Complement system proteins

注：本文不构成任何投资意见和建议，以官方/公司公告为准；本文仅作医疗健康相关药物介绍，非治疗方案推荐（若涉及），不代表平台立场。任何文章转载需要得到授权。急性缺血性脑卒中是一种高发病率、高致残率的疾病，其治疗手段和药物研发一直是医学界关注的焦点。随着医疗技术的进步，急性缺血性脑卒中的治疗策略不断优化，从传统的静脉溶栓到机械取栓，再到多靶点脑保护药物的研发，治疗手段日益多样化。本文基于摩熵咨询发布的《急性缺血性脑卒中药物——市场研究专题报告》部分精华内容，着重分析了血管再通治疗、抗血小板治疗、抗凝治疗和降纤治疗的诊疗指南及药物市场竞争格局，并分析了急性缺血性脑卒中药物的市场趋势，旨在为临床医生、科研人员及患者提供全面的参考信息。 01急性缺血性脑卒中诊疗指南及药物市场竞争格局分析  缺血性脑卒中急性期治疗主要分为再通治疗与综合药物治疗。再通治疗包括静脉溶栓（阿替普酶、尿激酶）和机械取栓，综合药物治疗主要有改善循环的丁苯酞与人尿激肽原酶（尤瑞克林）、神经保护类的依达拉奉、依达拉奉右莰醇等。据摩熵医药销售数据统计，国内缺血性脑卒中急性期主要治疗药物近几年市场规模均在百亿元以上，2023年市场规模已达129亿元。阿替普酶与尿激酶受治疗窗口限制，2023年销售额合计为25.96亿元，占比20.19%。丁苯酞作为石药核心品种，2023年销售额69.68亿元，占比54.19%。首批国家重点监控合理用药目录发布之前神经保护类药物市场巨大，依达拉奉作为佼佼者2019年销售额43.13亿元，但在重点监控目录发布后销售额断崖式下跌，2023年仅剩1.77亿元。依达拉奉右莰醇（先比新，1类新药）作为依达拉奉接棒产品，2020年上市至2023年销售额就已达到23.45亿元，仅次于丁苯酞。数据来源：摩熵医药销售数据库01替奈普酶可能成为阿替普酶的替代品血管再通治疗方案包括静脉溶栓、血管内机械取栓及动脉溶栓。（1）静脉溶栓治疗：目前静脉溶栓药物主要包括阿替普酶、替奈普酶、瑞替普酶和尿激酶。（2）血管内机械取栓：血管内介入治疗是近年急性缺血性卒中治疗的重要进展，可显著改善急性大动脉闭塞所致缺血性卒中患者的预后。（3）动脉溶栓治疗：由于缺乏充分的证据证实动脉溶栓的获益，因此，目前首选的血管内治疗方式是血管内机械取栓，而不是动脉溶栓。阿替普酶是由勃林格殷格翰（BI）研发，已成为全球公认的静脉溶栓治疗的标杆药物。在国内市场，阿替普酶也是静脉溶栓领域的佼佼者，2023年销售额高达15.31亿元，BI占据全部市场。相较于阿替普酶，尿激酶虽然在溶栓治疗中更易出现出血副作用，但其显著的价格优势使它在国内基层医疗机构中广泛使用。2022年尿激酶销售额突破10亿元大关，南大药业和人福药业占据了大部分市场份额。02抗血小板治疗对于不符合静脉溶栓与血管内机械取栓患者应在发病后尽快给与抗血小板治疗。急性出血性脑卒中抗血小板药物主要为阿司匹林、氯吡格雷、替格瑞洛及替罗非班。03抗凝治疗急性期抗凝治疗虽已应用50多年，但一直存在争议。Cochrance系统评价纳入28个随机对照（RCT）研究，所用药物包括普通肝素、低分子类肝素、口服抗凝剂和凝血酶抑制剂等。荟萃分析结果显示，抗凝药物治疗不能降低随访期末病死率，随访期末的病死率及残疾率亦无显著下降；抗凝治疗能降低缺血性卒中的复发率、降低肺栓塞和深静脉血栓形成发生率，但被症状性颅内出血增加所抵消。04降纤治疗降纤治疗适用于不适合溶栓，特别是高纤维蛋白血症患者。很多研究结果显示缺血性卒中急性期血浆纤维蛋白原和血液黏滞度增高，降纤制剂可显著降低血浆纤维蛋白原，并有轻度溶栓和抑制血栓形成作用。降纤酶是以五步蛇毒和白眉蝮蛇毒为原料的制剂，在国内销售额不高，2023年销售额仅0.24亿元。巴曲酶是巴西矛头蝮蛇毒分离，由日本东菱药业研发，国内由托毕西药业独家销售，2023年销售额达3.5亿元。02急性缺血性脑卒中药物市场趋势分析  01替奈普酶可能成为阿替普酶的替代品 缺血性卒中急性期治疗主要是溶栓和血管内治疗，目的是实现血管再通，恢复脑组织血流灌注。临床上常用的溶栓药物主要分为三代：（1）第一代代表药物是链激酶和尿激酶。链激酶其生产成本低，半衰期适中，但因其来源于细菌，有一定的免疫原性，且缺乏纤维蛋白特异性，在临床使用时易出现出血副作用。尿激酶是从人尿发现并分离出来的，可将纤溶酶原转化为纤溶酶，同样无纤维蛋白特异性。（2）第二代代表药物为阿替普酶。具有纤维蛋白特异性，可以有效减少出血风险。但半衰期较短，临床使用需要较高剂量，会导致血脑屏障的破坏，增加脑出血和水肿风险，价格也比较高。（3）第三代代表药物为替奈普酶。纤维蛋白特异性更高，半衰期更长。在美国2019年卒中急性期指南中，在某些情况下，推荐替奈普酶可以替代阿替普酶。比如：对无静脉溶栓禁忌证同时也适合行机械取栓的患者，选择替奈普酶（单次静脉团注0.25mg/kg，最大剂量25mg）而非静脉阿替普酶溶栓可能是合理的。对于轻度神经功能障碍且不伴有颅内大血管闭塞的患者，可以考虑替奈普酶替代阿替普酶。我国药品审评数据显示，截至2024年9月10日，勃林格殷格翰、世贸天阶医药、丰华生物注射用替奈普酶均已进入申请上市阶段。02多靶点脑保护药物拥有巨大的发展潜力急性缺血性卒中的治疗核心是挽救缺血半暗带的脑组织。早期再灌注治疗是目前为止被循证医学证实的最有效的治疗方法，但仍有至少一半的患者可能由再灌注损伤导致预后不良。另一个极有希望技能挽救缺血半暗带，又能防止再灌注损伤的治疗措施，是针对缺血级联反应的脑细胞保护。《缺血性卒中脑保护科学声明——来自脑卒中学会的科学声明》指出，多靶点药物可以在缺血级联反应的多个层面进行干预，从而实现多重效应终点。依达拉奉右莰醇作为我国自主研发的多靶点脑细胞保护剂，有基础研究显示，其具有清除自由基和抑制神经炎症双效协同机制，可有效阻断缺血性脑卒中缺血级联反应，打破了既往脑细胞保护药物在临床转化过程中不断面临失败的困境。研究者不断针对系列新靶点进行相关研究，并从传统脑保护靶点转向更上游、更广泛的领域，包括小RNA、蛋白质修饰等，既不局限于脑细胞保护的特定环节或药物靶点，而是关注脑细胞保护的整体病理生理过程，从更深层次、更广泛的角度探索脑细胞保护机制。目前比较热门的领域包括非编码RNA和多靶点保护。（1）非编码RNA：可通过与蛋白、DNA和RNA相互作用，参与多种细胞活动（如细胞凋亡、氧化应激、炎症反应和血管生成等），有望作为新型的AIS脑细胞保护药物。尤其是环状RNA，在组织中显示出高度的时空特异性，有望成为AIS的潜在治疗靶点。（2）多靶点保护：通过影响缺血级联反应的多个方面，包括兴奋性毒性、氧化应激和神经炎症等进行多个层面进行干预，实现多重效应终点。此外，由中医药多组分、多途径、多环节、多靶点的协同作用引申出的“以药试靶”“以靶组方”“态靶结合”等观点，也是一种多靶点保护新模式，拥有巨大的发展潜力。小结急性缺血性脑卒中的治疗正在经历一场深刻的变革，从单一的溶栓治疗到多靶点脑保护药物的研发，治疗手段不断丰富，治疗效果显著提升。随着替奈普酶等新一代溶栓药物的上市，以及多靶点脑保护药物的广泛应用，急性缺血性脑卒中的治疗前景更加光明，更多创新药物和治疗方案的涌现将为患者带来更多希望。