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关注并星标CPHI制药在线 上文中（《褪黑素促进骨再生作用机制的研究进展（上）》），我们介绍了褪黑素促进骨再生作用的抗炎和抗氧化作用以及在成骨细胞分化和自噬的作用，本文继续介绍褪黑素与成骨细胞凋亡和铁死亡的关系以及对破骨细胞的作用机制和促进血管生成的作用。 ③褪黑素与成骨细胞凋亡 研究表明，褪黑素对成骨细胞凋亡的影响具有两面性，且与褪黑素浓度密切相关。实验发现使用高糖培养成骨细胞48h后细胞的凋亡率为40.8%，凋亡蛋白cleaved caspase 3的表达升高，而加入褪黑素后细胞凋亡率为28.3%，cleaved caspase 3的表达降低。这与另外两项研究实验结果相似，褪黑素干预后成骨细胞早期凋亡率、总死亡率以及Bax、caspase-3等凋亡相关蛋白的表达明显降低。研究表明，褪黑素可以缓解并改善成骨细胞的凋亡水平，进一步分析发现其与抑制成骨细胞氧化应激密切相关。褪黑素干预后可使枸橼酸铁铵和铝作用成骨细胞造成ROS蓄积的结果得到缓解，使 ROS水平降低。研究表明褪黑素可使核因子红细胞2相关因子2（Nrf2）途径相关蛋白Nrf-2及HO-1表达进一步的增加。Nrf-2是人抗氧化反应元件（ARE）的正向调节因子，Nrf-2通路的激活可以调节细胞内大量抗氧化基因产物的表达水平，并降低氧化应激水平，从而使凋亡水平降低，说明褪黑素抑制成骨细胞的凋亡水平，可能与通过Nrf-2途径抑制成骨细胞的氧化应激水平有关。 另有研究表明使用高浓度褪黑素干预成骨细胞，介导内质网应激（ERS）、调节STIM1，导致Septin4、Septin7表达增加以及细胞膜钙升高，成骨细胞过量表达Septin4，可使细胞骨架破坏、细胞形态改变和细胞数量减少。这可能与细胞膜钙升高，通过ERK途径诱导成骨细胞都会使成骨细胞的凋亡明显增加有关。 ④褪黑素与成骨细胞铁死亡 铁死亡是一种铁依赖性的细胞死亡方式，是由于细胞内脂质过氧化、谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）抗氧化系统失调以及铁超负荷所致，主要特征是细胞内活性氧的堆积和线粒体形态、膜电位的改变。多项研究表明，褪黑素对成骨细胞的铁死亡具有抑制作用，且此作用与褪黑素改善成骨细胞氧化应激以及铁自噬密切相关。 首先，褪黑素通过调节Nrf2/HO-1、Wnt以及PI3K/AKT/GSK-3β/P70S6k信号通路使成骨细胞氧化应激水平降低，从而抑制铁死亡。研究表明褪黑素可以使高糖诱导成骨细胞发生铁死亡导致的GPX4和胱氨酸⁃谷氨酸逆向转运蛋白（SLC7A11）表达下调得到逆转，从而抑制成骨细胞的铁死亡。同时研究人员检测核因子红细胞2相关因子2（Nrf2）和血红素加氧酶⁃1（HO-1）的表达水平，结果显示在褪黑素组中的表达水平明显高于高糖组，而在使用Nrf2⁃SiRNA干扰后，褪黑素对成骨细胞铁死亡的改善作用则受到明显抑制，这说明其中Nrf2/HO-1通路起着重要作用。值得注意的是，实验发现铁剂量依赖性下调Wnt靶基因以及PI3K/AKT/GSK-3β/P70S6k 信号通路相关基因的转录与表达，抑制其信号传导，生成ROS和脂质过氧化产物（LPO）。在使用褪黑素后可逆转铁抑制的典型 Wnt及PI3K/AKT/GSK-3β /P70S6k 信号转导，减少ROS和LPO的产生，改善氧化应激，预防铁死亡，恢复铁死亡对成骨细胞分化的抑制作用。 其次，褪黑素可以调节miR-550a-3p/ELAVL1轴，改善铁自噬来抑制成骨细胞的铁死亡。ELAV样蛋白1 （ELAVL1） 是一种RNA结合蛋白，能够介导铁自噬，使铁蛋白降解，氧化应激水平升高，从而引起铁死亡。 