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摘要:外膜囊泡（OMVs）是许多革兰氏阴性细菌在生长过程中自发释放的，是细菌的重要毒力因子，帮助它们在恶劣的环境条件下生存。天然OMVs是细菌自然释放的，其产量对于疫苗制造来说太低，需要化学处理（去污剂提取）或遗传操作，从而产生膜抗原的通用模块（GMMAs）。多年来，OMVs的特性和属性使它们成为疫苗开发的可行平台。目前已有几种OMV疫苗获得许可，主要用于预防由B型脑膜炎奈瑟菌（MenB）和b型流感嗜血杆菌（Hib）引起的脑膜炎。还有几种针对其他革兰氏阴性细菌的OMV候选疫苗处于临床开发阶段，这些细菌是OMVs的来源，但也针对异源靶标，在这些靶标中OMVs被用作载体（例如2019年冠状病毒病[COVID-19]）。将OMVs用于非自身来源靶标的开发是OMV技术的重大进步，通过能够递送蛋白质或多糖抗原，提高了其多功能性。其他进展包括可以进行的一系列遗传修饰，以提高其安全性，减少反应原性，并增加免疫原性和保护效果。然而，仍然存在重大挑战，例如识别用于在OMV表面高含量表达异源蛋白的通用工具。在这里，我们概述了迄今为止OMV疫苗的进展，特别讨论了已获许可的基于OMV的疫苗和处于临床开发的候选疫苗。本文还描述了临床前研究的最新趋势，主要集中在遗传操作和化学偶联方面，以将OMVs用作异源蛋白质和多糖抗原的载体。还讨论了使用OMVs的剩余挑战和未来研究的方向。 关键点 外膜囊泡（OMVs）是疫苗开发的一种可行平台，目前已有一些基于OMV的疫苗获得许可并处于临床使用中。OMVs在使用上有着悠久而丰富的历史，特别是在针对脑膜炎奈瑟菌和b型流感嗜血杆菌的疫苗中，并且已经产生了大量支持使用这一平台来对抗许多其他病原体的临床前数据。最近的趋势是将OMVs用作异源蛋白质和多糖抗原的载体，支持多组分疫苗的开发。 1. 引言 外膜囊泡（OMVs）是许多革兰氏阴性细菌在生长过程中自发释放的，可能是由于细胞生长和外膜生物合成之间的不平衡，导致多余的膜材料以OMVs的形式释放。已有多项研究报告了OMVs在增强细菌在恶劣环境中的存活能力以及向宿主细胞传递毒力因子和DNA方面的作用。OMVs似乎参与了细菌的致病过程，帮助生物膜形成，并在宿主中或土壤中增加存活率。此外，OMVs支持细菌抵抗抗生素，并促进细菌之间抗生素抗性的转移。 OMVs模仿细菌的外部，类似于一种没有致病能力的病原体，并含有多种表面暴露的抗原。OMVs还含有与病原体相关的分子模式（PAMPs），如脂多糖（LPS）、肽聚糖、脂蛋白和鞭毛，这些成分具有自我佐剂性。此外，OMVs的粒径有助于被抗原呈递细胞（APCs）摄取，有助于向相应的T细胞呈递，并由滤泡树突细胞（FDCs）激活特定抗原的B细胞，从而诱导适应性免疫反应。基于这些原因，过去几年中，OMVs一直被视为疫苗开发的一种多功能平台。 细菌自然释放的OMVs被称为天然OMVs（nOMVs），但对于许多细菌来说，这种释放水平对于疫苗制造来说太低。为了提高产量，已使用去污剂（例如脱氧胆酸）从整个细菌中化学提取OMVs，结果产生了称为去污剂提取的OMVs（dOMVs）的类囊泡聚集体，这些聚集体是不溶性外膜蛋白。通常丢弃含有自发囊泡的发酵上清液，然后进行OMV的提取。可以引入超声步骤以获得更小且更均匀大小的dOMVs，也简化了无菌过滤。使用去污剂大大减少了LPS和脂蛋白的含量，从而降低了反应原性并提高了OMV的耐受性。然而，这种方法也导致了重要的保护性脂蛋白抗原的丢失，并损害了囊泡的完整性，并使得最终制剂被胞质蛋白污染。 可以通过遗传操作改变细菌的OMV特性（例如产量、内毒素性、蛋白质含量），并将其归类为突变衍生的OMVs（mdOMVs）或膜抗原的通用模块（GMMAs）。通常引入突变以破坏外膜与内膜以及周质中的肽聚糖层之间的联系。为了实现这一目的，已经采取了不同的策略。一种常见的方法是删除大多数革兰氏阴性细菌中存在的Tol-Pal系统的tolR基因。在大肠杆菌中使用nlpI的删除改变了肽聚糖动态；在流感嗜血杆菌、霍乱弧菌和大肠杆菌中破坏VacJ/Yersinia复发ABC（ATP结合盒）运输系统，导致磷脂在体外膜的外层积累。删除lpp、mltA（gna33）、rmpM、ompT、pagL、大肠杆菌共同抗原、degP和virk也会导致细菌外膜过度脱落。 由于天然释放的OMVs中LPS含量很高，因此引入了额外的突变以减少内毒素性。这通常是通过修改脂质A结构来实现的，特别是减少脂质A的酰链和磷酸基团的数量，影响其识别/触发Toll样受体（TLR）4的能力，并减少与脂质A相关的炎症反应。在大肠杆菌、志贺氏菌和沙门氏菌中使用了MsbB（lpxM）、HtrB（lpxL）和PagP（分别向脂质A添加肉豆蔻酰、月桂酰或棕榈酰链）的酰基转移酶的删除；在脑膜炎奈瑟菌中使用了lpxL1和lpxL2的删除。 与dOMVs相比，nOMVs和GMMAs的纯化更简单，所需的步骤更少。OMVs可以通过首先进行切向流过滤（TFF）与整个细菌分离，第二个TFF保留OMVs，同时去除可溶性蛋白质和其他低分子量杂质。 在这篇综述中，我们提供了OMVs及其遗传修改版本GMMAs作为疫苗平台的概述，以呈现蛋白质或糖抗原，临床水平的关键成就，临床前研究中出现的趋势，以及该领域的未来展望。 2.已获许可的基于外膜囊泡（OMV）的疫苗 目前有几种基于OMV的疫苗已获许可并在使用中。这些疫苗针对脑膜炎奈瑟菌，针对B型脑膜炎奈瑟菌（MenB）和b型流感嗜血杆菌（Hib）感染（表1）。 Bexsero（Bexsero是GSK集团拥有或许可使用的商标）中包含三种重组蛋白，从N. meningitidis（NZ98/254菌株）提取的OMV去污剂被指示用于预防由N. meningitidis B型引起的脑膜炎和脑膜炎球菌血症。该疫苗通过刺激产生识别疫苗抗原（NHBA、NadA、fHbp）和PorA的杀菌抗体而发挥作用，PorA是OMV的主要成分。Muzzi等人对脑膜炎抗原分型系统（MATS）的综述表明，该疫苗覆盖了81%至84%的MenB分离株。在几项临床试验中进行了测试，显示出良好的免疫反应，通过人体补体血清杀菌活性（hSBA）测量。在婴儿研究中，当OMV组分增加而重组蛋白保持不变时，免疫反应相应增加，以hSBA ≥5的比例和几何平均滴度（GMTs）衡量，这以剂量依赖性方式增加，在接受Bexsero中OMV全剂量的婴儿中最低（即25μg），在接受全剂量OMV的婴儿中最高。然而，系统反应原性的类似趋势并没有观察到，在接受四分之一、一半和全剂量OMV的接受者中观察到类似的反应原性概况。对于局部反应，含有OMV的四组分MenB疫苗接受者比接受不含OMV疫苗的个体有更高的发生率。此外，与单独的重组蛋白相比，含有OMV的疫苗在引起发热的频率上要高得多。该疫苗于2013年获得许可，适用于从2个月大的个体开始主动免疫，以预防由MenB引起的侵袭性脑膜炎（IMD）。已在17项研究中评估了疫苗的安全性，包括10项随机对照临床试验，涉及婴儿、儿童、青少年和成人，当与常规疫苗联合使用时（69-79%的对象），发热的频率更高，与仅接受常规疫苗接种的对象相比（44-59%），尽管大多数事件的严重程度轻至中度且持续时间短（大约1天）。尽管疫苗是使用免疫原性终点获得许可的，但在Bexsero引入英国后3年内，疫苗合格婴儿的MenB IMD病例减少了75%。 相同的OMVs单独配方在新西兰MenB疫苗中，用于对抗该国由N. meningitidis B型引起的脑膜炎暴发。OMV疫苗在几项临床试验中进行了测试，显示出可接受的安全性概况，在接种三剂疫苗后显示出强烈的免疫反应。疫苗接种计划在2004年至2006年间在新西兰的不同地区分阶段进行，用于不同年龄组的婴儿常规疫苗接种，直到2008年。据估计，该疫苗的有效性为77%，预防了2004年7月至2008年12月期间估计210例MenB IMD及其后遗症。类似地，在挪威，1983年开发的dOMV疫苗用于对抗MenB，用于控制MenB疾病的暴发。该疫苗在1988年至1991年期间用于171,800名青少年，估计在10个月后有效性为87%，之后迅速下降，与血清细菌活性的降低相一致。该疫苗还在2006年至2009年期间用于控制法国诺曼底由相同B14:P1.7,16菌株引起的暴发，病例发病率从2006年的31.6/10万下降到2009年的5.9/10万。另一种基于dOMV的疫苗（VA-MENGOC-BC，古巴Finlay Institute）于1987年在古巴获得许可用于对抗MenB（VA-MENGOC-BC是古巴Finlay疫苗研究所的注册商标），在接下来的20年中成功将MenB疾病的发病率降低了93-98%，最终使MenB不再成为古巴的公共卫生问题。2014年，该疫苗被Abivax收购，用于在亚洲和拉丁美洲国家的古巴以外地区分销。 Hib-OMPC是第一个被广泛许可的基于OMV的疫苗。它是一种高度纯化的b型流感嗜血杆菌（H. influenzae type b）荚膜多糖（多核糖核糖醇磷酸[PRP]），通过从B型脑膜炎奈瑟菌（N. meningitidis serogroup B）B11菌株的OMVs中用去污剂提取，与外膜蛋白复合物（OMPC）共价结合。在关键试验中，Hib-OMPC在3486名纳瓦霍婴儿（一个特别高风险的疾病人群）中显示出93-100%的效力，这些婴儿在2个月和4个月大时接种了疫苗。