物17e是否可以进入细胞直接与CARM1蛋白相互作用。结果表明化合物17e以浓度依赖性的方式增强了CARM1的蛋白热稳定性，说明化合物17e可以进入细胞并直接与CARM1结合（图6 A，B）。此外为了探究17e是否能抑制细胞中CARM1的甲基化活性，作者检测了与17e孵育后CARM1底物的甲基化变化。用17e处理A375细胞72 h，结果显示化合物17e以剂量依赖的方式降低不对称二甲基-PABP1和整体aDMA的水平（图6 C）。另外，在A2058细胞中，17e也呈剂量依赖性地降低了不对称二甲基-PABP1的水平（图6 D）。这些发现证实了化合物17e可以通过抑制CARM1的甲基转移酶活性来影响细胞中CARM1底物的不对称二甲基化。图6 （A-B）化合物17e与CARM1蛋白之间的相互作用；（C）化合物17e降低A375中的精氨酸甲基化水平；（D）化合物17e降低A2058中的精氨酸甲基化水平最后，作者研究了化合物17e在体内的抗肿瘤活性，通过建立A375异种移植BALB/c裸鼠，分别以10 mg/kg/d和25 mg/kg/d腹腔注射药，持续14天。结果发现，化合物17e在体内可显著抑制肿瘤生长，肿瘤生长抑制率（TGI）分别为63%（25 mg/kg）和55%（10 mg/kg）（图7 A-D），并且没有明显的毒性。此外，通过蛋白印迹分析了肿瘤组织中aDMA、PABP1和PABP1me2a的水平，结果显示不对称二甲基化显著降低，这与细胞研究的结果一致（图7 E）。图7 化合物17e在A375细胞来源的异种移植物中的体内抗肿瘤活性。（A）肿瘤体积；（B）体重；（C）化合物17e处理后小鼠肿瘤重量；（D）对照组和治疗组肿瘤体积的视觉图；（E）蛋白免疫印记检测PABP1不对称二甲基化和aDMA水平在本研究中，作者采用结构辅助药物设计，对先前鉴定的I型PRMT抑制剂化合物6进行化学修饰，得到了一系列衍生物。值得注意的是，化合物17e对CARM1表现出显著的抑制活性，并对其他PRMT表现出较高的选择性。化合物17e有效抑制各种肿瘤细胞的生长，特别是黑色素瘤A375细胞，在A375异种移植模型中也显示出了抗肿瘤活性，没有引起明显的毒性。总之，化合物17e是一种高选择性和高效的CARM1抑制剂，具有良好的药理活性。这一发现为探索精氨酸甲基化调节作为一种新的癌症治疗策略铺平了道路。原文链接：https://doi-org.libproxy1.nus.edu.sg/10.1021/acs.jmedchem.3c02265声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！长按关注本公众号   粉丝群/投稿/授权/广告等请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓

引言虽然信使RNA (mRNA)已被证明是有效的疫苗，但其作为一般治疗方式的潜力受到其不稳定性和低翻译能力的限制。2024年3月22日，麻省理工学院化学系/博德研究所王潇及刘如谦（David R. Liu）等团队（陈泓宇为论文的第一作者）合作在Nature Biotechnology（IF 47）在线发表题为“Branched chemically modified poly(A) tails enhance the translation capacity of mRNA”的研究论文，该研究设计并合成了具有多个合成poly(A)尾的拓扑和化学修饰的mRNA，用于增加mRNA蛋白表达的持续时间和水平。该研究表明，优化后的多尾mRNA在细胞转染后24 - 72小时的发光信号是对照mRNA的4.7 - 19.5倍，在体内转染后14天的可检测信号是对照mRNA <7天的可检测信号。进一步在小鼠肝脏中以最小mRNA剂量实现了临床相关基因Pcsk9和Angptl3的高效多路基因组编辑。综上所述，这些结果提供了一种可推广的方法来合成具有显著增强翻译能力的带帽分支mRNA。信使RNA (mRNA)疗法最近因其可编程性、可扩展性和易于设计和合成而备受关注，2019年冠状病毒病(COVID-19) mRNA疫苗的快速发展证明了这一点。例如，mRNA已在早期临床试验中用于产生旁分泌血管内皮生长因子(一种用于治疗心力衰竭的蛋白质)和用于纠正导致杂合性家族性高胆固醇血症的突变的Cas9蛋白。