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12月13日，中国药科大学药学院药理系、重庆中国药科大学创新研究院、多靶标天然药物全国重点实验室肖易倍教授，药理系陈美容副教授，生命科学与技术学院陆美玲副教授为共同通讯作者合作在Science杂志上以“First Release”形式在线发表了题为“Antiviralsignaling of a type III CRISPR-associated deaminase” 的研究论文。科学家们通过研究发现了名为CRISPR-CAAD的系统，通过“耗光”细菌内部的能量分子ATP来阻止噬菌体扩散，揭示了细菌免疫系统与能量代谢之间的独特联系，为细菌抵抗噬菌体感染的防治提供了新的思路。 药学院博士研究生李钰涛、博士后李兆星、硕士研究生闫朴睿、孔健平，以及生命科学与技术学院硕士研究生华晨扬为该论文的共同第一作者。 细菌虽比人类简单，却也有自己的“免疫系统”用来保护自己免受噬菌体感染。科学家们通过研究发现了名为CRISPR-CAAD的系统，通过“耗光”细菌内部的能量分子ATP来阻止噬菌体扩散，揭示了细菌免疫系统与能量代谢之间的独特联系，为细菌抵抗噬菌体感染的防治提供了新的思路。 基于CRISPR-Cas系统的新型基因编辑技术被称为“基因剪刀”，已被广泛应用于基因工程领域。在已知的CRISPR-Cas系统中，III型是最复杂的一种。团队通过生物信息学分析发现，某些III型CRISPR-Cas系统缺少传统的核酸切割功能，却携带一种脱氨酶（CAAD）和一种核苷酸水解酶（Nudix）。这种独特的组合让科学家推测，这类系统的免疫机制可能与能量代谢密切相关。 当CRISPR-CAAD系统检测到噬菌体入侵时，会合成几种特殊的信使分子（cA3、cA4和cA6）。其中cA4和cA6能激活CAAD蛋白，使其将细菌内部的ATP（一种提供能量的分子）转化为ITP。这种转化会迅速耗尽细菌的能量，阻止噬菌体的复制和扩散，同时抑制感染细菌的生长，从而达到“以牺牲少数个体保护整体”的效果。 然而，积累的ITP对细菌自身也有毒性，可能导致蛋白合成出错。为避免长期影响，当噬菌体被清除后，细菌利用Nudix酶将有害的ITP分解成无害的IMP，从而恢复正常生长。这种“解毒”机制确保了细菌群体的生存和健康。 陈美容副教授、陆美玲副教授、肖易倍教授合照（从左往右） 研究团队利用冷冻电镜技术捕捉到CAAD蛋白在激活前后的三维结构。这些高分辨率图像显示，信使分子cA4和cA6在激活CAAD蛋白时存在一种“协同效应”，即它们共同作用提高了系统的灵敏度和效率。这种精准而高效的设计反映了细菌在与噬菌体“战争”中进化出的精妙策略，为理解III型CRISPR系统的多样性提供了新视角。 论文链接： https://www-science-org.libproxy1.nus.edu.sg/doi/10.1126/science.adr0393 版权声明 本文来源：中国药科大学，版权属于原作者，仅用于学术 扫描回复“规律”，即可一键下载 有机化学反应规律总结（非常全面）  邢其毅版《基础有机化学》配套PPT

关注小药说药，一起成长！ 前言 由于有效载荷、连接子和偶联方法的改进，抗体偶联药物（ADC）的发展在过去十年中取得了显著进展。特别是，连接子设计在调节ADC在体循环中的稳定性和肿瘤中的有效载荷释放效率方面起着关键作用，从而影响ADC的药代动力学（PK）、疗效和毒性特征。 一些关键的连接子参数，如偶联化学、连接子长度和连接子空间位阻都会对ADC药物的PK和功效产生影响。理想的连接子应在循环系统中保持稳定，并在肿瘤中释放细胞毒性有效载荷。然而，现有的连接子通常会非特定地释放有效载荷，并不可避免地导致脱靶毒性。 因此，在ADC药物的设计中，正确调整连接子的这些重要参数，从而实现ADC稳定性和有效载荷释放效率之间的平衡，才能达到ADC药物预期的效果。