作为PedvaxHib（PedvaxHIB是默克夏普和多姆公司的注册商标）许可的疫苗，在接种第一剂后的1-3个月内，88%的婴儿诱导了抗PRP水平>0.15 μg/mL，在52%的婴儿中诱导了>1.0 μg/mL，几何平均滴度（GMT）为0.95 μg/mL；在第二剂和第三剂后分别上升到91%和60%。 PRP-OMPC在早期有Hib感染高风险的儿童中，在一剂后刺激强烈的免疫反应。然而，美国免疫实践咨询委员会（ACIP）建议，之前未接种疫苗的2-6个月大的婴儿应接受至少相隔2个月的两次PRP-OMPC剂量，以确保保护的持久性。他们还根据儿童的年龄推荐一剂或两剂给未接种疫苗的儿童。 最终，PedvaxHib与乙型肝炎表面抗原（HbsAg）结合，并作为Comvax（在欧盟为Procomvax）许可。这种组合导致抗PRP抗体水平低于之前独立疫苗（Procomvax-EU/Comvax-US）报告的水平。Procomvax和Comvax是默克公司/MSD在欧洲的注册商标。 在五项临床研究中，对1602名6周至15个月大的婴儿和儿童进行了Comvax（7.5 μg H. influenzae type b PRP，5 μg HBsAg）的免疫原性评估。在这些研究中，Comvax的免疫反应与使用单价疫苗PedvaxHib（7.5 μg PRP）和RECOMBIVAX HB（5 μg HBsAg）在不同部位接种，无论是同时还是相隔1个月进行比较。在之前未接种Hib或乙肝疫苗的婴儿中，Comvax的抗体反应在第二剂后显示出抗PRP水平>1.0 μg/mL的比例，与接受单价疫苗的受试者（72.4%）相似。该疫苗适用于由HbsAg阴性女性所生的婴儿，用于预防侵袭性Hib疾病和HBV感染，接种三剂，分别在2、4和12-15个月大时（MMR每周，CDC）。Procomvax于2009年由制造商退出欧洲市场，出于商业原因选择不更新市场授权。该决定与安全问题无关。 单价疫苗还与白喉和破伤风类毒素、百日咳抗原、HbsAg和灭活脊髓灰质炎病毒结合，作为六价儿童疫苗（VAXELIS）。VAXELIS是MSP疫苗公司的注册商标。这种组合适用于6周大的婴儿和幼儿的初次疫苗接种和加强疫苗接种，主要疫苗接种时间表为两到三剂，每剂至少间隔1个月。该疫苗的安全性概况与相同适应症的其他多价疫苗相当；然而，与肺炎球菌疫苗（Prevnar 13）的联合加强研究显示，两种疫苗的接受者中有高达52.5%的发热频率，尽管发热的强度轻至中等且持续时间短（<48小时）。总体而言，Hib PRP-OMPC疫苗的安全性与其他Hib疫苗相当，它们之间没有临床上显著的差异。 3.临床开发中的OMV疫苗 外膜囊泡（OMVs）在呈现多种天然构型的抗原以及自我佐剂性方面具有优势，因此有许多基于OMV的疫苗正在进行临床开发，以对抗它们所衍生的病原体（表1）。 GMMAs在其表面自然展示O-多糖（图1），并且已被用作疫苗候选物，用于预防非伤寒沙门氏菌和志贺氏菌，目前正在进行临床试验。 图1 展示在OMVs或GMMAs上的主要策略 GMMAs 膜抗原的通用模块，LPS 脂多糖，OMVs 外膜囊泡 在小鼠中，显示在沙门氏菌鼠伤寒菌和沙门氏菌肠炎菌GMMAs上的O-多糖已被证明可以引发强烈的抗O-多糖免疫球蛋白（Ig）G抗体反应，水平与相应的CRM197结合物配制的铝佐剂所诱导的反应相当。有趣的是，GMMAs增强了IgG抗体亚型轮廓，并与蛋白质结合物相比，导致更大的血清杀菌活性。现在正在对欧洲成人进行一项I期试验（NCT05480800），测试S. typhimurium和S. enteritidis GMMAs的双价配方吸附在Alhydrogel上。这种配方还与一种针对S. typhi的糖结合疫苗（Typhibev）结合，后者的I期临床试验也已经启动（NCT 05480800）。 第一个在临床试验中测试的基于GMMAs的疫苗是1790 GAHB的志贺氏菌宋内菌GMMA疫苗。GMMAs从一种基因工程改造的S. sonnei菌株中纯化，该菌株增加了脱落（ΔtolR），产生较少的反应原性五酰基化脂A（ΔhtrB），并稳定表达编码O-多糖的毒力质粒。S. sonnei GMMAs吸附在Alhydrogel上，在两项I期临床试验、一项扩展增强试验、一项IIa期临床试验中进行了测试，并最终在一项IIb期人类挑战感染模型（CHIM）试验中进行了测试。基于O-多糖的S. sonnei GMMAs已被证明在健康成人和疾病流行国家中耐受性良好且具有免疫原性，接种一剂疫苗后引发杀菌抗O-多糖IgG反应。值得注意的是，与初次免疫相隔3年的复种显示了疫苗诱导强大的记忆反应的能力。 1790GAHB在CHIM试验中未能显示临床效力，可能由于测试的O-多糖剂量低导致的免疫反应不足。然而，基于这些结果，已经开发了一种新的S. sonnei构建物，允许增加10倍的O-多糖剂量。这样的GMMAs已与志贺氏菌flexneri 1b、2a和3a GMMAs结合在一种4组分配方中，目前正在进行一项I/II期试验（NCT05073003）。 还有流行病学证据表明，B型脑膜炎奈瑟菌OMV疫苗对淋病奈瑟菌有中等程度的效力，导致人们建议基于OMV的疫苗可能适合预防淋菌感染，既可以通过针对脑膜炎球菌B的疫苗（NCT04297436和NCT04415424），也可以与特定的N. gonorrhoeae GMMAs结合，正在进行临床试验（NCT05630859）。 疫苗具有异源靶标，其中OMVs与另一种抗原结合，也在早期临床开发中，例如Intravacc BV开发的通过鼻内途径给药的针对2019年冠状病毒病（COVID-19；Avacc 10）的疫苗（NCT05604690）。 4.临床前研究中出现的趋势 传统上，OMVs被提出用于对抗它们所衍生的病原体引起的疾病，其中一些已获得许可或正在进行临床开发，还有许多处于临床前阶段。免疫反应可以针对LPS而不是蛋白质成分，正如早期对自然释放的V. cholerae OMVs的研究所显示的那样，这些研究通过粘膜免疫引发了抗体反应，保护小鼠后代免受口服V. cholerae的挑战，并确保对两种流行病学上最相关的O1血清型的Inaba或Ogawa变体的交叉保护。OMVs未能与O139交叉反应。 最近的研究已经展示了如何轻松进行遗传操作，以进一步提高OMV的安全性、免疫原性和保护效率。例如，已经显示破坏小的非编码RNA可以改善OMVs对小鼠模型中幽门螺杆菌感染的保护效率。使用鞭毛蛋白缺陷的S. typhimurium OMVs进行鼻内和腹腔免疫，有效地保护了异源S. choleraesuis和S. enteritidis的挑战，使用主要外膜蛋白缺陷的S. typhimurium突变体的OMVs进行免疫，增强了交叉保护。 最近，OMVs也被提出作为异源抗原的递送系统。事实上，OMVs可以被修改以显示来自不同（甚至是系统发育上距离很远的）病原体（病毒、细菌、寄生虫）的蛋白质或多糖。 4.1.作为异源蛋白载体的OMVs 特别是，由大肠杆菌菌株产生的OMVs已被用作重组蛋白的递送系统。通过将抗原融合到分泌信号或周质蛋白上，已用于在囊泡腔中表达重组抗原（图1）。通过双精氨酸（Tat）信号序列，GFP在大肠杆菌OMVs的腔中表达。通过与丰富的外膜蛋白OmpA的周质侧融合，在大肠杆菌OMVs的腔中表达腔隙，已针对A组链球菌（例如，Slo，SpyCEP，SpyAD）、B组链球菌（例如，SAM_1372）和沙眼衣原体蛋白抗原进行了测试。肺炎链球菌表面粘附素A（PspA）通过与N末端β-内酰胺酶信号序列的融合，在鼠伤寒沙门氏菌OMVs的腔中表达。 然而，为了更强的免疫反应，蛋白质定位在OMV表面应该更受青睐。只有少数研究报告了在OMV表面或囊泡腔中呈现相同抗原的直接比较。在V. cholerae OMVs中加载的大肠杆菌碱性磷酸酶PhoA，在小鼠鼻内免疫后引发了低免疫反应，可能因为酶位于OMV腔中的位置与表面相反。在Fantappiè等人的研究中，OMVs针对加载在大肠杆菌OMVs腔中的GAS和GBS蛋白诱导了高功能性抗体滴度，并且用Slo-OMV-和SpyCEP-OMV免疫的小鼠对GAS致死挑战有保护作用。同样，用PspA在鼠伤寒沙门氏菌OMVs腔中鼻内免疫的小鼠发展了抗原特异性血清抗体反应，而等剂量的重组PspA没有发展出可检测的反应。用重组OMV免疫的小鼠对肺炎链球菌挑战有保护作用。然而，建议进行额外的研究，以评估是否通过将抗原定位在OMV表面可以增强抗PspA免疫反应。Salverda等人证明，与具有OspA腔隙表达的构建物相比，在脑膜炎奈瑟菌OMVs表面表达的表面暴露的脂蛋白OspA导致强烈的抗OspA抗体反应，其中没有观察到抗原特异性抗体反应。Necchi等人也获得了类似的结果，他们直接比较了在S. typhimurium GMMAs内或化学连接在GMMA表面的N. meningitidis fHbp。在GMMAs腔中表达的fHbp引发的免疫反应极低，远低于在GMMA表面显示的相同抗原。作者还清楚地表明了需要在GMMAs上拥有fHbp（通过遗传操作或化学偶联），与fHbp与GMMAs物理混合相比，引发更强的杀菌反应。 然而，在OMV表面表达异源蛋白相当具有挑战性，通常以低表达水平为特征，并且取决于抗原。已经提出了不同的表面蛋白表达策略。通常通过蛋白水解处理超出细胞表面的蛋白质可以通过防止蛋白水解来保留在OMV表面。感兴趣的蛋白质可以融合到膜相关蛋白上，例如自转运体的β-桶结构域（例如Hbp，AIDA）。大肠杆菌的自转运体血红蛋白酶（Hbp）被用来在鼠伤寒沙门氏菌OMVs上表达结核分枝杆菌蛋白和沙眼衣原体的主要外膜蛋白MOMP的表位。相同的系统被用来在沙门氏菌OMVs上展示两个肺炎链球菌蛋白抗原的高密度。