通过双荧光素酶检测发现miR-550a-3p能够靶向作用于ELAVL1，褪黑素干预高糖培养成骨细胞后miR-550a-3p表达上调，调控ELAVL1表达下调，减少铁自噬的发生，从而使铁死亡得到抑制。根据上述实验结果可知，褪黑素显著降低成骨细胞的铁死亡水平是通过激活 Nrf2/HO-1通路、恢复Wnt及PI3K/AKT/GSK-3β/P70S6k信号通路传导、上调miR-550a-3p，降低ELAVL1相关铁自噬蛋白的表达实现的。 3、褪黑素对破骨细胞的作用机制 骨再生的控制不仅需要成骨细胞的调节，还需要破骨细胞的参与。破骨细胞源于造血干细胞，核因子κB 受体活化因子配体/核因子κB 受体活化因子(receptor actvator of nuclear factor-κBligand/receptor actvator of nuclear factor-κB，RANKL/RANK)通路的活化诱导破骨细胞的形成。骨保护素是基质细胞产生的诱饵受体，与 RANKL 结合并阻止其与 RANK 的相互作用。同时，巨噬细胞集落刺激因子促进破骨细胞前体的增殖和破骨细胞的存活。 褪黑素减少与骨吸收增加有关，提示褪黑素可能是一种内源性破骨细胞抑制剂。血清中的低褪黑素水平与骨质疏松症患者的低骨密度也表现出相关性。通过抑制 MT2 受体依赖的核因子κB信号通路促进间充质干细胞的成骨分化，并由 RANKL旁分泌下调破骨细胞的生成，表明褪黑素可能通过骨保护素/RANKL/RANK 轴影响成骨细胞系细胞和破骨细胞系细胞之间的相互作用。另有研究报道是褪黑素下调核因子κB 信号通路和活化 T 细胞核因子c-1 (NFATc1) 转录因子直接抑制破骨细胞的分化，而不涉及褪黑素受体。此外，褪黑素还上调骨细胞分泌降钙素发挥对破骨细胞的抑制作用。在细胞水平上，褪黑素抑制 RAW 264.7 细胞在低浓度RANKL 和巨噬细胞集落刺激因子诱导下分化为破骨细胞。 4、褪黑素具有促进血管生成的作用 骨修复需要血液供应和血运重建来恢复受损区域，血管化是骨再生的前提和关键环节。褪黑素促进血管生成的机制是通过上调血管内皮生长因子水平促进骨髓间充质干细胞介导的血管生成，即促进骨生成-血管生成偶联。将骨髓间充质干细胞经褪黑素处理，在得到具有更高表达水平的成骨相关标志物的同时，也得到更高表达水平的血管生成相关标志物，如血管内皮生长因子、血管生成素2和血管生成素4。褪黑素纳米复合支架的成功制备，实现了褪黑素的长效缓释和成骨能力的增强。将褪黑素包埋丝素电纺丝 (melatonin-encapsuled silk Fibronin electrospun，SF@MT) 纳米纤维植入大鼠临界尺寸的颅骨缺损中，通过激活 PI3K/Akt信号通路，可显著促进骨基质沉积和新血管形成。负载褪黑素的纳米纤维海绵支架 (Scaffold@MT) 的植入也显著改善了大鼠股骨远端缺损的血管化骨再生。通过核因子红系2 相关因子 2(nuclear factor-erythroid 2-Related Factor 2,Nrf2)/血红素加氧酶1(heme oxygenase，HO-1) 信号通路，褪黑素纳米复合支架可减少血管内皮细胞的氧化应激损伤以及直接刺激血管内皮生长因子的产生，从而逆转糖尿病条件下骨生成-血管生成的解偶联并促进成骨。相关的骨组织工程的进展进一步证实褪黑素具有改善缺血组织血管生成的潜力，进而加速骨修复。不过，也有研究指出，在肿瘤、年龄相关性眼病和低氧环境中，褪黑素抑制组织内新血管生成，这与骨愈合过程中的观察结果相矛盾。 参考资料 [1]王颖,郝楠,谢戬芳.褪黑素在骨关节炎中作用机制的研究进展[J].