END本文为原创文章，转载请留言获取授权急性缺血性脑卒中药物市场研究专题报告下期内容预告目录一、2024年急性缺血性脑卒中药物市场格局：先声药业创新药先必新势不可挡近期将持续更新，敬请期待近期热门资源获取数据透视：中药创新药、经典验方、改良型新药、同名同方的申报、获批、销售情况-2025042023H2-2024H1中国药品分析报告-2025042024年中国1类新药靶点白皮书-202503中国AI医疗健康企业创新发展百强榜单-202502解码护肤抗衰：消费偏好洞察与市场格局分析-2025022024年FDA批准上市的新药分析报告-2025012024年NMPA批准上市的新药分析报告-2025012024年医保谈判及市场分析报告-2025.012024年中国医疗健康投融资全景洞察报告-202501小分子化药白皮书（上）-2025012024医美注射材料市场发展分析报告-202412中国放射性药物产业白皮书-202410近期更多摩熵咨询热门报告，识别下方二维码领取联系我们，体验摩熵医药更多专业服务会议合作园区服务数据库咨询定制服务媒体合作👆👆👆点击上方图片，即可开启摩熵化学数据查询点击阅读原文，申请摩熵医药企业版免费试用！

这篇文章于2025年发表在Stem Cells，本文全面概述了当前肿瘤类器官整个工作流程（从采样和培养到药物筛选）的高通量解决方案。此外还探索了可以控制和优化单细胞制备、类器官培养和药物筛选的各种技术，最终目标是确保培养系统的自动化和高效率，并确定更有效的肿瘤治疗药物。摘要：肿瘤类器官已成为患者来源组织的理想体外模型，因为它们在一定程度上概括了源肿瘤组织的特征，为个性化肿瘤治疗提供了潜力，并在药物研发中显示出巨大的前景。然而，建立和应用该模型涉及多个劳动密集型和耗时的实验步骤，并且缺乏标准化的协议和统一的识别标准。因此，高通量解决方案对于肿瘤类器官模型的广泛采用至关重要。本综述全面概述了当前肿瘤类器官整个工作流程（从采样和培养到药物筛选）的高通量解决方案。此外，我们探索了可以控制和优化单细胞制备、类器官培养和药物筛选的各种技术，最终目标是确保培养系统的自动化和高效率，并确定更有效的肿瘤治疗药物。1.背景介绍合适的体外疾病模型对于未来的研究至关重要。基于三维（3D）细胞培养技术的肿瘤类器官培养系统已成为一种很有前途的肿瘤模型，能够模拟人体内肿瘤的生长和发展。该系统利用体内基质类似物形成的3D支架来概括体内肿瘤微环境（TME）;这是通过向从患者来源的手术、穿刺组织或体液样本中获得的肿瘤细胞中添加各种生长因子和小分子抑制剂来实现的。这种方法能够诱导和培养具有肿瘤特性的类器官。肿瘤类器官培养系统表现出源组织的高可复制性和稳定性，使其成为迄今为止最好的体外 3D模型。患者来源的类器官形成异质微结构。异质性有助于研究人员研究肿瘤发展的机制并进行药物筛选和疗效评估。 然而，肿瘤类器官培养系统的建立和应用受到实验作复杂、时间和人力成本昂贵以及缺乏标准化流程和统一鉴定规则的阻碍。这些限制强调了对高通量解决方案的需求，以促进肿瘤类器官模型的广泛采用。与其他肿瘤模型相比，类器官具有快速培养和有效模拟器官发生及其生理和病理状态的优势。为了最大限度地发挥这些优势，在培养过程中需要一系列高通量解决方案，以提高准确性和效率。肿瘤类器官作涉及几个可以高通量方式解决的关键步骤，包括生物样本处理、图像采集、药物筛选和细胞活力评估。本综述旨在全面概述用于肿瘤类器官培养的高通量解决方案，并讨论其应用、局限性和未来前景。这些关键步骤的高通量解决方案可以更精确地控制和优化类器官培养过程的关键方面，例如单细胞制备、细胞培养和药物筛选。这种方法提高了培养系统的效率，对发现更有效的肿瘤疗法具有重要意义。2.肿瘤类器官培养技术及应用类器官培养技术是体外3D培养技术的延伸，其关键区别在于提供了自我更新的条件，支持干细胞的自我维持和分化，从而更好地模拟人体的生理环境。值得注意的是，类器官可以维持细胞的生理功能，包括增殖、凋亡和分化。相比之下，传统的2D培养仅限于形成细胞单层，无法复制人体组织的3D结构，细胞在传代过程中往往会失去原有的生理功能。不同物种和品系的动物模型表现出不同的生理特征和反应，但受到高异质性和高成本的阻碍。相反，肿瘤类器官来源于患者来源的肿瘤组织。培养这些类器官涉及添加对相应癌症类型具有特异性的生长因子，从而建立一个概括体外微环境的体外肿瘤模型。这种方法不仅可以直接再现肿瘤的生长过程，还可以单独再现源肿瘤组织的特征，使肿瘤类器官模型能够更准确地捕捉个体间差异，为个性化肿瘤治疗提供基础。肿瘤类器官培养系统包括基质凝胶和维持类器官生长和活力的生长因子混合物。基质凝胶主要由胶原蛋白、巢蛋白、层粘连蛋白和其他成分组成，用作肿瘤细胞的3D支架，概括了天然细胞外基质（ECM）的关键特性，例如纤维组成、渗透性、空隙大小和机械稳定性。这种仿生环境能够在体外复制复杂的细胞-细胞和细胞-ECM相互作用，为支架上的细胞聚集、增殖和迁移提供理想条件，从而准确模拟人体的内部环境。除了使用基质凝胶外，肿瘤类器官模型的成功构建还依赖于补充特异性生长因子和小分子抑制剂（图1）。例如，肺癌类器官需要在培养基中添加表皮生长因子（EGF）以促进类器官增殖，而R-Spondin-1、Noggin和其他因子是维持干性所必需的。此外，成纤维细胞生长因子7（FGF7） 和FGF10是促进干细胞向细胞谱系远端分化所必需的。培养系统的另一个重要组成部分是小分子抑制剂，例如抑制上皮-间充质转化的A83-01和SB202190，它通过靶向丝裂原活化蛋白激酶信号通路来抑制细胞分化。值得注意的是，添加这些因子比使用血清更费力，而且由不同组织来源构建的类器官所需的特定因子并不相同，需要根据每个组织的特性进行调整。图1：类器官培养系统。根据肿瘤细胞的来源，需要向肿瘤类器官培养基中添加不同的细胞因子组合（例如，R-Spondin-1、Noggin、FGF7、FGF10、EGF、Wnt-3a、Y-27632、烟酰胺、N-乙酰-L-半胱氨酸、A83-01 和 SB202190）以促进或抑制参与类器官形成的信号通路以获得所需的类器官。建立类器官涉及一系列步骤，包括采样、培养和后续评估。肿瘤组织通常从手术标本、穿刺活检和内窥镜活检中获得，突出了构建类器官模型只需要最少数量的细胞的优势。值得注意的是，在组织采样和运输过程中存在污染风险，因此需要在样品管中添加抗生素，例如青霉素-链霉素。加工的初始步骤包括将肿瘤组织酶消化成单细胞，通常通过包括胶原酶、DNAase和透明质酸酶的方案。随后将消化的悬浮液离心以获得细胞沉淀，然后用红细胞裂解物处理以产生肿瘤的单细胞悬浮液。接下来，将单细胞悬液与基质凝胶混合并接种到孔板中，然后加入肿瘤类器官培养基。然后通过多种方法鉴定培养的类器官。首先，在细胞水平上评估细胞形态、排列和结构，以确定肿瘤类器官和源组织之间的一致性。其次，使用特异性抗体进行免疫组织化学染色来识别蛋白质水平肿瘤标志物的表达。第三，利用高通量测序技术在基因水平上分析基因表达谱和基因突变。最后，通过比较肿瘤组织和类器官对化疗药物的反应，评估肿瘤类器官在药物筛选和治疗策略开发中的效用（图2）。图2：类器官培养过程。将患者来源的肿瘤组织（手术、组织活检）或液体活检标本经过一系列处理后制成单细胞悬液，并根据一定数量的细胞制作种子板。