用得到的OMVs进行鼻内免疫在小鼠肺炎链球菌定植模型中诱导了强大的保护，无需粘膜佐剂。这种抗原展示方法非常高效，但似乎仅限于小蛋白。Kim等人将几种异源蛋白融合到孔形成细胞毒素ClyA的C-末端。工程化的大肠杆菌OMVs显示绿色荧光蛋白（GFP），与ClyA遗传融合，与单独的GFP相比，在免疫小鼠中引发了更强的抗GFP抗体滴度。通过相同的表达系统，表达Acinetobacter baumannii Omp22的大肠杆菌OMVs比用更高剂量的重组Omp22蛋白配制的铝免疫接种诱导了显著更高的Omp22特异性抗体。通过融合到膜锚定的第二脂蛋白fHbp，实现了在脑膜炎奈瑟菌OMVs上的OspA表面表达。 基于严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）的重组、六脯氨酸稳定的、D614G刺突蛋白（mC-Spike）与脑膜炎OMVs的LPS结合肽序列mCramp（mC）融合的COVID-19亚单位疫苗，在金黄叙利亚仓鼠模型中，通过鼻内免疫，引发了高水平的中和抗体，并检测到粘膜反应。候选疫苗在仓鼠挑战模型中也具有保护作用。工程化的OMVs，结合来自SARS-CoV-2刺突蛋白的受体结合基序（RBM）的肽，也已经制成，并在小鼠中显示可引发中和抗体。 2009年大流行性流感A病毒（H1N1）株H1型血凝素（HA）与中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）的受体结合域（RBD）的嵌合融合蛋白也已在大肠杆菌DH10ß的OMVs上表达，诱导小鼠产生免疫反应，保护免受流感挑战。 已经提出了其他装饰OMVs表面异源蛋白的方法，其中抗原分别产生并在OMV生产后添加（图1）。在这些策略中，SpyTag-SpyCatcher系统使用链球菌表面蛋白的SpyCatcher结构域，该结构域识别一个相应的13氨基酸肽（SpyTag）。识别后，在SpyCatcher的一个赖氨酸侧链和SpyTag的一个天冬氨酸之间形成了共价异肽键。SpyTag在OMVs上表达，并用于与任何蛋白融合的SpyCatcher偶联。 这种方法最近被用来将带有SpyTag的SARS-CoV2-Spike的RBD域偶联到展示Hbp并用SpyCatcher肽修饰的鼠伤寒沙门氏菌OMVs。候选疫苗在仓鼠模型中具有免疫原性和保护性。 最近，提出了一种基于亲和素的疫苗抗原交联方法，其中生物素化蛋白链接到表面经过生物素结合蛋白重塑的OMVs的外部。在小鼠中测试得到的OMVs，引发了强烈的抗原特异性抗体反应。 此外，化学偶联蛋白到OMVs也已被使用，目的是用异源蛋白抗原装饰OMVs，并有可能产生多组分疫苗。化学偶联是一种快速利用OMVs作为载体的方法，它允许在一定范围内更好地控制显示在囊泡上的抗原量和密度。来自不同病原体（N. meningitidis、Salmonella、Shigella）的OMVs已与不同蛋白（N. meningitidis fHbp、大肠杆菌SslE和FdeC、疟疾蛋白Pfs25、Pfs230和CSP等）链接，显示出OMVs上的抗原引发比单独蛋白抗原更强的功能性抗体反应。化学方法最近已扩展到病毒抗原（例如流感A病毒血凝素和狂犬病糖蛋白），证实了OMVs显著增加抗原特异性体液和细胞反应的能力。 4.2.糖偶联OMVs OMVs也被提出作为多糖的载体，从上述许可的Hib-OMPC结合疫苗开始，最初在动物中诱导抗体反应，并通过与TLR2结合触发细胞因子介导的反应。将Hib多糖偶联到B. pertussis的dOMVs也被证明是一种可行的方式，以诱导对百日咳和H. influenzae的双重反应。 考虑到它们的生产和纯化的便利性，以及增强免疫反应的潜力，最近有许多例子报道了使用GMMAs作为多糖载体。 GMMAs可以作为化学链接多糖的载体，提供将多糖偶联直接到LPS/脂寡糖（LOS）或暴露在囊泡上的蛋白质的可能性（图1）。来自不同病原体（N. meningitidis A和C群、H. influenzae b型、A组链球菌碳水化合物和Salmonella typhi Vi）的各种结构多样的多糖已成功共价结合到GMMAs上，引发动物中强烈的抗多糖免疫反应。所引发的抗体水平和功能性受每个GMMA连接的糖数量的影响不大，尽管较低的糖负荷被证明更好地确保了GMMA暴露蛋白的免疫原性。另一方面，需要针对具体情况优化糖链长度，以获得强大的免疫反应。与蛋白质连接相比，LOS/LPS导向的偶联在诱导对多糖的强大功能性免疫反应方面也同样有效。 OMV和GMMA结合了展示多拷贝碳水化合物的能力，有利于B细胞激活，并以其在天然细菌环境中的呈现。此外，它们的尺寸对免疫刺激是最佳的，并且由于存在如TLR2和4等TLRs，它们促进了内在的佐剂属性。有趣的是，使用S. sonnei和S. typhimurium的GMMAs作为模型，观察到诱导的免疫反应是由FDC向相应B细胞的抗原呈递介导的。TLR4的参与被看作是诱导强烈抗体产生的关键，而TLR2的激活似乎在GMMA的免疫原性中没有发挥作用。 除了化学偶联外，GMMAs和OMVs也可以被工程化以表达异源糖基，从而产生所谓的糖工程OMV（glyOMV）。不表达聚合O-多糖的大肠杆菌菌株已被基因改造，以在wbbL基因中插入异源多糖的生物合成操纵子，同时保持脂质A核心作为受体的生产。通过这种策略，异源糖基结构在内膜的细胞质侧合成，在天然未脱脂的焦磷酸载体（Und-PP）上组装，并通过内源性fippase Wzx的作用转移到周质侧。最后，内源性O-抗原连接酶‘WaaL’将组装好的多糖整体转移到脂质A-核心结构上。或者，工程化的糖基可以从头开始，一个残基接一个残基地组装，从内膜细胞质侧表达的截断的脂质A-核心的末端糖开始，然后以MsbA依赖的方式翻转到周质中。得到的LPS分子被运输到外膜，并通过Lpt蛋白复合物翻转到细胞外空间，使糖基工程化的脂质A-核心结构被转移到外膜并结合到囊泡中。由于可以在大肠杆菌中结合多种质粒编码的O-多糖生物合成途径，这种方法使OMV成为一个“即插即用”的平台，用于展示来自不同致病细菌的糖表位。 使用这种策略，Chen等人产生了一组包含来自八种致病细菌的O-多糖的糖基工程OMVs（glyOMVs），包括高度致病的弗朗西斯菌属土拉热菌A型Schu S4菌株（创建ft-glyOMVs）。免疫两周后，ft-glyOMVs在小鼠中诱导了与天然ftLPS相比O-多糖特异性IgG水平高出两到三倍。小鼠免受F.tularensis Schu S4的致命挑战，以及与F. tularensis亚种holarctica B型菌株的挑战，这些菌株表现出具有相同结构的O-多糖。Ft-glyOMVs在皮下给药时还引发了保护性的IgA介导的粘膜免疫反应。 Price等人成功地将大肠杆菌OMVs工程化以表达肺炎链球菌的荚膜多糖。GlyOMVs诱导的血清IgG调理吞噬滴度与PCV13中相应的化学结合物相当。大肠杆菌OMVs还被糖基工程化以表达C. jejuni的七糖，显示出在接种的鸡中挑战后细菌定植减少。 Stevenson等人使用大肠杆菌的超囊泡化JC8031菌株，在OMV表面实现了PNAG多糖的高水平表达。在PNAG阳性JC8031细胞中表达S. aureus PNAG去乙酰化酶IcaB（dPNAG-glyOMV），以富含去乙酰化的PNAG的glyOMVs。用两种工程glyOMVs免疫小鼠，结果产生了高水平的PNAG特异性抗体，但只有由dPNAG-OMVs诱导的抗体能够在体外杀死两种不同的PNAG产生细菌物种（即，革兰氏阳性的S. aureus和革兰氏阴性的F. tularensis holoartica）。候选疫苗还在小鼠中诱导了对致命剂量的S. aureus和F. tularensis的保护。 Tian等人在沙门氏菌OMVs中生物合成了S. flexneri 2a O-多糖，研究表明，通过鼻内和腹腔免疫小鼠，OMV疫苗在血清中诱导了显著的特异性抗-志贺氏菌LPS抗体，在阴道分泌物和支气管肺泡灌洗液中诱导了IgA，并提供了对致病性S. flexneri 2a感染的显著保护。 5. 结论 OMVs在使用上有着悠久而丰富的历史，特别是在针对N. meningitidis和b型流感嗜血杆菌的疫苗中。已经产生了大量临床前数据，以对抗许多其他病原体，支持使用OMVs及其遗传修改版本（GMMAs）作为提供同源和异源蛋白和多糖抗原的有前途的、负担得起的平台。 OMVs的纳米尺寸被认为可以增强被APCs的摄取，其激活是通过TLRs识别OMVs上的多种PAMPs而发生的。B细胞激活是通过OMV表面表位的重复和OMVs的尺寸促进的，这允许它们直接进入淋巴系统。T细胞/B细胞合作对于产生高亲和力抗体的浆细胞和记忆B细胞至关重要。对OMV作用方式的更多研究将有助于更好地理解这类疫苗的免疫是如何诱导的，并有助于阐明所确定的机制是与平台相关的还是病原体特定的。 COVID-19大流行以及抗生素抗性的出现，正在催化基于新型囊泡的候选疫苗进入临床开发（表1）。同源脑膜炎奈瑟菌OMVs包含在许可的疫苗中，并且正在对源自它们的同源病原体进行GMMAs的临床研究。当前试验的数据，无论是安全性还是免疫原性，将关键地进一步支持使用该平台进行新型疫苗开发。 该领域的当前进展集中在OMVs和GMMAs作为异源蛋白和多糖抗原的载体（图1）。使用这种技术开发的COVID-19疫苗（Avacc 10）正在进行临床测试。通过不同的新技术，包括化学偶联、分子工程和Spy-tag/Spy-capture，已经证明生成这种多组分囊泡是可行的。