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摘要:人类猴痘病毒（Mpox）被归类为痘病毒科（Poxviridae）的成员，属于正痘病毒属。Mpox具有双链DNA，并且已知有两个遗传谱系：起源于西非和刚果盆地的谱系，通常被称为中非谱系。Mpox可以通过天花疫苗接种或治疗剂进行治疗。修改天花疫苗用于治疗和预防Mpox已被证明是有益的，因为天花病毒和Mpox病毒之间有很强的联系，并且它们被归类为同一科。使用两种美国食品药品监督管理局（FDA）批准的天花疫苗（ACAM2000和JYNNEOS）对Mpox的交叉保护是有效的。然而，ACAM2000有潜在的显著不良反应，如心脏问题，而JYNNEOS的风险较低。此外，尽管天花疫苗已停止使用40年，但Mpox仍以改变的特征重新出现。两种针对SARS-CoV-2及其多种变体的领先mRNA疫苗的安全性和有效性已在临床试验和随后的数据分析中得到证明。这种第一种mRNA治疗模型涉及向患者注射信使RNA以产生目标蛋白并引发免疫反应。高效力、安全给药的可能性、低成本制造和快速开发只是RNA疫苗的一些好处，为传统疫苗提供了可行的替代方案。在预防Mpox感染方面，mRNA疫苗非常有效，并且有一天可能会取代现有的全病毒疫苗。因此，本文的目的是提供对正在进行的Mpox mRNA疫苗的研究、开发和测试的概述。 引言 猴痘病毒（Mpox）可能是痘病毒科（Poxviridae）和正痘病毒属（Orthopoxvirus）中不常见的成员。西非和刚果盆地的谱系，通常被称为中非谱系，是两种基因上不同的Mpox谱系。Mpox具有双链DNA（dsDNA）。1958年，在哥本哈根血清研究所，该病毒在猴子中被发现，并被命名为“Mpox”。1970年8月，一名发烧的9岁男孩在刚果民主共和国（DRC）的Basankusu医院被诊断出首例Mpox感染。2003年，美国中西部地区首次在非洲以外地区出现Mpox。这次爆发中，土拨鼠，美国本土动物，被命名为储库，而不是猴子和松鼠。从加纳传入的感染冈比亚囊鼠将Mpox病毒传入土拨鼠，进而传入美国。此外，关于Mpox的进化历史以及病毒在非洲的多样化时间和地点，仍然有许多未知之处。世界卫生组织（WHO）表示，截至2022年7月20日，在2022年5月首次在英国确认后，Mpox爆发已蔓延至82多个地点。这项流行病学研究报告了2022年马德里爆发的前5周内508例确诊的人类Mpox病例。在这次大规模爆发中，几乎所有病例（99%）发生在与男性发生性关系的男性（MSM）中，皮疹主要发生在生殖器、会阴或肛周区域，以及腹股沟区域的淋巴结肿大，表明在性活动中的密切身体接触在这次爆发中的传播中高度相关。2022年5月，一场新的Mpox大流行在所有六个WHO地区被检测到。WHO于2022年7月23日宣布其为公共卫生紧急情况。在当前大流行之前，Mpox已在中非和西非国家的各个地区有记录。此外，非非洲人群中的绝大多数Mpox病例归因于前往疾病流行国家的国际旅行或进口牲畜。由于天花疫苗引起的免疫下降，Mpox有潜力感染全球人口。虽然该病毒通常不会在健康免疫系统的个体中引起显著的死亡率，但如果它传播到免疫受损的个体、儿童、老年人、孕妇或有包括糖尿病在内的合并症的个体，可能会发生严重的疾病和死亡。据推测，95%的感染个体通过亲密接触传播。发现41%感染HIV的人是同性恋或双性恋男性，占感染者的98%。此外，到2022年，3-6%的确诊病例已经死亡。非洲以外的首例Mpox记录发生在2003年美国中西部。共有71人感染了该病毒；然而，没有报告死亡病例。2005年，在苏丹记录了49例病例；随后的基因分析研究揭示，病毒的来源可能不是苏丹而是DRC。非洲记录了更多的麻疹病例，DRC从2011年到2014年每年报告大约2000例。2017年9月，记录了118例确诊病例；2018年9月，英国报告了首例病例。自2022年5月以来，当前爆发的病例在欧洲、大洋洲、亚洲和美洲的非流行地区报告。超过70个国家共有16000人被证实死亡；目前的死亡人数为0.03%。病毒的地理传播可能归因于从受疾病影响的国家进口或国际运输受感染的动物。Mpox在全球范围内以集群爆发的形式出现，不仅引起了WHO的关注，也促使国际卫生组织以高度警惕和广泛合作。从目前在不同国家流行的Mpox DNA分离物的基因组测序初步结果表明，影响多个国家的爆发可能归因于西非谱系。值得注意的是，从多个国家获得的Mpox基因组序列与西非谱系发现的谱系存在差异。然而，需要进一步研究以确定这些突变或基因组变化对病毒的传播性、毒力和免疫逃逸的影响。尽管Mpox症状通常持续两到四周并且是自限性的，但严重病例可能会发生，并且有3%到10%的病死率。然而，一些获得许可的药物和疫苗只给予患有严重疾病或免疫系统受损的人。目前还没有针对Mpox感染的有效和安全的治疗方法。天花疫苗接种已在大多数社区和国家停止，导致免疫力下降。尽管有证据表明天花疫苗可以85%地保护Mpox，但自从WHO在1980年宣布天花病毒灭绝以来，就没有提供过针对天花病毒的免疫接种。此外，在孕妇中，通过胎盘的传播与先天性Mpox有关，这可能在分娩期间和分娩后以及新生儿中表现出来。保护的持续时间尚不清楚。如果疫苗接种减少性Mpox传播，爆发将被控制并防止在最初高风险群体内外进一步传播。 抗病毒药物治疗已经感染了致病性正痘病毒的个体将提供即时的好处，与疫苗相比，疫苗的保护效果是延迟的。抗病毒药物在控制疫情方面的有效性尚未得到检验，因为在天花根除运动期间它们并不可用。抗病毒治疗无疑将对未接种疫苗的Mpox患者进行治疗和控制疾病传播有利。还开发了多种核酸检测技术来检测和表征Mpox。DNA聚合酶（E9L）和包膜蛋白（B6R）是实验中关注的两个正痘病毒基因。目前还没有针对Mpox引起的疾病获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准的特定治疗方法。然而，有几种抗病毒药物（Tecovirimat、Cidofovir、Brincidofovir和静脉注射天花免疫球蛋白（VIGIV））是为治疗天花而开发的，现在正在用于治疗Mpox。然而，关于它们治疗Mpox感染的效力没有信息。 鉴于WHO宣布Mpox感染为全球公共卫生紧急情况，各国必须优先考虑及时和全面评估效力和效果，以确保为迅速实施疫苗接种做好准备。WHO在2022年6月24日发布了关于Mpox免疫接种的临时建议，强调目前不需要也不建议广泛接种。在疫苗效力的合作研究中，使用标准化程序和数据收集方法至关重要。WHO非常重视为疫苗接种倡议提供支持，其中包括监测和接触者追踪。此外，WHO强调需要在这种特定环境中实施有效的公共卫生沟通和强大的药物警戒。JYNNEOS疫苗已获准在美国当前的疾病爆发期间用于天花和Mpox预防。JYNNEOS可以被ACAM2000替代，ACAM2000已获批准用于帮助天花和Mpox预防。在III期临床试验中，改良的安卡拉牛痘病毒（MVA）显示出有利的安全性。然而，重要的是要注意，在MVA能够获得许可用于一般人群作为预防天花和Mpox感染的预防措施之前，还需要进行更大规模的疫苗研究。产品的定价是要考虑的因素之一。因此，使用ACAM2000或MVA对Mpox和天花进行暴露后疫苗接种仍然是首选选项。尽管有潜力，ACAM2000和MVA疫苗尚未满足全球医疗需求。新研究表明，使用JYNNEOS疫苗接种仅部分增加了针对Mpox的中和抗体（nABs）的产生。因此，为了对抗当前的Mpox，迫切需要一种安全、有效且易于获得的特定Mpox疫苗。使用核酸疫苗可以开发出针对该疾病的安全有效疫苗。大规模疫苗生产也容易且便宜。mRNA疫苗在预防病毒感染方面提供了许多优势。这些包括它们能够快速且大规模合成、出色的安全记录无需核输入以及在刺激体液和细胞免疫反应方面的效力。一旦进入，细胞将mRNA解释为一组指令并构建与病原体上的抗原结合的蛋白质。免疫系统将这些外来抗原识别为入侵者，动员称为ABs和T细胞的防御，并为免疫系统准备可能的未来攻击。斯坦福医学院的研究人员发现，旨在对抗COVID-19的辉瑞/BioNTech mRNA疫苗在刺激杀手T细胞方面表现出优越的效力，这是免疫系统的关键组成部分，与严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）的自然感染相比，SARS-CoV-2是2019冠状病毒病（COVID-19）的病因。多项研究提供了支持使用脂质纳米颗粒（LNPs）作为mRNA疫苗传递机制的有利使用的证据，由于在抑制Mpox方面取得了显著进展。这种现象的原因是纳米颗粒（NPs）被广泛认为是连续传递的可靠机制，确保了mRNA的完整性，增强了细胞吸收，并提高了核酸在宿主细胞内的传递和释放效率。研究人员还应推进对Mpox、其临床管理和感染控制和预防专业知识的了解，特别是在公共卫生人员中。应保证平等获得医疗保健和疫苗的机会，并充分解决MSM社区中的歧视和污名化问题。最后，研究人员应启动国际伙伴关系，进行临床研究，以检验Mpox疫苗和抗病毒药物的有效性和安全性。 考虑到关于Mpox的现有条件，应特别关注接种这种病毒。因此，在这项研究中，我们将检查Mpox的不同特征、预防方法和不同设计的mRNA疫苗。 Mpox的特征和结构 1970年在非洲报告了首例人类Mpox感染。正痘病毒的自然储库是小型啮齿动物，人类和灵长类动物是偶然宿主。天花免疫接种诱导对Mpox的交叉保护。六十年前，全球天花根除计划（GSEP）和Mpox在非洲共存。2022年人类Mpox爆发引发了对Mpox对GSEP倡议可能影响的文献评估。由于两种正痘病毒是相同的，证明没有非人类天花储库对评估GSEP至关重要。发现非人类天花储库非常遥远。人类Mpox限于未接种疫苗的个体，并未在接种天花疫苗的人类中表现出来。1989年之前，在DRC的监测确定Mpox极不可能在人类中持续存在，并发展成为重大的公共卫生问题。在天花疫苗接种停止几十年后，2005年至2007年在DRC的Mpox监测显示，人类Mpox的发病率增加了20倍，这与以前接种天花疫苗的比率大大降低有关。 天花仅在人与人之间传播，没有公认的人畜共患宿主；相反，猴痘可以通过动物宿主传播给人类。人类猴痘在西非和中非的农村社区间歇性地存在，那里的血清学调查由WHO资助。1986年之前，基于人群的调查估计，12-15%的儿童对正痘病毒有抗体。患者的平均年龄仅为四年半。338例猴痘病例中有245例归因于动物来源。从加纳进口的啮齿动物贸易引发了疫情，这些啮齿动物被作为异国情调的宠物出售。有推测这些啮齿动物通过动物与动物的接触将感染传播给了共同饲养的土拨鼠，土拨鼠也是作为宠物购买的。尽管报告了47例确诊和可能的病例，但没有死亡发生。大多数病变是孤立的皮肤病变。为与人类病例和商业啮齿动物有直接接触的个体提供了天花疫苗（DryVax，Wyeth）。2003年美国爆发的两例人与人之间的传播可能是一个因素；然而，与感染啮齿动物的接触仍然是可能的。 在电子显微镜下，猴痘具有可识别的椭圆形或砖形结构，具有大小在200到400纳米之间的脂蛋白包膜。尽管是一种DNA病毒，猴痘在与糖胺聚糖结合并进入宿主细胞后，在感染细胞内完成其生命周期。为了进入宿主细胞，还提出了使用经典的凋亡模拟机制。其他方法包括通过基于肌动蛋白的大胞饮作用机制的内体摄取，或通过病毒包膜上的配体与宿主细胞的质膜受体（如硫酸肝素或硫酸软骨素）的相互作用，这导致病毒包膜的片段分散在质膜中。然后病毒将酶和病毒蛋白分泌到细胞质中，削弱细胞防御并促进早期基因表达，导致早期蛋白的发展，DNA复制和中间转录因子的创造。具有每个侧面的侧体的外膜，保护膜结合，一个充满dsDNA基因组和转录因子的酶填充的核心。 以前的研究表明，猴痘基因组与天花基因组高度相似，大约为96.3%。这种相似性归因于猴痘基因组内的基本酶和蛋白。此外，在190个开放阅读框（ORFs）中发现了60多个氨基酸残基。在56,000-120,000的核苷酸位置，猴痘，一个非常保守的中央编码区序列（CRS），被各种末端包围，包括倒置末端重复（ITRs）。猴痘基因组的ITR区域至少有四个已识别的ORFs。猴痘病毒颗粒包含30多种膜和结构病毒蛋白以及与DNA依赖性RNA聚合酶相关的转录酶。病毒有两种不同的传染性形式，即细胞外包膜病毒（EEV）和细胞内成熟病毒（IMV）。EEV被认为在早期扩散中起着至关重要的作用，而IMV是在细胞溶解时产生的。IMV和EEV基本上非常不同，因为IMV缺乏最外层的膜层并以不同的方式感染细胞（图1）。然而，这两种病毒颗粒具有不同程度的病毒蛋白整合。