KLF2

*仅供医学专业人士阅读参考作为抗肿瘤免疫应答的主力，CD8+T细胞的一举一动可以说都备受关注，但从时间维度上来看，各种基础研究大多只抓取了某个特定的时间节点，并没有一直追踪着CD8+T细胞在肿瘤微环境中的全程动态变化，如果做到了这一点，又能揭示什么奥秘呢？近日在Nature Cancer期刊上，以色列魏茨曼科学研究所团队发表的最新研究，就成功在单细胞层面构建了持续追踪肿瘤特异性CD8+T细胞分化和增殖动态变化的模型，进而评估PD-1抑制剂治疗的作用及影响疗效的因素；研究者们发现，1型经典树突状细胞（cDC1）的共刺激，是大量肿瘤特异性CD8+T细胞流入肿瘤微环境的关键环节；而将PD-1抑制剂与4-1BB激动剂联合使用，就可正向调节CD8+T细胞的“流向”，有力激活免疫应答[1]。论文首页截图为了实现持续追踪肿瘤特异性CD8+T细胞的目标，研究者们构建模型时可以说是煞费苦心：研究选用了OT-1小鼠模型（可特异性识别卵清蛋白/OVA抗原）和相应的黑色素瘤细胞系（B16-OVA），并在植入黑色素瘤细胞的10天后，向小鼠体内注射等量的OT-1特异性CD8+T细胞和非特异性的“旁观”CD8+T细胞。完成初步模型构建后的第1-第45天，研究者们均会对肿瘤微环境、肿瘤引流淋巴结（tdLN）和脾脏进行取样，对OT-1特异性CD8+T细胞、“旁观”CD8+T细胞和内源性T细胞进行单细胞RNA测序，并采用相同的追踪策略评估结直肠癌小鼠模型作为对照。研究者们总共收集到了12万多个CD8+T细胞在不同状态下的特征，用于开展后续的一系列分析。研究建模方法汇总根据关键细胞因子表达提示的细胞功能状态，研究者们首先对CD8+T细胞进行了分类，较为突出的类别有幼稚样（naive-like，特征为高表达Sell, Klf2及Tcf7）、记忆样（memory-like，特征为高表达Tcf7及Ccr7）等，效应CD8+T细胞也可细分为炎症效应型、早期效应型和细胞毒效应型等等，但不管是哪一类CD8+T细胞，都要经历一定的动态变化。拿研究分析的主角——肿瘤特异性CD8+T细胞（即OT-1特异性）来说，它们在植入小鼠体内后第3天，才在tdLN中的数量超过旁观CD8+T细胞，到第6天才在肿瘤微环境中占据多数；而从功能上来看，肿瘤特异性CD8+T细胞足足经历了6个阶段的改变：第1阶段：早期效应阶段，特征是进入小鼠体内后快速大量分泌细胞因子第2阶段：植入小鼠体内后3天，CD8+T细胞的早期效应特征逐步减退，开始富集激活状态和细胞毒性-功能异常表征第3-4阶段：CD8+T细胞活性进一步减弱，逐渐转向前体幼稚样和记忆样状态第5阶段：对应植入小鼠体内后第6-15天，CD8+T细胞的细胞毒效应性频率和功能异常频率同时出现上升，对应免疫检查点表达显著上调等表征第6阶段：对应植入小鼠体内的4周后，植入的CD8+T细胞已进入晚期功能异常状态，与小鼠体内的内源性CD8+T细胞无异CD8+T细胞的动态变化全过程然而在tdLN和脾脏内，肿瘤特异性CD8+T细胞经历的变化过程与肿瘤微环境中明显不同，特别是在tdLN中，肿瘤特异性CD8+T细胞在植入小鼠体内3天后的增殖速率明显加快，研究者们由此推测，这部分来自tdLN的CD8+T细胞快速增殖，是它们随后大量涌入肿瘤微环境的决定性因素；文章开头提到的cDC1s细胞，就是在这一步起到了关键的调控作用。接下来，研究者们分析了PD-1抑制剂治疗对上述动态变化过程的影响：伴随着PD-1抑制剂对肿瘤生长的显著抑制，肿瘤特异性CD8+T细胞在肿瘤微环境中能更早占据数量优势（植入后第5天，占比超过90%），在表型状态上也更多见早期效应型和细胞毒效应型，相关调控基因表达也有显著改变，如编码4-1BB（对应早期效应型）的Tnfrsf9表达就显著上调。而在tdLN中发生的唯一显著改变，则是CD8+T细胞快速增殖的状态更盛。综合这两方面来看，PD-1抑制剂对肿瘤特异性CD8+T细胞动态变化的影响，主要是使更多的CD8+T细胞从tdLN涌入肿瘤微环境，并在微环境中促使它们向效应表型分化；而联用4-1BB激动剂的价值就在于影响第二步，即它会使更多CD8+T细胞向早期效应型和细胞毒效应型转化。