MEF2D

急性淋巴细胞白血病为一种常见的恶性血液肿瘤，生物学特征复杂多样且临床异质性较大。受内在遗传学因素以及外在环境因素等影响，导致原始幼稚淋巴细胞在骨髓、脾脏和淋巴结中恶性克隆增生，最终引起肝脾淋巴结肿大，组织浸润，机体出现贫血、出血等症状，并引起一系列的并发症：如中枢神经系统白血病、脓毒血症等。2016 年上海血研所对 172 例白血病患者进行转录组测序，发现了新的DUX4、MEF2D以及ZNF384融合的B-ALL亚型（Liu et al, EBioMedicine, 2016）(图1)。蒙国宇团队依托血研所平台，多年来一直以DUX4融合、MEF2D融合以及ZNF384融合的B-ALL发病机制为研究核心，开展了一系列系统性的研究工作。经过多年的努力， 首次从结构生物学角度揭示了致癌融合蛋白IGH::DUX4调控下游靶基因的全新机制（Dong et al, Leukemia, 2018；Dong et al, Leukemia, 2019），以及其驱动的致癌性可变剪接从而诱导白血病发生的分子机制，最终筛选到一系列与预后相关的重要指标，为白血病的临床诊疗提供新方向、新依据（Zhang et al, Cancer Communications, 2021）；在最新的研究中，该团队提出了可以提高可变剪接精准识别的新策略，这将有助于识别疾病发生中的致癌剪接事件（Jiang et al, Briefings in Bioinformatics, 2023）。此外，该团队也系统地研究阐述了MEF2D fusion类型B-ALL的致病机制，主要通过小鼠模型和多学科交叉的技术手段，明确了MEF2D-HNRNPUL1融合蛋白是白血病致癌驱动因素，初步探索了传统化疗药物联合靶向HDAC9抑制剂进行治疗，将有望改善MEF2D融合B-ALL患者临床治疗效果的可能性（Zhang et al, Blood, 2022）（图一)。这些深入研究不仅为阐述白血病的发病机制提供了丰富的数据支持，还为未来开展药物筛选和临床靶向治疗提供了夯实的理论基础。图一. (A) DUX融合、MEF2D融合以及ZNF384融合在急淋中占比；(B) 课题组研究进展轴线图。2023年12月19日，蒙国宇教授团队在《Clinical and Translational Medicine》期刊发表了题为“Transcription factor 12 mediated self-feedback regulatory mechanism is required in DUX4 fusion leukemia”的研究论文，这使得课题组在急性B淋巴细胞白血病的机制研究领域又迈出了新的一步。在此项研究中，蒙国宇团队以IGH::DUX4驱动的急性B淋巴细胞白血病为研究对象，聚焦于转录因子12（TCF12）在此类型白血病发生发展中的关键作用。通过对患者临床样本和白血病细胞系样本的ChIP-seq和RNA-seq数据进行整合分析，并运用多种实验手段，揭示了TCF12与IGH::DUX4的协同作用机制 (图二)。图二. (A) DUX4融合类型B-ALL患者中TCF12存在高表达；(B) 整合ChIP-seq和RNA-seq数据发现TCF12与IGH::DUX4在基因组上存在协作。研究结果显示，IGH::DUX4的靶基因TCF12可能是这一类型白血病的重要辅助因子。IGH::DUX4与TCF12的共表达显著增强了DUX4驱动的转录激活活性。TCF12的敲低和基因敲除显著降低了白血病细胞中IGH::DUX4驱动的靶基因转录激活。在TCF12敲除细胞中，基于AI的结构预测和互作分析发现：TCF12上参与相互作用氨基酸的突变会严重削弱TCF12与IGH::DUX4之间的相互作用和协同转录活性(图三)。值得关注的是，TCF12-IGH::DUX4相互作用界面的破坏，会导致IGH::DUX4驱动的白血病细胞存活受损，并呈现对化疗的敏感性(图4)。这一研究结果揭示了TCF12介导的正向自反馈调控机制在IGH::DUX4白血病中的重要性，为该特定类型的白血病的治疗开辟了新的药物靶点。