尽管猴痘复制复杂，但它与其它正痘病毒的复制方式广泛接受为相同。 图1 被双链DNA猴痘病毒感染的细胞将同时具有细胞内成熟的病毒（IMV）和细胞内包膜病毒（IEV）。猴痘是最大和最复杂的病毒之一，其特征为砖形结构，长度在220-450纳米，宽度在140-260纳米。它由核心、侧结构、外膜和外脂蛋白包膜四个组成部分构成。核心由双链病毒DNA和核心纤维组成，是中心组件。栅栏层是一个围绕这一特定层的不可渗透结构。中央的核、侧体和栅栏层都被包含在外膜中。 猴痘感染中的免疫反应 先天和适应性免疫有助于正痘病毒的识别和根除。正痘病毒利用许多DNA感应系统，如DNA依赖性蛋白激酶、Toll样受体9（TLR-9）、环状鸟苷酸-腺苷酸（环状GMP-AMP，cGAMP）合成酶和干扰素γ（IFN-γ）可诱导蛋白16，来触发免疫反应。核因子κB（NF-κB）和IFN信号通路由于DNA感应器激活刺激干扰素基因（STING）而被激活。正痘病毒产生dsRNA中间体，刺激TLR3和蛋白激酶R（PKR）。PKR和TLR激活NF-κB和IFN途径。真核翻译启动的2A复合体也被PKR磷酸化，通过这种机制抑制mRNA翻译。在识别病毒并启动早期先天反应后，随后的病毒根除严重依赖适应性免疫反应。大多数造血抗原呈递细胞（APCs）是CD14+单核细胞。这些细胞可以向CD4+和CD8+T细胞展示猴痘抗原，因此有助于细胞因子的产生，消除感染细胞和宿主的血清学反应。感染淋巴结的肺和纵隔淋巴管，以及窦充满了免疫阳性的单核细胞，用于痘病毒抗原，表明这些细胞是淋巴和随后的血液传播的主要载体。淋巴组织、皮肤、口腔粘膜、胃肠道、生殖系统和肝脏的病变似乎是通过与单核细胞相关的病毒血症进行系统性病毒传播的结果。研究人员假设单核吞噬系统在促进病毒在系统性感染期间向全身的二级和三级部位传播中起着至关重要的作用。猴痘抗原仅在表现出形态缺陷的组织中看到，主要局限于成纤维细胞、巨噬细胞、树突状细胞（DCs）和受损组织的上皮细胞。自然杀伤细胞（NK细胞）与单核细胞一样，在先天免疫中起着关键作用，可能影响适应性免疫反应。NK细胞在控制猴痘病毒载量方面的作用在CAST/EiJ小鼠中被揭示，然而，病毒清除与NK细胞数量或活性之间没有相关性。由于缺乏NK细胞，这种菌株特别容易受到正痘病毒感染。最近的一项研究表明，感染猴痘的食蟹猴（通过平均46.1倍在感染后第8-9天和感染后第7天的23倍）的淋巴结和外周血液中NK细胞数量迅速增加。感染显著损害了许多NK细胞亚群在快速增殖之前的迁移能力，导致它们在淋巴和/或炎症区域的招募受到不利影响。此外，已经显示趋化因子受体如CXCR3、CCR5、CCR6和CCR7表现出下调。此外，已经证明，从血液和淋巴结分离的NK细胞在颗粒化和产生IFN和肿瘤坏死因子（TNF）的能力上有所降低。IL-15治疗在预防CAST/EiJ小鼠的致命猴痘感染方面显示出效果，即使在CD4+和CD8+T细胞数量减少的情况下也是如此。这意味着观察到的保护作用可能归因于NK细胞的扩增。IL-15治疗的给药已被观察到引起短暂增加的CD8+T细胞和NK细胞群体，它们表现出分泌IFN。猴痘的两个谱系在致病性方面不同。中非谱系引起更严重的疾病，具有出色的病死率。这种病原体的显著致病性归因于其阻碍T细胞受体介导的T细胞激活和阻碍人类细胞产生促炎细胞因子的能力，如TNF-α和IFN-γ。中非谱系还具有一个基因，可以防止补体酶的工作，这导致了一个关键的免疫调节组成部分，有助于其更高的毒力。然而，研究表明，主要组织相容性复合体（MHC）表达或MHC分子的细胞转运不受猴痘毒力的影响。西非谱系的较低毒力是由于ORF中的缺失和片段化造成的。 作为正痘病毒属的成员，天花病毒在人类中引起严重且高度传染性的疾病。1980年，由于全球性的疫苗接种运动，利用来自密切相关的牛痘病毒（VACV）的疫苗，天花被宣布灭绝。目前尚无已知针对人类猴痘感染的特定干预措施。相比之下，1980年代扎伊尔的实证证据表明，在根除工作中接种天花疫苗的个体也显示出显著的猴痘感染交叉保护。然而，目前50岁以下年龄组的相当一部分人没有天花疫苗接种记录，且最初在全球根除工作中使用的疫苗目前不可获得。在2022年全球猴痘爆发期间，为被认为对猴痘高度易感的人群提供了超过一百万剂现代化的天花疫苗，用于暴露前和暴露后的预防。随着对天花疫苗的免疫力下降，猴痘有可能在全球人口中增加。42年前，在中国使用天坛型牛痘病毒（VTT）来保护人们免受天花的侵害。重要的是要找出43年前或更早接种疫苗的人对天花的免疫程度，以及他们的免疫系统对猴痘的敏感性。一项研究使用294名志愿者来了解剩余体液免疫的水平。他们观察了牛痘特异性IgG水平、nABs滴度和猴痘A29L、B6R、A35R和M1R的交叉ABs。结果显示，人群对天花疫苗保持体液免疫，而VTT特异性NAb水平随年龄下降。在1981年之前，应该接受VTT的大部分人群仍然对猴痘免疫，特别是针对A35R和B6R抗原的ABs。基于这些结果，似乎大多数中国人群在天花疫苗接种后至少保留VTT特异性IgG ABs 42年。这些ABs可能提供一定程度的猴痘保护。研究人员发现，60人（89.6%）和40人（70.1%）的接种者分别有抗猴痘IgG和Nabs。在30%的疫苗接种者中，研究人员看到了对正痘病毒和猴痘肽池的T细胞反应。因此，研究表明，40-60年前接种天花疫苗的人群中有相当一部分表现出体液交叉免疫。然而，较小的子集（30%）的接种者对猴痘显示出T细胞特异性反应。 在COVID-19大流行期间，SARS-CoV-2病毒出现了新的变种，表现出逃避先前感染或初始疫苗获得的部分免疫力的能力。这促使开发更新的疫苗，以提供针对奥密克戎和其他令人关注的SARS-CoV2病毒变种的交叉保护。目前尚不清楚猴痘基因组中是否发生类似的突变，以及是否需要对疫苗进行未来的修改以维持免疫力。根据在卢瓦尔河谷进行的法国研究，发现有9人在免疫后六个月内突破了猴痘，尚不清楚这是否是由于免疫力下降、MVA-BN疫苗引起的猴痘特异性nAB反应水平相对较低，或是否预示着能够逃避疫苗诱导免疫力的新猴痘变种的出现。暴露前预防研究表明，突破病例的数量有限，尽管疫苗估计的有效性约为85%，但仍然可以预期。例如，Sagy等人在接种一剂疫苗后21至47天发现了5例突破猴痘。 此外，猴痘病毒已被确定具有编码多种病毒蛋白的能力，这些病毒蛋白在规避宿主的免疫反应中起着至关重要的作用。这些物质可以干扰合成与炎症相关的基因的关键转录因子，如干扰素调节因子3（IRF3）和NF-κB，并阻碍负责病原体识别的受体的信号通路。猴痘除了降低IFNα/β合成和阻碍蛋白激酶R（PKR）介导的途径外，还可以干扰干扰素信号。猴痘还分泌针对TNF、IFN-γ、IL-1β、IL-18和IL-6等重要炎症分子的蛋白。此外，猴痘可以通过合成几种破坏凋亡途径的病毒蛋白来抑制感染细胞的凋亡。猴痘免疫调节因子的另一个例子是补体控制蛋白（CCP），它阻止补体激活途径的启动。猴痘中非扎伊尔株表达的D14，抑制补体激活，但这种病毒蛋白并非西非猴痘株的特征。最后，猴痘可能通过阻止T细胞和NK细胞的激活来抑制免疫细胞功能（图2）。 图2 展示了猴痘感染可能的免疫病理学，包括体液免疫、先天免疫、适应性免疫和免疫逃逸。(a) 猴痘病毒抑制趋化因子（CCR5、CXCR3和CCR6）的表达，耗尽NK细胞功能并减少IFN-γ和TNF-α的分泌。(b) 猴痘病毒引起嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和单核细胞等粒细胞和单核细胞的异常。猴痘可能阻止自然杀伤细胞释放炎症细胞因子和清除病毒感染的细胞。猴痘也可能阻碍T细胞受体的跨信号传递，破坏适应性免疫反应。(c) 通过抑制抗病毒的I型干扰素反应，猴痘避免了先天免疫反应。猴痘可能通过降低mRNA产生和抑制I型干扰素，从而绕过蛋白激酶R途径，该途径介导蛋白激酶R的磷酸化。通过干扰MAPK/ERK1/2途径的磷酸化，猴痘也可能减少炎症介质的产生。通过增加ATK途径的磷酸化，它抑制了细胞凋亡。e) 猴痘患者可能因为一种中和病毒的单克隆抗体可能通过附着在细胞上的Fc受体（FcR）上的Fc区域增强病毒进入细胞而有更糟糕的预后。与猴痘感染引起的细胞因子风暴相关的是大量的辅助性T细胞2（Th2）免疫反应。这种反应的特点是血清中IL-4、IL-6、IL-5、IL-8和IL-10水平的增加，以及与Th1相关的细胞因子（如IFN-α、IFN-γ、TNF-α、IL-2和IL-12）的减少。同时观察到总抗体滴度的增加，以及IgG和IgM水平的上升。 猴痘感染疫苗 通过预防严重疾病和降低住院率，疫苗被视为抗击猴痘的关键方法。然而，对一种正痘病毒的免疫反应可以检测到其他正痘病毒。这种发现所导致的保护水平可能因不同正痘病毒之间的相关程度而异。人们认为，免疫学上越来越天真的人群是自天花免疫结束以来猴痘发病率上升的原因。由于免疫交叉反应，可以开发多种动物模型来测试疫苗和抗病毒药物。这种交叉反应有两个主要原因。首先，因为正痘病毒在许多序列上具有相似性，特别是在免疫学上重要的蛋白质方面，所以有许多共同的免疫表位。此外，至少有24种膜和结构蛋白被ABs靶向。有证据表明，天花疫苗可能提供一些针对猴痘的保护，并减轻其临床表现。目前，美国战略国家储备（SNS）中有三种天花疫苗：ACAM2000®、JYNNEOS（也称为IMVAMUNE、IMVANEX、MVA-BN）和Aventis Pasteur天花疫苗（APSV），这些疫苗可以在研究性新药（IND）程序下用于天花。 1980年，世界卫生组织（WHO）宣布全球根除了自然发生的天花。然而，随后对生物恐怖主义的担忧和猴痘的爆发促使在21世纪初基于VACV进一步授权天花疫苗接种。第一批天花疫苗，如Dryvax，是使用淋巴源的Lister/Elstree、Ikeda和纽约市卫生局VACV菌株开发的，这些菌株是在动物皮肤上培养的。相比之下，第二和第三代疫苗的开发包括使用细胞培养技术，以提高其安全性。目前，在美国，有两种官方授权的天花疫苗。美国FDA在2007年批准了基于复制VACV的第二代天花疫苗ACAM2000。ACAM2000基于Dryvax克隆。被认为对天花病毒高度易感的人应该进行积极疫苗接种作为预防措施。然而，不建议在这个人群中特别进行针对猴痘的免疫接种。ACAM2000在高度免疫抑制的个体中禁忌，因为可能会出现显著不良反应，如心肌心包炎，特别是在那些之前没有接触过天花的人中。通过在原代细胞培养或鸡蛋中使用病毒的多次通过作为减毒技术，已经实现了基于进一步减毒VACV的替代疫苗的开发。2019年，FDA批准了Jynneos。Jynneos被归类为第三代活体、非复制、减毒免疫接种，专门设计用于预防天花。2022年5月17日，在确认美国首例正在进行的猴痘流行病例后，作为预防疾病的措施，开始了由Bavarian Nordic开发的MVA疫苗JYNNEOS的接种。2022年6月28日，美国国家免疫计划提议向已经暴露或疑似暴露于猴痘的个体皮下注射疫苗。这一建议旨在扩大符合免疫资格的人群范围，作为扩大的暴露后预防（PEP）策略的一部分。2022年8月9日，FDA发布了紧急使用授权（EUA），允许经皮内注射0.1毫升JYNNEOS，增加了可用的疫苗库存。接种JYNNEOS的患者不会面临患上心肌心包炎或心肌病等严重副作用的风险。然而，ACAM2000疫苗可能会有严重的副作用，如呼吸困难、面部肿胀、头晕和心肌心包炎风险增加。ACAM2000和JYNNEOS是美国FDA批准的疫苗。然而，ACAM2000有更高的显著副作用风险，包括心脏问题，而JYNNEOS较少。因此，JYNNEOS比ACAM2000更可取。此外，建议在有暴露猴痘疾病风险的个体中使用JYNNEOS进行暴露前预防正痘病毒感染。APSV，一种复制能力牛痘疫苗，可在许可免疫不可用或不适用时，在研究性新药申请（IND）或EUA下进行接种。预计ACAM2000和APSV的安全性将具有可比性。人们还假设，像ACAM2000一样，APSV会导致心肌心包炎。美国FDA已在ACAM2000不适用或不可用的情况下给予APSV有条件的批准，作为IND或EUA。 使用牛痘的Lister（Elstree）菌株对开发LC16 m8疫苗至关重要，这是一种活体、复制、第三代天花免疫接种。这种特定的疫苗自1975年以来已在日本获得正式授权用于积极免疫接种。2022年8月，日本当局扩大了疫苗的范围，包括防范猴痘。由于更好的安全性和减毒表型，这些疫苗可以给予免疫受损的患者。通过动物研究获得的数据确定这些猴痘疫苗的有效性，这表明在非人灵长类动物中接种这些疫苗提供的保护，以及临床试验的数据，这些试验确立了它们在人类中的免疫原性（表1）。 