用于酶替代、抗体治疗和基因编辑等应用的mRNA治疗需要持续的高水平蛋白质生产，但传统的mRNA药物存在RNA不稳定和低表达效率的问题，需要高剂量，可能导致细胞毒性。为了应对这些挑战，有必要努力提高mRNA载体的翻译持续时间和整体蛋白质产量。为了扩大mRNA药物的应用范围，人们做出了许多努力。用N1-甲基伪尿嘧啶(m1 ψ)替代尿嘧啶(U)通过阻断toll样受体识别降低免疫毒性。非翻译区(UTRs)的密码子优化和序列操作已被证明可以增加蛋白质表达。一种有望扩大mRNA药代动力学窗口的策略是使用环状RNA (circRNA)，它对外切酶切割具有抗性，而外切酶切割是线性mRNA降解的主要途径。然而，circRNA技术在目前的状态下面临着一些限制。circRNAs的翻译起始依赖于内部核糖体进入位点(IRES)，其效率低于7-甲基鸟苷酸(m7G)帽依赖的翻译起始机制。circRNA限制了化学修饰的使用，包括m1 ψ，因为它们阻断了circRNA合成所需的RNA剪接，并消除了基于IRES的翻译起始。类似的限制适用于自我扩增的RNA，其中复制响应保守序列元素与m1 ψ和生成的复制子是无帽的，具有免疫原性。因此，需要其他策略来保护mRNA转录物免受核酸外切酶依赖的快速衰变，特别是3' poly(A)尾部的死基化，同时保留有效的帽依赖翻译起始机制。支链化mRNA的合成及筛选流程（Credit: Nature Biotechnology）在最广泛接受的帽依赖翻译机制模型中，限速步骤是真核翻译起始因子(eIF4E和eIF4G24)组装以m7G帽为中心的翻译起始复合物。翻译起始复合物通过eIF4G与细胞质poly(A)-binding protein (PABPCs)的相互作用进一步稳定，后者识别3 ' poly(A)尾部，形成多聚体复合物和闭环结构。PABPCs具有双重作用，通过与eif结合启动翻译，并通过掩盖poly(A)尾部以防止死乙烯化来延长mRNA的稳定性。之前已经证明，在poly(A)尾部引入位点特异性的抗外切酶修饰，可能通过稳定新生的poly(A)尾部和维持poly(A) -PABPC1相互作用，有效地增加了纤维素中mRNA的稳定性和蛋白质的产生。结构研究表明，PABPC1是一种多聚体蛋白复合物，其中单个PABPC1分子结合poly(A)尾部形成稳定的宏观结构。为了实现上述目标，作者开发了具有多聚(A)尾部的化学修饰，帽状，分支的mRNA寡核苷酸偶联物，称为多尾(multitail) mRNA。系统地评估了poly(A)尾部不同的化学和拓扑模式对mRNA翻译能力的影响及其作用机制。已经在细胞系和小鼠中成功构建了可延长蛋白表达长达14天的支链mRNAs，并在最小剂量下提高了聚集规律间隔短回文重复(CRISPR)编辑效率。从RNA生物化学的更广泛的角度来看，该研究提供了一种可推广的方法，将定义的但不同的修饰引入到poly(A)尾部，并表明这些化学和拓扑模式被mRNA翻译机制很好地耐受。原文链接https://www-nature-com.libproxy1.nus.edu.sg/articles/s41587-024-02174-7责编|探索君排版|探索君文章来源|“iNature”End往期精选围观一文读透细胞死亡(Cell Death) | 24年Cell重磅综述（长文收藏版）热文Nature | 破除传统：为何我们需要重新思考肿瘤的命名方式热文Nature | 2024年值得关注的七项技术热文Nature | 自身免疫性疾病能被治愈吗？科学家们终于看到了希望热文CRISPR技术进化史 | 24年Cell综述

本文为转化医学网原创，转载请注明出处 作者：Jerry 导读： 细胞间通讯通常依赖于外泌体作为信使，在缺氧肿瘤微环境中对癌症转移至关重要。一些环状RNA(circRNA)富集在癌细胞来源的外泌体中，但对其调节细胞间通讯和癌症转移的能力知之甚少。 3月21日，复旦大学附属肿瘤医院唐爽/宋少莉教授团队在期刊《Advanced Science》上发表了研究论文，题为“Hypoxic Exosomal circPLEKHM1-Mediated Crosstalk between Tumor Cells and Macrophages Drives Lung Cancer Metastasis”。