当类器官形成时，可以进行药物敏感测试以观察细胞活力，并且可以进行数据收集和分析。类器官培养方案的标准化对于确保实验结果的可靠性至关重要。在肿瘤类器官培养系统的背景下，从单细胞采集到类器官培养、药物筛选和验证，每一步都必须遵守标准化作程序（SOP）。这种方法包括实验室前准备、实验室方案和实验室后处理。肿瘤类器官模型的构建大致可分为以下阶段：肿瘤组织消化和解离、分离的肿瘤干细胞与基质凝胶混合、将它们接种在孔板中，以及添加富含细胞因子的培养基以促进类器官生长。这个过程需要大量的劳动力和时间成本，从而限制了类器官的适用性。肿瘤类器官培养的第一步涉及确定合适的细胞来源。肿瘤细胞可以来自患者样本、细胞系或干细胞。纯化的肿瘤细胞通过消化、分离和培养获得。然而，这个过程充满了挑战。不同癌症类型的消化时间差异很大，例如，乳腺肿瘤组织由于其纤维含量高，需要4-6小时，而胃肠道肿瘤可以在1-2小时内消化。此外，不同的癌症类型需要不同的消化酶系统。这些因素给研究人员带来了障碍，包括消化组织的等待时间延长、过度消化导致的细胞活力低以及消化不足，这会阻碍单细胞悬液的产生，从而影响下游实验。这些挑战的出现凸显了对一种能够产生单细胞悬液的简化、高效和可靠的消化方法的需求。细胞培养需要精确控制细胞密度和分布，以确保肿瘤细胞的增殖。细胞计数和活力评估对于确定生成单细胞悬液后的活细胞数量是必要的。然后将相应的培养系统基质凝胶与单细胞悬液混合并接种在孔板中。虽然这个过程相对简单，但仅通过体力劳动在短时间内产生大量类器官，同时保持对每个类器官球体质量的控制是具有挑战性的。这种限制在高通量药物敏感性检测中尤为明显，其中在384孔板或更高通量规格中接种类器官需要自动化机器。随后，建立了类器官培养系统，其中细胞悬液接种在3D基质中，以模拟肿瘤的体内生长环境并诱导类器官形成。评估药物对肿瘤类器官的影响需要多方面的方法，包括药物制备、药物筛选和数据分析。药物制备过程包括选择、溶解和稀释药物，以确保其质量和浓度满足实验要求。药物筛选包括用药物治疗肿瘤细胞并观察其疗效和毒性等参数。数据分析涉及组织和分析实验数据，以阐明药物的潜在机制及其治疗效果。培养和标准化的困难困扰着传统的类器官培养。此外，大小和形状可变的类器官生产通常既耗时又昂贵，这使得大规模生产成为一项重大挑战。因此，高通量和自动化作是在标准化、减少劳动力和降低成本方面实施类器官培养进步的关键解决方案。为了确保类器官培养的整个过程以高精度和高效率进行，必须设计高通量解决方案，同时考虑自动化、高通量和可重复性等因素。此类解决方案的示例包括使用微流体技术进行类器官植入，用于药物治疗和检测的自动化机器人，用于细胞状态分析的高分辨率成像，以及用于结果处理的数据分析软件。通过实施高通量SOP，可以最大限度地减少实验误差和不确定性，并提高实验的可信度和可重复性。3.当前离体类器官培养涉及的底物技术和适用于各种应用的高通量解决方案目前正在研究高通量解决方案，以减轻类器官培养过程中的劳动密集型和关键步骤。这些解决方案大致可分为分离和培养、药物筛选和活性评估。这些解决方案的形式包括集成高通量功能的设备、方法和软件。高通量设备和方法包括自动化样品处理设备、微流体、器官芯片、3D打印技术和高内涵成像系统。High-throughput软件可以快速准确地获取和分析大量的实验数据，从而提高数据处理的效率和准确性。特别是成像系统，可以同时获取各种类型的生物信息，如细胞形态、荧光强度和细胞活性，从而更全面地了解药物对肿瘤细胞的作用机制和疗效。微流体是指在数十到数百微米的通道中处理微量流体（10-9-10-18 l）的系统技术。该技术有四个主要应用：分子分析、生物传感、分子生物学和微电子学。在生物学和医学中，微流体技术在细胞培养、单细胞分析和临床诊断中发挥着越来越重要的作用。微流体技术在生物学研究中的应用可以显著减少样本量，从而降低实验成本，实现生物样本的快速和高通量检测，最大限度地从少量样本中收集更多信息，创建更好的人体生理病理环境模拟，并促进更深入和全面的研究。例如，循环肿瘤细胞（CTC）的数量可以表明肿瘤的恶性程度和转移风险;然而，外周血中CTC的稀缺阻碍了它们的应用。尽管如此，随着微流控技术的不断发展，已经出现了几种基于微流控的CTC捕获技术。值得注意的是，Jinho Kim等人构建了一种微流控装置（SIM-Chip），它可以从全血中富集CTC并识别和分离它们。类器官微流控技术将类器官和微流体技术集成在一起，通过在微流控芯片上设计微通道和反应单元来实现类器官的体外培养和模拟。该技术利用微流体设备和计算软件精确控制微环境，模仿 TME来研究肿瘤间充质相互作用。微流体技术有助于将细胞、药物和营养物质精确、及时地输送到癌细胞。此外，微流体技术允许自动控制液体输送速度、浓度和持续时间，从而能够使用药物混合物和营养物质进行动态筛选。类器官微阵列是一种基于微流控的类器官培养平台，可模拟体内TME，从而能够研究肿瘤生长和转移。这项技术需要在后续实验和分析之前构建微流体通道和细胞培养室。此外，3D打印技术可以与微流体相结合，创造创新的解决方案。3D打印技术是一种增材制造方法，通过堆叠层从计算机模型数据制造 3D物理对象。3D打印技术的出现为微流体提供了新的可能性。首先，3D打印技术为微流控芯片制备的标准化和大规模生产提供了广阔的前景。其次，3D生物打印技术能够精确控制细胞和生物材料的分布，更好地模拟生物组织的复杂微观结构。3D生物打印技术可以创建高分辨率的微结构，以准确再现TME的复杂特征。此外，这些3D打印模型可用作肿瘤生物学中多功能研究和应用的临床前模型。通过将3D打印技术与微流控相结合，可以快速构建许多稳定的肿瘤类器官模型，最大限度地发挥类器官模型的优势。高内涵筛选（HCS）是一种基于成像的分析方法，它利用自动成像和数据分析在单细胞水平上提供具有高分辨率、高通量和高信息含量的无偏倚多参数数据。HCS能够在各个水平（包括细胞和分子水平）捕获图像和提取信息，从而可以检测基因表达、蛋白质定位和形态的变化。类器官培养完成后，可以采用高内涵成像技术，包括通过自动高通量摄影（例如高速显微镜成像）获取类器官数据。HCS的主要功能是以更少的单元、更短的时间和更高的吞吐量快速获取大量数据，同时减少劳动力消耗。该技术可以收集多通道数据，包括细胞形态、状态、数量和功能信息。此外，HCS可以与药物输送装置集成，以实时观察细胞对药物的即时反应。近年来，人工智能（AI）技术大幅发展。在医疗领域，人工智能可以促进药物的设计并有助于癌症检测、诊断和治疗优化等应用。高通量实验和AI技术在医学中的整合越来越受到关注。AI可以在生成肿瘤类器官的整个过程中得到利用，从构建到应用。基于AI的自动化可以帮助形成稳定的类器官球体。结合图像识别和数据分析的智能算法可以快速分析实验结果并得出结论。各种基于AI的图像识别算法也可以实现类器官的高通量应用。配备AI模块的智能分析系统可以根据收集的数据类型和分析目的选择合适的数据分析方法。表1总结了高通量底物技术的特点、优点和缺点。表1. 肿瘤类器官培养系统中的高通量底物技术4.类器官培养过程的高通量解决方案高通量技术在组织解离中的应用将患者来源的肿瘤组织团解离成单细胞是肿瘤类器官培养的关键初始步骤。