图三. (A) TCF12敲除后DUX4融合引起的异常转录被抑制；(B) TCF12敲除后药敏实验研究。蒙国宇团队的研究不仅深化了对IGH::DUX4白血病的理解，同时DUX4-TCF12复合物结构也为开发针对此类白血病的特效药提供了理论和实践基础。上海交通大学医学院附属瑞金医院蒙国宇教授、胡伟国教授、复旦大学脑科学转化研究院青年副研究员张浩为论文的共同通讯作者。上海交通大学医学院附属瑞金医院博士后李智慧、硕士生姜明昊、博士生王俊飞、硕士生卓芷仪为论文的共同第一作者。该工作得到了上海市科委基础重点项目、国家自然科学基金、“上海市教委高峰临床医学资助项目”、“上海高等学校特聘教授（东方学者）项目”等基金的支持。参考文献:Li Z, Jiang M, Wang J, et al. Transcription factor 12-mediated self-feedback regulatory mechanism is required in DUX4 fusion leukaemia. Clin Transl Med. 2023 Dec;13(12):e1514. doi: 10.1002/ctm2.1514. PMID: 38115701; PMCID: PMC10731121.责编|探索君排版|探索君文章来源|“iNature”End往期精选围观王晓红教授团队：绘制单次冷冻囊胚移植成功的女性植入期外周血microRNA动态表达谱，开拓领域创新研究热文维生素B12在细胞重编程与组织再生中发挥关键作用！热文不孕症治疗新方向！又一导致女性不孕的关键因素被发现热文Let-7家族miRNA或为癌症潜在免疫治疗靶点热文一项最新发现或可用于阿尔茨海默病药物开发点击“阅读原文”，了解更多~

摘要成簇规律间隔短回文重复序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)/CRISPR相关蛋白9(CRISPR-associated protein9, Cas9)基因编辑技术是未来治疗疾病的理想工具，可以以极高的精度和效率与永久纠正有害碱基突变或干扰致病基因。多种高效的cas9变异体和衍生物已经被开发来应对疾病期间发生的复杂基因组变化。然而，目前尚缺乏将CRISPR系统有效递送至体内病变细胞的策略，具有靶点识别功能的非病毒载体可能是未来研究的重点。疾病发作导致的病理和生理变化有望作为识别靶向递送的因子或基因编辑的靶点。疾病种类繁多且复杂，针对不同疾病选择合适的基因编辑方法和传递载体至关重要。与此同时，靶向递送CRISPR/Cas9技术用于疾病治疗仍存在许多潜在挑战。本文从基因编辑类型、递送载体、疾病特征3个方面对目前的研究进展进行综述。此外，本文总结了成功的临床试验实例，最后描述了当前CRISPR应用可能存在的问题。背景介绍基因编辑是一种精确修改基因组序列以诱导基因组插入、删除或碱基替换的技术。许多疾病都伴随着体内基因表达的变化，尤其是一些由单个基因突变引起的遗传疾病，而基因编辑技术有望在基因水平控制疾病的发生。迄今为止，基因编辑技术主要经历了三代的发展:第一代基因编辑技术是锌指核酸酶(zinc-finger nucleases, ZFNs);第二代为转录激活因子样效应物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases, TALENs);应用最广泛的第三代基因编辑技术是成簇规律间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)/CRISPR相关蛋白9(Cas)。与使用靶向DNA链蛋白质的ZFNs和TALENs不同的是，CRISPR技术通过改变向导RNA中一小段片段的碱基序列将Cas蛋白定向到基因组的特定位置，从而提高了基因编辑的效率，也扩大了基因编辑技术的适用性。CRISPR/Cas9是一种在科学界广泛应用的高效基因编辑工具。