在过去几年中，人们开发了许多新的连接子，包括组织蛋白酶可切割连接子、酸可切割连接子、GSH可切割连接子、Fe(II)可切割连接子、新型酶可切割连接子、光响应可切割连接子和生物正交可切割连接子。其中，组织蛋白酶、GSH和酸可切割连接子已被充分研究并应用于经批准的ADC中。连接子设计取得了许多重要进展，这些工作将有助于指明连接子未来的发展方向。 组织蛋白酶可切割连接子 2017年，Caculitan等人发现缬氨酸瓜氨酸（Val-Cit）连接子对多种组织蛋白酶表现出广泛的敏感性，包括组织蛋白酶B、组织蛋白酶K、组织蛋白酶L等。为了提高选择性，Wei等人设计了一种使用环丁烷-1,1-二甲酰胺（cBu）结构的连接子，该结构主要依赖于组织蛋白酶B。 在细胞内，组织蛋白酶B抑制剂能够有效地抑制（超过75%）含cBu-Cit连接子的药物释放，而组织蛋白酶K抑制剂没有显著的效果。相反，传统的含Val-Cit的连接子似乎对所有单一蛋白酶抑制剂耐受（组织蛋白酶B、L和K的抑制剂均小于15%）。同时，与含有Val-Cit连接子的ADC相比，含有cBu-Cit连接子的ADC在体外表现出更大的肿瘤抑制作用。 此外，肽连接子的优化不仅限于开发新的结构，肽连接子可以通过最小的结构变化进行优化，如氨基酸的类型和结构化学。一些研究将Val-Cit和Val-Ala二肽结构与MMAE的有效载荷连接进行了比较。在非内化抗体的情况下，结合到工程化半胱氨酸的Val-Cit和Val-Ala连接子都表现出类似的特征，并且比Val-Lys和Val-Arg类似物表现出更好的性能。在使用随机半胱氨酸结合的抗Her2 ADC的情况下，与Val-Cit相比，Val-Ala在高DAR结构中显示出较少的聚集性。另一方面，两种连接子显示出相似的缓冲稳定性、组织蛋白酶B释放效率、细胞活性和组织病理学特征。 四肽Gly-Gly-Phe-Gly显示出稳定和有效的可切割连接子的所有特性，已上市的ADC药物Enhertu使用了此类连接子。第一三共的Enhertu是一种血浆稳定的ADC，DAR为7.7，在溶酶体中发生蛋白酶降解，释放DX-8951f，这是一种有效的拓扑异构酶I抑制剂，来源于exatecan。由于连接子不含增溶剂，达到如此高的DAR是非常可观的，因为它与广泛确立的原理相矛盾，即高DAR结合物可能具有较差的药代动力学特征。这里使用的自降解间隔子是简单和紧凑的半胺化，而不是Val-Cit连接子使用的PABC。 酸可切割连接子 酸切割连接子利用肿瘤组织（4.0–5.0）和血浆之间的pH差(∼7.4）选择性地向肿瘤组织释放有效载荷。这种策略在Mylotarg获得了最早的临床成功，后来也在Besponsa中得到应用。然而，酸切割连接子的稳定性不足严重限制了其在ADC中的应用，苯酮衍生的腙连接子在人和小鼠血浆中以2天的半衰期水解，Sacituzumab-govitecan（Trodelvy）的血清稳定性也不令人满意，其半衰期为36小时。 因此，酸裂解ADC需要更稳定的连接子，或者只能使用中度细胞毒性的有效载荷。2019年，一种新型的硅醚基酸裂解ADC被开发出来，携带高细胞毒性的单甲基auristatin E（MMAE）。这种设计极大地提高了酸裂解连接子的稳定性，此外，这种使用新型硅醚连接子的ADC在人血浆中的半衰期超过7天，并且在小鼠异种移植模型中显示出良好的治疗效果。 GSH可切割连接子 与血浆(∼5μmol/L）中相比，GSH切割的连接子依赖于细胞质中较高水平的谷胱甘肽（1–10 mmol/L）。二硫键在这些连接子中最常用，然而，目前的二硫键结构无法实现高循环稳定性和高效细胞内释放的完美结合。 2017年，Thomas等人试图通过将小分子药物直接连接到硫单抗中的工程化半胱氨酸来解决这个问题。通过直接连接抗体，抗体的空间保护将提高循环稳定性。 体内稳定性研究表明，当DM1通过二硫键连接到单抗的K149C上时，超过50%的药物即使在七天后仍保持连接。