此步骤可确保收获的单细胞的数量和活力，并为后续实验提供稳定的数据源。已经开发了全自动组织处理器和单细胞悬液制备仪器等仪器，以促进单细胞的高通量自动收获。这些仪器可以通过机器研磨和酶促反应将人类肿瘤组织制备为单细胞。组织解离剂结合了机械研磨和酶消化，可以从组织中分离单细胞悬液，并将组织块制备为匀浆。这些仪器利用自动化系统来定制应用，例如温度、时间和速度，以实现标准化过程作和更轻松的样品处理。这些仪器的优点包括提高精度和效率以及减少细胞损伤。该仪器可同时处理多达8种不同的组织和样品，样品量从20毫克到4000 毫克不等，并且易于作。例如，只需将组织样品放入分离管中，通过隔膜封闭的孔添加酶和其他溶液，并设置所需的程序，即可使机器通过研磨过程自动处理组织样品，从而获得高质量的单细胞悬液或亚细胞材料。例如，Jungblut等人使用仪器成功地将小鼠肺组织加工成高质量的单细胞悬液。自动化组织样本采集是肿瘤类器官培养的另一个重要方面。使用机器人辅助技术或自动采样设备可以有效地收集和处理大量样品。实施自动化组织采集系统和机械臂辅助作可以提高样本采集的速度和准确性。此阶段用于组织处理的仪器可以满足其中的大部分需求。随着人工智能技术的飞速发展，组织的自动化处理也将越来越智能化和个性化。未来，该过程可能不只涉及简单的消化，还涉及消化过程中的自动传感装置，以实时自动调节温度、酶浓度和其他条件，这是一个值得的未来研究方向。高通量技术在类器官植入中的应用类器官培养是模拟肿瘤发展过程的关键步骤。然而，类器官培养过程中的手动作会导致单个类器官液滴的组成、形态和功能发生显着变化，这可能会影响最终的实验结果。此外，手动培养的效率有限，因此在短时间内制备大量类器官具有挑战性。相比之下，将自动化和标准化引入高通量培养系统，例如基于微流体技术的自动化类器官培养平台，可以标准化和均质化每个类器官，从而实现类器官的单分散和高通量培养。这种方法可以更好地模拟肿瘤的恶性表型和转移能力。自动化细胞培养和监测可以显著提高肿瘤类器官培养的效率和准确性。例如，使用微量滴定板和自动化设备进行类器官培养和检测可以简化流程，确保一致性和可重复性。Jiang etal.开发了一个自动化类器官平台，集成了微流体连接的3D打印技术，能够通过自动化作快速制造和培养正常组织和肿瘤类器官。在这项研究中，将原代组织来源的细胞与基质凝胶混合，并将所得细胞悬液注入微流控系统中，通过微流控液滴打印机产生均匀的细胞负载基质凝胶液滴。液滴在微流体管道内糊化，以高通量产生均质的类器官前体。然后将这些前体打印到96孔板中，这种设计有助于在培养过程中对类器官进行高通量成像表征。值得注意的是，这些类器官前体在1周内以更低的成本和更短的时间成功培养，并已准备好进行药物测试。结果表明，通过这种方法制备的肿瘤类器官表现出81%的预测准确性，表明在模拟患者肿瘤对抗癌药物的反应方面具有高度的可重复性。Du etal.利用基因工程人类结肠类器官建立了一个小型化3D类器官培养平台，实现了高通量筛选。研究人员采用了多点组合分液器（也称为液体分液器），将细胞-凝胶混合物或药物试剂自动分液到384/1536孔板中，并确保准确和一致的分液。这种方法产生了快速和高质量的检测数据。3D类器官培养平台已被证明可用于大规模初级化合物筛选，通过促进细胞中化合物活性的高通量筛选和在 384 孔板中小型化类器官，在 1536孔板中实现超高通量测序。此外，结合配备冷却台和移液臂的液体处理机器人，可以在常规分析开发中测试多种浓度的基质凝胶，从而快速优化类器官生长条件。带有液体处理机器人的全自动工作站可用于类器官的自动接种。还开发了一种微流体装置来图案化水凝胶，利用层流在两侧形成疏水通道，同时在中间产生亲水通道。当液体水凝胶注入亲水区域时，它被周围的疏水区域限制在这条路径上。该设备为培养的细胞和组织提供了受控的 3D微环境，克服了与微柱和小压力屏障相关的昂贵且复杂的作挑战，从而提高了微流体细胞培养分析的效率。通过在设备内培养人脐静脉内皮细胞来证明该方案的可行性。光刻技术是制造器官芯片中广泛采用的技术，其中利用光刻胶在光的影响下将光掩模的图案转移到芯片上，从而能够生产具有任意图案的器官芯片。值得注意的是，胡 等人开发了一种用于肺癌类器官培养的集成超疏水微孔阵列芯片（InSMAR-chip），能够同时培养数百个类器官并促进高通量培养和分析。随着高通量技术的不断进步和改进，未来将开发越来越复杂和精细的类器官模型，并且也有可能模拟完整的人体系统并从这个角度考虑肿瘤的治疗。因此，作品的精细化将增加。由于在此过程中人为错误是不可接受的，因此有必要开发机器来执行这项工作。然而，与此同时，用机器取代体力劳动也有其自身的问题，例如，类器官中可能存在细胞团块或微小组织，导致植入不均匀。将来，可能需要开发更多的技术，例如流体动力学，以使他的分布更加均匀。高通量技术在药物筛选中的应用药物警戒筛选和验证是高通量解决方案的重要组成部分。培养的类器官为药物筛选提供了一种很有前途的工具，因为它们可以概括体内TME，从而能够更准确地预测药物疗效。与机器学习算法集成的自动化药物筛选平台可以快速准确地检测药物对肿瘤类器官的影响。通过比较不同药物治疗下肿瘤类器官的生理参数，可以初步确定具有潜在治疗效果的药物。类器官建模在肽药物筛选中的现有应用和前景已在以前的综述中进行了系统描述。我们在这里没有讨论传统的类器官药物筛选方法，只关注应用高通量类器官药物筛选。Schuster等人开发了一种可以自动化的微流体3D类器官培养平台，利用微流体技术和编程软件实现动态的、时间依赖性的类器官药物输送和联合治疗。此外，该平台还与图像分析仪相结合，可实时监测类器官形态和活力。通过对患者来源的胰腺肿瘤类器官进行药物筛选来验证微流控平台的可行性，这表明联合和动态治疗在治疗肿瘤类器官方面比恒定的单药方案更有效。现有研究主要集中在药物梯度或两种药物的组合上。然而，Li等人开发了一种高通量、开放空间、可重复使用的多层微流体芯片，用于基于类器官的组合药物筛选，以识别日益复杂的药物组合。该微流控芯片具有连接到数据收集工具的可编程流量控制系统。该芯片由一个入口层和多个分散层组成，能够同时从入口层加载不同的样品，然后样品溶液流入下面的分散层。单个微泵控制每个通道中的液体流动，最大限度地减少细胞稀释，并有助于通过显微镜技术进行组织学分析。Komen等人设计了一个由药物层和细胞层组成的微流控平台。两层由膜隔开，两个通道以交叉形状相交，允许细胞从交叉处接种。完成后，底部通道关闭，两个独立的注射泵调节药物层中的药物浓度，然后通过膜扩散到下部空间，从而提供动态药物给药。Zhai等人报道了一种具有创新控制结构和芯片设计的数字微流控系统。他们的药物分配器将所需的药物剂量预加载到芯片上，将其与细胞悬液滴混合，形成具有不同药物浓度的药物筛模型，最后将混合物输送到培养细胞的位置。该技术使用两种化疗药物进行了验证。与传统的96孔板相比，该系统具有多项优势，包括减少细胞和药物消耗以及最小的空间要求。在器官芯片方法中，Ryuji Morizane 的团队通过开发类器官模型来提高类器官质量和疾病模型保真度，为肾脏疾病研究做出了重大贡献。Ryuji Morizane的团队报告了一种可以在微流控芯片上流动培养的肾类器官，他们使用内源性内皮祖细胞为与组织工程血管构建相关的研究提供了新思路。