安徽医学,2024,45(06):794-797. [2]季明意,季欣意,徐俊峰.褪黑素促进骨再生机制及在口腔种植中的应用[J].中国组织工程研究,2025,29(18):3868-3876. [3]李富华,张锦玉.褪黑素对成骨细胞作用机制的研究进展[J].中国骨质疏松杂志,2024,30(11):1678-1682. 作者简介：小泥沙，食品科技工作者，食品科学硕士，现就职于国内某大型药物研发公司，从事营养食品的开发与研究。 END 2025金笔奖征文活动开启，来投稿吧！ 领取CPHI & PMEC China 2025展会门票 智药研习社直播预告 来源：CPHI制药在线 声明：本文仅代表作者观点，并不代表制药在线立场。本网站内容仅出于传递更多信息之目的。如需转载，请务必注明文章来源和作者。 投稿邮箱：Kelly.Xiao@imsinoexpo.com ▼更多制药资讯，请关注CPHI制药在线▼ 点击阅读原文，进入智药研习社~

扫码报名2024肝病新药联盟年会暨减重新药论坛！ 胶质母细胞瘤（Glioblastoma, GBM）是成人中最具侵袭性的原发性恶性脑肿瘤,其治疗方法主要包括手术、放疗，靶向治疗，免疫治疗和干细胞治疗等。由于GBM存在高度的异质性，通常有低的突变负担，并且其肿瘤微环境固有的免疫抑制性，使得传统的化疗和免疫疗法难以发挥预期效果。mTOR是雷帕霉素靶蛋白，其通过PI3K-AKT-mTOR信号通路或通过影响胶质母细胞瘤微环境在胶质母细胞瘤的发展中起着至关重要的作用。GSPT1作为调控蛋白翻译终止的关键蛋白，在胶质母细胞瘤中高度表达，并通过特定机制促进胶质母细胞瘤的进展。有研究表明，mTOR抑制剂耐药原因之一可能是由于GSK3β表达量降低引起，而GSPT1的降解会促使GSK3β的表达上调，有望克服其耐药。与此同时，mTOR的抑制能有效增强GSPT1降解剂活性，并且mTOR抑制和GSPT1降解在细胞翻译的始末具有协同作用。基于此，研究人员提出了一种利用分子胶技术将小分子抑制剂和分子胶降解剂特性整合到单一分子中的新策略。 首先，通过结合多种mTOR抑制剂和E3泛素连接酶配体，结合分子胶的特点，研究人员选择刚性短的连接体构建双功能化合物库，通过多轮筛选，筛选出YB-2-43，它对胶质母细胞瘤细胞的增殖具有抑制作用。通过进一步的结构优化，最终获得mTOR抑制和GSPT1降解活性更好的双功能化合物YB-3-17。同时使用MLN0128（mTOR抑制剂）和SJ6986（GSPT1降解剂）治疗U87细胞，发现其抗肿瘤活性虽有提高，但仍逊于YB-3-17，这表明YB-3-17在同时干扰两个靶点时存在显著协同作用。 基于torkinib与mTOR的共晶结构(PDB:4JT5)，研究人员使用mTOR对YB-3−17和MLN0128进行了分子动力学模拟，对接结果表明YB-3-17能够有效适应mTOR的激酶口袋，其琥珀酰亚胺环中的羰基基团与mTOR的LYS2306形成了强烈的氢键相互作用，这可能增强了其抑制活性。MMGBSA分析显示，YB-3-17与mTOR的亲和力较低，表明与MLN0128相比，YB-3−17是一个更稳定的配合物。此外，使用CRBN-CC885GSPT1的共晶结构(PDB:SHXB)，预测了YB-3-17的分子胶结合模式。 将YB-3-17中的谷氨酰胺进行乙基化以得到YB-3-17-NEG，作为阴性对照组；其丧失了与CRBN的结合，并且降低对GSPT1的降解活性，但保留了较强的对下游mTOR磷酸化的抑制。经免疫共沉淀实验显示，在YB-3-17处理下，Flag-CRBN HeLa细胞中的GSPT1蛋白与mTOR相比显著富集，而MLN0128和阴性对照分子YB-3-17-NEG则没有达到这种效果，这些结果突出表明YB-3−17独特的作用机制，其选择性地增强GSPT1在目标细胞环境中的积累，并诱导CRBN和GSPT1之间形成紧密的次级复合体。 