PD-1抑制剂联合4-1BB激动剂可更好地激活CD8+T细胞和抗肿瘤免疫应答最后，研究者们对人类乳腺癌患者的CD8+T细胞基因表征进行分析，找到了与小鼠实验高度相似的幼稚样、细胞毒性和功能异常CD8+T细胞状态及动态变化表征，且对接受PD-1抑制剂治疗的乳腺癌患者，是否表达共刺激基因（CD27、TNFRSF9）、效应基因（GZMH）和免疫检查点LAG3，就可作为预测治疗应答的关键标志物。研究者们在论文中表示，未来希望能有更多同类研究，把追踪动态变化的范围进一步扩展到CD4+T细胞、NK细胞、树突状细胞等关键免疫细胞亚群，这样才能真正厘清复杂的肿瘤微环境和影响免疫治疗的因素，并基于这种动态变化框架设计临床研究，真正实现免疫治疗的个体化、精准化，不要总想着靠一种药物、一个方案就解决问题啦。参考文献：Barboy O, Bercovich A, Li H, et al. Modeling T cell temporal response to cancer immunotherapy rationalizes development of combinatorial treatment protocols[J]. Nature Cancer, 2024.本文作者丨谭硕

点击图片查看OTC2023类器官前沿应用与3D培养论坛会后报告，OTC2024论坛征集投稿做报告，详询：王晨 180 1628 8769内耳感觉上皮由感觉毛细胞和非感觉支持细胞所构成，声音的感受以及声-电信息转换由内耳感觉上皮的毛细胞所完成。感觉上皮的完整性对于听觉功能感知极为重要，哺乳动物的毛细胞一旦受损，难以自发性再生，因此明确感觉上皮的发生和维持的机制对听觉功能重建策略的制定极为重要。目前发育生物学集中在研究内耳前体细胞本身的内部基因特化为感觉上皮，然而，驱使内耳前体细胞转变为感觉上皮细胞的源动力未知。近期，复旦大学附属眼耳鼻喉科医院李文妍教授、李华伟教授团队和浙江大学贺永教授团队合作，在Science子刊《Science Advances》期刊发表题为“Varying Mechanical Forces Drive Sensory Epithelium Formation”的研究论文，该项研究破解了内耳感觉上皮发生源动力的这一谜团。该研究通过建立力学性能可控的水凝胶体系培育内耳类器官，揭示了细胞外基质（ECM）的力学梯度变化为促发内耳感觉上皮发生的动力，并分别解析了不同硬度引发内耳前体细胞扩增及分化的信号调控分子机制，为感音神经性耳聋的再生治疗提供了新线索。图1 机械性能可控的水凝胶体系调控内耳类器官形成机制1. 建立机械应力可控的复合水凝胶体系研究团队结合既往研究基础，假设ECM挤压为推动感觉上皮发生的动力，结合类器官研究发育的巨大优势，制备机械应力可控的复合水凝胶体系，通过改变水凝胶的机械参数研究内耳类器官的生物学特性。为高效调控类器官培养过程中的机械应力，团队开发了由GelMA（EFL光固化GelMA水凝胶产品介绍）、HA及RGD（EFL丙烯酰化RGD肽产品介绍）三种组分构成的类器官培养用复合水凝胶。其中光固化的GelMA水凝胶，是明胶和甲基丙烯酸酐交联合成，其具备生物兼容性优越，理化属性稳定可控的特点。HA作为一种天然存在于生物体内的糖胺聚糖，可进一步提高凝胶基质稳定性和亲水性。同时RDG为作为细胞粘附的功能基团，增加水凝胶的生物兼容性。通过明确水凝胶功能成分不同浓度对类器官细胞活性影响，划定各成分范围。探索了各个成分不同浓度对水凝胶硬度、吸水性能、孔径等影响，以GelMA浓度作为水凝胶机械应力调控的参数。图2 复合水凝胶机械性能及表征2. 水凝胶硬度调控内耳类器官形成为探索ECM对内耳前体细胞命运影响，团队通过改变水凝胶机械参数，培育内耳前体细胞来源类器官。随着水凝胶的硬度增加，1.5kPa条件的水凝胶硬度能够最佳的促进类器官细胞的增殖，与Matrigel中培养相当。继续增加水凝胶的硬度会导致细胞增殖能力的减退，包括前体细胞标志物Lgr5的表达。将1.5kPa水凝胶中培育的类器官分别种植于不同硬度水凝胶继续培养半个月后，发现类器官细胞细胞分化为毛细胞的效率在0.2-5kPa呈现逐渐增加，继续增加硬度会使毛细胞的分化效率下降。