Ryuji Morizane的团队在类器官芯片中增加了流体流动，并使用该模型测试了两种新药，突出了类器官模型在阐明治疗测试和发现的复杂疾病机制方面的巨大潜力。值得注意的是，药物筛选是一个备受关注的领域，一个关键问题是添加药物后细胞活力状态的评估。药物筛选的最终评价是细胞对药物的反应，我们经常评估细胞的状态。经典方法是基于细胞毒性的MTT和CCK-8 测定。随着技术的发展，检测灵敏度也提高了，可以使用基于ATP酶活性的方法。可用于这些方法的商业化试剂盒;然而，一个缺点是这些方法不是实时进行的，并且不能反映给药早期细胞的状态;因此，需要新的解决方案，例如C3蛋白和ATP比率。随着研究技术的进步，研究人员可用的工具也在进步。现在可以将CFP-Asp-Glu-Val-Asp（DEVD）-YFP 融合蛋白转染到细胞中以确定caspase-3表达水平，然后使用多光子显微成像进行数据采集，以获得有关肿瘤对药物敏感性的定时或延迟数据。此外，Ryuji Morizane的团队利用基因编码的荧光生物传感器PercevalHR，该传感器可以感应ATP：ADP比率，从而反映细胞能量代谢的状态，用于类器官中的高通量药物筛选。该技术在肾脏类器官中的应用，其中药物的肾毒性评估，表明它可能适用于未来的高通量药物筛选。值得注意的是，拉曼光谱也可用于研究癌细胞中的药物代谢。由于自然界中存在或由人类合成的化合物数量庞大，因此有必要进行大规模的实验以选择最好的药物。由此可见，近年来药物筛选的高通量应用发展迅速，许多制药企业已经拥有了进行高通量药物筛选的全套设备和方法。未来的高通量技术发展可能侧重于降低成本和精细化模型，以解决药物分子的复杂结构，并使数据能够与人工智能、大数据分析和其他技术相结合，全面研究药物的机制、疗效和安全性。对于靶向药物，需要一种更复杂的方法来评估药物的活性，以评估其疗效，同时还要观察对人类的毒副作用。还有一些药物需要与其他药物或其他疗法联合才能有效，并且可能需要开发一个更全面的系统来观察治疗过程中或特定阶段的疗效。这可能是未来的趋势，但与此同时，它将需要更高水平的自动化和经济性。类器官培养中的数据采集和数据分析数据采集类器官成像和数据分析过程比2D细胞培养更复杂，增加了对所用成像工具和分析技术的要求。为了客观地呈现类器官的表型和结构并实现高通量类器官药物筛选过程，我们需要将自动化与3D成像和机器学习方法相结合。Ryuji Morizane的团队现在可以通过自动3D成像来绘制肾脏类器官的结构图，从而克服了类器官的复杂结构给高通量药物筛选带来的困难。细胞成像是了解肿瘤类器官培养状态和评估药物疗效的重要工具。高分辨率显微镜和图像分析技术可在培养和药物筛选过程中实现快速准确的细胞形态、数量和活力检测。在我们的实验方案中，采用活细胞荧光显微镜来获取类器官数据。使用在平移台上配备类器官平台的倒置显微镜进行观察，并设置了一个外壳来控制类器官的细胞环境并保持类器官培养所需的温度、湿度和CO2气体成分。ImageXpress 软件用于采集图像。显微镜连接软件支持在不同位置、z堆栈和多个颜色通道进行自动图像采集。此外，光片显微镜已被用于通过融合多视图图像来评估肿瘤类器官的药物疗效，从而实现完整的3D断层扫描。这种方法补偿了在3D结构样品最深处获得的图像质量低下，并使荧光分子能够到达直径达1mm的类器官的核心，从而能够从不同区域收集相关数据。数据分析在培养过程中会产生大量数据，包括有关细胞活力和生理指标的数据。数据可视化技术将复杂数据转换为直观的图表，便于理解和分析。这些数据为后续的临床试验和药物开发提供了有价值的参考。已使用连接到配备MATLAB脚本的计算机的显微镜来分析荧光图像以量化细胞凋亡，从而为每个类器官提供所需荧光标记物的平均荧光强度和相应的图像。AI分析是类器官培养中数据分析的重要工具。通过利用机器学习算法，AI分析可以分析和预测用于药物筛选的实验数据，使我们能够了解药物对肿瘤类器官的作用机制，预测药物疗效和副作用，并优化药物筛选策略。AI图像分析软件（Aivia）为从2D到5D的图像可视化、分析和数据组合提供了一个全面的平台，能够在几分钟内快速处理和重建高度复杂的高质量图像。AI图像分析同时集成了传统的图像分析和深度学习算法，通过专用软件从数字显微镜图像中提取特定数据，为图像分析技术开辟了新的途径。下图（图3）说明了如何将上述高通量技术用于组织解离、类器官生长、药物筛选、数据分析和数据采集。图3：通过高通量技术进行组织解离、类器官植入、药物筛选、数据分析和数据收集的整个过程。（A） 在初始样品制备步骤中，通过组织解离器处理患者来源的肿瘤组织以获得单细胞悬液。（B） 使用微流体技术进行3D打印，并将所得类器官植入96孔板或微流体芯片中。（C） 在药物筛选过程中，药物可以通过药物打印机自动给药或微流体输送。（D） 然后通过高内涵成像系统获取图像数据，并通过AI分析进行数据分析。在类器官培养过程中，我们发现细胞的异质性显著，包括活体和死亡的测定可能显示受到多种因素的干扰。因此，可能需要开发排除组织和个体患者之间类器官形成的复杂因素和差异的算法。随着成像技术的发展，用于评估细胞活动的图像处理算法存在困难，未来的图像处理可能需要更高的计算量，因此需要大型服务器提供更强大的算法。此外，可以使用基于数据优化的计算模型来解决能耗相对较小的数据分析问题。5.总结与展望肿瘤类器官培养系统在体外概括TME具有广泛的应用。通过在体内模拟TME，该技术可以更准确地预测药物对肿瘤的影响。引入高通量解决方案有助于实现从培养到药物筛选的加工过程的自动化和放大，从而提高培养效率和筛选准确性。目前，类器官技术无法完全概括TME。此外，缺乏相关行业的支持阻碍了微流控技术的广泛应用，微流控技术无法取代传统的类器官培养平台。天然衍生基质的化学性质，例如温度敏感性和室温下的聚合反应，会导致微流体通道堵塞，这也是当前微流体和高通量技术面临的挑战。此外，缺乏对微流体中负载的Matrigel的低温控制是3D打印技术的一项重大挑战。患者来源的肿瘤样本的有限可用性也阻碍了浓度依赖性评估和联合疗法的评估，突出了提高患者样本细胞提取效率和标准化培养技术的需求。类器官目前正在快速发展，未来将开发越来越多的复杂模型，例如Ryuji Morizane团队制作的类器官芯片模型，以解决疾病发展的真实情况。此外，高通量解决方案应该相对较快地开发。高通量实验也将变得更加快速、准确、自动化，并且能够处理大规模实验数据。未来，加强肿瘤类器官培养系统与高通量实验（如药物筛选）的整合，对于确定更有效的肿瘤治疗和药物至关重要。识别微信二维码，添加抗体圈小编，符合条件者即可加入抗体圈微信群！请注明：姓名+研究方向！本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