CRISPR/Cas9系统在细菌和古细菌中作为对抗噬菌体感染和质粒转移的防御机制而自然进化得来的。当外源性噬菌体或质粒首次浸润时，细菌或古细菌会获得其DNA序列的一段片段，并将其插入到CRISPR间隔区域。如果再次感染同源DNA，该细菌将启动CRISPR区域的转录。在经过一系列的加工和成熟过程后会产生了一个单向导RNA(single guide RNA, sgRNA)，随后sgRNA引导Cas9剪切DNA链，从而破坏同源间隔区。sgRNA的识别过程需要原间隔区相邻基序(protospacer-adjacent motifs, PAMs, 一种短的鸟嘌呤富集序列)的参与。化脓性链球菌Cas9(Streptococcus pyogenes Cas9, SpCas9)的首选PAM是NGG，而这在大多数生物的基因组中是常见的，因此促进了CRISPR技术在植物和动物科学以及生物医学领域的使用。通过改变向导RNA的一小段片段的核苷酸序列，CRISPR/Cas9可以精确靶向几乎任何所需的基因组位点，从而纠正致病突变或沉默与疾病发病相关的基因。然而，CRISPR/Cas9可能无法触及基因组中的一些高度染色质化区域。该技术在治疗癌症、心血管疾病、镰状细胞性贫血和神经退行性疾病方面具有令人瞩目的潜力。野生型Cas9仅切割双链DNA形成双链断裂(double-strand breaks, DSBs)，而DSBs可以通过DNA修复机制（即同源定向修复(homology-directed repair, HDR)和非同源末端连接(non-homologous end joining, NHEJ)）进行修复。原始基因的碱基序列受损会导致失活，但单个有害基因的失活并不能解决所有疾病的复杂过程。因此，研究人员通过阐明Cas9的理化结构、Cas9切割双链的作用机制和其他性质来寻找修饰Cas9的可能的方法。他们通过突变Cas9的结构域并引入效应子进而赋予Cas9新的功能，包括转录调控工具如dCas9(dead Cas9)效应子和单碱基替换工具如胞嘧啶碱基编辑器(cytosine base editors, CBEs)、腺嘌呤碱基编辑器(adenine base editors, ABEs)和先导编辑器(prime editors, PEs)。此外，从Leptotrichia shahii中分离的Cas13a可以完成RNA识别和切割功能。这些Cas9变异体和衍生物丰富了基因编辑范式，并且可适用于其他类型的疾病。虽然有几项实验证明使用基因编辑技术在体外修饰细胞再回输体内可以治疗某些疾病，但这种方法不适用于大多数类型的疾病。在CRISPR技术成为一种常见的治疗模式之前，实现稳定、高效和安全的体内递送是必须克服的挑战。CRISPR系统如质粒DNA(plasmid DNA, pDNA)、mRNA和核糖核蛋白(ribonucleoprotein, RNPs)在直接递送后易在体内降解和免疫清除，因此需要递送载体的帮助。腺相关病毒(Adeno-associated virus, AAV)载体因其负载能力有限、缺乏特异性靶向能力以及不能整合到宿主基因组等缺点，因此不适合在大多数疾病中应用。非病毒载体是近年来的研究热点，其中脂质纳米颗粒已在临床上用于递送CRISPR基因药物。在动物实验中，聚合物纳米粒子、仿生纳米材料和外泌体也显示出递送CRISPR系统的潜力。我们需要进一步研究和开发将非病毒载体以便应用于广泛的临床研究。每种疾病都有不同的特点，我们的目标不是开发一种通用的递送载体，而是开发适用于不同类型疾病的多种递送载体。因此，研究疾病的发病机制以及疾病细胞和组织的病理特征，并基于这些特征构建疾病组织中环境响应性和配体识别的纳米粒子将进一步丰富基因靶向药物。此外，来自免疫细胞或病变器官的外泌体和细胞膜可有效避免免疫清除，其表面丰富的膜蛋白使基因靶向药物能够递送至病变细胞。在这篇综述中，我们讨论了CRISPR技术的发展，并总结了近年来发展的各种类型的基因编辑工具。