这些新方法将有助于简化针对各种不同病原体机制或甚至不同病原体的疫苗。我们预计，未来这类疫苗将取得显著进展，并将有更多的基于囊泡的疫苗可用，以帮助对抗新兴疾病和未满足的医疗需求。 为了推动人用及兽用疫苗行业交流，共同探讨该领域的最新研发进展、产业化现状及未来发展趋势，生物制品圈联合四叶草会展将于2024年8月16日-17日在苏州共同举办“第三届新型疫苗研发峰会”。诚邀全国相关领域专家、学者和企业家共享学术盛会。现将有关事宜通知如下。 名称：2024第三届新型疫苗研发峰会 时间：2024年8月16-17日（周五-周六） 地点：苏州（酒店定向通知） 主办单位：四叶草会展、生物制品圈 媒体支持：药时空、抗体圈、细胞基因研究圈 会议费用：点击二维码即可查询。 报名方式：扫描下方二维码→ 填写表格 → 报名成功（报名志愿者，免交报名费，承担一定工作任务）！ 转发分享福利：疫苗研发企业、科研院校和监管机构人员，前30位报名人员转发分享会议信息可免费参会（不含餐饮）报名后，扫描下方二维码加工作人员微信后，发送截图即可。 组委会获得报名信息后，根据报名信息进行初筛，并进一步与报名者沟通确认，实现精准邀请，最终有机会进入大会微信群（严格审核通过）。 大会日程 已经确定的报告人 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

摘要：病毒样颗粒（VLPs）已成为生物学、医学甚至工程学中的关键工具。在最初用于解析病毒原子级结构之后，VLPs迅速被用于开发抗病毒疫苗，随后作为展示平台用于生成各种疫苗。最近，VLPs被用作纳米机器，将药物活性产品输送到体内的特定部位和特定细胞。在这里，我们专注于使用VLPs开发疫苗，其应用范围广泛，从针对病毒的经典疫苗到针对慢性炎症、疼痛、过敏和癌症的治疗性疫苗。在这篇综述中，我们穿越时间，从最新的实验性基于VLP的疫苗开发开始，以每年赚取数十亿美元的上市疫苗结束，为已经出现在地平线上的下一波预防性和治疗性疫苗铺平了道路。 1.病毒样颗粒（VLPs）的概念 病毒样颗粒（VLPs）是指由于表达编码病毒的衣壳、核心或包膜蛋白而自行组装成的颗粒，甚至是源自多层病毒的单层颗粒的制剂。由非病毒或人工蛋白形成的对称颗粒也可以被视为VLPs；在这种情况下，对称性指的是衣壳单元在几何上的组织方式。然而，这类VLPs不在本综述中讨论。此外，VLPs自行组装成模仿原始病毒的结构、大小和对称性的颗粒，但VLPs不能复制，因为它们缺乏基因组和复制酶。关于VLP结构、免疫原性和表达的详细描述，以及它们与疫苗接种的相关性，已在其他地方进行了综述。 乙型肝炎病毒的结构蛋白，主要是核心蛋白（HBc）和表面抗原（HBsAg），是最早在异源表达系统中表达的VLPs之一。这些努力促成了1986年首个针对HBV的重组人用疫苗的使用，该疫苗利用了表面抗原。接下来，引入了一种针对人乳头瘤病毒（HPV）的疫苗，该病毒会导致宫颈癌，使用的是L1结构蛋白。HPV疫苗在2006年和2007年上市。在此成功之后，2011年中国批准了一种针对戊型肝炎病毒（HEV）的疫苗。总的来说，使用VLPs作为传统疫苗平台具有几个优点，如表1所列。 当前的综述旨在通过首先描述一些基于VLP的疫苗在临床前开发和临床试验中的实例，最后描述目前市场上的基于VLP的疫苗，来讨论一些VLP疫苗开发的最新进展。 2.临床前开发 VLPs已广泛用作预防性或治疗性疫苗平台，用于多种疾病的预防。在本节中，我们旨在讨论一些VLP作为疫苗平台在以下疾病中成功诱导抗体和/或T细胞反应的临床前应用实例：传染病（讨论的实例：中东呼吸综合症、2019冠状病毒病（COVID-19）、流感、疟疾和获得性免疫缺陷综合症（AIDS）、炎症、过敏、疼痛、神经退行性疾病（阿尔茨海默病和帕金森病）和癌症）。 表1. 使用传统病毒样颗粒作为疫苗平台的优势 2.1.用于在预防性或治疗性方案中诱导抗体的基于VLP的疫苗 具有重复表面的颗粒可以最佳地刺激B细胞。20世纪70年代的研究发现，至少有12-16个表位间隔5-10纳米可以诱导最佳B细胞反应（例如，半抗原和人工聚合物），称为免疫子。随后人们意识到，典型的RNA病毒表现出多个免疫子的特征，因为它们通常直径为30纳米，有180个衣壳蛋白副本间隔约5纳米，如图1所示。使用这种颗粒的优势包括有效地交联B细胞受体，以及成功地被天然IgM抗体识别，导致经典补体途径的激活，引起抗原在滤泡树突状细胞（FDCs）上的沉积，增强生发中心（GC）的形成，并诱导持久和长寿命的浆细胞。因此，用全长抗原装饰并装载RNA的VLP被认为是激活B细胞和诱导长寿命B细胞反应的重要工具。此外，对于某些VLPs，特别是RNA病毒衍生的VLPs，可以装载RNA或CpGs（富含非甲基化CG基序的DNA寡核苷酸），分别在B细胞中激活TLR7/8或TLR9。这增强了IgG2a和IgA抗体反应，并增强了浆细胞形成和亲和力成熟。装载在VLPs中的RNA类型也很重要，细菌RNA是最有效的B细胞增强剂。下面，我们讨论了一些预防性和治疗性基于VLP的疫苗的例子，这些疫苗能有效地激发抗体反应，从而介导对疾病的保护。在目标抗原不能很好地诱导TH细胞反应的情况下（例如，自身分子或碳水化合物），针对VLPs的TH是必不可少的，因为它将介导分子间的相互作用，推动针对目标抗原的抗体反应。 图 1 当抗原以颗粒形式存在，并且表面表位每5-10纳米重复出现时，抗原处理得到促进。这种重复结构被免疫系统识别为病原体相关的结构模式（PASPs），这有助于B细胞的交联、天然IgM的结合、补体激活、高亲和力长寿命抗体的诱导以及生发中心的形成。使用 BioRender.com 创建。 2.1.1.传染病 冠状病毒病：冠状病毒是一类最近引起广泛关注的病毒，主要由于SARS-CoV-2引起的持续大流行。冠状病毒是一类具有单链正义RNA分子的RNA病毒，大约30 kB，编码包括四种结构蛋白在内的多种蛋白，如图2A所示：刺突（S）、膜（M）、核衣壳（N）和包膜（E）。人们已经做出了巨大努力，使用传统的VLP平台来开发针对这类病毒的疫苗。然而，除了一些针对SARS-CoV-2的候选疫苗目前正在I、II和III期临床试验中外，这些努力的大部分仍处于临床前阶段，如表2所总结。 图 2 A 一种典型的冠状病毒基于四种结构蛋白：刺突蛋白（S）、包膜蛋白（E）、膜蛋白（M）和核衣壳蛋白（N）。B 通过基因融合将MERS-CoV的RBD（受体结合域）融合到优化的CuMVTT-VLPs中，开发马赛克VLP基础疫苗的策略，这些VLPs包含一个通用的TT表位和TLR7/8配体。使用 BioRender.com 创建。 表 2. 临床试验中的基于病毒样颗粒（VLP）的疫苗列表。 中东呼吸综合症（MERS）：中东呼吸综合症冠状病毒（MERS-CoV）在人类中引起严重的呼吸道疾病，并在十年前沙特阿拉伯首次注册大流行后，继续在全世界超过27个国家构成威胁。MERS的死亡率非常高，大约在40%的范围。MERS-CoV包含几种免疫原性蛋白，包括刺突（S）蛋白，该蛋白通过其受体二肽基肽酶4（Dpp4）介导病毒进入宿主细胞。因此，受体被用作疫苗开发中针对病毒的主要靶向剂。已经进行了临床前研究，使用不同的平台，包括VLPs，来开发针对MERS-CoV的疫苗。 我们最近优化了一种称为黄瓜花叶病毒样颗粒（CuMVTT）的植物源性VLP，通过遗传融合将破伤风毒素（TT）表位整合到其中，作为改进的疫苗平台。TT表位的整合被认为可以增强B细胞和TH细胞之间的相互作用，特别是在老年人中，这是由于存在预先存在的TT特异性记忆TH细胞。此外，CuMVTT-VLPs在表达过程中结合了来自大肠杆菌的RNA，作为TLR7/8激动剂。该平台在小鼠、猫、狗、兔子和马中被证明具有高度免疫原性。 使用这个新平台（CuMVTT），我们开发了一种基于MERS-CoV刺突蛋白的受体结合基序（RBM）与CuMVTT-VLPs遗传融合的可扩展疫苗（图2B）。所得的马赛克VLP基疫苗（mCuMVTT-MERS）在大肠杆菌中表达，允许自发包装TLR7/8配体。mCuMVTT-MERS诱导了高水平的特异性抗体，能够中和MERS-CoV/EMC/2012分离株，显示出转化为单峰驼和人类的有希望的潜力。Wang等人使用杆状病毒表达系统构建了MERS-CoV-VLP疫苗，并在恒河猴中进行了测试。开发的疫苗可以诱导特定的抗RBD滴度（ELISA）1:1280以及T细胞介导的免疫。研究表明MERS-CoV-VLPs具有出色的免疫原性，是很有前途的疫苗候选物。同一组还开发了一种表达MERS-CoV RBD的嵌合VLP基疫苗，利用犬细小病毒（CPV）的VP2结构蛋白。用嵌合疫苗免疫也在小鼠模型中诱导了RBD特异性的体液和细胞免疫。不幸的是，到目前为止，还没有基于VLP的疫苗进入临床试验。 严重急性呼吸综合症（COVID-19）：持续的COVID-19大流行已经压倒了全球的卫生系统。大约有三十种不同的疫苗已经获得不同国家的批准用于人类，大约有八十个候选疫苗正在进行临床开发，其中19个处于III期临床试验。然而，随着新的关注变体（VOCs）的不断出现，仍然需要开发有效、可扩展、负担得起和稳定的传统疫苗。 作为一个例子，我们通过将SARS-CoV-2的受体结合域（RBD）化学偶联到我们免疫学优化的CuMVTT VLPs上，开发了COVID-19疫苗。我们利用了VLP表面最流行的修饰目标，其中包含可接近的赖氨酸残基（图3A）。展示的RBD识别病毒受体血管紧张素转换酶2（ACE2），确认了正确的构象结构，并产生了高度特异性的抗体反应，体外中和了SARS-CoV-2[29]和VOCs。