引言你以为RNA只是传递遗传信息的“信使”？太简单了！细胞内的RNA远比我们想象的更加复杂而动态。它们身上布满了各种化学修饰，就像隐藏的“暗号”或“指令”，精密地调控着基因的表达。在这张神秘的“RNA表观转录组图谱”（RNA Epitranscriptomics）上，“N⁶-甲基腺苷”（N⁶-methyladenosine, 简称 m⁶A）无疑是最受瞩目的标记之一。它被发现与mRNA的命运息息相关，尤其是加速mRNA的衰变——简单来说，带有m⁶A的信使分子似乎活不长。然而，一个令人困惑的“罗生门”出现了：如果mRNA带着加速降解的标记，它怎么来得及被细胞的“翻译机器”——核糖体读取并合成蛋白质呢？特别是当m⁶A出现在指导蛋白质合成的“编码序列”（Coding Sequence, CDS）里时，这个矛盾似乎更加突出。难道m⁶A是基因表达的“自毁开关”？核糖体是如何理解并应对这个标记的？4月30日发表在《Cell》上的一项重磅研究“tRNA modifications tune m⁶A-dependent mRNA decay”，揭开了这个谜团的惊人真相。研究人员发现，m⁶A对mRNA衰变的影响并非孤立存在，它竟然与另一种RNA分子——转运RNA（tRNA）上的特定化学修饰“握手”合作！这项研究精确地揭示，m⁶A在mRNA的编码序列中会成为核糖体的“减速带”，降低翻译效率，而tRNA上的一种特殊修饰“5-甲氧基羰基甲基-2-硫代尿苷”（mcm⁵s²U）则能像“助推器”一样，巧妙地缓解这种“减速”效应。这场mRNA与tRNA修饰之间的“双簧戏”，共同构成了调控特定mRNA（特别是那些编码关键信号通路的mRNA）命运的精妙开关。更令人警醒的是，研究发现，这套系统的失衡，竟然与人类健康，尤其是肿瘤的发生和侵袭性紧密相关！细胞如何通过协调不同类型RNA上的化学标记，来决定一个信使分子的生死？这种全新的泛表观转录组学相互作用，又将如何改写我们对基因表达调控和癌症机制的理解？m⁶A的“神秘”位置：为何有的加速衰变，有的却稳定mRNA？以往的研究发现，m⁶A修饰并非随机分布，它倾向于出现在mRNA的编码序列（Coding Sequence, 简称CDS）内部以及接近终止密码子（Stop Codon）的区域。但这种分布模式具体如何影响mRNA功能，我们并不完全清楚。为了弄清楚m⁶A的位置效应，研究人员首先利用高分辨率的m⁶A图谱技术（miCLIP）在人HEK293T细胞中绘制了m⁶A的精确位置地图。通过将m⁶A位点明确划分到mRNA的不同区域（5'UTR, CDS, 3'UTR），他们发现：那些mRNAs，如果它们的m⁶A位点仅位于3'UTR，它们的平均衰变速率并没有比没有m⁶A的mRNA更快，甚至在某些情况下，它们的稳定性略有增加。在人类细胞中，没有m⁶A的mRNA平均半衰期约7小时，而m⁶A仅在3'UTR的mRNA半衰期略长于7小时。然而，如果mRNAs的m⁶A位点位于编码序列（CDS）内部，这些mRNAs的平均衰变速率则显著提高。在人类细胞中，m⁶A位于CDS的mRNA平均半衰期显著短于7小时，而在小鼠胚胎干细胞（mESCs）中也观察到了类似的模式。这表明，m⁶A对mRNA衰变的影响并非一概而论，其位置至关重要。位于CDS的m⁶A才是加速mRNA衰变的主要“推手”。进一步分析发现，高度不稳定的mRNA在CDS中富集了m⁶A，而稳定的mRNA的CDS区域m⁶A含量较低。这与m⁶A的“元基因”（metagene）分布模式相吻合，表明m⁶A在CDS区域的富集与mRNA的快速衰变密切相关。为了在受控条件下验证这一结论，研究人员构建了一系列报告基因（Reporter Gene）。这些报告基因表达的mRNA经过精心设计，不含天然的m⁶A修饰位点，但在特定位置引入了可被甲基化的DRACH序列（m⁶A的识别基序）。他们构建了三种主要的报告mRNA：一种不含可甲基化位点作为对照；一种在CDS的末端（紧邻3'UTR之前）插入DRACH序列；另一种在3'UTR的起始位置插入DRACH序列。当将这些报告基因转染到HEK293T细胞中，并阻断转录后，研究人员监测了报告mRNA的衰变速率。结果发现：含有CDS m⁶A的报告mRNA的衰变速度最快，半衰期约为2.3小时（使用Actinomycin D阻断转录）或7小时（使用Triptolide阻断转录）。对照报告mRNA（无m⁶A）的半衰期约为7小时（Actinomycin D）或19小时（Triptolide），比CDS m⁶A报告mRNA稳定得多。含有3'UTR m⁶A的报告mRNA的半衰期约为3.4小时（Actinomycin D）或330小时（Triptolide），其稳定性介于前两者之间，且在Triptolide处理下甚至比无m⁶A报告mRNA更稳定（虽然Actinomycin D处理下略快，这可能与阻断机制差异有关）。为了确认这种差异是由m⁶A修饰本身引起的，研究人员使用了METTL3抑制剂STM2457（METTL3是主要的m⁶A甲基转移酶）。STM2457处理后：CDS m⁶A报告mRNA的衰变速度显著减慢，半衰期从7小时增加到5.9小时（Triptolide），变得与无m⁶A对照报告mRNA的6小时半衰期相似。3'UTR m⁶A报告mRNA在STM2457处理后显示出稳定性增加，这与之前观察到的m⁶A在3'UTR的稳定作用一致。这些实验有力地证明，m⁶A在编码序列（CDS）中的存在是导致mRNA快速衰变的关键因素。翻译机器的“秘密”：mRNA衰变与核糖体的速度之舞为什么m⁶A在CDS会加速mRNA衰变呢？研究人员推测，这可能与mRNA的翻译过程紧密相关。核糖体是负责将mRNA序列翻译成蛋白质的“机器”，它们沿着CDS前进。如果CDS上的m⁶A影响了核糖体的运动速度，这或许会引发下游的衰变机制。为了验证翻译是否是m⁶A介导的mRNA衰变所必需的，研究人员使用了翻译抑制剂（如cycloheximide和emetine）处理了表达报告基因的HEK293T细胞。结果显示：无论是使用cycloheximide还是emetine，含有CDS m⁶A的报告mRNA的衰变速度都显著减慢，其稳定性大大提高。这强烈支持CDS m⁶A介导的衰变是翻译依赖性的。其他报告mRNA（无m⁶A或3'UTR m⁶A）的稳定性也有所提高，但效果不如CDS m⁶A报告mRNA那样显著和一致。随后，研究人员将目光转向了内源性（细胞自身）的m⁶A靶mRNA。他们分析了在emetine处理的小鼠胚胎干细胞中，内源性mRNAs的衰变速率。结果发现：与未处理的细胞相比，在emetine处理的细胞中，CDS区域含有m⁶A的mRNA的稳定性提高最多，其稳定性与不含m⁶A的mRNA相当。进一步对人HEK293T细胞的数据分析也发现，mRNA的m⁶A水平（特别是CDS中的m⁶A）与其在emetine处理后的稳定性高度相关，相关系数平方（R²）约为0.66，显示出很强的线性关系。虽然单个mRNA的稳定性变化可能不大，但这种关联在转录组水平上普遍存在，超过20%的基因表现出超过20%的稳定性提高。这些结果表明，m⁶A介导的mRNA衰变严重依赖于mRNA的翻译过程。这提出了一个重要的假说：CDS中的m⁶A可能通过影响核糖体的翻译速度来调控mRNA的衰变。m⁶A如何“绊倒”核糖体：解码效率的微调如果翻译是关键，那么m⁶A具体是如何影响核糖体的呢？一种可能性是，m⁶A修饰的密码子在核糖体翻译过程中被“低效”解码，导致核糖体速度减慢，甚至“暂停”。我们知道，低效的密码子（Non-optimal codons）会减慢翻译速度，并且与mRNA半衰期缩短有关。