猴痘感染新型疫苗 开发新型疫苗以对抗新兴和传染性疾病受到重大概念和科学挑战的阻碍。COVID-19大流行凸显了开发既安全又高效的疫苗配方所面临的挑战。这些配方通常基于流行的生物平台，如完整的减毒或灭活的SARS-CoV-2病毒、非复制性人类或猿猴腺病毒DNA载体，这些载体使用病毒的部分，或特定的mRNA模板，针对病毒刺突（S）糖蛋白的部分。为了降低疫苗篡改的风险并优先考虑研究人员的安全，当前生产和分发基于生物平台的病毒疫苗的协议需要使用高度规范的生物安全设施，以及严格的冷链和包装线。此外，由于它们的稳定性和特异性差，第二代疫苗不是针对亚单位疫苗的实用方法。另一方面，控制合成技术使得为许多致命疾病生成疫苗配方成为可能，如疟疾和COVID-19，这些疫苗成本低、稳定、特异性强、无毒且安全。因此，探索针对猴痘的新型疫苗策略对于降低感染风险至关重要。有希望的方法包括灭活疫苗、活减毒疫苗、病毒样颗粒（VLPs）、重组蛋白疫苗、核酸疫苗和基于NP的疫苗。 细胞内mRNA递送是由最先进技术辅助的，由LNPs领导。mRNA生产的最关键的组成部分是离子化脂质，它通常与磷脂、甾醇和脂锚定聚乙二醇（PEG）一起存在于LNPs中。根据分析，蛋白质表达不是决定疫苗效力的唯一因素。其他变量也起作用。NP生物物理特性已知会影响免疫原性，就像其他疫苗方法一样。NPs的大小影响它们刺激免疫系统的能力和当它们被用作基于蛋白质的疫苗的纳米载体时在组织和细胞中的分散。脂质体的大小是另一个影响T辅助细胞与T辅助细胞2比率（Th1/Th2）的因素。因此，与更大或更小的囊泡相比，250至750纳米之间的囊泡引发更强的Th1反应。另一方面，多层囊泡可能会触发更多的Th2反应。研究还表明，LNPs触发免疫系统的能力受到它们表面电荷的影响。例如，带正电荷或负电荷的囊泡比不带电荷的囊泡引发更强的抗体中和反应。由于它们与先天免疫系统组分的相互作用，阳离子脂质增强了LNP配方mRNA疫苗的免疫原性，从而实现适当的治疗效果。 LNP在其他mRNA递送方法（如单核吞噬系统（MPS）、细胞摄取促进、最小免疫原性和内体捕获）方面的优势使其成为一个新兴的候选者。mRNA加载的LNP遇到的几个障碍之一是免疫接触，包括先天和适应性免疫以及与LNP组分的相互作用。然而，LNP组成突出了一个重大障碍，即通过细胞质运输将mRNA临床递送到目标组织。因此，它们可能通过增加疫苗吸收到DCs和阻止mRNA与非APCs的相互作用来减少不良副作用的可能性。了解mRNA-LNP治疗引起这些不良效果的机制并制定预防措施至关重要。身体对PEG化LNPs的反应产生抗PEG抗体，这可能导致不良效果。立即超敏反应的重要细胞，嗜碱性粒细胞或肥大细胞，是IgE抗体结合到FcεRI的地方。作为介质，几种酪氨酸激酶被激活。身体在给药时将抗PEG IgM与PEG化脂质体结合。这个复合物激活了经典的补体途径，并由于Kupffer细胞吞噬作用迅速退出血流，这个过程被称为加速血液清除（ABC）现象。这种类胰蛋白酶刺激嗜碱细胞、肥大细胞和巨噬细胞，产生炎症介质。这种介质通过与平滑肌、内皮和自主效应细胞的受体结合，激活补体（C）激活相关的伪过敏（CARPA）。mRNA-LNP基于药物可能触发自身免疫的方式有：（1）先天免疫系统对LNPs作为佐剂的反应，导致自身免疫过程进行；（2）mRNA作为自身抗原，通过TLR7启动自身免疫过程；（3）在mRNA-LNP疫苗的情况下，免疫系统得到加强，可能加剧自身免疫反应。研究人员发现，编码四种参与病毒附着、进入和传播的高度保守的猴痘表面蛋白的mRNA-脂质NP疫苗可以诱导针对猴痘特异性免疫和异源保护，以应对致命的VACV挑战。与当前的猴痘疫苗MVA相比，mRNA疫苗产生了更大的中和和细胞扩散抑制活性针对猴痘和VACV，以及增强的Fc效应Th1偏向的体液免疫对四种猴痘抗原和四种VACV同源物。然而，用两种、三种或四种猴痘抗原表达的mRNA疫苗接种可防止与疾病相关的体重减轻和死亡。然而，用单一猴痘抗原mRNA疫苗接种对VACV挑战提供了最小的保护。抗体活性从中和到非中和不等，因此为什么多价猴痘mRNAs比MVA提供优越的交叉保护。研究人员证明，针对四种高度保守的病毒表面抗原的mRNA基础疫苗通过引发强效抗体迅速抑制病毒感染，对VACV提供了显著的保护。表达四种高度保守的猴痘抗原的mRNA疫苗是Freyn等人在另一项调查中评估的潜在疫苗之一。关于诱导免疫反应和预防小鼠的致命感染，mRNA疫苗的表现与MVA相当或更好。此外，研究人员还检测到对疫苗编码的四种VACV同源物和四种猴痘抗原的更高Fc效应Th1偏向的体液免疫。虽然包含编码两种、三种或四种猴痘抗原的mRNA的多价疫苗与MVA免疫相当或更好地保护了免受与疾病相关的体重减轻和死亡，但编码单一猴痘抗原的mRNA疫苗只提供了有限的VACV挑战保护。这些发现鼓励开发针对正痘病毒的mRNA疫苗，以便在爆发期间迅速响应。另外，使用两种IMVs（A29L和M1R）和两种EEVs（A35R和B6R）开发了猴痘四价mRNA疫苗mRNA-ALNP和mRNA-B-LNP。小鼠两次肌肉注射mRNA-A-LNP和mRNA-B-LNP后，发展出强大的VACV特异性nABs和猴痘特异性IgG抗体。此外，它在小鼠中促进了针对猴痘的保护性记忆B细胞和杀手T细胞免疫的发展。来自mRNA-A-LNP和mRNA-B-LNP免疫小鼠的血清被动转移也保护了裸鼠免受VACV挑战。小鼠在接受两次mRNA-A-LNP或mRNA-B-LNP剂量时免受VACV感染。结论mRNA-A-LNP和mRNA-B-LNP都是安全有效的免疫选择，可用于预防猴痘流行和其他由正痘病毒引起的爆发，包括天花。 在另一项研究中，J.W.Hooper等人表明，在用由四种VACV基因（L1R、A27L、A33R和B5R）组成的DNA疫苗接种后，猕猴在面对猴痘的致命攻击时免受严重疾病的影响。用单一基因（L1R）免疫的动物患上了严重疾病，但活了下来，该基因指定了一个病原体nABs靶标。这是首次证明针对天花-猴痘免疫的亚单位疫苗策略的可行性。猴痘E8L蛋白被显示包含一个环形神经节苷脂结合基序，根据另一项调查。这个基序由三个潜在的B线性表位共享，可以用来提供安全有效的猴痘疫苗。由于这三个序列在E8L蛋白中被鉴定出来，建议将它们用作未来猴痘特异性疫苗配方中的免疫原（重组蛋白、合成肽或基于遗传的）。这种基于脂筏/神经节苷脂的策略除了目前的治疗方法外，还可能为未来病毒流行提供治疗和疫苗反应。根据现有数据，仍然需要推进有效和安全的新型疫苗的开发，这些疫苗专门针对猴痘。这需要在宣布猴痘为之前探索创新的疫苗方法，包括VLPs、重组蛋白、核酸（mRNA或DNA）和基于NP的疫苗。 为了提高疫苗的特异性和效力，研究人员开发了专注于保守抗原的亚单位疫苗。这些疫苗以纯化蛋白或质粒DNA的形式接种，或通过病毒载体疫苗进行。这些方法特别针对导致感染的两种不同的免疫学形式的痘病毒，即成熟病毒粒子和包膜病毒粒子。核酸疫苗在安全性和效力方面显示出与传统灭活疫苗相当，有效地模拟了疫苗接种过程。此外，使用工业手段生产这些疫苗既经济又简单。为了确定最有效的疫苗，评估许多因素至关重要，如对机体的影响、反应原性、安全性、细胞毒性以及与疫苗接种相关的潜在副作用，特别是在那些处于较高风险或更容易出现不良结果的人群中。2022年非洲以外地区猴痘爆发突显了缺乏已显示效力和最小不良反应的疫苗。在猴痘流行期间使用这种疫苗可能有助于预防或减少感染，作为那些靠近确诊病例人群的暴露前预防（PrEP）。 mRNA疫苗 DNA中存储在细胞核中的遗传指令被运送到细胞质中，那里的核糖体负责将它们翻译成蛋白质。mRNA治疗可能恢复由特定蛋白质功能丧失引起的疾病治疗中的蛋白质活性，而大多数传统药物通过结合和阻断过度活跃的疾病引起蛋白。此外，mRNA治疗预计将只产生预期的影响，正如核酸序列所描述的。mRNA也比抗体或细胞治疗更容易大规模生产和纯化。此外，mRNA寿命短，无法进入细胞核，因此极不可能导致遗传变化。信使RNA在疫苗开发中的使用也是新颖的。尽管mRNA疫苗对公众来说是相对较新的，但专家们已经研究了一段时间。编码刺突蛋白的DNA序列作为mRNA疫苗合成的模板，然后被包装成基于脂蛋白的载体，以促进其被细胞迅速吸收并在体内保护免受破坏。当肌肉内注射时，疫苗到达更远的区域，mRNA分子进入细胞，在那里它们可能帮助加快翻译过程。当mRNA进入体内时，将触发体液免疫反应，促使B细胞成熟为记忆B细胞。通过这种方式，记忆B细胞在随后的暴露中可能有效地阻断抗原。两种最常见的mRNA疫苗已被证明在临床研究中对SARS-CoV-2及其多种变体安全有效。由Pfizer-BioNTech（纽约，纽约，美国）和Moderna（剑桥，马萨诸塞州，美国）制造的两种基于mRNA的疫苗已获得FDA授权。mRNA-1273，或“Spikevax”，是一种狂犬病疫苗。FDA为18岁以上的成年人授予了mRNA-1273的EUA。传统的、非复制型和自复制（自我扩增）mRNA基础疫苗是三种主要类型。非复制构建中使用的mRNA是短而基础的，它不编码可能无意中触发免疫反应的任何蛋白质。感兴趣的免疫原编码在一个由5′和3′非翻译区（UTRs）包围的编码序列内，一个5'帽子结构的7-甲基鸟苷（m7G）通过三磷酸桥连接到第一个核苷酸，以及一个3′-聚（A）尾部。5′ m7G帽子抑制5′-3′外切核酸酶介导的降解，激活翻译启动因子，并促进有效翻译，同时也防止被细胞质RNA传感器、RNA螺旋酶视黄酸诱导基因I（RIG-I）识别。5′和3′ UTRs的大小和组织以及这些区域中的调节元素也影响最大基因表达。mRNA疫苗构建的翻译和稳定性取决于聚（A）尾部及其长度。序列工程（密码子优化）和核苷酸改变（例如，用假尿苷替换尿苷）通过减少TLR识别和对mRNA构建的先天免疫反应来提高翻译效率。由于DNA依赖RNA聚合酶在构建合成过程中产生小的核糖核苷酸和双链RNA杂质，因此mRNA纯度至关重要。通过抑制先天免疫反应和产生I型干扰素和炎症细胞因子，刺激蛋白质翻译和合成，这些反应是由这些模式识别受体识别的污染物去除时触发的。然而，在其自然状态下，mRNA不能用于治疗。缺乏有效、耐受良好的递送机制一直是开发mRNA疫苗的主要障碍，直到最近。细胞吸收和易位的需求是主要障碍。mRNA分子面临着由于细胞膜上的负电位而造成的严重障碍。裸露的mRNA太大且带有很强的负电荷，无法被动穿透细胞膜，使其容易受到核酸酶的消化。自复制mRNA和非复制mRNA疫苗构建包含相同的属性，包括5′帽子序列、5′和3′翻译区（UTRs）、带有编码序列（CDS）的开放阅读框（ORF）和3′聚（A）尾部。自复制mRNA疫苗提供了质粒DNA疫苗的多功能性，以及改善的免疫原性和安全性。对这些疫苗按预期工作至关重要的是到达细胞的细胞质，那里编码和放大抗原蛋白。由于RNA的亲水性和大的净负电荷，细胞吸收受到阻碍。使用电穿孔或弹道颗粒的物理传递，以及与阳离子脂质或聚合物的静电复合，已被作为解决这个问题的潜在解决方案进行了研究，以改善细胞吸收。在自复制mRNA疫苗的初始临床前测试中，小动物和非人类灵长类动物显示出强大的先天和适应性免疫反应。关于mRNA不稳定性和大规模生产的实用性的担忧长期以来一直对创建mRNA疫苗的可能性表示怀疑。在现代，这些担忧被视为技术广泛采用的不可逾越的障碍。现在可以生产足够数量和质量的非放大mRNA疫苗以满足监管标准，并且它们正在人类临床试验中研究。如果自复制mRNA疫苗在人类试验中的有希望的结果得到免疫原性、效力和可接受性方面的类似优异结果的证实，这个平台有潜力将核酸疫苗建立为人类疫苗的灵活新工具。 非病毒途径施用的自复制mRNA疫苗的未来是光明的：它们可能成本低、有效、易于扩展且适应性强。自复制mRNA像病毒一样通过扩增其基因组和宿主细胞的抗原编码mRNA来发挥作用。这导致宿主免疫系统对抗原产生强大且持久的反应，包括体液和细胞免疫反应。此外，从理论上讲，自复制mRNA可以编码任何真核序列，而无需修改生产过程。这将允许与当前疫苗相比，更快和更适应的研究与开发时间表，以便更快地应对新的传染病。非复制mRNA（NRM）构建体由编码序列（CDS）编码，其5′和3′端被非翻译区（UTRs）包围，具有5′帽结构和3′-聚（A）尾部。自复制mRNA（SAM）构建体包含可以调节细胞内mRNA扩增的附加复制酶组分。NRM和SAM在LNPs中配制，这有助于封装mRNA构建体，从而促进细胞吸收并防止降解。通过其传递系统，mRNA通常通过膜衍生的内吞途径进入细胞。内体逃逸促进mRNA进入细胞质。