类似的平台，CuMVTT-RBD，在小鼠模型中进行了鼻内给药测试。疫苗候选物引发了强烈的特异性系统性和粘膜IgG和IgA反应，有效中和了不同的VOCs。 图 3 以下技术的示意图。A 化学技术将表位结合到病毒样颗粒（VLPs）上主要基于修改VLP表面的化学基团。VLP表面的赖氨酸（Lys）残基（以红点显示）是最常用的修饰目标。表位应该被修改以包含一个自由的半胱氨酸（Cys），以适应所选择的化学结合方法。B 一种遗传融合技术，允许VLP衣壳蛋白和目标表位的共表达。遗传融合技术可能被认为是GMP翻译目的和扩大规模的更好选择[37]。使用 BioRender.com 创建。 为了转化目的，我们接下来设计了一种新的疫苗候选物，通过将SARS-CoV-2的RBM遗传嫁接到CuMVTT VLPs中，称为马赛克CuMVTT-RBM（图3B）。开发的疫苗可以大规模生产（1000升发酵罐运行>250万剂），在4°C下具有高稳定性，持续14个月，并且可以用于多次增强剂量。CuMVTT-RBM还在小鼠和兔子模型中诱导了高特异性抗RBD和抗刺突抗体滴度，对突变RBD和VOCs具有交叉反应性。由于高生产率和在4°C下易于储存，我们预计生产和运输成本将比当前基于RNA的疫苗低几个数量级。使用VLP AP205融合RBM也获得了类似的结果。此外，我们还产生了一个双马赛克颗粒，它诱导了针对S1中的RBM以及S2中的切割位点的中和抗体，这是第二个“次要”中和表位。 使用不同的技术，其他组也成功地使用VLPs开发了针对COVID-19的疫苗。例如，Tan等人设计并在小鼠模型中测试了RBD-SpyAP205疫苗，采用主要/增强方案。他们使用SpyTag/SpyCatcher技术在AP205-VLP平台上展示RBD。他们的结果显示，疫苗候选物可以引发中和抗体反应。 如上所述，SARS-CoV-2包含四种基本结构蛋白，可以在没有病毒基因组的哺乳动物细胞中组装成VLPs。Yilmaz等人描述了一种基于VLP的疫苗，表达六脯氨酸预融合稳定化的刺突（S-6p）以及SARS-CoV-2的N、M和E结构蛋白。该疫苗被吸收到明胶上，并与K型CpG ODN配方。使用HEK293细胞表达疫苗候选物，并产生了表达四种结构蛋白的囊泡VLPs。结果表明，在接种动物中有效产生了抗S、抗RBD和抗N IgG，并防止了肺病理。这种疫苗候选物目前正在进行II期临床试验；请参阅表2。 总的来说，基于重组蛋白的疫苗可以使用不同的宿主表达系统生产，如昆虫细胞、酵母、哺乳动物细胞和植物。最近，随着COVID-19大流行的发展，基于植物的疫苗开发在该领域变得更加被接受。最近发表的一项研究描述了基于植物的SARS-CoV-2疫苗的成功构建。作者将SARS-CoV-2的M、N和E基因克隆到双生病毒载体中，并在N. benthamiana植物中进行了瞬时表达。该过程产生了与原生SARS-CoV-2病毒粒子形状和大小相似的植物源性VLPs，但没有刺突蛋白。图4展示了使用烟草植物中的农杆菌渗透法的植物表达系统过程。作者指出，这样的VLPs将来可以作为携带S抗原的平台。 图 4 利用两个载体在烟草植物中进行共表达的农杆菌渗透法。使用 BioRender.com 创建。 Medicago公司也利用植物衍生的VLP生产方法开发了他们的SARS-CoV-2疫苗（CoVLPs疫苗；Covifenz）。CoVLPs是通过表达修改后的全长S蛋白产生的，该蛋白在植物细胞中表达后三聚体化，并移动到质膜中的脂质筏上，自发组装成从植物细胞表面“出芽”的VLPs。在猕猴中，这些VLPs在AS03佐剂存在的情况下诱导了强烈而持久的IgG反应，并增强了T细胞反应，从而保护灵长类动物免受病毒感染。CoVLPs目前正在进行晚期临床试验，并已在加拿大获得批准用于人类（表2）。 流感：流感病毒是一类属于Orthomyxoviridae科的包膜RNA病毒。病毒表面的糖蛋白血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）是疫苗开发的主要靶点。HA由一个球形头部和一个茎组成。目前市场上的季节性流感疫苗针对HA的球形头部进行中和；然而，球形头部的快速抗原变异使得诱导的抗体的亲和力降低，这就需要每年或每两年开发新的疫苗。相反，HA的茎部更加保守；然而，由于球形头部的免疫优势和茎部的空间障碍，可能具有挑战性但并非不可能对茎部产生有效的免疫反应。针对NA，流感病毒的第二大蛋白，可以防止病毒进入宿主细胞，降低疾病严重程度，并抑制病毒复制。与HA和NA类似，M2蛋白是流感病毒的一个完整表面蛋白，M2的细胞外结构域在流感A中高度保守。基质蛋白（M）和核蛋白（NP）是病毒的主要内部蛋白。图5展示了流感病毒的结构和主要抗原。 图 5 一幅卡通插图，展示了流感病毒的主要抗原，包括：血凝素（HA）的球形头部和茎部，M1基质蛋白，M2离子通道，NA神经氨酸酶和核衣壳蛋白（NP）。使用 BioRender.Com 创建。 VLPs构成了一个有吸引力的、替代传统流感疫苗配方的疫苗平台，因为它们模仿了原生病毒但缺乏任何遗传物质。Buffin等人表明，使用哺乳动物细胞进行疫苗生产有许多优势，包括维持糖基化模式。他们开发了一种包含HA、基质（M1）和NA蛋白的VLP疫苗。表达的VLPs模仿了真正病毒的外表面，并显示出高度的免疫原性。 使用噬菌体Qβ，我们设计了一种针对HA球形结构域不同形式的VLP疫苗。球形结构域被化学偶联到VLP的表面。几乎所有疫苗候选物都在小鼠中诱导了保护性抗体，这些抗体也与变异株发生了交叉反应。有趣的是，HA球形结构域是在细菌中产生的，表明糖基化对诱导保护性抗体并非必需，因为小鼠中血凝抑制抗体的水平与经典疫苗获得的水平相似。接下来，这种疫苗在I期临床试验中进行了测试，结果显示这种完全由细菌生产的疫苗至少与经典病毒基础疫苗在人体中对抗体和T细胞的免疫原性一样。 另一种有趣的方法是在铁蛋白纳米颗粒上展示HA，这可以诱导针对H1N1流感病毒株的高水平广泛中和抗体。 由于HA蛋白非常多变且保守性差，基于保守结构的疫苗，如M2的细胞外结构域（eM2）或HA茎部，可能是HA和NA疫苗的一个有趣的替代品。事实上，早期通过遗传融合在HBcAg上展示eM2或通过化学偶联在Qβ上展示的实验，都能诱导能够保护免受多种流感A病毒株侵害的抗体。基于Qβ的M2e疫苗还测试了通过鼻内给药诱导保护性抗体的能力。使用这种途径的疫苗接种在小鼠的血清和肺部诱导了高水平的保护性IgG和IgA抗体。 与Qβ类似，源自噬菌体AP205的AP205-VLPs也通过遗传融合在N-末端展示M2蛋白，显示出高诱导特异性抗体的能力。在针对流感病毒的eM2基疫苗的背景下，有趣的是我们已经提供了证据，在小鼠流感模型中，携带原核RNA的VLPs，一种TLR7/8配体，并展示eM2比携带真核RNA的VLPs诱导了更好的保护性IgG亚类，突出了包装RNA的类型的重要性，并确认了抗-M2 IgG抗体的亚类对保护至关重要。 HA的茎部区域，比HA的球形结构域更保守，可能是另一个有吸引力的靶点。事实上，可以将茎部区域表达为适合化学偶联到VLPs的三聚体，并且当在HBcAg上展示时，它可以在小鼠中诱导强烈的IgG反应。此外，铁蛋白纳米颗粒上展示的HA茎部在小鼠中诱导了广泛的中和和保护性抗体。因此，针对流感病毒保守结构的基于VLP的疫苗候选物，HA或M2蛋白，可能是目前用于对抗季节性和未来流感大流行的流感疫苗的合适替代品。 作为诱导对流感亚型更广泛免疫覆盖的替代方法，已经开发了一种包含来自H5N1、H7N2和H9N2的3或4个全长HA蛋白的马赛克、多亚型VLP疫苗。多亚型VLP疫苗在雪貂中进行了鼻内测试，并显示出有效性和免疫原性。也有几种针对H9N2的基于VLP的疫苗被描述。 疟疾：WHO估计2020年大约有85个疟疾流行国家的241百万疟疾病例，与2019年的227百万病例相比。2016年至2020年间，苏丹的死亡病例增加了49%，报告的80%病例是由于恶性疟原虫（P. falciparum）。针对疟疾的疫苗可以分为三种方法：红细胞前期疫苗、血液期疫苗和阻断传播疫苗（TBV）。最先进的红细胞前期疫苗是RTS,S（MosquirixTM），一种基于VLP的疫苗，WHO在2021年10月推荐在高风险地区使用。RTS,S在下面的“市场上的基于VLP的疫苗”部分讨论。 Chan等人设计并开发了一种通过利用鸭HBV VLPs结合大Pfs230和Pfs25蛋白的阻断传播疫苗。该疫苗在与cGMP兼容的Hansenulla细胞系中表达。诱导的抗体能够识别配子体表面的原生蛋白，并在标准膜喂养测定中降低传播活性。同一组最近使用鸭HBV的小表面抗原（dS）在支架表面上更大一部分展示环孢子蛋白（CSP）。为了克服RTS,S的缺点，CSP只出现在疫苗表面的一小部分。Barillas Mury小组还专注于通过使用Spycatcher-SpyTag技术将Pfs47（一种在配子体表面表达的蛋白）结合到Acinetobacter噬菌体（AP205-VLPs）上，开发一种TBV。候选疫苗诱导了高抗体滴度，对Pfs47具有高亲和力，证实了其潜力。 炎症。病毒样颗粒（VLPs）已被广泛用于开发针对不同慢性炎症性疾病的治疗性疫苗。在这方面，已经在不同动物种类中为不同的临床前疫苗生成了概念验证。在昆虫叮咬过敏（IBH）中，马因蠓（Culicoides）叮咬引起的Ⅰ型/Ⅳ型过敏反应而遭受慢性过敏性皮肤炎，由嗜酸性粒细胞介导。白细胞介素-5（IL-5）被认为是嗜酸性粒细胞的关键刺激因子（图6）。 