早期体外实验也显示，m⁶A可以干扰细菌核糖体对tRNA的识别。为了在活细胞中验证这一假说，研究人员结合了m⁶A高分辨率图谱和核糖体分析技术（Ribosome Profiling）。核糖体分析可以捕捉mRNA上被核糖体保护的片段，从而揭示核糖体在mRNA上的位置和密度。核糖体停留在某个密码子上的时间越长，该密码子的A位点（Aminoacyl-tRNA binding site）的覆盖度就越高，这通常意味着该密码子正在被低效解码。研究人员首先在HEK293T细胞中鉴定了被m⁶A修饰的密码子，并进行了核糖体分析。为了排除不同mRNA之间密码子使用频率差异带来的偏差，他们采取了严格的对照策略：对于每一个m⁶A修饰的密码子，都找到了同一mRNA中最近的、未被m⁶A修饰的同类型密码子进行比较。比较结果显示：与未被修饰的同类型密码子相比，m⁶A修饰的密码子在核糖体A位点的覆盖度显著更高，表明这些密码子在活细胞中确实被低效解码了。这种低效解码效应并非由m⁶A结合蛋白引起，通过分析核糖体在m⁶A位点附近的阅读框偏移，研究人员确认核糖体是停留在m⁶A所在的密码子上，而不是在其他位置，这符合解码效率降低的模式。为了进一步确认这种低效解码是m⁶A本身造成的，研究人员使用了METTL3抑制剂STM2457处理HEK293T细胞，抑制m⁶A的形成，并再次进行核糖体分析。结果令人惊叹：在STM2457处理后，原本被m⁶A修饰的密码子在核糖体A位点的覆盖度显著降低，回到了未修饰密码子的基线水平。此外，通过计算单个密码子的m⁶A化学计量度（即该密码子被m⁶A修饰的比例），研究人员发现在未处理的细胞中，m⁶A化学计量度与密码子A位点覆盖度之间存在强烈的正相关关系（R²约为0.66）。而在STM2457处理的细胞中，这种相关性几乎完全消失（R²小于0.01）。这些数据有力地证明，m⁶A修饰确实会降低哺乳动物核糖体对密码子的解码效率，导致核糖体在含有m⁶A的密码子处减速。“密码”不是铁板一块：m⁶A对不同密码子的区别对待m⁶A的识别基序通常是DRACH序列，它可以存在于九种不同的有义密码子（Sense Codons）中。研究人员进一步探究了这九种可被甲基化的密码子是否受到m⁶A的同等影响。他们分析了这些密码子在被m⁶A修饰后的A位点覆盖度。结果发现：在这九种密码子中，有八种在被m⁶A修饰后，其A位点覆盖度都有所增加，表明普遍存在低效解码现象。然而，不同密码子受到的影响程度差异巨大。例如，GGA密码子即使被甲基化，其A位点覆盖度变化很小；而GAA密码子即使未甲基化时覆盖度已较高，被m⁶A修饰后覆盖度进一步显著增加。这种差异是为什么呢？研究人员推测这可能与密码子-反密码子（Codon-Anticodon）相互作用的强度有关。GGA密码子与tRNA的反密码子通过沃森-克里克（Watson-Crick）碱基配对形成三个氢键，是一种固有强相互作用的密码子。而GAA密码子形成一个G-C碱基对，相互作用强度中等。看起来，m⁶A对密码子的影响程度，与其固有的密码子-反密码子相互作用强度有关，对于相互作用中等强度的密码子，m⁶A的“减速”效应更为明显。在STM2457处理后，这些密码子（特别是那些对m⁶A敏感的）的A位点覆盖度增加效应几乎完全逆转，再次确认这是m⁶A本身的作用。因此，m⁶A对不同密码子的解码效率影响是存在差异的，这种差异性取决于密码子-反密码子相互作用的强度。tRNA的“救援”：mcm⁵s²U如何解除m⁶A的“减速”魔咒？我们知道，tRNA上的化学修饰会影响其对mRNA密码子的解码效率。研究人员注意到，m⁶A位于密码子的第三位（即“摆动”位置，Wobble Position）时，引起的核糖体暂停效应比m⁶A位于前两位时更强。而沃森-克里克碱基配对规律允许反密码子的第三位（U34）与密码子的第三位（“摆动”碱基）进行非沃森-克里克配对。恰好，某些tRNA在U34位点含有修饰“5-甲氧基羰基甲基-2-硫代尿苷”（5-methoxycarbonylmethyl-2-thiouridine, 简称 mcm⁵s²U）。mcm⁵s²U修饰已知可以提高解码效率。这让研究人员产生了一个大胆的猜想：tRNA上的 mcm⁵s²U修饰，是否能够“救援”或缓解m⁶A修饰密码子的低效解码？为了验证这一猜想，研究人员构建了敲除ELP1或CTU2基因的HEK293T细胞系。ELP1和CTU2是mcm⁵s²U生物合成途径中的关键酶。敲除这些基因会导致tRNA缺乏mcm⁵s²U修饰。他们确认了敲除细胞系中tRNA缺乏mcm⁵s²U修饰，并再次进行了核糖体分析。他们特别关注了那些既能被m⁶A修饰，又被含有mcm⁵s²U的tRNA解码的密码子，例如AAA、AGA和GAA。对这些密码子在野生型（WT）细胞以及ELP1 KO和CTU2 KO细胞中的A位点覆盖度进行分析后发现：在缺乏mcm⁵s²U修饰的ELP1 KO和CTU2 KO细胞中，m⁶A化学计量度与这些密码子的A位点覆盖度之间的相关性显著增强。特别是对于AGA密码子，在野生型细胞中m⁶A对其影响不大，但在缺乏mcm⁵s²U的细胞中，m⁶A导致了强烈的核糖体暂停。这表明AGA密码子对mcm⁵s²U的缺乏特别敏感。这种现象在STM2457处理的细胞中被逆转，再次确认这是m⁶A与mcm⁵s²U相互作用的结果。这些结果表明，m⁶A和mcm⁵s²U这两种在不同RNA分子上的修饰，在翻译核糖体的A位点上存在功能性相互作用，mcm⁵s²U能够缓解m⁶A对密码子解码效率的降低作用。低效解码往往会导致核糖体“碰撞”（Ribosome Collisions），即一个核糖体在前面慢速或暂停时，后面的核糖体赶上来发生碰撞。核糖体碰撞被认为是激活mRNA衰变机制（如无停顿衰变No-Go Decay）的信号。研究人员也检测了在不同细胞系中m⁶A修饰密码子处的核糖体碰撞情况：在野生型细胞中，AGA和GAA等对m⁶A敏感的密码子处检测到了核糖体碰撞。这种碰撞在STM2457处理后减少，确认是由m⁶A引起的。更重要的是，在缺乏mcm⁵s²U的细胞中，AGA和GAA密码子处的核糖体碰撞显著增加。这些数据绘制出了一幅清晰的图景：m⁶A修饰导致核糖体减速，特别是当tRNA缺乏mcm⁵s²U“救援”时，减速更加严重，从而引发核糖体碰撞。这些局部的核糖体碰撞可能就是生理性的mRNA衰变信号。双重调控的“管家”：mcm⁵s²U/m⁶A系统如何管理重要mRNA的命运既然mcm⁵s²U能够对抗m⁶A引起的低效解码，那么它是否也能影响m⁶A介导的mRNA衰变呢？研究人员回到了报告基因实验。他们构建了一个报告基因，其CDS中的DRACH位点包含一个AGA密码子。如前所述，AGA密码子的解码需要完整的mcm⁵s²U修饰，且对mcm⁵s²U缺乏非常敏感。将这个含有AGA密码子的报告基因转染到野生型、ELP1 KO和CTU2 KO细胞中后，研究人员检测了报告mRNA的衰变速率：在ELP1 KO和CTU2 KO细胞中，报告mRNA的半衰期都比野生型细胞中缩短了，衰变速度加快。这种加速衰变是由m⁶A驱动的，因为STM2457处理可以稳定报告mRNA。这表明，缺乏mcm⁵s²U确实会加速m⁶A修饰mRNA的衰变。