定位在细胞质中的核糖体迅速将NRM构建体转化为目标蛋白，然后进行翻译后修饰。核糖体还能够迅速翻译SAM构建体，生成对mRNA自我扩增至关重要的复制酶装置。核糖体促进将自我扩增的mRNA构建体翻译为目标蛋白，然后进行翻译后修饰。所考虑的蛋白以细胞内、跨膜或分泌形式产生。适应性和先天免疫反应识别目标蛋白。 mRNA治疗在降低预先存在或抗载体免疫风险、提高安全性、精确剂量控制以及多次给药潜力方面提供了许多优势。Pardi等人进行了一个实验，他们通过静脉注射将单剂量的LNP封装的修饰核苷mRNAs给药，这些mRNAs编码抗HIV-1 nAB VRC01的重链和轻链，在小鼠体内。研究人员观察到这种给药后的血清中功能性AB水平显著升高。此外，这种干预有效地保护了人源化小鼠免受HIV-1感染。 LNP-mRNA货物在注射后不久通过内吞作用到达肌肉细胞，随后mRNA被翻译以产生亚稳态三聚体前融合S蛋白。肌肉旁边的血管动脉网络可能稍后吸引已经渗透的APCs。使用细胞翻译机制和其他细胞质组分通过每个注射的mRNA产生一个结构良好且完全功能的蛋白是mRNA疫苗的一个优势。使用全长S蛋白的mRNA疫苗的翻译产物中包括一个跨越氨基酸1至15的信号肽，允许蛋白质被转移到质膜或从细胞质中释放。一旦主要被内体衍生的蛋白酶体分解，I类主要组织相容性复合物（MHCs）将包括大部分蛋白质，并分别呈现给CD8+和CD4+T细胞。II类MHC复合物由转染mRNA疫苗或其内吞免疫原的DCs组装，然后呈现给免疫细胞。然而，通过B细胞激活的体液免疫反应是mRNA疫苗接种的主要方法。通过CD40的结合和与同源CD4+T细胞的相互作用激活后，幼稚B细胞将在淋巴器官中增殖并发展成记忆B细胞或分泌ABs的浆细胞。亲和力决定了新激活的B细胞是否会发展成长寿命的浆细胞或休眠的记忆B细胞。浆细胞产生的ABs在血液中循环，并在次级抗原暴露时结合和中和抗原，防止携带抗原的病毒感染其目标细胞。如果没有足够的ABs，记忆B细胞就不会被触发以产生随后的免疫反应。 mRNA疫苗还具有自我佐剂特性。当ssRNA被TLR7和TLR8在内体中识别时，会激活髓样分化标记88（MyD88）信号。TLR3、视黄酸诱导基因I蛋白（RIG-I）、黑色素瘤分化相关基因5（MDA5）和其他分子识别dsRNA并触发TIR结构域含适配体诱导干扰素-β（TRIF）和线粒体抗病毒信号蛋白（MAVS）分子的激活，进而介导I型干扰素IFN AB形成、特定细胞免疫反应和自我佐剂效果通常通过上述过程由mRNA疫苗诱导（图3）。 图3 基于脂质的NPs和信使RNA的结构。一个mRNA分子包含以下组分：5'端帽、3'非翻译区(UTR)、开放阅读框、聚(A)尾，以及5'和3'非翻译区(UTRs)。大多数mRNA疫苗通过脂质纳米颗粒(LNPs)进行传递。LNPs通常包含胆固醇、磷脂、可电离脂质和PEG偶联脂质等脂质组分。携带抗原mRNA的LNPs被用来制造猴痘mRNA疫苗，这些抗原在转染细胞中的产生和定位如图C所示。树突细胞和其他抗原呈递细胞(APCs)摄取mRNA-LNPs或局部产生的抗原。为了刺激CD4和CD8 T细胞，这些APCs必须首先前往淋巴结。CD8 T细胞的启动导致产生细胞毒性T淋巴细胞，这些细胞可能通过从内部破坏来消除病原体。T滤泡辅助细胞(Tfh)和Th1细胞是CD4 T细胞启动抗原的两种可能结果。Tfh细胞帮助激活生发中心(GC)反应。疫苗接种引起GC反应，导致产生分泌抗体的长寿浆细胞(LPLCs)和亲和力成熟的记忆力B细胞(MBCs)。由LPLCs产生的抗体类别转换到与Th1或Th2相关的抗体，受Tfh细胞向Th1或Th2表型的倾斜影响。 mRNA疫苗载体及其优势和挑战 有效地将信使RNA疫苗输送到人类细胞中是一个巨大的挑战。由于裸露的mRNA是外源核酸，因此会被核酸酶迅速分解，并且免疫系统很容易识别它。作为疫苗的裸露mRNA的药效作用要少得多。保护给定的mRNA免受核酸酶的破坏，并促进其运输到细胞中，对于提高mRNA疫苗的免疫学效果是必要的。最近的发展提高了mRNA作为疫苗平台的雄心。例如，通过使用假尿苷等核苷类似物进行RNA化学修饰，显著增强了体内蛋白质合成，这减轻了未修饰核苷酸引起的翻译抑制。高效液相色谱（HPLC）纯化的应用通过消除体外转录副产品，包括可能阻碍mRNA翻译的dsRNA，提高了mRNA的翻译效率和纯度。脂质和LNPs已被用于运输小分子药物和siRNAs。LNPs的使用显著提高了mRNA的体外和体内传递效率。实施新的配方技术，包括连续流动微流体装置，促进了任意尺寸和规模的NPs的一致合成。mRNA COVID-19疫苗中的LNPs由四个基本组成部分构成。胆固醇、中性磷脂、聚乙二醇（PEG）脂质和可电离阳离子脂质。存在带正电荷（在低pH下）的可电离胺基，在颗粒形成期间可以与带负电荷的mRNA相互作用。这有助于在导入期间通过膜融合。此外，PEG-脂质的目的是调节颗粒大小并作为立体屏障以防止与储存相关的聚集。这些元素与mRNA一起，通过快速混合生产方法产生尺寸在60到100纳米之间的颗粒。例如，针对SARS-CoV-2的nCoVsaRNA和ARCoV疫苗候选物的平均颗粒大小分别为75和89纳米。目前的mRNA-LNP COVID-19疫苗的缺点是需要在（超）低温下储存。通过确定这些疫苗不稳定的潜在原因，可能可以提高mRNA-LNP产品的稳定性，从而便于在较低温度下储存疫苗。 阳离子脂质体最初作为mRNA疫苗的脂质体传递系统。脂质体是由磷脂单层或多层排列组成的球形囊泡。由通常包括极性头基和非极性尾部的材料组成，该囊泡具有容纳目标基因的水性内部。这些基团之间的疏水和亲水相互作用刺激了囊泡的形成。通过静电作用，带正电荷的阳离子脂质与带负电荷的mRNA组装形成脂质复合物（LP），这是一个多层囊状复合物。LP中封装的mRNA对RNase降解具有抵抗力，允许其在不降解的情况下传递。然而，由于阳离子脂质在生理环境中带正电荷，它们容易与生物液体中其他带负电荷的分子发生相互作用。此外，它们容易被免疫细胞捕获，这最终损害了它们的传递能力。pH响应性阳离子脂质在这一基础上被筛选并制成各种mRNA传递载体结构。 多年来，阳离子聚合物如聚(L-赖氨酸)、聚乙烯亚胺(PEI)、DEAE-葡聚糖、聚(β-氨基酯)(PBAE)和壳聚糖已广泛用于核酸的传递。在最基本的形式中，当过量的阳离子聚合物与核酸结合时，会形成静电结合的阳离子聚合物复合物。尽管已经制造了大量的聚合物，但它们在传递核酸方面并不像LNPs那样先进，而且很少有研究在动物上有效使用它们来提供疫苗。将PBAE与聚乙二醇(PEG)-脂质共形成mRNA/PBAE/PEG-LNPs。这些NPs通过静脉注射显示它们可以将mRNA传递到动物肺部。使用促红细胞生成素作为报告基因，研究了一种名为聚(胺-酯)(PACE)的可生物降解聚合物在静脉注射后基因传递的背景下。 作为体外转录(mRNA)的初始传递试剂，研究了二乙氨基乙基(DEAE)-葡聚糖。后来的研究表明，DEAE-葡聚糖在传递mRNA方面的效率比脂质介导的转染低100到1000倍。这一发现也促进了包括mRNA在内的核酸的基于脂质的转染试剂的发展，从而阻碍了聚合物载体的进展。进行了一项全面的研究，评估了mRNA传递后的功能和抗原特异性T细胞反应。为此，将聚合物聚乙烯亚胺(PEI)和PBAE与商业转染试剂Lipofectamine™ 2000和1,2-二油基-3-三甲基氨基丙烷(DOTAP)/1,2-二油基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)进行了比较。每种载体中都存在复合有gag HIV-1抗原的mRNA。在用与阳离子脂质复合的gag mRNA免疫的小鼠的脾脏和淋巴结中，鉴定了分泌IFN-γ的针对gag的T细胞。然而，这并不适用于用裸露或聚合物复合mRNA免疫的小鼠。PEI及其衍生物是经常使用的阳离子聚合物。这些物质表现出水溶性，与氨基相关的大量正电荷密度，并且已被验证为体外转染的mRNA载体。PEI因其高分子量（即超过25 kDa）而具有危险性。这种现象的可能原因是阴离子血清蛋白附着在多聚体表面，这是由于阳离子聚合物与阴离子血清血浆蛋白之间的相互作用。然而，随后尺寸的增加是暂时的，因为附着在多聚体表面的蛋白质最终防止了颗粒的聚集。为了解决这些困难，已经进行了许多努力。通过鼻内给药环糊精共价2 kDa PEI，首次展示了阳离子聚合物介导的mRNA疫苗转染的可行性和有效性。环糊精与PEI的结合促进了沿多胺主链的电荷密度的位移，导致细胞毒性降低，同时保持了可质子化的基团，最终增强了转染。 猴痘感染中的mRNA疫苗 在这项研究中，使用蛋白质组学和结构疫苗学方法设计了针对猴痘的mRNA和多表位疫苗(MVC)。首先，研究人员从猴痘蛋白质组中分离出10种可能用作疫苗靶标的蛋白质。然后使用结构疫苗学方法为B细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)和辅助T淋巴细胞(HTLs)绘制了这些蛋白质的表位。使用适当的连接子将9个CTL、6个B细胞和5个HTL的表位组合起来创建MVC(多表位疫苗)和基于mRNA的疫苗。通过分子对接、结合自由能计算和体外克隆，发现在大肠杆菌K12菌株中高效表达和建议的MVC与TLR2之间有很强的相互作用。免疫模拟的结果显示，注射后的抗原滴度在第5天达到峰值，然后在IgM、IgG、IgM+IgG、DCs、IFN-gamma和IL(白细胞介素)产生后迅速下降，表明设计的疫苗候选物可能有效地诱导针对猴痘的免疫反应。通过改变连接子和佐剂附着可能进一步增强针对猴痘的免疫反应，尽管这在当前研究中尚未经过测试。由于研究，使用高度抗原性和非过敏性肽创建了既有效又动态的疫苗，以对抗猴痘。这项研究使用免疫信息学方法基于mRNA创建了猴痘疫苗模型。为了更好地预测T细胞和B细胞表位，根据其抗原性、过敏性和毒性评分选择了三种蛋白质。为了提高免疫反应，使用与表位特异性连接子和佐剂连接的主要T细胞和B细胞表位设计了疫苗结构。为了创建既稳定又高度免疫原性的疫苗，插入了Kozak序列、MITD序列、tPA序列、Goblin 5'和3' UTRs以及聚(A)尾部。研究人员使用分子建模和3D结构验证预计疫苗结构将具有高质量。基于人群覆盖和表位保守性，假设开发的疫苗模型将对多种猴痘致病株提供更好的保护。在考虑了几个对接分数和理化及免疫学因素后，Mpox-V4最有前途。通过分子动力学和免疫学模拟评估，预计最佳疫苗模型将具有高结构稳定性和与免疫受体结合的高亲和力，以诱导针对猴痘的细胞和体液免疫原性反应。对这些优先结构在实验室和人类中的进一步研究可能为有效和安全的猴痘疫苗铺平道路。 两剂针对猴痘的四价mRNA疫苗（mRNA-A-LNP和mRNA-B-LNP）在另一项研究中被开发出来。这些疫苗的灵感来自猴痘特异性抗原A29L、A35R、M1R和B6R。小鼠在接受mRNA-A-LNP和mRNA-B-LNP的两次肌肉注射后，会促进产生针对猴痘的IgG抗体和针对VACV的中和抗体。这些疫苗不仅具有强大的细胞免疫反应，而且在小鼠体内具有持久的效应记忆T细胞和生发中心B细胞活性，并对猴痘有偏向性。mRNA-A-LNP和mRNA-B-LNP的双重给药为小鼠提供了额外的VACV挑战保护。当被动转移来自mRNA-A-LNP和mRNA-B-LNP免疫小鼠的血清时，裸鼠可免受VACV挑战的保护。研究人员在体内研究中证明，猴痘四价mRNA疫苗是安全的，因为没有一种mRNA-A-LNP或mRNA-B-LNP引起任何显著的不良影响。根据研究，注射部位没有显示出任何异常的皮肤反应迹象。由于疫苗不会引起主要的皮肤反应（也称为“接种”），因此没有自体接种或意外接种的风险，这与ACAM2000形成对比（在像ACAM2000这样高度复制的疫苗中，疫苗部位的损伤通常用作成功疫苗接种的标志）。这些基于mRNA的疫苗显示出作为预防措施的前景，不仅针对猴痘，还针对其他正痘病毒，如天花。 在美国，科学家们创造了一种针对猴痘的多价mRNA疫苗（Mpoxac-097）并在小鼠中测试了其免疫原性。然后将连接五个猴痘病毒抗原（A29L、E8L、M1R、A35R和B6R）的串联2A肽进行了密码子优化。这种疫苗可以保护免受VACV挑战，并产生强大的免疫反应，包括针对猴痘的nABs和T细胞反应。接受Mpoxac-097的小鼠没有显示出显著的病理变化。总之，比较了Mpoxac-097、Mix-5和单价抗原LNP mRNA的免疫原性与多价猴痘mRNA疫苗候选物。由于Mpoxac-097产生广泛的nABs和针对猴痘的特异性T细胞反应，因此在接种Mpoxac-097疫苗后可能会避免VACV挑战。