研究人员对YB-3-17进行了进一步的生物学活性评估以及机制验证。YB-3-17以浓度和时间依赖性的方式显著抑制了U87细胞中S6K，4EBP1以及AKT蛋白的磷酸化水平，表明其抑制mTORC1/2复合物活性的能力。YB-3−17处理细胞6h可以观察到GSPT1明显降解。随后，研究发现，YB-3-17诱导的GSPT1降解可以被蛋白酶体抑制剂(卡非佐米、硼替佐米)、类泛素化抑制剂(MLN4924、MLN7243)和泊马度胺阻断，但不会被MLN0128阻断，这表明GSPT1的降解依赖于蛋白酶体系统而不是与mTOR的结合。 这表明了YB-3-17通过蛋白酶体途径作用于GSPT1的特异性。激酶活性测定表明，YB-3-17的ICs0为0.22nM，优于mTOR抑制剂MLN0128。在生物学活性评估中，YB-3-17还展现出了对多种神经肿瘤细胞的增殖抑制作用，显著优于单靶点mTOR抑制剂、GSPT1降解剂以及它们的联合治疗。这一结果充分展示了YB-3-17通过双靶点协同作用所带来的治疗优势。相比单一靶点药物，YB-3-17能够同时作用于mTOR和GSPT1，可以更有效的抑制肿瘤细胞增殖。 进一步，通过蛋白质组学和激酶谱实验评估YB-3-17的降解选择性和激酶抑制选择性，以此来评估其安全性。蛋白质组学分析显示，YB-3−17处理后GSPT1，GSPT2和SNUPN均有下调，但通过western blotting验证表明，YB-3−17并没有诱导GSPT2和SNUPN这两种蛋白的降解，这表明YB-3−17只显著降解GSPT1，而不影响其他细胞内蛋白，展现极好的降解选择性。同时，激酶谱实验显示，不同于MLN0128，YB-3−17不抑制对细胞生长至关重要的FGR、CSF1R （FMS）、LCK和LYNa等脱靶蛋白，进一步证实，YB-3-17在抑制mTOR活性时具有显著的选择性，未对多种常见的细胞生长相关激酶产生抑制作用。同时，在对小鼠进行的为期三天的连续给药研究中，MLN0128单次30 mg/kg剂量会导致小鼠死亡，而接受等量YB-3−17治疗的小鼠在整个研究期间保持良好的健康状况。这些数据表明，YB-3−17降低了脱靶效应的毒性，同时通过降解GSPT1和抑制mTOR增强了疗效。 通过RNA测序分析，作者进一步探索YB-3-17的作用机制。KEGG分析显示，YB-3−17显著富集了与多种途径相关的基因，包括氨基酸合成、内质网蛋白质加工和胰岛素抵抗信号。这种广泛的活性表明YB-3-17对细胞过程的多方面影响。且通过火山图分析，YB-3-17处理后SENS2、DDIT4和CHAC1在mRNA水平上的显著上调，这些基因能够显著增强对mTOR的抑制活性。同时，YB-3−17还显示出大量富集与细胞凋亡（DDIT3）和p53信号通路（GADD45A）相关的基因。以上数据表明，YB-3-17通过影响更广泛的信号通路发挥抗肿瘤效应。 在体内实验中，通过将U87细胞接种到雄裸鼠中建立了异种移植模型，随后，通过腹腔注射对小鼠进行治疗。与对照组相比，MLN0128和YB-3−17均能显著抑制肿瘤生长。然而，在相同剂量下，YB-3−17表现出更好的疗效。在10/20 mg/kg剂量下，YB-3−17几乎完全停止肿瘤生长，导致肿瘤消退，表明其体内抗肿瘤能力更强。并且，相比于MLN0128，不同剂量的YB-3-17处理小鼠后，小鼠状态良好。进一步在体内验证了YB-3−17抑制mTOR和降解GSPT1的能力。