针对IL-5的单克隆抗体（mAbs）已成功用于治疗具有嗜酸性粒细胞成分的人类疾病，特别是嗜酸性粒细胞性哮喘。因此，可以预期通过疫苗降低IL-5水平会减少一般的嗜酸性粒细胞疾病，包括IBH中马皮肤的嗜酸性粒细胞浸润，扩展了早期在小鼠中的观察。为此，我们将马IL-5共价连接到我们的CuMVTT平台上，并在34匹冰岛马的安慰剂对照研究中测试了疫苗。疫苗未添加佐剂，未显示任何安全问题，但在89%的接种马中诱导了抗IL-5自身抗体，这转化为了临床改善。通过每年加强注射，有效性可以提高到100%，并在几个季节中保持，几乎完全消除了症状。这种方法可能被视为针对马的慢性炎症性疾病的突破性治疗，并有潜力在未来转化为人类。除了IL-5，IL-31在IBH以及人类、狗、猴子和小鼠的过敏性瘙痒中也起着重要作用（图6）。 图 6 IL-31 和 IL-5 是过敏性瘙痒的中心介质。通常，过敏原穿透皮肤，触发肥大细胞和辅助性 T 细胞 2 型（TH2）。IL-31 的分泌刺激周围感觉神经元，导致瘙痒。IL-5 是生成和激活嗜酸性粒细胞所需的主要细胞因子。使用 BioRender.com 创建。 与IL-5不同，IL-31主要促进瘙痒；然而，这种瘙痒导致慢性抓挠引起局部炎症，通常因感染而加剧。基于CuMVTT平台，生成并测试了一种IL-31马用疫苗。结果证明了疫苗的安全性，并揭示了方法的有效性，与安慰剂组相比，治疗组的临床评分显著降低。特应性皮炎是狗最常见的过敏性疾病，导致广泛抓挠和毛发脱落以及继发感染。在对屋尘螨敏感的狗中测试了展示在CuMVTT上的犬IL-31，这些狗在局部挑战过敏原后发展出典型的特应性皮炎症状。免疫的狗在免疫后显示出显著减少的瘙痒，这与诱导的特定抗体滴度相关。然而，在抗体滴度下降时注意到反应较弱，表明维持IgG滴度是未来改进的领域。进行的研究为狗特应性皮炎的有效治疗奠定了基础。还需要进行进一步的研究来增加和延长有效性，并且使用单克隆抗IL-31抗体的结果将指导针对人类IL-31的疫苗开发。除了IL-5，展示IL-13的VLPs也可能是广泛用于治疗特应性皮炎的另一种有趣的方式，并且应该与针对IL-4的VLPs一起更详细地探索。已经证明，针对促炎细胞因子IL-17A的mAbs对银屑病非常有效，银屑病影响全球1%至4%的人口。IL-17生物制剂的高成本限制了患者的获取。使用基于IL-17展示在Qβ或CMVTT上的疫苗针对小鼠的IL-17A，在心肌炎、类风湿性关节炎和多发性硬化症以及银屑病的临床前模型中证明是有效的。针对TNF-α的mAbs在一系列炎症性疾病中显示出疗效，如银屑病、克罗恩病、类风湿性关节炎和溃疡性结肠炎。不幸的是，接受抗TNF-α治疗的患者可能在长期内产生抗药性，除了与治疗相关的高成本外。因此，开发针对TNF的疫苗可能是有吸引力的。已经描述了两种基于VLP的疫苗：一种疫苗基于HPV，使用生物素/链霉亲和素展示了TNF衍生肽，另一种基于全长TNF或在Qβ上使用SMPH化学和在TNF或肽中引入的自由Cys展示的TNF衍生肽。两种策略都诱导了能够中和TNF并消除胶原蛋白诱导的关节炎中的疾病的治疗性抗体。有趣的是，基于整个TNF连接到Qβ-VLPs的疫苗诱导的抗体能够中和跨膜和可溶性TNF。相比之下，基于TNF N-末端20个氨基酸（a.a.）的疫苗候选物（Qβ-C-TNF(4-23)）中和了可溶性TNF，但不是膜形式。尽管如此，两种疫苗都产生了能够保护小鼠免受类风湿性关节炎的特定抗体。相比之下，只有接种全长TNF（Qβ-C-TNF(1-156)）的小鼠显示出对单核细胞李斯特菌感染的增加敏感性以及潜伏的结核分枝杆菌的增强复活，而接受基于肽的疫苗的小鼠没有免疫受损。因此，仅针对可溶性TNF-α可能是一个有效的临床转化策略，可能克服机会性感染的风险。基于HPV和TNF衍生肽的疫苗与单独的融合肽相比，将抗TNF抗体水平提高了1000倍。如上所述，这种疫苗候选物还抑制了小鼠模型中胶原蛋白诱导的关节炎的发展。考虑到这些发现，进行了一项基于（Qβ-C-TNF(3-24)）的临床研究。研究显示了令人失望的结果；然而，基于小鼠TNF衍生肽的疫苗未能在人类中诱导TNF中和抗体（未发表）。 过敏。目前，特异性脱敏是治疗过敏的唯一可用方法。这种策略需要长期应用过敏原，并可能导致危及生命的过敏性休克。因此，能够通过几次注射缓解过敏症状的治疗性非反应原疫苗被认为是一种有吸引力的策略。对于治疗猫过敏，我们之前描述了一种治疗性疫苗，由主要猫过敏原（Fel d 1）与Qβ-VLPs偶联而成。单次注射能够诱导对1型过敏反应的保护。此外，过敏原诱导的系统性嗜碱细胞脱颗粒被特异性IgG抗体抑制，这一特性被FcγRIIb增强。将过敏原偶联到VLPs不仅可以增加过敏原特异性IgG反应，而且显著降低了过敏原引起过敏反应的能力，这是这种新的特异性免疫治疗方法的重要安全特性。在HBcAg上展示的过敏原也发现了类似的结果。为了快速转化，我们开发了一种替代策略，通过给猫接种疫苗来治疗人类的Fel d1过敏。使用基于CuMVTT的偶联疫苗，我们的结果表明在猫中具有耐受性，没有明显的毒性，疫苗还产生了强烈且持久的特异性IgG反应，具有高亲和力和中和能力。人类和猫预计将从这种治疗中受益，这将降低人类患哮喘的风险，并促进宠物主人与他们的猫的互动。Hirschberg等人研究了用屋尘螨（Dermatophagoides pteronyssinus，Der p1）致敏后以及用来自携带免疫优势表位Der p1的酵母逆转录转座子的p1蛋白的杂交Ty-VLPs疫苗接种后诱导的免疫反应。他们的结果表明，杂交疫苗取消了过敏原特异性IL-5的产生，并且这种效应是通过CD4+ T细胞介导的。在一项较早的研究中，当Der p 1衍生的肽与Qβ-VLPs化学偶联时，在人类中诱导了强烈的IgG反应。最近的证据表明，基于VLP的过敏原疫苗接种也可能对预防性干预具有吸引力。花生过敏是一种日益频繁的疾病，在美国尤其如此，目前尚无治疗方法。CuMVTT-VLPs被用来展示烤花生（Ara R）提取物或纯化的单一过敏原Ara h1或Ara h2，并通过化学偶联在花生过敏的小鼠模型中进行了测试。所有生成的疫苗的一剂或两剂可以保护对花生敏感的小鼠在用整个花生提取物挑战后的过敏反应。令人惊讶的是，所有三种疫苗候选物，即使是基于单一过敏原的，也能够提供对整个花生提取物的系统性和局部挑战的保护，并且所有疫苗都保护了在用复杂提取物口服挑战后胃肠道的嗜酸性粒细胞和肥大细胞浸润。这些结果表明，针对单一过敏原的疫苗接种可以提供对复杂过敏原混合物挑战的保护。抗体被确定为作用方式，因为纯化的IgG或甚至是单一的单克隆抗Ara h 2抗体的被动转移都能保护小鼠免受过敏反应。也研究了肥大细胞和嗜碱细胞上的FcγRIIb受体的作用，所获得的结果证明了这种抑制性受体在阻止对复杂提取物的过敏反应中的关键作用（图7）。简要地说，对单一过敏原的高水平特异性IgG抗体的诱导将导致免疫复合物的形成，这些复合物将结合FcγRIIb，从而抑制IgE介导的信号，这些信号也由其他过敏原触发。基于Ara h 2的疫苗的GMP材料已经生产出来，并且在美国已经获得了IND（表2）。疼痛。神经生长因子（NGF）对神经系统的早期发育至关重要，但在后期，它成为疼痛的重要介质。mAb tanezumab在几项人类研究中显示出有效性，目前正在注册中，还有许多其他mAbs正在开发中。因此，开发针对NGF的治疗性疫苗可能具有重大兴趣。事实上，我们已经展示了一种基于VLP的疫苗对NGF的强效效力，以控制类风湿性关节炎和骨关节炎中的疼痛。开发的疫苗是基于在CuMVTT VLPs上呈现小鼠NGF蛋白。然而，进一步的研究对于建立针对NGF的疫苗的安全性至关重要。 图7 一个卡通图示，展示了在花生过敏模型中抑制肥大细胞上FcγRIIb的机制。A 花生过敏原与结合在高亲和力Fcε RI上的IgE结合，导致肥大细胞脱颗粒和过敏反应。B 使用基于VLP的疫苗（CuMVTT-Arah2）进行免疫，诱导针对单一过敏原Ara h2的特异性IgG抗体，形成免疫复合物，该复合物结合到FcγRIIb上，抑制IgE介导的信号。通过BioRender.com创建。 2.1.2.神经退行性疾病 阿尔茨海默病：阿尔茨海默病（AD）是导致痴呆的主要因素之一，这是一种随着年龄增长迅速增加的疾病。根据阿尔茨海默协会的数据，在美国，AD影响大约620万65岁以上的人，预计到2060年这个数字将增加到1380万。此外，目前的治疗费用，特别是护理援助，在2020年达到了美国的> 2500亿美元。针对淀粉样斑块的主动免疫是一种有前景的治疗策略。然而，目前还没有针对AD的批准的预防性或治疗性疫苗。在最初的突破性研究将针对AD的潜在疫苗置于聚光灯下之后，开发了一种基于Qβ和Aβ的N末端（CAD106）的VLP疫苗候选物。只选择了前6个氨基酸，因为在用原始疫苗候选物Aβ1-42配制的佐剂进行的临床研究中，诱导了自身特异性T细胞，这些细胞在高达10%的患者中诱发了脑膜炎性脑炎。临床前评估表明，在不使用佐剂的情况下用CAD106免疫可以在淀粉前体蛋白（APP）转基因小鼠中有效清除斑块，重现了使用佐剂配制的Aβ1-42获得的原始发现。此外，没有观察到Aβ特异性T细胞的迹象。随后在AD患者中的临床研究表明，清除斑块没有脑膜炎性脑炎或微出血的迹象。然而，目前没有明确的证据表明CAD106免疫的AD患者的性能有所改善。使用我们的免疫学优化的VLPs（CuMVTT-VLPs）以及Aβ1-6肽，我们建立了一种针对AD的疫苗。