体内药效研究表明，在人类淋巴瘤-肿瘤异种移植小鼠模型中，这种新型抗CD22-DM1-ADC可诱导肿瘤消退。 同年，这种新策略被用于PBD作为有效载荷的ADC。与马来酰亚胺肽（Val-Cit）-PBD-ADC相比，在人类非霍奇金淋巴瘤异种移植小鼠模型中，新型二硫键的ADC表现出类似的活性。同时，这种新型二硫键ADC的MTD高于Val-Cit ADC（10 vs2.5 mg/kg）。 Fe(II)可切割连接子 铁代谢异常可提高游离亚铁的水平，基于这一策略，增加未结合的亚铁浓度已用于前药设计。2018年，Spangler等人报告了一种Fe(II)反应性1,2,4-三氧烷骨架的（TRX）连接子，并将这种连接子用于ADC。 通过TRX和Fe(II)的O–O键之间的Fenton反应裂解连接子，提供羰基中间体并通过β-消除释放有效载荷。 在体外细胞毒性研究中，含有TRX连接子的ADC在抗原阳性细胞中的活性与含有Val-Cit连接子的经典ADC相似。然而，在抗原阴性的MDA-MB-468细胞系中，含有TRX连接子的ADC仍然显示出显著的毒性。这种不稳定性是由金刚烷部分和抗体上附近位点之间的非特异性相互作用引起的。 新型的酶可切割连接子 与组织蛋白酶一样，焦磷酸酶和磷酸酶也是在溶酶体中选择性表达的水解酶。2016年，默克公司的研究人员设计了含有磷酸和焦磷酸的连接子与组织蛋白酶B敏感的Val-Cit-PABA搭配，旨在传递糖皮质激素。这种亲水性和永久性带电基团的优点是溶解性，不仅能够与亲脂性糖皮质激素衍生物进行生物偶联，而且促进ADC纯化， ADC中的残余连接子少于0.10%。含有磷酸和焦磷酸的ADC在体外都具有活性。 默克公司的同一组研究人员还开发了一种独特的基于焦磷酸酶的连接子，用于释放含羟基有效载荷地塞米松和丙酸氟替卡松。 两种ADC在体外均表现出良好的稳定性，对肿瘤细胞系具有较强的活性。  除了2006年为ADC开发的经典β-葡萄糖醛酸酶可切割连接子外，还发现β-半乳糖苷酶在肿瘤细胞中过度表达并具有水解活性。最近报道了一种使用β-半乳糖苷酶裂解连接子的ADC，其中包含PEG10间隔子。间隔子被硝基取代，以提高自降解速率。类比β-葡萄糖醛酸酶连接子，其解离机制涉及水解β-半乳糖苷酶部分，它赋予化学前体亲水性。另一个优势是β-半乳糖苷酶仅存在于溶酶体中，而β-葡萄糖醛酸酶在溶酶体中表达，也在实体瘤的微环境中表达。研究证明，在抗HER2-ADCs释放MMAE的背景下，含β-半乳糖苷酶连接子的 ADC在体外和体内均比T-DM1更为有效。 最近，还出现了硫酸酯酶裂解的连接子，硫酸酯酶在几种癌症类型中过度表达，表现出潜在的选择性。研究涉及以MMAE为有效载荷的抗Her2抗体，与经典的可切割Val-Cit和Val-Ala连接子相比，硫酸酯酶连接子对Her2+细胞系显示出相似的效力。 光响应可切割连接子 近年来，基于光响应切割的有效载荷释放策略逐渐出现。光响应可切割具有以下优点，包括低毒性、快速反应、高灵敏度和特异性。 2015年，Nani等人首次对ADC采用近红外（NIR）光照锁定策略。光响应切割基于七甲川菁荧光团骨架。在用NIR光（λ=650–900nm）照射后，ADC以位点特异性方式在受照肿瘤区域有效释放小分子细胞毒素CA-4。 在体外细胞毒性实验中，含有NIR光裂解连接子的ADC在EGFR+细胞系中经辐射后表现出相当于CA-4的活性，而未经辐射时表现出低活性。然而，这种连接子的自聚集和光不稳定特性限制了其作为药物的进一步开发应用。 最近，有研究报告了一种新型的紫外（UV）光控ADC。连接子引入了紫外光控制的邻硝基苄基作为切割触发。在稳定性和释放研究中，这种含有MMAE的连接子在自然光下6天内释放<1%，在辐照后10分钟内显示MMAE的快速释放，并达到最高平台。在体外细胞毒性实验中，用365nm（40W）紫外光照射后，含有邻硝基苄基连接子的ADC的活性显著增加，比未经照射的ADC高50倍。 