因此，内耳前体细胞的命运受ECM的硬度所调控。5kPa复合水凝胶中的类器官毛细胞比例高于Matrigel中培养的比例，可控水凝胶体系可更好的诱导内耳类器官的形成。将复合水凝胶体系培育的内耳类器官发育过程与体内感觉上皮发育过程进行类比，发现多个关键标志物呈现相同的表达趋势，证实了水凝胶中类器官可以高度模拟感觉上皮的生物学特性。原子力显微镜检测发育过程中的上皮紧靠的间质细胞（主要ECM分泌细胞）区域，发现细胞特化的关键时间点，该区域硬度处于最好水平，进一步说明ECM硬度调控内耳感觉上皮形成。图3 水凝胶硬度调控类器官细胞扩增和分化3. 解析ECM硬度调控感觉上皮发生机制通过对发育规律的解析，可解析相关调控细胞命运的关键靶点。对中等硬度（1.5kPa）促细胞增殖机制进行解析，干预YAP，F-actin等靶点发现其传导中等ECM的作用。并明确中度的细胞外基质硬度通过细胞表面的ITGA3感知，继而细胞内F-actin骨架重聚，诱发YAP核转位来驱动前体细胞的增殖。图4 ECM中等硬度调控内耳前体细胞扩增的机制Bulk-RNAseq对比中等硬度（1.5kPa）和高硬度（5kPa）水凝胶当中的类器官基因组学特征，找到相关关键差异基因及富集信号。通过相关小分子化合物抑制剂和基因联合干预，揭示较高的细胞外基质硬度促发感觉上皮的特化则需要细胞表面的机械感受分子PIEZO2的活化，使得钙离子内流，驱使细胞内ERK去磷酸化，活化转录因子KLF2来驱动细胞命运转变，实现前体细胞分化为毛细胞和支持细胞。ECM梯度硬度变化促发内耳前体细胞扩增和分化的机制得到解析，为感音神经性耳聋的再生治疗提供了关键的靶点。图5 ECM高硬度调控内耳前体细胞分化的机制4. 结构化类器官：3D打印下一代内耳类器官团队利用复合水凝胶的可操控性，结合3D打印技术，打印内耳类器官细胞，构建了具备螺旋状的上皮形态，高度类似于体内的内耳感觉上皮形态。这一形态颠覆了既往内耳类器官的囊状结构，使得内耳类器官有望能从无序发育迈向结构化调控。图6 3D打印内耳感觉上皮结构化螺旋状类器官复旦大学附属眼耳鼻喉科医院夏明宇、吴明轩及浙江大学机械工程学院李元戎为该研究共同第一作者，李文妍教授、李华伟教授和贺永教授为共同通讯作者。此项研究工作的参与者还有：刘耀谦、马艽遥、楼伊云、贾高干、高庆等。本研究由科技部“干细胞及转化研究”国家重点研发计划、国家自然科学重大专项和上海市科委项目等多项基金的资助。文章来源：https://www-science-org.libproxy1.nus.edu.sg/doi/10.1126/sciadv.adf2664点击图片查看OTC2023类器官前沿应用与3D培养论坛会后报告，OTC2024论坛征集投稿做报告，详询：王晨 180 1628 8769

耳聋是人类发病率最高的感官缺陷性疾病，其中由耳蜗感觉上皮的毛细胞或其连接螺旋神经元缺失、功能障碍所引起的感音神经性聋占主要部分。目前，生物治疗方面，除了极少数的基因突变所致感音神经性耳聋有相应的基因纠正实现听觉恢复的策略，绝大部分的感音神经性耳聋仍难以治愈。耳蜗感觉上皮是听觉信息感知和声电转换的重要功能单元，再生策略重建感觉上皮完整性和神经通路功能连接是治疗感音性神经性耳聋希望所在。明确内耳感觉上皮发育的事件和规律，对于再生治疗策略实现听觉功能恢复极为重要。感觉上皮形成经历了前体细胞阶段性扩增和特化的动态过程，其基因调控机制复杂。过往内耳发育生物学聚焦于细胞内部的基因调控命运的转变，而调控内耳前体细胞命运转变的驱动力仍未知。图1 类器官揭示生物机械应力调控听觉器官形成为克服发育的内耳深在颞骨难以操控等问题，复旦大学附属眼耳鼻喉科医院李文妍研究员、李华伟教授课题组与浙江大学机械工程学院贺永教授课题组合作，借助内耳类器官模型，并建立机械力可控的复合水凝胶体系操控其生长，揭示了细胞外基质（ECM）机械应力为内耳感觉上皮发生的驱动力。相关成果“Varying Mechanical Forces Drive Sensory Epithelium Formation”于2023年11月3日发表在Science子刊《Science Advances》。