如前所述，CuMVTT包含一个TT表位，据提出由于对破伤风的预先存在的存储记忆TH细胞，可以增强老年人的反应。开发的疫苗可以用于预防性和治疗性环境。CuMVTT-Aβ1-6在年轻和老年小鼠中显示出高度的免疫原性，并且对破伤风的预免疫增强了对Aβ1-42的反应。实际上，在CuMVTT表面上展示Aβ1-6诱导的抗体表现出正确的特异性，因为免疫小鼠的血清可以像针对Aβ肽1-17的单克隆抗体一样有效地识别AD斑块在死后大脑切片上。最近的努力利用HBc为特定患者生产个性化的AD疫苗。研究人员通过将SpyCatcher插入截断的HBc的主要免疫优势区域（MIR）构建了一个平台，该平台可以组装成能够轻松结合不同SpyTag表位的均匀VLPs，例如Aβ（1-6），Aβ（1-15），cAβ（1-7）cEP1和cEP2来自β-淀粉样单体或寡聚体，以及来自tau蛋白的T294，pTau396-404和pTau422。一项研究的结果表明，HBc-S-pTau422在转基因小鼠中减轻了认知缺陷以及神经病变进展。对于替代的Qß-，HPV-和逆转录病毒颗粒-基础疫苗候选物也观察到了强大的免疫原性和良好的安全性。Aβ可能不是治疗AD的唯一靶标。事实上，Maphis等人报告了针对tauopathies的治疗性疫苗的开发，包括AD。在苏氨酸181处磷酸化的Tau肽被化学连接到Qβ-VLPs（pT181-Qβ）。该疫苗诱导了一种强大而持久的特定抗体反应，能够识别死后的人脑切片，并能够减少转基因小鼠的皮层和海马中的可溶性和不溶性pTau。因此，针对Aβ或Tau或两者的组合的疫苗可能是AD治疗或甚至预防发展的有希望的途径。 帕金森病：帕金森病被认为是第二常见的神经退行性疾病，与运动障碍、认知障碍和进行性残疾有关。该病影响60岁以上的1%的人。中和有毒的α-突触核蛋白（a-syn）寡聚体被提出在阻止寡聚体和聚集体在大脑中的传播以及细胞毒性方面发挥作用。Doucet等人提出了一种基于将针对α-syn C末端区域的短肽偶联到Qβ平台的主动疫苗策略。所获得的结果证明了疫苗在野生型小鼠和α-syn转基因小鼠中诱导高抗体滴度的能力，并识别了Lewy体。尽管诱导的抗体能够特异性地识别溶液中的寡聚α-syn，但疫苗未能在转基因小鼠模型中产生显著变化，与对照条件相比，对行为表型没有影响。缺乏临床前疗效是否是由于使用的特定小鼠模型尚不清楚，这些结果表明需要优化的临床前模型，这可能是一个具有挑战性的任务。癌症。已经在几种肿瘤中研究和使用了抗体，并已被证明是抗肿瘤免疫的重要参与者。抗肿瘤抗体的效应功能包括诱导凋亡、干扰肿瘤信号通路、抗体依赖性细胞毒性（ADCC）或激活补体。尽管大多数抗肿瘤抗体以mAb的形式被动给药，但疫苗可能是主动诱导抗肿瘤抗体的有希望的替代方案。然而，大多数针对癌症的疫苗旨在诱导T细胞而不是抗体，下面描述的疫苗可能更准确地被描述为“利基候选物”。诱导抗体的癌症疫苗的突出例子是基于AP205的，它已经在临床前用作治疗性疫苗的平台，用于诱导癌症治疗的抗体。作者使用SpyTag/SpyCatcher技术，用人类表皮生长因子受体-2（HER-2）装饰VLPs，这是一个经典的mAb治疗靶标。使用这种策略，他们能够克服B细胞耐受性，并诱导强烈的抗HER2 IgG抗体，阻碍了表达HER-2的小鼠乳腺癌肿瘤的进展。此外，三阴性乳腺癌肿瘤中xCT蛋白的过度表达已被用作靶表位，并插入到MS2-VLPs中。该疫苗引发了强烈的特定抗IgG2a反应，阻碍了肿瘤生长并防止了在已建立的4T1小鼠模型中的转移。与人类乳头瘤病毒相关的癌症占所有恶性肿瘤类型的约4.5%，并且已被证明每年影响超过50万人。与HPV相关的癌症包括宫颈癌（99.7%）和阴道、肛门、阴茎、外阴和口咽的鳞状细胞癌。HPV的衣壳L1蛋白是一个高度免疫原性表位，针对已获得许可的预防性HPV疫苗（稍后在4中讨论）。结构L1蛋白可以自组装成VLPs，形态上类似于亲本原生病毒（图8）。小衣壳蛋白L2是HPV类型中高度保守的蛋白质，因此可以被认为是开发下一代泛HPV疫苗的合适靶标。然而，基于L2的疫苗已被证明比基于L1的疫苗诱导的中和抗体水平低。Schellenbacher等人构建了一种表达L1和L2蛋白的嵌合HPV疫苗（HPV16 L1-HPV16 L2（嵌合体17-36）），并且佐剂化的VLPs诱导了针对与HPV16不同的HPV类型的广泛谱系中和抗体。这些发现表明，这种嵌合疫苗可能对由高风险、低风险和beta HPV相关疾病引起的粘膜感染提供保护。关于RG1-VLP作为另一种使用L2作为疫苗候选物的尝试的临床研究即将开始。RG1-VLPs包含HPV16L2的保守氨基酸17-36，这些氨基酸紧密融合在HPV16L1-VLP的免疫优势表面环中。小动物模型的免疫实验已确认对医学上相关的高风险和低风险HPV类型具有交叉保护。AAVLP-HPV是另一种嵌合疫苗，旨在展示L2表位，来自HPV16和31，显示在腺相关病毒衍生的VLPs上。用这些VLPs在Montanide佐剂中配制的小鼠和兔子的免疫诱导了特定的抗体滴度，能够在伪病毒感染测定中中和几种HPV类型的感染。这种嵌合疫苗已成功完成I期临床试验（表2）。 图8 人乳头瘤病毒（HPV）的L1和L2衣壳蛋白 A. HPV的L1衣壳蛋白是一种高度免疫原性表位，能够组装成VLPs，例如（已获得许可的预防性基于HPV的疫苗：Cervarix®、Gardasil®和Gardasil9®）。B. 一种表达L1和L2两种衣壳蛋白的嵌合HPV疫苗。通过BioRender.Com创建 2.2.病毒样颗粒（VLPs）治疗性疫苗用于诱导治疗性方案中的保护性T细胞 带有T细胞表位的VLPs是有效的工具，可以诱导TH1以及细胞毒性T细胞淋巴细胞（CTLs），尽管VLPs不包含遗传物质。外源性抗原优先进入主要组织相容性类II（MHC-II）途径以启动CD4+ T细胞。然而，以前的研究表明，颗粒状的VLPs可以被APCs成功摄取并通过交叉呈现进入MHC-I途径。通过与抗原处理相关的转运蛋白（TAP）独立的内体途径或TAP依赖的内体至细胞质途径可以实现MHC-I的装载。将VLPs与APCs的刺激因子结合使用可以产生CTL和TH1反应。在小鼠中测试的所有TLR配体中，刺激TLR3、TLR7/8尤其是TLR9最为有效，而其他TLRs，如TLR2和TLR4，对刺激CTL反应的能力较弱。此外，装载有TLR配体的Qβ-VLPs，如RNA或CpGs，能够有效地诱导CTL和TH1反应，但如果装载了多聚谷氨酸或为空载则无法做到这一点。出乎意料的是，我们已经证明VLPs和TLR配体可以分开传递，无需物理连接，只要TLR配体以颗粒形式配制，就可以在体内产生CTL反应。形成沉积物的佐剂可能提供进一步增强诱导的T细胞反应的机会。 2.2.1.癌症 由人乳头瘤病毒（HPV）引起的癌症：预防性HPV疫苗旨在针对晚期蛋白L1和L2产生体液反应。因此，这样的疫苗在治疗环境中不会显示出疗效，因为在病毒感染的增殖细胞中没有检测到病毒衣壳蛋白。HPV治疗性疫苗的主要目标是消除癌前病变和持续的HPV感染。早期E蛋白（E6和E7）是转录因子，负责推动感染细胞的增殖。因此，这两种蛋白在肿瘤细胞中高度表达，使它们成为治疗性疫苗的理想靶标。在宫颈上皮内瘤变（CIN）自发消退中检测到基质中CD4+：CD8+比率的增加，CD4+ T细胞对E2蛋白的反应以及E6和E7特异性CD8+ T细胞的浸润。已经采取了几种不同的临床前方法来开发HPV治疗性疫苗，包括使用VLPs。一些研究设计了一种针对肿瘤蛋白E6和E7的基于T细胞的疫苗，其他研究开发了一种包含衣壳和肿瘤蛋白的嵌合疫苗。例如，Greenstone等人展示了HPV-VLPs通过生成包含主要衣壳蛋白L1加上整个非结构性E7或E2融合到小衣壳蛋白L2中的嵌合VLPs来诱导细胞介导的免疫的能力。HPV16 L1/L2-HPV16 E7嵌合VLPs保护了野生型和MHC-II缺陷小鼠（缺乏Th细胞）免受TC-1肿瘤挑战。另一项研究使用修饰后的兔出血病病毒VLP（RHDV-VLP）作为疫苗平台，装饰有E748-57肽。使用表达E6和E7抗原的TC-1细胞系在小鼠模型中测试了开发的疫苗。作者将疫苗与抗CTLA-4检查点抑制剂或用于Treg耗竭的抗CD25结合使用。结果表明肿瘤负担减少了50%，生存率显著提高。我们已经证明，展示或与E7蛋白混合的Qβ-VLPs可以诱导对肿瘤生长的保护并增强超过80%的接种小鼠的生存。另一项研究生成了一个将长E7蛋白片段结合到禽传染性肿瘤病病毒VLPs中的VLP-E7疫苗。在表达人类HLA-A2的人源化转基因小鼠中，在治疗环境中接种了TC1/A2癌细胞系，测试了VLP-E7疫苗。结果表明完全根除了已建立的肿瘤以及持久的免疫反应。 黑色素瘤：一些临床前实验已经探索了使用VLPs作为针对黑色素瘤的治疗性疫苗的疗效。装载A型CpGs的Qβ-VLPs（Qβ(G10)，也称为CMP-001）不包含任何肿瘤抗原，并且在肿瘤内注射后已测试了抗黑色素瘤反应。Sabree等人证明CMP-001诱导形成抗Qβ抗体，这些抗体使Qβ VLPs包被，随后被浆细胞样树突状细胞（pDCs）摄取，导致细胞因子分泌和抗肿瘤T细胞反应。CMP-001已在临床试验中使用，如表2所示。在最近发表的一篇论文中，Melhim等人表明，CMP-001单独或与pembrolizumab（PD-1抑制剂）联合用于晚期黑色素瘤患者是可耐受的，并且能够逆转抗PD1抗性治疗，具有持久且强烈的临床反应。使用化学偶联方法开发了Qβ(G10)MelanA疫苗，并在II-IV期黑色素瘤患者的I/II期研究中证明了潜在的疗效。