2019年，报道了一种光响应、自断裂的连接子，使用光笼C40氧化碱性位点（PC4AP）。与前面提到的两个ADC相比，这种连接子在设计上具有“双重保险”。在365 nm辐射下，PC4AP的羟基与其自身抗体上附近的胺发生分子内加成反应，随后的消除反应导致裂解和有效载荷释放。含有肽-PC4AP-DOX的ADC在阳性细胞中显示出与有效载荷DOX相当的毒性，并且在没有辐射的情况下没有细胞毒性。 生物正交可切割连接子 生物正交化学具有选择性高、加工快速简便、副产物无毒等特点。2019年，Wang等人开发了一种生物正交可切割连接子，该连接器使用了经典的生物正交切割对Cu(I)-BTTAA和dsProc。 然而，生物正交可切割连接子目前主要集中在体外探索上。在反应效率、反应速率、底物稳定性、生物相容性和操作方便性方面仍存在问题，离临床应用还很远。 小结 在过去的几年里，ADC的结构优化和机制扩展方面取得了许多进展。新的可切割连接子已经被开发出来，以获得对肿瘤的更高选择性。尤其新型光响应可切割连接子和生物正交可切割连接子可以打破传统ADC的细胞内药物释放限制。这些新型连接子的初步数据令人鼓舞，未来将极大地促进ADC药物的迅猛发展。 参考文献： 1.The Chemistry Behind ADCs. Pharmaceuticals (Basel). 2021 May; 14(5): 442. 2. Antibody-drugconjugates: Recent advances in linker chemistry. Acta Pharm Sin B. 2021Dec;11(12):3889-3907. 公众号内回复“ADC”或扫描下方图片中的二维码免费下载《抗体偶联药物：从基础到临床》的PDF格式电子书！ 公众号已建立“小药说药专业交流群”微信行业交流群以及读者交流群，扫描下方小编二维码加入，入行业群请主动告知姓名、工作单位和职务。

无论是人类还是微生物，在生存过程中都会面临病毒（或噬菌体）的威胁。你知道吗？细菌虽然比人类简单，却也有自己的“免疫系统”用来保护自己免受感染。北京时间12月13日，我校药学院药理系、重庆中国药科大学创新研究院、多靶标天然药物全国重点实验室肖易倍教授，药理系陈美容副教授，生命科学与技术学院陆美玲副教授为共同通讯作者合作在Science杂志上以“First Release”形式在线发表了题为Antiviralsignaling of a type III CRISPR-associated deaminase的研究论文。药学院博士研究生李钰涛、博士后李兆星、硕士研究生闫朴睿、孔健平，以及生命科学与技术学院硕士研究生华晨扬为该论文的共同第一作者。科学家们通过研究发现了名为CRISPR-CAAD的系统，通过“耗光”细菌内部的能量分子ATP来阻止噬菌体扩散，揭示了细菌免疫系统与能量代谢之间的独特联系，为细菌抵抗噬菌体感染的防治提供了新的思路。 神奇的“基因剪刀”CRISPR-Cas：已广泛应用于基因工程领域 细菌虽然比人类简单，却也有自己的“免疫系统”用来保护自己免受噬菌体感染。这些细菌免疫系统非常多样化且复杂，它们的工作原理至今仍在被科学家探索。研究细菌的这些“免疫系统”不仅有助于揭开生命活动的奥秘，还直接推动了科学技术的进步，比如以CRISPR-Cas9为代表的基因编辑技术就是从细菌免疫系统中得到的灵感。 基于CRISPR-Cas系统的新型基因编辑技术被称为“基因剪刀”，已被广泛应用于基因工程领域。CRISPR-Cas系统是一种存在于细菌和古细菌中的天然免疫机制。它会像“侦察兵”一样用RNA检测外来入侵者（比如噬菌体的DNA或RNA），并发动攻击以保护自己。CRISPR技术已经被人类利用来进行基因编辑，在医疗、农业等领域带来了革命性的突破。人类依靠免疫系统会识别并清除病毒。比如cGAS蛋白通过“捕捉”病毒DNA来激活下游免疫反应，而ADAR1蛋白会“修改”病毒RNA，干扰其功能。 