Mpoxac-097与Mix-5一样有效和具有免疫原性。由于其制造过程更简单，抗原串联共表达仍然很吸引人。用Mpoxac-097免疫的小鼠没有出现任何显著的病理变化。综合来看，研究人员的结果表明，多价猴痘mRNA疫苗是可行的。作为单独研究的一部分，生成了表达猴痘蛋白M1R和A35R的A35R-M1R融合体（VGPox1和VGPox2）以及A35R和M1R的封装全长mRNA的组合（VGPox3）。在所有三种疫苗的单次免疫后，最早在第7天检测到抗A35R的总IgGs。在接种VGPox 1和2后，很快产生了抗M1R的总IgGs；然而，直到第35天，VGPox 3才显示出任何显著的抗M1R抗体。nAB和T细胞免疫反应显示出类似的模式。接触到致死剂量的病毒的小鼠在接受任一组mRNA疫苗接种后免受感染，并且病毒从他们的肺部被清除。这些数据表明，与两个单独蛋白的共表达相比，编码A35R和M1R融合蛋白的新mRNA疫苗激发了更强的抗病毒免疫。与目前的全病毒疫苗一样有效，如果更多的话，mRNA疫苗对于保护免受猴痘病毒的侵害同样有效。 研究人员进行了一组表达各种病毒抗原组合的多组分猴痘疫苗候选物的开发和合成，例如M1R、E8L、A29L、A35R和B6R。这是通过使用LNP封装的mRNA疫苗平台实现的，该平台由Zhang等人开创。在小鼠中给予两剂mRNA疫苗候选物，即AR-Mpox5和AR-Mpox4a，已经诱导了强大的抗体反应和特定的T辅助1型（Th1）偏向的细胞反应。这已通过体外和体内特征描述得到证明。接受五价和四价疫苗候选物接种的小鼠，即AR-Mpox5和AR-Mpox4a，在VACV挑战中表现出增强的保护。猴痘mRNA疫苗候选物在BALB/c小鼠在高剂量VACV感染后减轻体重方面显示出效力。在进行临床试验之前，最好进行更多的研究，以评估预防措施在其他动物模型中的效力，如使用循环猴痘株的非人灵长类动物挑战模型。在接受多组分mRNA疫苗的AR-Mpox5和AR-Mpox4b接种组中，观察到显著的抗原特异性CD8+T细胞反应。多组分mRNA疫苗在暴露于各种抗原时，诱导了倾向于产生Th1细胞因子的CD4+T细胞的免疫反应。同样，在接受三剂多价天花DNA疫苗的猕猴中，观察到偏向Th1的抗原特异性细胞免疫反应。相反，接种MVA的小鼠在产生IFN-γ的CD8+T细胞群体中显著增加。 正痘病毒和猴痘mRNA疫苗 这项研究表明，本研究中针对猴痘、天花和牛痘的疫苗配方，通过使用in silico疫苗技术进行重复接种，有效地诱导了强大的体液和细胞免疫反应。在进行in silico疫苗接种后，B细胞群体被激活，导致免疫球蛋白、CD8 T细胞毒性和CD4 Th细胞、记忆细胞和细胞因子的产生增强。根据物理化学标准，该疫苗显示出稳定性并展现出理想的品质，分子对接显示与MHC分子良好的结合。由于本工作中抗原的遗传相似性，开发了一种针对所有三种病毒共有保守表位的mRNA疫苗。选择抗原A29、A30、A35、B6和M1，以开发普遍适用的基于mRNA的免疫接种。使用在保守区域发现的B细胞和T细胞表位，开发了多表位mRNA构建体。通过免疫信息学分析，这些表位通过比较猴痘、牛痘和天花的序列来确定。疫苗构建体显示出稳定性，并通过免疫信息学分析与MHC分子最佳结合。免疫模拟分析触发了体液和细胞免疫反应。基于in silico研究结果，建议本研究中开发的通用mRNA多表位疫苗候选物可能对猴痘、天花和牛痘具有潜在的保护作用。这对于推进旨在减少可能毁灭性大流行的发生的战略可能具有重要意义。 对牛痘的广泛研究表明，其一些抗原，包括A27、L1、A33和B5，与其他正痘病毒的同源抗原在免疫原性方面非常相似。这些结果确立了使用牛痘抗原作为疫苗靶标，以创建通用痘病毒疫苗的可行性。在科学调查领域，一组学者使用四种不同的牛痘病毒抗原，包括A27、L1、A33和B5，制造了一种新型的痘病毒疫苗候选物，称为mRNA-ALAB-LNP。在接种单一疫苗后，小鼠表现出抗L1抗体的强劲产生，同时对A33、A27和B5的免疫反应相对较弱。第二次注射后，所有IgG滴度均超过5个对数，其中抗A33 IgG的滴度在这四种抗原中最高。高结合抗体水平显示对牛痘有很强的中和能力。在测试的四种抗原中，只有A33被证明可以显著促进IFN-γ的细胞反应。血清IgG对匹配的猴痘抗原A35、M1、A29和B6的反应与对牛痘抗原的反应一样强，甚至更强，这表明编码四种牛痘抗原的mRNA-ALAB可能是未来针对猴痘、天花和其他正痘病毒感染的疫苗开发有希望的候选物。 另一项旨在创建针对猴痘的多价mRNA疫苗，该疫苗将针对EV和MV表面蛋白，并分析其有效性和保护的分子基础。在BALB/c小鼠中评估了四种mRNA疫苗的免疫原性，这些疫苗包含EV（A35R和B6R）、MV（A29L、E8L、H3L和M1R）或EV和MV表面蛋白的不同组合。第一次疫苗接种后7天，看到了动态的免疫反应，并且两次疫苗接种后，通过ELISA确认对所有免疫原产生了强大的IgG反应。观察到的更高累积IgG反应与相关的VACV中和活性之间的相关性，突出了每个免疫原在刺激免疫反应和根除VACV感染中的累积效应。此外，基于mRNA的疫苗引发了偏向Th1表型的CD4+T细胞反应，并针对抗原。研究了包含EV和MV表面抗原不同组合的mRNA疫苗在保护小鼠模型免受致命VACV挑战方面的效力。结果表明，包含EV和MV抗原的疫苗配方展示了最高水平的保护。这项研究的结果为MPV多价mRNA疫苗的保护机制提供了见解，并为开发更强大、更安全的mRNA疫苗以减轻未来猴痘爆发奠定了基础。根据研究作者的说法，mRNA-LNP疫苗显示出引发针对猴痘的免疫反应并提供针对致命VACV挑战的交叉保护的能力。该疫苗包含四种已知高度保守并在病毒附着、进入和传播过程中发挥关键作用的猴痘表面蛋白的组合。基于mRNA的疫苗接种导致对猴痘的四种抗原和VACV的四种同源物产生了更明显的Fc效应Th1偏向的体液免疫反应。此外，这些疫苗对猴痘和VACV都显示出增强的中和和细胞扩散抑制特性。这一发现与使用MVA平台的现有猴痘疫苗形成对比。表达两种、三种或四种猴痘抗原的mRNA疫苗在预防与疾病相关的体重减轻和死亡方面显示出效力。然而，单一猴痘抗原mRNA疫苗仅对VACV挑战提供了部分保护。与MVA的同源保护相比，具有中和和非nABs活性的多价猴痘mRNAs提供了显著的交叉保护。这些结果表明，针对四种高度保守的病毒表面抗原的基于mRNA的疫苗可能通过诱导高度功能性的ABs迅速减少病毒感染，从而保护免受VACV的侵害。 正痘病毒和猴痘mRNA疫苗 研究表明，夏等人开发的疫苗配方针对猴痘、天花和牛痘，通过使用in silico疫苗技术进行重复接种，有效地诱导了强大的体液和细胞免疫反应。这些抗原mRNA-LNPs单独（每个5微克）或平均组合在低剂量（每个0.5微克）下给予两次，尽管四种抗原mRNA-LNPs的免疫原性可能存在差异，但仍能引发针对猴痘的特异性IgG抗体和强大的针对VACV的中和抗体。在小鼠中，VACV感染导致体重减轻和死亡，而接受两次5微克剂量的A27、B5和L1 mRNA-LNPs，或平均混合四种抗原mRNA-LNPs（每种剂量为5微克）的小鼠受到保护。他们收集的数据支持这些抗原mRNA-LNP疫苗候选物可能在对抗猴痘和类似正痘病毒感染方面有用。桑等人在另一项研究中开发了两种猴痘四价mRNA疫苗，即mRNA-A-LNP和mRNA-B-LNP。这些疫苗使用两种IMVs（A29L和M1R）和两种EEVs（A35R和B6R）制造。在接受两次肌肉注射mRNA-A-LNP和mRNA-B-LNP后，小鼠显示出产生针对猴痘的特异性IgG抗体和强大的针对VACV的中和抗体的能力。在小鼠中，对猴痘的免疫反应包括诱导记忆B细胞免疫和杀手记忆T细胞免疫。通过被动转移来自接受mRNA-A-LNP或mRNA-B-LNP免疫的小鼠的血清，实现了对裸鼠的VACV挑战的保护。接受不同剂量的mRNA-A-LNP和mRNA-B-LNP的小鼠显示出可比的抵抗VACV挑战的能力。研究人员展示了mRNA-A-LNP和mRNA-B-LNP作为针对猴痘流行病和其他由正痘病毒引起的爆发的潜在疫苗的安全性和有效性。 研究人员通过在转录前结合DNA质粒的简化制造技术，创建了两种多抗原mRNA疫苗候选物，这些候选物编码四种（M1、A29、B6、A35，称为Rmix4）或六种（M1、H3、A29、E8、B6、A35，称为Rmix6）猴痘抗原。研究人员发现，尽管Rmix6产生的细胞免疫反应明显大于Rmix4，但这些猴痘多抗原mRNA疫苗候选物对VACV具有相似有效的交叉中和免疫反应。单独封装每个编码抗原的mRNA是一种常见的开发多抗原mRNA疫苗的方法，尽管一次性覆盖所有mRNA更有效。由于不同的LNP生产，可以很容易地确认每种mRNA疫苗成分的免疫原性。此外，接受两种疫苗候选物接种的小鼠免受致命的VACV挑战的保护。根据对猴痘单个抗原诱导的B细胞受体（BCR）谱系的分析，M1抗原有效地诱导了中和抗体反应。此外，所有中和抗体在前20种最常见的抗体中似乎都针对与7D11相同的构象表位，表明可能存在病毒免疫逃逸的潜在弱点。根据这些结果，来自简化生产方法的Rmix4和Rmix6似乎是对抗猴痘的良好选择。（表2）。 未来展望 临床建模研究的结果显示对猴痘的保护性免疫很少。这表明，在猴痘重新出现的现阶段，由于缺乏对这种疾病的免疫力，大多数人有感染病毒的危险。猴痘的复发感染可能构成挑战。全世界已有超过80,000例猴痘确诊病例，康复者被认为对再次感染免疫。然而，最近有一个案例似乎再次感染了。研究人员在这篇评论中报告了在意大利米兰的圣拉斐尔医院发现的两例可能的猴痘再次感染。这些病例表明猴痘可能存在两次再感染。研究人员在最初的病例临床和病毒学治愈后，对第二次发作进行了检测，发现循环阈值高、症状短暂、临床表现类似于猴痘，并且可检测到中和抗体。对于最近开始的猴痘，循环阈值高，表明病毒水平低。其他可能解释再感染的理论包括性污染或组织储库中的复发。其他人的共感染可能导致或加剧症状，或者可能使再感染更容易。此外，研究人员从两个患者收集的样本中分离并测序了猴痘，这些样本来自第一次发作。他们无法从第二次发作的样本中分离病毒，可能是由于循环阈值高表明的低病毒载量。SARS-CoV-2也可能有负面影响。尽管基因组数据不能确认存在两种不同的病毒，因此是再感染（与复发相反，复发将呈现相同的病毒），但临床医生需要意识到猴痘再感染的潜力，并应通过病毒培养和测序进行调查。此外，猴痘再感染的潜力对传播和疫苗政策具有影响。此外，如果猴痘中发生特定突变，降低天花疫苗对猴痘的效力，情况可能会变得更加严重。尽管猴痘的确诊病例数量每天都在下降，但病毒仍然存在于全球，并可能以相同的谱系返回或传播到其他地区，包括中非。由于其出色的安全性、生产成本效益、高效力和快速开发，mRNA疫苗的出现显著改变了疫苗学领域。临床试验为支持两种主要的针对SARS-CoV-2及其许多变体的mRNA疫苗的安全性和有效性提供了证据。目前正在使用的JYNNEOS是一种来自减毒、非复制性正痘病毒株-改良安卡拉-巴伐利亚北欧（MVA-BN）的活疫苗。与其他疫苗不同，MVA-BN无法在人体内部复制。此外，它在不产生严重不良效果的情况下引发针对正痘病毒的体液和细胞免疫反应。基于上述观察，目前可用疫苗的有效性仍然值得怀疑。人们普遍认为，它未能提供预期和必要的有效性，以遏制疾病的传播，以及与疫苗相关的严重并发症的复发发生率可能超过猴痘引起的发病率和死亡率。因此，迫切需要开发表现出针对猴痘增强特异性、安全性和有效性的新型疫苗。关于这一点，研究人员建议在宣布猴痘为大流行病和实施准备活动变得更加困难之前，开发和测试更新的灭活和/或mRNA疫苗，以克服现有疫苗的缺点。然而，在过渡期间，直到这些疫苗经过测试并商业化，MVA-BN疫苗可以被用来减缓疾病的传播，因为它在比较ACAM2000疫苗时具有更高的效力和更安全的配置文件。 由于SARS-CoV-2的新变种的出现，人群对它的抵抗力正在下降，这导致了mRNA疫苗的重新设计。mRNA疫苗的好处在于，它们可以通过改变免疫原性转基因来快速针对变种进行修改。传统疫苗通常涉及培养大量活性病毒，然后进行灭活，这可能需要数周甚至数月的时间。另一方面，mRNA疫苗可以快速生产、测试和创建。基于仅从COVID-19 mRNA疫苗中获得的信息，为猴痘开发mRNA疫苗可能提供一种更简化的方法来预防另一场可能具有毁灭性的病毒大流行。这一主动措施将有效减轻可能随之而来的严重健康和社会经济后果。 美国唯一批准使用的小pox疫苗是改良的安卡拉-巴伐利亚北欧牛痘疫苗。