文中还总结了CRISPR系统在体内的递送系统，重点讨论了开发更适合不同疾病的新系统，最后讨论了应用CRISPR技术治疗疾病可能出现的一系列问题和相应的策略。综上所述，该方法对于为不同疾病提供最有效的基因治疗模式具有积极的意义。01CRISPR技术的发现与发展CRISPR相关基因编辑技术是目前最热门的生物工具之一。自2013年以来，CRISPR技术的研究呈爆发式增长，数以万计CRISPR相关的文章被发表。2020年10月，诺贝尔化学奖被授予法国微生物学家艾曼纽埃尔·卡彭蒂耶和美国生物学家珍妮弗·杜德纳，以表彰他们“开发了一种新的基因组编辑方法”。这种方法在受到广泛关注之前已经被科学家研究了近30年（见图1）。图1 CRISPR/Cas技术发展中的主要事件时间表和代表性Cas9变异体。1987年，CRISPR序列首次被报道。Cas9切割DNA双链的机制在2012年被报道，随后Cas9被用于哺乳动物细胞的基因编辑。此后，CRISPR技术迅速发展，多个具有特定功能的Cas9变异体被鉴定出来。具有代表性的变体是单碱基替换工具(例如CBE和PE)和转录调控工具(例如dCas9)。自2016年以来，基于CRISPR的基因编辑技术陆续应用于临床并取得了巨大成功。CRISPR表示成簇规律间隔短回文重复序列、Cas表示CRISPR相关、dCas9表示死亡Cas9、PAM表示原间隔序列相邻基序、CBE表示胞嘧啶碱基编辑器、ABE表示腺嘌呤碱基编辑器、GBE表示糖基化酶碱基编辑器。(图由Adobe Illustrator创建)1.1利用TITTLECRISPR技术进行早期检测一种特殊的重复间隔的序列。和许多伟大的发现一样，CRISPR技术的发现也是在一个意想不到的事件中诞生的。1987年，Nakata等人在研究大肠杆菌的iap基因时首次报道了一个位于iap基因3'端结构域的不寻常序列。该序列由5个高度同源的序列组成，包含29个核苷酸，间隔为32个核苷酸。在接下来的十年里，这种特殊的重复序列在多种细菌和古细菌中被检测到。2002年，Janson等人对已确定的特定重复序列进行了概括总结，将这些重复序列命名为一个家族，并使用缩写CRISPR表示成簇规律间隔短回文重复序列。此外，之前的研究已经揭示了多种CRISPR相关蛋白(Cas)—Cas1~Cas4。细菌和古细菌的防御武器。2005年，研究人员发现CRISPR中的间隔序列并非每种生物所特有。Mojica等发现，大多数间隔序列来源于外源性DNA，只有一小部分与外界无关，并且他们发现病毒更有可能感染没有同源间隔序列的细胞。他们推测CRISPR与细菌抵抗外部噬菌体感染和质粒转移有关。这一猜想在两年后得到证实。当首次遭遇噬菌体或质粒侵袭时，含有CRISPR序列的细菌会获得他们的一段DNA序列，这段序列作为特殊重复序列之间的间隔区域。CRISPR RNA(crRNA)经过一系列的转录和成熟过程，产生一个含有20个碱基的原间隔序列的单链crRNA，该单链crRNA通过互补碱基配对与入侵的DNA结合。仅由crRNA识别外源序列并不能保护其免受噬菌体的攻击，还必须通过Cas蛋白的裂解活性干扰外源序列而使其失活。CRISPR/Cas蛋白家族根据基因组和蛋白质结构信息分为两类，其中最著名的蛋白Cas9属于第二类CRISPR/Cas系统。第一类CRISPR/Cas系统的特征是一个能够剪切DNA链的大型Cas9蛋白复合物，而第二类只需要一个剪切蛋白。Cas9的特征是存在两个核糖核酸酶结构域，靠近氨基端的RuvC样核酸酶结构域和位于蛋白质中间的HNH核酸酶结构域，这两个结构域都具有切割DNA链的功能。值得注意的是，原间隔序列并非从外源序列中随机获得，而总是伴有一种富含鸟嘌呤的序列（该序列被称为原间隔相邻基序(PAMs)）。随后的研究表明，PAM序列在获取间隔区(在该区域Cas蛋白进行切割)中发挥重要作用。1.2Charpentier和Doudna的贡献随着CRISPR/Cas9的功能机制逐步被揭示，天然CRISPR/Cas9已迅速应用于细菌转化。