在所有已知的CRISPR-Cas系统中，III型是最复杂的一种。与其他CRISPR系统通过直接切割噬菌体核酸来消除威胁不同，III型系统使用一种“间接攻击”方式：先识别噬菌体的核酸，然后产生一种叫做“信使分子”的物质，这些分子可以进一步激活其他防御反应。这种复杂性为科学研究和技术应用提供了巨大潜力。 陈美容副教授、陆美玲副教授、肖易倍教授合照（从左往右） 升级版“秘密武器”CRISPR-CAAD：课题组发现细菌通过能量代谢抵抗噬菌体的新机制 1. 如何发现CRISPR-CAAD？ 研究团队通过生物信息学分析发现，某些III型CRISPR-Cas系统缺少传统的核酸切割功能，但却携带一种脱氨酶（CAAD）和一种核苷酸水解酶（Nudix）。这种独特的组合让科学家推测，这类系统的免疫机制可能与能量代谢密切相关。 2. ATP的消耗机制 进一步实验表明，当CRISPR-CAAD系统检测到噬菌体入侵时，会合成几种特殊的信使分子（cA3、cA4和cA6）。其中cA4和cA6能激活CAAD蛋白，使其将细菌内部的ATP（一种提供能量的分子）转化为ITP。这种转化会迅速耗尽细菌的能量，阻止噬菌体的复制和扩散，同时抑制感染细菌的生长，从而达到“以牺牲少数个体保护整体”的效果。 3. 恢复机制：防止“反噬” 然而，积累的ITP对细菌自身也有毒性，可能导致蛋白合成出错。为了避免长期影响，当噬菌体被清除后，细菌利用Nudix酶将有害的ITP分解成无害的IMP，从而恢复正常生长。这种“解毒”机制确保了细菌群体的生存和健康。 4. 精准调控的机制 为了更深入地揭示CRISPR-CAAD系统的工作原理，研究团队利用冷冻电镜技术捕捉到CAAD蛋白在激活前后的三维结构。这些高分辨率图像显示，信使分子cA4和cA6在激活CAAD蛋白时存在一种“协同效应”，即它们共同作用提高了系统的灵敏度和效率。这种精准而高效的设计反映了细菌在与噬菌体“战争”中进化出的精妙策略，为我们理解III型CRISPR系统的多样性提供了新视角。 结语 我校研究团队对CRISPR-CAAD系统的研究为细菌免疫系统的多样性和复杂性提供了新的视角。通过深入解析这种机制，不仅有助于推动基因编辑和生物医学技术的发展，还可能为解决人类面临的重大健康问题提供重要启发。 细菌虽小，却在与噬菌体的较量中展现了惊人的“智慧”。这些微生物的进化奥秘，正在逐步为我们揭示出生命科学的更多可能性。 近三年，该团队成员聚焦核酸免疫与调控，以通讯作者（含共通）在Science，Nature Chemical Biology，Cell Research，Nature Communications，PNAS，NAR，Cell Reports，APSB和JMC等学科顶尖及以上期刊发表研究论文近30篇,申报专利50余项。团队积极投身有组织科研体系，通过与生命科学与技术学院陈依军教授、药学院药物化学系杨鹏教授、药物分析系纪顺利副教授、中药学院赵玉成教授、湖南中医药大学李顺祥教授、新加坡国立大学胡纯一教授、南京财经大学李光磊博士联合攻关，最终得以顺利完成本研究。生命科学与技术学院硕士研究生吴宛倩和崔钰瑢，湖南中医药大学博士研究生段彦亦参与了本课题研究。该研究工作得到了国家自然科学基金创新研究群体项目（82321005）、国家重点研发计划（2023YFC3402300）等项目的支持。上海交通大学分析测试中心和南方科技大学冷冻电镜平台为数据采集提供了保障。 近年来，我校积极推进自由探索与有组织科研有机融合。聚焦“健康中国”建设过程中的重大科研任务，加强创新人才队伍建设，跨学科、跨领域组建攻关团队，共同解决全球性的科学难题。 全文链接： https://www-science-org.libproxy1.nus.edu.sg/doi/10.1126/science.adr0393 来源：药学院、生命科学与技术学院、宣传部 文字：肖星宇、吴旻玥 编辑：王琳琳、龙彦妤