在猴痘大流行期间，确保ACAM2000®天花疫苗（一种既定的预防措施）和实验性的APSV（一种潜在的替代干预措施）的可用性至关重要。在美国，现在已经开发出两种疫苗来减轻猴痘感染的风险和严重程度。这些疫苗被称为JYNNEOS（有时被称为Imvamune或Imvanex）和ACAM2000。JYNNEOS已成为正在进行的猴痘流行的疫苗选择。尽管同时封装所有mRNA对于多抗原mRNA疫苗生产更可取，但隔离和封装每个编码抗原的mRNA是标准做法。使用单独的LNP准备，可以快速轻松地测试mRNA疫苗的每个组分的免疫原性。研究人员进一步证明，猴痘多抗原mRNA疫苗候选物可以诱导针对VACV的强大交叉中和免疫反应。此外，Rmix6诱导的细胞免疫反应显著高于Rmix4。 基于mRNA的疫苗相比标准疫苗提供了几个潜在的优势，如以下几点：除了引发体液和细胞介导的免疫反应外，这些疫苗还具有几个有利的特性。首先，它们没有传染性成分，也不会稳定地整合到宿主细胞的基因组中。其次，它们对健康个体具有良好的耐受性。第三，它们具有成本效益，并且可以快速生产，使用易于标准化和可扩展的程序。第四，它们增强了有效应对广泛出现的爆发的能力。最后，它们表现出高度的耐受性。例如，疫苗在预防传染病方面具有重要意义，mRNA疫苗技术在预防COVID-19方面的应用展示了其作为平台的有效性和安全性。使用猴痘mRNA序列A29L、M1R、A35R和B6R作为灵感，研究人员在一项研究中创建了两种猴痘mRNA疫苗候选物，称为MPXfus和MPXmix。MPXfus是一个由四个抗原蛋白组成的单组分系统，它们通过柔性连接物串联融合，并由单个mRNA编码为融合蛋白。MPXmix是一个多组分系统，由四个mRNA分子组成，每个分子对应一个特定的抗原蛋白。使用Lignum NPs将同等质量的MPXfus或MPXmix用于免疫小鼠，以评估和比较这两种潜在的Mpx疫苗所引发的免疫反应。免疫反应分析的结果表明，MPXfus和MPXmix都能在小鼠中引发强大的细胞免疫反应和高水平的抗原特异性抗体。此外，病毒中和实验的结果表明，用MPXfus或MPXmix免疫的啮齿动物的血清在VACV存在时表现出显著的中和活性。此外，MPXfus和MPXmix诱导的抗原特异性抗体的滴度、细胞免疫反应水平或针对VACV的nABs活性之间没有观察到显著差异。在不同的研究中，创建了三种编码猴痘蛋白A35R和M1R的mRNA疫苗。这些疫苗包括A35R胞外域与M1R蛋白的融合体（VGPox 1和VGPox 2）以及A35R和M1R的封装全长mRNA的组合（VGPox 3）。这项工作表明，在抗病毒免疫方面，由猴痘A35R胞外域和信号肽组成的融合蛋白的mRNA疫苗优于亚致死活体VACV-WR病毒。由于VGPox 1和VGPox 2在接种后7天就早期诱导了针对病毒的体液免疫，人群免受致命的VACV挑战的保护。研究人员结果中猴痘和牛痘之间的强烈相似性使它们更加显著。这表明VGPox 1或2可能是针对其他正痘病毒的有效mRNA疫苗。尽管这项工作提供了关于mRNA疫苗对猴痘的有效性的有见地的信息，但应注意许多限制。例如，研究人员使用VACV而不是猴痘进行了体外中和和体内测试。进一步将mRNA疫苗与非人灵长类动物中的其他许可疫苗（如JYNNEOS）进行比较的研究可能会在这些结果上建立。继续评估当前疫苗的安全性和有效性以预防猴痘至关重要。因此，创建一种具有广泛应用潜力的新疫苗来预防猴痘及其不断增长的变种，可能为应对感染的动态性质提供有用的预防策略。许多研究表明，基于mRNA的LNP优于传统疫苗技术，因为它产生更高水平的nABs、更有效的猴痘特异性T细胞反应和对猴痘的保护。亲脂性药物的安全性取决于剂量和组合，并且不可能预测长期不良影响，特别是在许多剂量后，因为目前没有长期健康结果数据。在低风险患者中广泛使用mRNA疫苗之前，应该进行研究进展，重新评估利弊。此外，重要的是全面评估疫苗有效性的各个方面，包括反应原性、细胞毒性测试结果、安全性和不良反应，特别关注那些处于更高风险或更脆弱的人。这种评估对于辨别传统和新型疫苗在效力方面的最优选择至关重要。BNT166疫苗候选物编码的表面抗原存在于猴痘的两种感染形式中，使它们能够有效地对抗病毒复制和感染性。两项基于mRNA的多价疫苗候选物的安全性、耐受性、反应原性和免疫原性将在临床试验（NCT05988203）中进行评估。亚研究A是一项I期、开放标签、剂量递增试验，旨在评估两种多价疫苗候选物（BNT166a和BNT166c）在大约64名健康参与者中的安全性、免疫原性和反应原性，这些参与者之前没有接种过牛痘疫苗或没有天花疫苗接种史。两剂将在大约31天间隔内给予。如果赞助商选择不激活BNT166c组，则不会进行随机化。亚研究B是一项随机化、观察者盲、赞助商非盲的I期亚研究，旨在评估两种多价疫苗候选物（BNT166a和BNT166c）在大约32名之前接种过天花疫苗的健康参与者中的安全性、免疫原性和反应原性。两剂将在大约31天间隔内给予。参与者将按照1:1的比例进行随机分配。如果赞助商选择不激活其中一个组，这个亚研究将是一个开放标签的亚研究，只有一个组。I/II期试验的目标是招募196名健康参与者，他们要么没有接种过牛痘疫苗，要么没有已知或疑似的天花疫苗接种史。 mRNA疫苗的开发是一个快速发展的领域。众多mRNA疫苗正在进行针对各种疾病的临床试验，包括癌症和流感。与mRNA疫苗相关的一个重要障碍是它们无法承受极端寒冷和热稳定性。CureVac开发的一种热稳定的疫苗(CvnCoV)显示出不到50%的临床效力，这表明当前的目标是创造一种表现出“高临床效力”的热稳定疫苗。鉴于科学文献中缺乏关于mRNA疫苗稳定性的数据，有必要进行精心设计的研究，使用延长时间、各种辅料和储存温度来填补现有的知识空白。基于研究人员掌握的有限信息，他们推断疫苗缺乏热稳定性可以归因于它们所使用的合成mRNA的困难特性。此外，根据研究人员的发现，mRNA疫苗的热稳定性可以通过有或没有实质性配方修改来增强。作为提高mRNA疫苗稳定性和储存条件的可行替代方案，例如，脱水mRNA LPN悬浮液的替代技术，如冻干，将发挥作用。提高疫苗热稳定性的第二种方法是通过mRNA序列优化。在他们的第一个热稳定疫苗临床试验初步失败之后，CureVac目前正在开发第二种COVID-19疫苗，该疫苗结合了非编码区域mRNA优化。此外，在LPN中包括辅料，如脂质和胆固醇，可能会使疫苗容易受到氧化降解。因此，通过优化NP组分和生产过程，可以提高疫苗的稳定性。最后，一项理论研究提出，重新利用mRNA生成双链区域可能是提高疫苗稳定性的另一种策略。由于可及性不足，几个低收入和中等收入国家面临mRNA疫苗的显著未满足需求。这表明可及性仍然是低疫苗接种率的一个重要决定因素，超过了对疫苗犹豫的担忧。根据研究结果，全球COVID-19疫苗公平性仍然是一个重大问题。迫切需要集中努力提高疫苗接种率，特别是在覆盖不足和对疫苗有大量未满足需求的国家。重要的是要减少疫苗获取的障碍，确保mRNA疫苗的可用性和传播，并克服疫苗犹豫，以减少未满足的需求，实现不同地理区域的更高疫苗接种率。 结论 鉴于该病毒与SARS-CoV-2相比具有较低的传染性，并且天花疫苗已显示出对猴痘的效力，研究开发针对性疫苗候选物和探索治疗方法的重要性不容忽视。当前的大流行，如COVID-19，继续威胁全球健康，凸显了需要负担得起的疫苗，这些疫苗可以用来保护全球人口免受传染病的侵害。此外，大多数感染猴痘的人从未接种过天花疫苗。结果可能有助于政府设计或倡导针对最危险人群的公共卫生政策和免疫计划。对天花疫苗产生的抗体是交叉反应性的，这意味着它们可以识别并对抗其他正痘病毒。此外，COVID-19大流行凸显了需要对猴痘病毒进行新的生物技术研究，以促进低成本治疗和疫苗的创造。最后但同样重要的是，鉴于当前流行病可能导致严重疾病和死亡，必须立即进行严格、良好控制的前瞻性试验以证明效力。在处理意外情况时，核酸平台表现出色。尽管成功将随时间衡量，但自从获得FDA批准以来，mRNA疫苗的开发和测试速度是显著的。核酸技术然后可以评估和专利治疗和预防效应分子，如抗体。SARS-CoV-2展示了在没有灵活的基础设施的情况下，要始终领先于一个快速适应的代理可能有多困难。mRNA疫苗可以迅速开发、评估并大规模生产。mRNA疫苗中缺乏活病毒使它们成为更安全的选择。然而，mRNA疫苗也有自己的问题。尽管疫苗的mRNA可能在注射后迅速被销毁或产生细胞因子风暴，过敏反应、肾衰竭、心力衰竭和梗死仍然是可能的不良反应。考虑到相关技术的快速发展，这种疗法的传递和稳定性可能只是时间问题。生物/纳米技术、复杂的纳米/制造以及开放报告和数据共享方面的突破，使得能够迅速开发出在猴痘感染期间有效的mRNA疫苗技术。在将猴痘标记为大流行之前，还有时间创造一个引人注目且安全的新一代疫苗，以根除病毒或开发创新的疫苗平台。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

▲ 详细日程见文末 ▲摘要:伪狂犬病毒（PRV）是一种高度传染性疾病，可感染大多数哺乳动物，猪是唯一的天然宿主，给世界养猪业造成了巨大的经济损失。先天性免疫是宿主抵御病原体攻击的第一道防线，对于适应性免疫的正常建立至关重要。宿主会利用先天性免疫反应来抵御PRV的入侵，但PRV会利用各种策略来抑制先天性免疫反应，从而促进病毒的复制。目前，世界范围内用于预防猪感染PRV的减毒活疫苗，如Bartha K61。然而，越来越多的数据表明，这些疫苗并不能完全抵御自2011年底以来出现的PRV新变种。本文综述了PRV与宿主天然免疫之间的相互作用以及减毒活疫苗的研究现状，旨在促进新型、高效PRV疫苗的研制。关键词：伪狂犬病毒，先天免疫，免疫逃避，减毒活疫苗，重组疫苗。1背景PRV是导致伪狂犬病（PR）的病原体，也被称为奥杰斯基病（AD，Aujeszky’s disease）。PRV属于α-疱疹病毒亚家族，宿主范围很广，虽然猪是它的天然宿主，但包括人、猫、狗、山羊和牛在内的许多哺乳动物也可能感染。猪感染PRV可引起呼吸道、生殖和神经系统症状。处于不同生长阶段的猪会出现不同的症状。受PRV感染的新生仔猪会出现神经系统症状，死亡率高达 100%，而成年猪一般只表现出轻微的呼吸道症状，但会在神经系统中形成终生潜伏感染，这种潜伏感染可被重新激活，成为病毒的动态贮存库。PRV具有大约143kb 的双链DNA基因组，紧密排列，至少70个开放阅读框，并含有两个反向重复序列。几种 PRV 蛋白发挥调节宿主先天性免疫反应的功能，主要包括干扰素(IFN)系统、细胞凋亡和自噬，以促进病毒的产生。先天免疫对病毒感染反应迅速，但病原体清除和预防再感染的关键依赖于后天免疫系统，而高质量的先天免疫反应是建立后天免疫系统的先决条件。因此，了解 PRV 的先天免疫逃避机制对于疫苗的开发具有重要意义。自PRV流行以来，以 Bartha K61为代表的减毒活疫苗在预防和控制该病方面发挥了重要作用。然而，自2011年以来，中国出现了新的变异。Bartha K61对PRV变异株感染不能提供完全的保护作用。新的疫苗的开发是一个必要条件，一些学者认为，增强先天免疫能引起病毒的衰减。病毒先天免疫逃避的破坏可以减少病毒的毒力，同时建立强有力的免疫应答。本文综述了PRV先天性免疫逃避的多种策略，主要包括干扰素系统、自噬和细胞凋亡，以及PRV减毒活疫苗的研究进展。我们希望这篇综述能够为开发针对新型PRV变异体的疫苗提供一些思路。2PRV的先天免疫调节机制病毒感染诱导先天免疫应答，并通过模式识别受体 (PRR) 识别病原体相关分子模式 (PAMPs) 激活抗病毒先天免疫应答。据报道，宿主可以通过几种PRR识别PRV感染: Toll样受体2 (TLR2)，环磷酸鸟苷-磷酸腺苷合酶 (cGAS)，RIG-I样受体 (RLRs)，DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) 盒多肽41 (DDX41) 和IFN调节因子的DNA依赖性激活剂。随后，特异性信号传导途径被激活以响应病原体感染而产生干扰素、促炎因子和趋化因子。我们总结了参与先天性免疫系统调控的PRV编码蛋白，重点是那些参与逃避 IFN 介导的免疫反应的蛋白（图1；表1）。图1 PRV通过编码多种蛋白质调节IFN介导的先天性免疫应答表1 PRV 因子与宿主的先天免疫系统相互作用2.1 IFN-I系统IFN-I 介导的先天性免疫应答是宿主抵抗病毒感染最有效的防御策略之一。然而，病毒在长期的进化过程中，已经发展出了各种各样的逃避宿主免疫的策略。