通过免疫印迹法分析腹腔注射指定剂量的YB-3−17,MLN0128后，裸鼠肿瘤细胞中GSPT1、cyclin D1、pS6K、pAKT和β-actin的变化，进一步证实了YB-3-17显著抑制mTOR下游蛋白的磷酸化，并以剂量依赖性方式降解GSPT1。 综上，本研究提出了在一个小分子中同时实现mTOR抑制和GSPT1降解的双靶双机制小分子设计策略，通过多轮筛选以及结构优化，设计开发出小分子YB-3-17，其表现出优于mTOR抑制剂MLN0128的肿瘤抑制活性、选择性和安全性。该化合物验证了双靶点、双机制策略的可行性，为抗肿瘤药物开发提供了新的治疗思路。 参考文献 Yongbo Liu, Xiuyun Sun, Qianlong Liu, Chi Han, Yu Rao. A Dual-Target and Dual-Mechanism Design Strategy by Combining Inhibition and Degradation Together. J Am Chem Soc. 2024 Dec 2. doi: 10.1021/jacs.4c11930 封面图来源：pixabay 《生物安全法案》再遇挫，药明系周一开盘大涨！ 2024-12-09 Acta Pharmacol Sin| 上海药物所评测AlphaFold3的GPCR-配体复合物预测表现能力显示实验结构的必要性 2024-12-08 里程碑！乙肝治愈率首次突破30%大关 2024-12-07 版权声明/免责声明 本文为授权转载文章。 本文仅作信息交流之目的，不提供任何商用、医用、投资用建议。 文中图片、视频、字体、音乐等素材或为药时代购买的授权正版作品，或来自微信公共图片库，或取自公司官网/网络，部分素材根据CC0协议使用，版权归拥有者，药时代尽力注明来源。 如有任何问题，请与我们联系。 衷心感谢! 药时代官方网站:www.drugtimes.cn 联系方式: 电话:13651980212 微信:27674131 邮箱:contact@drugtimes.cn 点击，报名参加肝病会议!

在神经退行性疾病中，突触和树突的变化会导致回路失调，进而引发神经元死亡。通过刺激树突和突触的再生，有可能恢复受损的神经回路功能。然而，中枢神经系统（CNS）神经元的再生能力非常有限，尤其是在受损或患病的情况下。因此，识别能够促进树突再生、重建功能性突触连接、增强神经元对压力抵抗能力的因素和信号通路至关重要。 胰岛素是一种能够穿越血脑屏障的肽类激素，对神经系统的能量平衡、树突可塑性和神经传递等过程具有重要影响。胰岛素通过促进微管蛋白的生成来支持神经突生长。此外，研究已证实，胰岛素信号不足和胰岛素抵抗与神经退行性疾病如阿尔茨海默病和帕金森病相关。尽管鼻腔给药胰岛素能改善这些患者的记忆和情绪，但胰岛素能否促进树突和突触再生以恢复神经回路功能及其作用机制尚不清楚。 近日，Adriana Di Polo等在Sci Adv发表了题为“Insulin restores retinal ganglion cell functional connectivity and promotes visual recovery in glaucoma”的研究论文。该研究揭示了胰岛素能够通过激活 mTOR 通路，促进视网膜神经节细胞（RGCs）的树突和突触再生，从而恢复这些细胞的功能和视觉行为。 为了探讨胰岛素是否能促进树突再生，研究人员通过在小鼠眼内注射磁性微珠来诱导眼部高压（OHT），随后用胰岛素治疗。研究发现，OHT导致视网膜神经节细胞（RGCs）树突显著退缩，而仅仅降低眼压并不能促进树突再生。但胰岛素治疗可以促进这些树突再生，恢复其长度、覆盖面积和分支数量。研究还显示，局部使用的胰岛素可以穿透角膜到达视网膜，表明胰岛素有助于 RGCs 在 OHT 条件下实现树突再生。 