本研究中，研究人员通过系统分析非小细胞肺癌(NSCLC)细胞分泌的外泌体，发现了一种缺氧诱导的外泌体circPLEKHM1，它通过将巨噬细胞极化为M2型来驱动NSCLC转移。circPLEKHM1靶向治疗显著降低了体内NSCLC转移。 本研究揭示了一种新的circRNA介导的机制，揭示了癌细胞如何在缺氧肿瘤微环境中与巨噬细胞相互作用以促进转移，并强调了外泌体circPLEKHM1作为肺癌转移预后生物标志物和治疗靶点的重要性。 https://onlinelibrary-wiley-com.libproxy1.nus.edu.sg/doi/10.1002/advs.202309857 研究背景 01 转移是癌症死亡的主要原因，涉及肿瘤细胞与肿瘤微环境(TME)之间的相互作用。肺癌是全球癌症相关死亡的主要原因。大约50%的晚期NSCLC患者发生骨转移，治疗选择非常有限。转移的治疗仍然是一项重大临床挑战。 缺氧和肿瘤浸润的免疫细胞是促进转移的潜在微环境因素。作为肿瘤微环境中的主要免疫细胞，巨噬细胞优先聚集在肿瘤的缺氧区域，在那里它们极化为M2型肿瘤相关巨噬细胞，并与肿瘤细胞进行交流，促进癌症进展和转移。然而，缺氧肿瘤微环境指示巨噬细胞调节癌症转移的机制仍未得知。 目前还缺乏阻断肿瘤细胞-巨噬细胞交流来对抗癌症转移的办法。 研究发现 02 为了探讨缺氧诱导的外泌体在NSCLC转移中的作用，研究人员首先研究了这些外泌体是否能直接影响NSCLC细胞的迁移。与PBS对照相比，在缺氧诱导的外泌体中只观察到肿瘤细胞迁移的轻微增加，并且在缺氧和常氧外泌体中促进肿瘤细胞迁移的效果相当。这些结果表明，缺氧诱导的外泌体在癌细胞迁移过程中除了直接影响外，还可能发挥重要作用。研究还表明，缺氧外泌体预处理的巨噬细胞对NSCLC细胞迁移能力的增强作用最为显著，且可促进NSCLC细胞迁移，并上调NSCLC细胞中N-cadherin和波形蛋白的表达。 这提示缺氧外泌体可通过巨噬细胞介导NSCLC细胞转移。 为了研究circPLEKHM1-ASO在体内的作用，研究人员通过心内注射给肺癌转移小鼠模型施用circPLEKHM1-ASO。结果表明，与对照组相比，circPLEKHM1-ASO治疗显著降低了肺癌转移并提高了总生存率，同时显著降低了转移浸润巨噬细胞中的circPLEKHM1水平。在另一肺癌骨转移的临床前小鼠模型中，获得一致结果，即circPLEKHM1-ASO治疗显著降低了NSCLC的骨转移。此外，体内微CT扫描显示，circPLEKHM1-ASO治疗显著减少了NSCLC荷瘤小鼠骨转移过程中的骨破坏，并增加了骨密度。与此一致的是，在circPLEKHM1-ASO治疗的小鼠肿瘤中发现了M2巨噬细胞标志物(CD206和CD115)表达和OSMR表达的显著降低。 这证明，circPLEKHM1通过调节OSMR介导的巨噬细胞极化来促进NSCLC的转移。总之，circPLEKHM1-ASO在体内显著抑制了NSCLC转移并减少了肿瘤M2型巨噬细胞。 研究结果还表明，circPLEKHM1是通过OSMR介导的M2巨噬细胞抑制NSCLC转移的关键治疗靶点。 缺氧诱导的外泌体circPlEKHM1通过巨噬细胞促进NSCLC转移 研究结论 03 总之，研究人员发现外泌体circPLEKHM1作为一种在NSCLC中强有力的缺氧诱导转移促进环状RNA，作为NSCLC转移的预后生物标志物和治疗靶点。外泌体circPLEKHM1对TME中的缺氧做出反应，并作为癌细胞-巨噬细胞串扰的信使，通过增强PABPC1-eIF4G相互作用作为调节OSMR介导的M2巨噬细胞极化的关键支架来促进NSCLC转移。 参考资料： https://onlinelibrary-wiley-com.libproxy1.nus.edu.sg/doi/10.1002/advs.202309857 注：本文旨在介绍医学研究进展，不能作为治疗方案参考。如需获得健康指导，请至正规医院就诊。 热门·直播/活动 🕓 上海｜06月14日-16日 ▶ 第六届上海国际癌症大会将于6月14-16日在上海举办，学科交叉，共同推进肿瘤研究与诊治多模态！ 🕓 北京｜09月20日-21日 ▶ 第五届单细胞技术应用研讨会暨空间组学前沿研讨会欢迎您的参与！ 点击对应文字 查看详情