该项研究制备机械性能可控的复合水凝胶体系，培育内耳前体细胞来源的类器官，通过操控水凝胶的机械应力，可精准的控制类器官细胞的扩增和向毛细胞定向分化。作者假设水凝胶的机械应力模拟内耳发育的周围ECM的推挤力，推动感觉上皮的发生。通过比对一系列动态形成的类器官和体内耳蜗上皮的分子标志物以及发育的感觉上皮周围的硬度，验证水凝胶机械应力推动含有毛细胞类器官形成高度模拟了ECM机械应力驱使内耳感觉上皮发生。图2 ECM机械应力调控内耳感觉上皮发生的机制进一步剖析ECM机械应力如何调控细胞内部的信号实现阶段性的扩增和特化，作者发现中度机械力活化了ITGA3、F-actin骨架、YAP等重要信号机械转导分子，并通过基因和抑制剂等联合干预，揭示ECM机械力调控前体细胞扩增通过细胞表面的ITGA3感知，促发F-actin骨架重聚，继而使得YAP进入细胞核完成该过程。为明确细胞分化阶段的调控规律，利用RNAseq对比中度机械力和高度机械力水凝胶培育的内耳类器官的基因组，发现机械感受分子PIEZO2、ERK信号、机械转导效应分子KLF2等的编码基因明显改变。继而，通过上下游基因干预和小分子化合物抑制剂等联合干预，明确ECM机械力调控内耳前体细胞转变为毛细胞的机制：ECM机械力活化PIEZO2，使得钙离子内流，继而使得ERK去磷酸化，导致转录因子KLF2的活化实现前体细胞特化为毛细胞这一过程。图3 3D打印高度类似内耳感觉上皮的螺旋状类器官该项研究突破性利用内耳类器官剖析内耳发育的规律，解析了相应调控细胞增殖和分化的靶点，相关靶点将应用于感音神经性耳聋重建策略的制定研究。为使得内耳类器官更加形态化模拟感觉上皮的螺旋状结构，本研究利用复合水凝胶结合3D打印技术构建了高度类似内耳感觉上皮的类器官，形成的毛细胞具备纤毛样形态。这一形态颠覆了以往内耳类器官的封闭囊状结构，推动内耳类器官迈向结构化。李文妍、李华伟团队长期从事感音神经性耳聋的临床和基础研究，深耕内耳类器官平台开发和应用。此前团队开发内耳类器官培养体系，发现细胞外基质（ECM）的机械物理作用调控内耳前体细胞的增殖的机制(Xia et al., 2020)，该项研究发现的YAP关键分子为毛细胞再生提供了关键靶点。分阶段打造听觉通路体外模型，建立了首个具备功能性突触连接的耳蜗微器官(Xia et al., 2023)，目前正推向毛细胞及螺旋神经元突触连接功能障碍的疾病模拟、基因筛选、药物筛选的相关应用研究。复旦大学附属眼耳鼻喉科医院夏明宇、吴明轩及浙江大学机械工程学院李元戎为该研究共同第一作者，李文妍研究员、李华伟教授和贺永教授为共同通讯作者。此项研究参与人员还有复旦大学刘耀谦、马艽遥、楼伊云、贾高干和浙江大学高庆等。本研究由科技部“干细胞及转化研究”国家重点研发计划、国家自然科学重大专项和上海市科委项目等多项基金的资助。原文链接：https://www-science-org.libproxy1.nus.edu.sg/doi/10.1126/sciadv.adf2664参考文献：Xia, M., Chen, Y., He, Y., Li, H., and Li, W. (2020). Activation of the RhoA-YAP-beta-catenin signaling axis promotes the expansion of inner ear progenitor cells in 3D culture. Stem Cells 38, 860-874.Xia, M., Ma, J., Wu, M., Guo, L., Chen, Y., Li, G.L., Sun, S., Chai, R., Li, H., and Li, W. (2023). Generation of innervated cochlear organoid recapitulates early development of auditory unit. Stem Cell Reports 18, 319-336.本文仅用于学术分享，转载请注明出处。若有侵权，请联系微信：bioonSir 删除或修改！