PRV 通过几种策略调节宿主的先天性免疫反应。采用微阵列技术，用野生型 PRV 株感染细胞后，IFN-β 通常诱导的一部分基因表达下降。在病毒感染后，病毒 DNA 首先被细胞质 DNA 传感器 cGAS 识别，导致 cGAS 中的构象开关催化第二信使 cGAMP 的产生，然后 cGAMP 与位于内质网上的 STING 结合。它们转运到高尔基体，招募TANK-结合激酶1（TBK1）和IRF3/7，并使IRF3/7磷酸化，最后磷酸化的IRF3/7被转运到细胞核，激活编码IFN-I的基因转录。随后，JAK-STAT通路被IFN-I激活，启动数百个ISGs的转录，从而调节细胞因子。PRV 编码一系列蛋白质来规避 IFN-I 介导的先天免疫，其主要靶标是 cGAS-STING 信号通路和 IFN-I 信号通路（表 1）。STING是cGAS-STING 通路中的关键蛋白之一，一项可靠的研究表明，PRV UL13 招募 E3 连接酶 RING-finger 蛋白 5 (RNF5)，以促进 STING 的 K27-/K29 链接泛素化和降解。过氧化物酶1（PRDX1）通过与TBK1和IκB激酶ε（IKKε）相互作用来促进IFN诱导，Lv等人证实UL13能降解PRDX1，从而抑制IFN的产生，这取决于其激酶活性。研究表明，UL13 可通过泛素化和蛋白酶体介导的降解作用降解 IRF3。Bo等人通过筛选50种PRV蛋白发现UL13限制了ifn-β 转录。进一步的研究发现，UL13利用其激酶活性诱导IRF3磷酸化，从而减弱IRF3与其启动子的结合。gE和US3也以多种方式抑制IRF3活性。gE通过降解irf3的伴侣CREB结合蛋白 (CBP) 来抑制IFN的产生。US3抑制IRF3的活性，通过蛋白酶体途径机械降解IRF3。UL24通过降解irf7损害DNA传感途径。ifn-i介导的先天免疫反应是宿主抵抗病毒感染的最有效防御策略之一。然而，病毒已经开发了各种策略来逃避宿主免疫。在漫长的进化过程中。PRV以几种策略调节宿主先天免疫应答。当使用微阵列技术用野生型PRV株感染细胞时，通常由ifn-β 诱导的基因子集的表达降低。病毒感染后，病毒DNA首先被细胞质DNA传感器cGAS识别，导致cGAS中的构象转换以催化第二信使cGAMP的产生，然后cGAMP与位于内质网上的STING结合。JAK/STAT 信号通路在 IFN-I 介导的 ISG 产生中起重要作用。JAK/STAT 通路受 PRV 广泛调控。PRV 阻断了 JAK/STAT 信号通路重要节点 STAT1的磷酸化。几种病毒蛋白在这一过程中发挥积极作用，包括 EP0，US3，UL24，UL42和 UL50。EP0蛋白是通过抑制 IRF9的转录来拮抗天然宿主干扰素应答所必需的。Bcl-2相关转录因子1(Bclaf1)维持 STAT1和 STAT2磷酸化，并通过与 ISRE 和 STAT2直接相互作用来转录 ISG 来促进 ISGF3与 ISRE 的结合。US3通过蛋白酶体途径降解 Bclaf1抑制 ISG 的产生，促进 PRV 的免疫逃避。此外，UL42还干扰 ISGF3与 ISRE 的结合，其他一些研究发现 UL24抑制 ISG (包括 OASL，ISG20等)的转录。发现 UL50降解 IFN 受体以下调 IFN-α 免疫应答。Janus 激酶磷酸化并传导干扰素的抗病毒信号，最近发现 PRV 通过诱导蛋白酶体降解而降解 Janus 激酶。然而，其中涉及的机制仍不清楚。核因子-κB（NF-κB）在调节免疫、炎症反应、细胞增殖和存活方面起着至关重要的作用。NF-κB 的主要形式是由 p50 和 RelA 亚基组成的异源二聚体，它们以抑制活性的状态与 IκB 家族蛋白结合。当细胞受到应激、细胞因子或病原体入侵等各种刺激时，NF-κB 抑制蛋白 IκBα 被激活并与 NF-κB 分离，通过蛋白酶体途径降解，NF-κB 进一步转运到细胞核，激活各种基因的转录。细胞 NF-κB 信号通路受到 PRV 感染的严重影响。最近的研究发现，PRV编码蛋白UL13通过抑制RIG-I和MDA5的转录来调节NF-κB的活化，从而抑制RLR介导的IFN-β的产生，以逃避先天宿主免疫。此外，UL24 与 p65 相互作用，介导蛋白酶体途径中的 p65 降解，从而影响 NF-κB 的激活。总之，PRV 从多个方面调控 IFN 的功能，包括 IFN 的产生和 IFN 信号通路。病毒抑制 IFN 信号转导的能力与毒力之间存在密切的相关性。通过删除 STAT1/2 拮抗剂可以减弱麻疹病毒。一项重要研究发现，PRV 的糖蛋白 gE/gI 复合物能显著抑制浆细胞树突状细胞（pDCs）分泌 IFN。与野生型（WT）PRV 株相比，删除了 gE/gI 的 Bartha K61 减毒疫苗株通过 pDC 触发了更强的 IFN-I 反应。恢复甚至改善在野生型 PRV 感染中受损的 IFN 系统是一种很有前景的抗病毒策略。尽管 IFN 系统并不是病毒毒性的唯一决定因素，但它仍具有重要作用。PRV 的免疫逃逸因子在病毒感染中所起的关键作用为疫苗和抗病毒药物的开发提供了潜在的目标。2.1 细胞凋亡、自噬和坏死细胞凋亡是一种程序性细胞死亡，其特征是细胞膜起泡、染色质凝结和 DNA 断裂，同时保持膜的完整性，形成凋亡小泡。细胞凋亡是宿主抵抗病原体入侵的一种手段，它使受感染的细胞过早死亡，导致病毒增殖中止，并通过轻度释放抗原诱导特异性免疫。有报道称 PRV 诱导细胞凋亡。PRV 的 US3 和 gE 蛋白不仅能拮抗 IFN 系统，还能通过不同途径抑制细胞凋亡。研究表明，US3 可激活 PI3K/Akt 和 NF-κB 通路，从而抑制细胞凋亡；gE 可使细胞外信号调节激酶 1/2（ERK1/2）磷酸化，从而降解促凋亡蛋白Bim。DNA 损伤反应（DDR）对维持基因组完整性至关重要，它根据损伤程度导致 DNA 修复、细胞周期停滞和细胞凋亡。PRV 感染会造成宿主细胞的 DNA 损伤，导致细胞凋亡，最近的研究表明 PRV 与 DDR 之间存在更深入的对话。磷酸化的 H2AX 是 DDR 的标志，而 PRV 的 UL13 可与 H2AX 相互作用并磷酸化 H2AX，从而促进其复制。富亮氨酸 PPR 矩阵蛋白（LRPPRC）是一种多功能蛋白，也是第一个独立于 Caspase 蛋白之外的凋亡蛋白。最近，Xu 等人发现 PRV 的 UL16 蛋白与 LRPPRC 相互作用，减弱了 LRPPRC 对 NF-κB 的激活，而 NF-κB 是 PRV 复制的宿主限制因子。这些基因是开发新型减毒活疫苗时有望减弱 PRV 的靶标。自噬可用于修复细胞内成分，并在细胞饥饿时为细胞提供重要的能量和物质。越来越多的研究表明，自噬是免疫反应不可或缺的一部分。PRV 可诱导细胞自噬，通过经典的 Beclin-1-Atg7-Atg5 途径促进复制。Wnt/β-Catenin信号通路调节细胞增殖、分化和存活。最近的研究发现，PRV 感染会显著激活 Wnt/β-Catenin 信号通路，这可能会通过上调病毒诱导的自噬促进病毒增殖。自噬通路似乎被 PRV 利用，Sun等人的研究表明，PRV 对自噬的调控十分精妙，在感染早期诱导细胞自噬，这与病毒复制无关，随着病毒复制的进展，自噬水平下降。进一步的研究发现，US3 可激活 PI3-K/AKT 通路来抑制自噬。US3 对细胞自噬的抑制有利于细胞存活，并可能促进 PRV 的复制。Bcl2-associated athanogene 3（BAG3）参与调节细胞凋亡、发育、细胞骨架组织和自噬。BAG3 可抑制 PRV 复制，PRV 蛋白 UL56 与 BAG3 相互作用，并通过溶酶体途径降解 BAG3；但在 WT PRV感染中却观察不到这种现象。PRV的其他一些蛋白可能会拮抗UL56降解BAG3的活性，具体细节还有待进一步探讨，BAG3可能是生成稳定细胞系以生产高水平PRV减毒活疫苗的潜在靶标。坏死是一种不同于细胞凋亡的细胞死亡形式。在受体相互作用蛋白激酶 3（RIPK3）及其伴侣蛋白（RIPK1、TRIF、DAI 或其他）的帮助下，混合谱激酶结构域（MLKL）被激活，导致细胞破裂，释放出大量与损伤相关的分子，并引发炎症反应。PRV 以依赖 RIPK3 的方式导致细胞坏死，而抑制坏死会促进 PRV 复制。PRV 是否会阻断坏死尚不清楚，但其他一些疱疹病毒，如小鼠巨细胞病毒（MCMV）编码的 M45/vIRA 可阻断 RIPK3 的活性，同样，HSV-1 编码的核糖核苷酸还原酶大亚基（ICP6）可与人体细胞中的 RIPK3 相互作用，从而抑制坏死。这些信息表明，PRV 可能具有某种潜在的能力来抑制细胞坏死，从而促进其复制。细胞凋亡、自噬和坏死是细胞死亡的三种典型形式，随着时间的推移，这些形式的细胞死亡的独立性和相关性得到了越来越多的认识。当细胞受到刺激并相互转化时，可以同时诱导多种类型的细胞死亡。PRV 感染与宿主死亡率之间的关系是复杂的，PRV 与宿主之间的相互作用是研制抗 PRV 感染的新型疫苗和抗病毒药物的基础。3PRV变异体的基因组进化目前，许多欧美国家已宣布自己不再感染 PRV，中国已通过接种 Bartha K61疫苗有效地控制了 PRV 感染。自2011年以来，中国东部和北部的几个养猪场发生了 PRV 感染暴发，更令人担忧的是，这些受感染的猪已经接种了PRV疫苗。2011年以前，尽管不同的 PRV 分离株的生物学特性不同，但只有一种PRV血清型。他等人根据 PRV全长序列构建了最大似然树，结果表明目前的PRV分离株可分为基因型1和基因型2两个不同的分支。利用 gC 基因构建的最大进化枝可信度树证实了 PRV 分为进化枝1和进化枝2，同时表明这两个进化枝已经独立传播了几个世纪。最大似然树分别基于 gB 和 gD 构建，PRV 分为两个进化枝，毫无疑问，Bartha K61和2011年后的变异被分配到不同的进化枝。有趣的是，2011年以后，中国的 PRV 分离株主要是基因型2，这部分解释了为什么 Bartha K61疫苗(基因型1)不能提供对新型 PRV 变异体的完全保护。GB、 gC 和 gD 是主要的抗原基因，易发生突变，因此经常用于 PRV 系统发育分析。抗原基因的独立系统发育分析使得更容易理解疫苗和不同毒力株之间的关系。研究表明，PRV 变异体 gC 和 gD 的突变在逃避 Bartha K61诱导的免疫中起关键作用。天然突变和重组体促进 PRV 菌株多样性的变异。翟等人于2017-2019年间从中国东部的养猪场采集了 PRV 样本。根据 gC 基因，这些 PRVs 属于进化分支2。主要 PRV 糖蛋白 gB，gC，gD 和 gE 的测序分析显示分离物内氨基酸序列分歧最大，分别为4.0,0.7,0.3和1.1% 。与 Bartha K61疫苗株相比，这些分离株在几个蛋白位点有突变，特别是 S41G，R162H 和 S345L 在 gC 上的变化可以改变受体结合和/或糖基化，这可能导致变异 PRV 的出现。自然重组加速了病毒基因组的进化，生物信息学分析表明，在 PRV 基因组中经常发生包被和包被重组。Tan 等人发现了一种新的 HN2019 PRV 毒株，它来源于经典 PRV (如 Ea)和 HB-98疫苗毒株的重组。胡等人利用 Bartha K61对所有中国分离株进行重组预测，得到23个重组事件。Bo 等人发现 Bartha 菌株为重组 JSY13变体提供了部分基因。早期伪狂犬病病毒 SC 株是介于中国地方性病毒株和巴萨疫苗样病毒株之间的重组病毒株。这些报道表明，重组在中国 PRV 的演变中起着关键作用。Bartha K61是近半个世纪前引入中国的，长期免疫对 PRV 的突变和重组有很大的贡献。因此，PRV 的监测和进化分析对于 PR 疾病的预防和控制非常重要，而这些信息可以为 PRV 疫苗的开发和使用提供关键信息。4PRV活疫苗接种疫苗是预防传染病的最有效策略之一。根除 PRV 运动的成功主要归功于应用了优良的 PRV 疫苗。然而，传统的疫苗接种并不是一劳永逸的解决方案，人类与传染病的斗争仍在继续。PRV 变异体在中国的流行促使我们集中精力开发新的和更有效的疫苗来阻止 PRV 变异体大流行。减毒疫苗保留了病原体的大部分自然结构。尽管如此，它们在体内的复制能力和毒力降低，现在普遍认为减毒疫苗提供更好和更完整的免疫保护，特别是 T 细胞介导的免疫(图2)。减毒活疫苗是目前应用最为广泛和发展最为迅速的疫苗。本节总结了目前减毒活疫苗和基于病毒载体的活疫苗研制的进展和关键问题，并对新型活疫苗的研制提供了见解。图2 野生型伪狂犬病毒和减毒活疫苗可诱导体内产生后天免疫系统4.1减毒活疫苗大多数 PRV 疫苗是基于部分基因缺失的减毒活疫苗。