图1：胰岛素在OHT条件下促进RGCs树突再生 进一步的实验显示，在 眼部高压（OHT） 条件下视网膜神经节细胞（RGCs）与双极细胞之间的兴奋性突触显著减少，而胰岛素治疗则能恢复这些突触的关键蛋白（PSD95 和 VGLUT1）的表达。 通过使用带有红色荧光蛋白标签的病毒载体，研究人员可视化并量化了再生树突上的突触复合体，发现胰岛素治疗能够显著恢复近端及远端 RGCs 树突上兴奋性突触的密度。此外，胰岛素对不同 RGC 亚型的突触恢复效果一致，这意味着胰岛素治疗可以独立于 RGC 亚型及其与胞体的距离，全面恢复再生树突上的兴奋性突触密度。 图2：胰岛素可恢复脆弱神经元的兴奋性突触 mTORC1 和 mTORC2 是关键的调节器，其中 mTORC1 主要负责 mRNA 翻译和蛋白质合成，而 mTORC2 则调控细胞骨架的组织和细胞生长。研究者利用靶向短干扰 RNA（siRNA）抑制了 mTORC1 的下游效应蛋白 S6K 和 4EBP1，以探究它们在胰岛素介导的树突再生中的作用。 结果显示，敲低 S6K 完全阻止了胰岛素诱导的树突再生，导致 RGCs 的树突缩短且分支减少，而 4EBP1 的敲低并未影响再生过程。此外，S6K 的再生作用在不同类型的视神经损伤（如创伤性视神经损伤）中均得到了验证，表明 S6K 是胰岛素依赖的 RGC 树突再生的关键调节因子。 图3：S6K对于胰岛素介导的 RGC 树突再生至关重要 此外，研究还发现 S6K 可以通过磷酸化 mTORC2 的关键成分 SIN1 来影响其活性，而 SIN1 的磷酸化是胰岛素介导的树突再生所必需的。具体来说，S6K 磷酸化了 SIN1 的 Thr86 和 Thr398 位点，促进了 mTORC2 的激活。SIN1 的敲低显著抑制了胰岛素诱导的 RGC 树突再生，表明 SIN1 在这一过程中起着关键作用。 此外，SIN1 的磷酸化还与 Akt 的激活有关，Akt 进一步激活 mTORC1，形成正反馈循环，从而增强蛋白质翻译和树突再生。这说明 mTORC1 和 mTORC2 通过 SIN1 相互作用，共同促进胰岛素诱导的 RGC 树突再生。 研究人员利用 OHT 诱导的损伤模型考察了胰岛素治疗对 RGC 存活的影响。结果显示，在 OHT 后使用胰岛素治疗，能够显著提高 RGC 的存活率，维持其密度接近未受损的对照组水平，而对照组中使用生理盐水治疗的视网膜则表现出明显的神经元死亡。此外，通过单细胞钙离子（Ca²⁺）信号记录分析，发现胰岛素治疗恢复了 RGC 的光刺激引发的 Ca²⁺ 瞬态动态，表现为 Ca²⁺ 衰减时间缩短，与未受损伤的对照组相似。功能性测试表明，胰岛素治疗还能显著改善视力表现，使高眼压引起的视觉损伤得以恢复。 图4：胰岛素刺激神经元存活并恢复视觉功能 总体而言，本研究结果表明，胰岛素治疗是一种有效的再生策略，能够促进青光眼患者RGCs的树突和突触再生，恢复神经回路功能，为胰岛素在青光眼和其他视神经病变中的应用提供了新的见解。 参考文献： El Hajji S, Shiga Y, Belforte N, et al. Insulin restores retinal ganglion cell functional connectivity and promotes visual recovery in glaucoma. Sci Adv. 2024;10(32):eadl5722. doi:10.1126/sciadv.adl5722 本文仅用于学术分享，转载请注明出处。若有侵权，请联系微信：bioonSir 删除或修改！ 点击下方「阅读原文」，前往生物谷官网查询更多生物相关资讯~