超过60%的接受治疗的患者产生了特定的效应和记忆T细胞反应以及高水平的IFN-γ、TNF-α和IL-2细胞因子产生。最近，我们已经将我们的努力转向开发针对患者肿瘤特异性表位的个性化VLPs疫苗，以实现有效的T细胞反应。鉴于针对单一抗原允许肿瘤细胞通过下调这单一抗原来复发，我们设计了一种在具有挑战性的移植小鼠黑色素瘤模型中的多靶标疫苗。我们的结果表明，针对生殖系和突变表位可以增强诱导的抗肿瘤反应。我们还测试了微晶（MCT）佐剂与CuMVTT-p33疫苗结合的沉积效应。结果表明MCT将反应极化为TH1并增强诱导的抗肿瘤反应。 乳腺癌：由于我们已经在黑色素瘤中展示了使用多靶标疫苗策略的增强疗效，我们已经将这些发现扩展到一个侵袭性转移性乳腺癌小鼠模型。为了进一步提高主动免疫疗法，我们设计了一种个性化的多靶标疫苗，使用Qβ-VLPs包装TLR9配体，通过整合基于质谱的免疫肽组学和全外显子测序，展示延长的新生抗原。与短新生抗原的疫苗接种相比，长新生抗原的疫苗接种更有效，并且抗肿瘤效应可以显著重新极化肿瘤微环境，减少肺转移并增强生存。 获得性免疫缺陷综合症（AIDS）。自从20世纪80年代作为获得性免疫缺陷综合症（AIDS）的病原体被发现以来，HIV已成为全球主要的公共卫生问题。尽管抗病毒药物能够控制病毒，但迫切需要一种针对HIV的治疗性疫苗，以消除接受抗逆转录病毒治疗的患者中的长期持久性HIV。对HIV-1发病机制的了解表明，T细胞免疫在控制HIV感染的急性期中起着至关重要的作用，长期研究表明CD8+ CTL反应与HIV复制的控制和感染清除有关。1996年，Wolf等人构建并表达了一种嵌合HIV-1 VLP疫苗。将gp120的第3个可变区域（V3）或CD4结合域插入Pr55gag-VLPs中；这种插入没有干扰VLPs的组装能力。使用不同的途径和不同的嵌合Pr55gag/V3 VLPs对小鼠进行免疫，没有使用任何佐剂。结果表明对V3区域内已知表位有强烈的MHC-I (Dd) CTL反应。此外，已经证明Gag-VLP疫苗能够在处理的单核细胞来源的树突状细胞（DCs）中诱导干扰素α（IFN-α），APOBEC3G和APOBEC3F蛋白mRNA表达增加，这些蛋白已知是HIV-1的抑制剂。此外，包含HIV V3环的酵母衍生VLP已被证明可以被小鼠树突状细胞处理，与MHC类I相关呈递。 3.临床开发 目前有几种预防性和治疗性的基于VLP的疫苗处于临床开发阶段。我们在表2中列出了与上述讨论的疾病相关的临床试验。 4.市场上的VLP疫苗 4.1.人乳头瘤病毒疫苗 Gardasil®是首个获批作为针对人乳头瘤病毒（HPV）的预防性疫苗。Gardasil9®覆盖9种而非4种血清型，已经在美国取代了Gardasil®。Gardasil®、Gardasil9®和Cervarix®疫苗是L1-HPV表位的重组制造VLPs（表3）。然而，Gardasil9®包含比Gardasil®更大的总抗原负荷，以补偿不同共同配方VLPs的数量增加。Gardasil可预防4种HPV（6、11、16和18型），而Gardasil9®可预防另外5种（31、33、45、52和58型）。这些疫苗的设计目的是激发病毒中和抗体，以预防最初的HPV感染。这些上市疫苗已被证明能提供100%的预防宫颈癌前病变和生殖器疣的发展的保护效果，预计保护效果至少持续4.5年。HPV疫苗是安全的，局部不良反应如肿胀、疼痛和发红大多是轻度和短期可逆的。全身反应很少见，可能涉及恶心、发烧、头痛和疲劳。目前酵母或昆虫表达系统中的许可HPV疫苗的成本可能被认为是全球广泛实施的一个障碍。最近在大肠杆菌中表达低成本HPV疫苗的努力已成功。Cecolin®是一种针对HPV16和HPV18的双价L1-HPV疫苗，已成功在大肠杆菌中表达，并在小鼠、山羊和兔子中显示出高度免疫原性。2019年12月30日，Cecolin®正式获得国家药品监督管理局的批准，于2020年5月在中国上市。2021年10月，WHO为Cecolin®授予了预认证，使其成为首个获得WHO预认证的中国制造的HPV疫苗。 表3. 市场上目前批准的基于VLPs的HPV预防性疫苗列表 4.2.乙型肝炎病毒（HBV）疫苗 有几种针对可能危及生命的疾病乙型肝炎的HBV疫苗可供商业使用。HBV感染可能导致慢性感染，并使患有肝硬化和肝癌的人处于危险之中。现有的疫苗对HBV显示出98-100%的保护。 第一代HBV疫苗于1981年获得批准，基于Bulmberg的工作，他因发现澳大利亚抗原（现称为乙型肝炎表面抗原（HBsAg））而获得诺贝尔奖，该抗原在感染者的血清中。独特的疫苗是基于直接从人类携带者中获得HBsAg。然而，由于生物安全问题，这种血液来源的疫苗在1986年被改进的重组HBsAg版本所取代，使用重组DNA方法和在酵母细胞以及目前也在哺乳动物细胞中生产。第二代HBV重组疫苗最初是使用酵母系统生产的。现有的酵母衍生的HBV疫苗基于HBsAg单体自组装成VLPs。几项研究表明，纯化的酵母衍生的HBsAg呈现为∼22 nm VLPs 。形成的HBsAg VLPs中60-70%由HBsAg单体蛋白组成，其余由脂质组成。总的来说，形成的VLPs具有高度免疫原性，能够激发强大的中和抗体，并且是一种安全的疫苗，不含任何病毒基因组。使用单一抗原（HBsAg的小S抗原）进行疫苗接种有一些限制，包括实现血清保护所需的时间延长。30-40%的成年人在接种2剂疫苗后达到血清保护，但即使在接种第3剂后，也可能有10%的人无法达到这一点。最近FDA批准的第三代HBV疫苗PreHevBrio表达三种HBV表面抗原，S、pre-S1和pre-S2，并在哺乳动物细胞中生产。III期临床试验证实了疫苗在老年人和慢性病患者中的高免疫原性。研究得出结论，在第3剂后4周，疫苗在血清保护率上与单一抗原疫苗相比没有劣势。接种2或3剂后的血清保护率高于接种经典HBV疫苗（对照组）。超过90%的参与者在接种2剂后报告了快速诱导的保护性抗体轮廓；此外，观察到良好的安全性。表4总结了不同HBV疫苗的可用性，表5概述了第二代和第三代HBV疫苗之间的主要差异。 表4. 市场上一些基于VLPs的FDA批准的HBV疫苗 表5. 第二代与第三代乙型肝炎病毒（HBV）疫苗的比较 4.3.乙型肝炎病毒（HEV）疫苗 乙型肝炎病毒是印度、中国、肯尼亚、苏丹、尼泊尔和孟加拉国等国家超过50%的急性病毒性肝炎的罪魁祸首。据估计，全球每年约有3500万例病例发生，平均死亡率为0.2-4%，在孕妇中高达25%。HEV是一种无包膜病毒，大小为27-35纳米，分为四种不同的基因型，I、II、III和IV。I型和II型仅限于人类，而III型和IV型感染其他哺乳动物，然后可以将病毒传播给人类。尽管存在这种遗传多样性，但所有HEV都属于同一血清型。病毒的正义链RNA基因组包含三个开放阅读框，其中一个编码病毒衣壳蛋白，是中和抗体的主要靶标。HEV239（Hecolin®）于2012年在中国获得批准作为针对HEV的疫苗。该疫苗是由厦门万泰沧海生物技术有限公司（中国）开发的基于重组VLP的疫苗，编码基因来自ORF2 HEV基因型I菌株。在大肠杆菌表达系统中产生的重组蛋白由368-606个氨基酸组成（p239）4-5，经过复性并自组装成20-30纳米大小的VLPs。形成的VLPs在小鼠和恒河猴中具有高度免疫原性。Hecolin®在人类中显示出良好的安全性和100%的疗效。目前正在进行研究，以评估疫苗在高风险群体中的安全性和有效性，以评估潜在的全球使用，正如WHO推荐的那样。 4.4.疟疾疫苗 RTS,S/AS01（Mosquirix™）被认为是迄今为止针对疟疾红细胞前阶段的最先进疫苗。单价重组疫苗针对环孢子蛋白（CSP）蛋白的片段，这是P. falciparum包膜蛋白的主要成分。CSP蛋白片段被融合到HBsAg作为载体。在RTS,S中，R：代表19个中心串联重复，T：代表C末端的T表位，第一个S代表修饰的表面抗原，第二个S指的是未修饰的表面抗原，允许CSP在粒子表面的马赛克HBsAg颗粒上呈现。该结构组装成VLPs，并与AS01配制而成，AS01是一种有效的佐剂。RTS,S/AS01已在III期临床研究中进行了评估；然而，结果仅显示部分保护，并存在一些令人担忧的安全问题，特别是年轻女性可能增加的死亡率。RTS,S马赛克颗粒包含与CSP-HBsAg融合蛋白相比，有4倍摩尔过量的未修饰HBsAg亚单位。相比之下，下一代RTS,S/AS01疫苗（R21）仅包含CSP-HBsAg融合蛋白，R21因此在表面显示更多的CSP表位，并能在小鼠中诱导无菌保护。正在进行几项晚期临床试验，以测试下一代R21的安全性和有效性，并提高第一代RTS,S的疗效（表2）。2021年10月6日，WHO建议在撒哈拉以南非洲地区以及P. falciparum传播中等至高的地区广泛使用RTS,S/AS01疫苗。 5.结论 VLPs表现出高度免疫原性与卓越的安全性的独特组合，使它们成为疫苗设计的理想平台。自从首次描述基于VLP的HBV疫苗以来，该领域已取得显著进展，VLPs现在是许多上市疫苗的基础，如针对HPV和HEV的疫苗。关于使用VLPs作为展示平台的非常激动人心的新颖发展已经实现，不仅用于病原体衍生的抗原，如针对疟疾免疫的HBsAg上展示的CSP，还用于自身分子，如用于针对阿尔茨海默病的疫苗的Aβ或用于治疗伴侣动物和人类的慢性疾病的细胞因子。因此，我们预计未来几年将有几种新产品，包括针对人类和动物的产品，将进入市场。 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。