PRV的美国区基因US3、 US和US8是主要的毒力基因，被认为是对PRV复制不重要的非核心基因。US2在大多数疱疹病毒中保守，通过调节ERK的定位间接调节MAPK的活性。另一项研究表明，缺失PRV us2基因会增加病毒滴度。US9是一种膜蛋白，在病毒传播过程中发挥着至关重要的作用疱疹病毒(包括 PRV)的顺式神经传输。UL23编码一个与PRV毒力相关的非结构蛋白 PK，几乎不具有免疫原性。目前这些基因常被用作PRV衰减剂。第一株PRV减毒活疫苗 Bartha K61株是最好的改良活疫苗之一。对巴沙 K61疫苗株进行了体外连续传代，获得了减毒特性。后来，研究人员在 Bartha K61的美国区域发现了许多缺失，包括 US8和 US9基因的完全缺失和 US7和 US2基因的部分缺失。随着 PRV 遗传学和分子生物学的进步，PRV 基因的作用还没有被恢复，更多的基因缺失的 PRV 疫苗正在通过各种技术被开发。基因工程技术，如同源重组、细菌人工染色体和 CRISPR/Cas9基因编辑系统，可以快速构建基因缺失的菌株，作为活的减毒性病毒候选菌株。这主要包括单基因缺失、双基因缺失、三基因缺失、四基因缺失和五基因缺失疫苗(表2)。表2 PRV减毒活疫苗概述尽管减毒活疫苗对PR的预防和控制具有重大意义，但一些研究人员对减毒活疫苗在易感动物中的安全性提出了质疑。减毒性病毒菌株rPRvtJ-delgE/gI对猪是无毒的，但对绵羊是致命的，这表明gE和gI的缺失可能不足以减弱。另一组基于PRVΔTK&gE-AH02株构建TK/gE双基因缺失疫苗，导致1日龄无PRV抗体仔猪死亡。基于PRVΔTK和gE-AH02的PK基因缺失导致PRV病毒进一步减弱，并且在接种没有 PRV 抗体的新生仔猪后没有观察到临床症状。最近的一项研究发现，基于gE/TK缺失菌株的 US3基因的进一步缺失在具有更高水平的中和抗体，细胞因子和组织驻留记忆T细胞(TRM)的小鼠中具有更好的免疫原性。值得注意的是 US3编码的PK蛋白，它广泛参与PRV的免疫逃逸，如第1.2节所述。因此US3基因可能成为活体减毒性病毒设计和开发的有希望的目标。越来越多的基于突变体的减毒PRV疫苗已经开发出来，但仍有一些问题需要进一步考虑。首先，减毒剂仅限于US2、 US3、 US7、 US8、 US9和UL23的单个或多个缺失，下一步需要进一步开发新的减毒相关基因; 其次，多基因缺失后的病毒生长特性很少受到关注，一些基因缺失可能会降低病毒滴度，影响减毒活疫苗的生产; 最后，该疫苗在除猪以外的动物中的安全性有待进一步研究，特别是在非人灵长类动物中。为了控制新的 PRV 变种，更新疫苗株以匹配循环株是最关键的。因此，必须继续监测现场菌株的变化，并据此构建新的候选疫苗。我们的一般概念是，疫苗的安全性与毒力相关基因缺失的数量呈正相关，但更多的基因缺失对疫苗株的免疫原性和产量有更大的影响。减弱病毒免疫逃避是构建减毒疫苗的一种策略。先前的研究显示，US3、 US8、 UL13、 UL16、 UL24、 UL42、 UL50和 EP0有助于 PRV 逃避宿主的先天免疫，因此这些基因具有构建减毒性病毒的潜力。免疫逃逸基因的引入可以降低 PRV 的毒力，提高其安全性。例如，Wang 等人构建的 PRV EP0缺失突变体对 IFN-α 介导的抗病毒免疫更敏感。另一个研究小组构建了一个 UL50缺失的 PRV 突变体，该突变体对 IFN-α 介导的病毒抑制类似敏感。尽管缺乏动物研究来验证这些基因降低毒力的能力，将 PRV 免疫逃逸基因导入目前的减毒活疫苗是一个有希望的策略来产生新的 PRV 活疫苗。4.2. 抗多种病原体的减毒重组PRV活疫苗猪至少受到40种病原体的威胁，其中包括16种病毒、15种细菌、8种寄生虫和1种原生动物。近年，猪只传染病如非洲猪瘟、口蹄疫、猪只繁殖与呼吸系统综合症、猪细小病毒和流感等已被广泛记录。针对每一次潜在的疫情爆发，采用适当的疫苗接种是最有效的方法，但现场存在许多混合感染。不同疫苗在短期培养周期内多次正确接种是很难实现的。异源抗原基因在病毒基因组中的插入和表达导致额外的免疫保护或增强的免疫效应是一个令人兴奋的研究课题。PRV 有一个很大的基因组，如前所述，一些基因的缺失使其减弱而不会显著影响其生长能力和免疫原性。几种基于伪狂犬病毒的载体疫苗已经研制成功。例如，共同表达流行性乙型脑炎病毒(JEV)的 PrM-E，经典猪瘟病毒(CSFVs)的 E2，口蹄疫病毒 p12A 和3C，PPV VP2，猪三角冠病毒(PDCoV)穗(S) ，PRRSV gP5和 M，ASFV 和SARS-CoV-2S 或 N 的 CP204L (p30) ，CP530R (pp62) ，E183L (p54) ，B646L (p72)和 EP402R (CD2v)基因。这些多价疫苗对许多疾病具有预防作用，但其在猪体内的安全性和有效性仍有待进一步研究。这些研究表明，基因缺失的减毒 PRV 病毒可以作为一种有前途的载体来开发针对两种或两种以上病原体的多价疫苗。分子佐剂通过多种机制调节免疫系统，从而提高疫苗的效力。设计合适的分子佐剂来构建基于基因缺陷PRV的重组活疫苗是一个很有前景的方向。Zheng等人构建了表达PPV VP2蛋白和猪IL-6的重组PRV，显著增加了 PPV 特异性淋巴细胞的增殖。将Fms相关酪氨酸激酶3配体（Flt3L）插入到TK和gE缺陷的PRV中，构建重组HNX-TK-/gE--Flt3L，可显著促进树突状细胞的成熟和活化(DCs)。5结论PRV仍然是猪的主要传染源之一。此外，人类感染PRV的持续发生增加了 PRV 的风险水平。PRV利用多种策略逃避宿主先天免疫。先天性免疫逃逸基因的修饰或缺失是开发新型减毒活疫苗的一个有前途的策略。减毒性病毒活菌株也是研制新型多价疫苗的良好载体，可对抗病毒、细菌和支原体等两种或多种病原体，特别是与呼吸道有关的病原体。另外，合适的分子佐剂的插入可以大大提高疫苗的保护效率。尽管已有几种 PRV 疫苗应用于临床，但加快新型疫苗的研制是当前PRV变种和其他病原体流行的迫切需要。参考资料：Nie Z, Zhu S, Wu L, Sun R, Shu J, He Y, Feng H. Progress on innate immune evasion and live attenuated vaccine of pseudorabies virus. Front Microbiol. 2023 Mar 3;14:1138016. doi: 10.3389/fmicb.2023.1138016. PMID: 36937252; PMCID: PMC10020201.为了推动兽用生物制品行业交流，共同探讨该领域的最新研发进展、产业化现状及未来发展趋势，生物制品圈联合四叶草会展、乘风济海将于2024年4月17日-18日在南京共同举办“兽用生物制品研发和产业化大会”，系中国医药全产业链新资源大会（CBC大会）中的一个分领域专业会议。诚邀全国相关领域研究者共享学术盛会。名称：兽用生物制品研发和产业化大会时间：2024年4月17日-18日（周三-周四）地点：南京国际展览中心主办单位：生物制品圈、抗体圈、四叶草会展，乘风济海媒体支持：药时空、细胞基因研究圈报名方式：扫描下方二维码或点击文章最底部“阅读原文”→ 填写表格 → 报名成功组委会获得报名信息后，根据报名信息进行初筛，并进一步与报名者沟通确认，实现精准邀请（严格审核通过）。大会日程注：大会日程以会议现场为准。中国医药全产业链新资源大会（CBC大会）是一场将“政、产、学、研、用、管、投”各方精英围绕全产业链新资源展开的合作大会，将于2024年4月16日-18日在南京国际展览中心举办。大会将主打“全产业链新资源对接”，围绕投资、立项、临床前研发、临床研究、生产、供应链国产化、销售、MAH合作、国际品种合作、公司股权合作与并购全产业链，为中国医药同仁带来全新的资源与商机。大会下设的同期会议包括：宠物药品、食品、保健品新资源大会兽用生物制品研发和产业化大会透皮技术研发生产与注册开年分享会吸入制剂研发、生产与注册新机遇新进展分享会中国改良新药与缓控释制剂全产业链合作大会陆续更新中......识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

来自日本熊本大学等机构的科学家们通过研究详细分析了DDX41基因的功能及其意义，研究者表示，DDX41基因在转录过程、RNA剪接和整体的基因组完整性维护方面扮演着重要角色。 DDX41基因能编码一种名为DEAD盒型RNA螺旋酶（DEAD-box-type RNA helicase）的特殊核酶，然而其在恶性肿瘤发生背后的分子机制研究人员并不清楚；近日，一篇发表在国际杂志Leukemia上题为“DDX41 coordinates RNA splicing and transcriptional elongation to prevent DNA replication stress in hematopoietic cells”的研究报告中，来自日本熊本大学等机构的科学家们通过研究详细分析了DDX41基因的功能及其意义，研究者表示，DDX41基因在转录过程、RNA剪接和整体的基因组完整性维护方面扮演着重要角色，相关研究结果或为科学家们开发治疗血液系统恶性肿瘤的新型疗法提供新的思路和线索。 DNA的复制、转录和转录后改变是必要的细胞过程，其能被大量酶所调节，RNA螺旋酶就是这样一组关键的酶类，其主要参与多种转录和转录后过程，其中一种重要的RNA螺旋酶就是DEAD盒型RNA螺旋酶，其主要位于细胞核中并由DDX41基因所编码。DDX41基因突变会导致造血细胞祖细胞（血细胞前体细胞）的癌症，包括急性髓性白血病（AML）和骨髓增生异常综合症（MDS）；然而，研究人员并不清楚发生恶性肿瘤背后的分子机制，为了填补这一空白，研究人员进行了一项综合性研究来详细揭示DDX41基因的功能性机制。 图片来源：Leukemia (2022). DOI:10.1038/s41375-022-01708-9 研究者Matsui教授说道，目前我们正在调查DDX41基因，其是已知的AML/MDS的致病性基因之一，以该基因为研究重点，研究人员分析了其发生突变对细胞所产生的细胞的细节信息。通过对亲本K562细胞系和DDX41突变表达R525H的细胞系进行一系列细胞实验，研究人员发现，DDX41能通过与编码RNA的5’剪接位点（SS）结合从而在mRNA的合成上发挥着重要作用，进一步研究结果表明，DDX41能与和RNA剪接相关的蛋白相互作用，RNA剪接是一种产生mRNA的必要分子过程，这些实验重新描述了DDX41在细胞转录过程中功能的重要性。 为了进一步确定DDX41的功能意义并理解恶性肿瘤发生背后的机制，研究人员观察了DDX41敲低后细胞（DDX41的表达水平会降低）所产生的效应；这些实验结果表明，DDX41敲低后的细胞或许存在DNA复制和有丝分裂过程的异常，此外他们还观察到了这类细胞中R环的形成会有所增加，R环（R-loops）是由DNA:RNA杂交体与一种未配对的DNA所形成的特殊结构。这些研究结果与DDX41功能被抑制的实验所得到的研究结果一致，当DDX41的功能被抑制后就会让细胞出现轻度的复制压力，最终就会导致细胞周期因G2-M过渡减缓而中断，G2-M期的过渡是细胞周期中的一个关键检查点；此外，研究者发现，DDX41会调节RNA聚合酶II过程的暂停，其是一种能成功执行转录功能的重要过程。 总之，本文研究结果阐明了DDX41的功能性意义，并揭示了其在维持细胞基因组稳定性上的作用，这些研究发现或许能帮助科学家们理解DDX41突变所引起的血液系统恶性肿瘤发生背后的分子机制，并有望帮助开发新型的治疗性措施。本文研究结果意义重大，未来研究人员还将继续深入研究阐明血液系统恶性肿瘤发生背后的详细分子机制，如果研究人员能建立一种新型的分子靶向性疗法，或许有望为治疗人类恶性肿瘤提供新的希望。（生物谷Bioon.com） 原始出处： Shinriki, S., Hirayama, M., Nagamachi, A. et al. DDX41 coordinates RNA splicing and transcriptional elongation to prevent DNA replication stress in hematopoietic cells. Leukemia 36, 2605–2620 (2022). doi：10.1038/s41375-022-01708-9