为了在全转录组水平上验证这一发现，研究人员使用了SLAM-seq技术测量了mcm⁵s²U缺陷细胞中细胞内源性mRNAs的衰变速率。SLAM-seq可以通过标记新合成的RNA来区分新旧mRNA，从而更精确地测量衰变速率。结果显示，在ELP1 KO和CTU2 KO细胞中，m⁶A修饰的mRNA的衰变确实加速了。这证明mcm⁵s²U对m⁶A介导的内源性mRNA衰变具有抑制或缓解作用。缺乏mcm⁵s²U会增强m⁶A的“破坏力”。这两种RNA修饰之间的相互作用，构成了一个全新的mRNA衰变调控机制。研究人员称之为“泛表观转录组学”（Pan-epitranscriptomic）调控系统。这个系统就像一个“管家”，协同管理着细胞内功能相关的mRNA“调控子”（Regulons）的命运。那么，这个“管家”系统具体调控哪些重要的mRNA呢？研究人员分析了受mcm⁵s²U/m⁶A系统调控的mRNA在癌细胞标志性通路（Cancer Hallmark Pathways）中的富集情况。结果揭示了一个显著的差异：负责细胞“内务管理”（Housekeeping）功能的代谢通路相关的mRNAs通常稳定，且CDS中的m⁶A含量较低。然而，编码信号通路关键组分的mRNAs则含有高水平的m⁶A，且衰变速度快。这些富含m⁶A、快速衰变的信号通路mRNAs在emetine处理后稳定性显著提高，再次确认其衰变是翻译依赖的。更重要的是，这些高度修饰、不稳定的信号通路mRNAs在缺乏mcm⁵s²U的细胞中衰变速度进一步加快。这意味着，m⁶A通过耦合翻译与快速衰变，来精确控制关键信号通路的表达。而mcm⁵s²U则像一个“许可”（Licensing）机制，通过缓解m⁶A的负面影响，确保这些重要信号通路mRNA能够获得更持续的表达，不至于过快被降解。这个mcm⁵s²U/m⁶A平衡系统，实际上是在微调这些紧密调控信号通路的mRNA的“寿命”。当RNA修饰失衡，疾病“趁虚而入”：mcm⁵s²U/m⁶A与癌症mcm⁵s²U/m⁶A系统调控着信号通路mRNA的命运，而信号通路的异常是癌症的标志。早期研究已经表明，m⁶A促进多能性因子mRNA衰变，帮助干细胞分化；而mcm⁵s²U则支持多能性因子表达，维持干细胞状态。持续表达多能性基因和致癌信号通路与肿瘤干性（Tumor Stemness）密切相关。这些都暗示mcm⁵s²U/m⁶A系统可能在癌症中发挥作用。研究人员分析了正常人体组织中mcm⁵s²U和m⁶A生物合成相关基因的表达水平，发现mcm⁵s²U生物合成基因相对于m⁶A生物合成基因的表达比例与组织的干性程度相关。更有趣的是，对TCGA（癌症基因组图谱）泛癌数据集的分析显示：与正常组织相比，多种肿瘤样本中都观察到mcm⁵s²U与m⁶A生物合成相关基因表达比例的失衡，具体表现为mcm⁵s²U相关基因表达相对于m⁶A相关基因升高。这种mcm⁵s²U/m⁶A比例的失衡（偏向mcm⁵s²U）与肿瘤的侵袭性增加和预后不良有关。这表明，肿瘤的发生和发展可能与mcm⁵s²U/m⁶A“管家”系统的失衡有关。为了进一步评估mcm⁵s²U/m⁶A系统作为癌症生物标志物的潜力，研究人员在METABRIC乳腺癌患者队列中，计算了mcm⁵s²U和m⁶A生物合成相关基因的表达水平对患者总生存期（Overall Survival）的单变量Cox比例风险模型。结果惊人地一致：mcm⁵s²U相关因子与患者风险增加相关（风险比>1，例如，mcm⁵s²U硫化相关因子URM1、MOCS3、CTU1、CTU2的风险比分别为1.019、1.011、1.008、1.005，均大于1），这意味着这些基因的高表达预示着较差的预后。而m⁶A相关因子（如METTL3、METTL14、WTAP等）与患者风险降低相关（风险比<1，例如，METTL3、METTL14、WTAP的风险比分别为0.986、0.989、0.992，均小于1），意味着这些基因的高表达与较好的预后相关。这种与两者分子功能相反方向的关联，在独立的SCAN-B乳腺癌患者队列中也得到了验证，再次强调了mcm⁵s²U/m⁶A系统失衡与乳腺癌患者预后不良之间的联系。研究人员基于METABRIC队列的系数，构建了一个“泛表观转录组学基因表达评分”（Pan-epitranscriptomic Gene Expression Signature），用于预测患者预后。结果显示：该评分能够显著区分不同预后风险的患者群体。评分较高的患者组（代表mcm⁵s²U相关基因表达相对较高）与较差的生存率显著相关（Log-rank检验p值小于0.0001）。在不同的乳腺癌亚型中，这个评分在更具侵袭性的亚型（如Basal亚型）中显著升高。这表明，mcm⁵s²U/m⁶A平衡系统可能在多种人类癌症中发挥作用，并有望作为一个新的泛癌生物标志物，帮助评估肿瘤的侵袭性和患者预后。癌症中观察到的密码子偏好性（Codon Bias）变化，或许并非直接通过改变蛋白质合成速度起作用，而是通过调控mcm⁵s²U/m⁶A系统来影响mRNA的周转。这项开创性的研究揭示了一个全新的基因表达调控机制：mRNA上的m⁶A修饰和tRNA上的mcm⁵s²U修饰并非各自为营，它们在翻译核糖体上“相遇”，协同作用，精细地调控着细胞内重要mRNA的命运。m⁶A像是一个“减速带”，让核糖体在CDS中停顿；mcm⁵s²U则像一个“助推器”，帮助tRNA更好地解码m⁶A修饰的密码子，缓解这种停顿。两者的平衡，决定了mRNA是快速衰变（m⁶A占优，特别是在mcm⁵s²U不足时）还是相对稳定（mcm⁵s²U有效“救援”）。这个“泛表观转录组学”调控系统，尤其对那些编码关键信号通路组分的快速衰变mRNA至关重要，确保了这些通路能够在需要时被激活，又能在完成任务后迅速“关闭”，维持细胞的动态平衡。当mcm⁵s²U/m⁶A的平衡被打破，偏向mcm⁵s²U时，重要信号通路mRNA的寿命延长，可能导致信号通路过度激活，推动肿瘤的发生和发展，预示着更具侵袭性的疾病和不良预后。这项发现不仅加深了我们对RNA修饰复杂性的理解，提供了一个解释m⁶A如何与翻译偶联调控衰变的新模型，也为癌症诊断和治疗提供了新的视角。未来，深入研究这个mcm⁵s²U/m⁶A系统如何精确识别靶标mRNA、如何与其他RNA结合蛋白（如YTHDF家族蛋白）协作或并行工作，以及如何利用这一系统失衡的特性进行干预，无疑是令人兴奋的研究方向。RNA的世界远比我们想象的更加精彩和复杂！参考文献https://www-cell-com.libproxy1.nus.edu.sg/cell/fulltext/S0092-8674(25)00415-5声明：本文仅用于分享，不代表平台立场，如涉及版权等问题，请尽快联系我们，我们第一时间更正，谢谢！往期热文：Cell | 颠覆认知！不是被动扩散，CD36介导内吞才是许多“大块头”药物入胞的秘密通道Nature Methods | mScarlet3-H：红色荧光蛋白的新一代王者！Nature Methods | 告别“平面时代”！光学显微镜如何带你看清3D细胞世界的秘密？Nature | 帕金森病新曙光！iPS细胞人体试验结果揭晓，安全有效性初显！Cell | 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