在2011年Siksnys等人将第一个CRISPR基因序列从嗜热链球菌转移到大肠杆菌中，并且接受了CRISPR基因序列的大肠杆菌成功抵御了质粒转化，这是关于CRISPR/Cas9在非宿主细菌中发挥作用的首次报道。这一发现提示，CRISPR/Cas系统可作为抵御外部感染的防御机制，而且CRISPR系统发挥作用并不依赖CRISPR/Cas系统的宿主。在2012年Charpentier和Doudna从嗜热链球菌和化脓性链球菌中纯化了Cas9蛋白，使原核DNA能够在体外裂解。他们还阐明了CRISPR/Cas9的工作机制，指出Cas9的裂解位点由crRNA中的种子序列控制，并且需要PAM的参与。此外，通过改变种子序列的核苷酸序列，该系统可以在多种情况下发挥基因沉默的作用并通过改变核苷酸种子序列提供基因靶向和基因编辑的功能。1.3CRISPR技术的繁荣哺乳动物细胞的基因编辑。之前关于CRISPR/Cas9的研究主要集中在原核细胞，在2013年张峰等人发表的一篇论文开始将CRISPR技术应用于医学、农业等领域。他们将反式激活crRNA(tracrRNA)、pre-crRNA、宿主因子核糖核酸酶(RNase) III和来自化脓性链球菌的Cas9整合到人源293T细胞中，并添加各自的启动子和两个核定位信号(nuclear localization signals, NLSs)以确保该结构顺利进入细胞核。该实验针对位于人空气门同源盒1(EMX1)位点的PAM前的30个碱基对。结果表明在至少spCas9、tracrRNA和pre-crRNA存在的条件下实现了EMX1切割。另外，来自嗜热链球菌的Cas9的功能也被张峰等人验证并得到了一致的结果。在同年发表的另一篇论文中，Church等构建了crRNA-tracrRNA融合转录体成为sgRNAs并将crRNA缩窄至20bp。这些研究具有重大意义，既证实了CRISPR基序在哺乳动物细胞中起作用，又简化了CRISPR基因编辑系统，从而为CRISPR的使用提供了更多可能性。转录调控工具dCas9。Cas9的DNA链切割功能是通过设计一个简单的sgRNA片段来引导Cas9到达目标位点来实现的，但许多关于基因的其他研究已被用于研究DNA链切割以外的功能。Qi等人突变了上述野生型Cas9的RuvC1和HNH核酸酶结构域(D10A和H841A)，导致Cas9失去裂解酶活性。针对非模板DNA链设计的sgRNA能有效沉默dCas9基因的表达，而针对模板DNA链设计的sgRNA不能有效沉默基因的表达。sgRNA与靶基因启动子序列的相对位置对沉默效率也有显著影响。重要的是，无论靶序列是模板链还是非模板链，对于靶向启动子序列的sgRNA基因沉默都会发生。2013年7月，Qi等人的另一项研究发现，dCas9与VP64、KRAB等转录调控相关的效应蛋白相互作用共同调控基因表达，这是目前dCas9最常用的用途。首次研究利用CRISPR技术治疗疾病。在CRISPR/Cas9被证明在哺乳动物细胞中发挥作用后的几个月里，科学家迅速在小鼠、果蝇和大鼠等动物以及水稻和小麦等植物中实现了基因编辑。然而，治疗疾病是对CRISPR技术的最大期望。在2013年12月，Wu等人发表了一项利用CRISPR/Cas9在碱基缺失导致白内障的小鼠模型中治疗白内障的研究。他们将编码Cas9的mRNA和sgRNA共同注射到将患白内障的小鼠的受精卵中。在获得的22只幼鼠中，10只携带突变等位基因，其中6只NHEJ介导的插入和缺失以及4只HDR介导的修复。HDR诱导的4只小鼠白内障均治愈，其中2只NHEJ诱导的小鼠成功治愈。基于这些结果，CRISPR/Cas9可以修饰基因组来治疗遗传性疾病。在同一时期进行的另一项研究中，Schwank等人从有囊性纤维化跨膜导体受体(CFTR)突变的2例患者分离出了肠道干细胞，并使用CRISPR/Cas9技术纠正了致病突变。此外，他们提出了对基因突变干细胞进行体外编辑并随后将其引入体内治疗疾病的方案，该方案在几年后成功用于临床。单碱基基因编辑技术。虽然CRISPR/Cas9通过切割双链进行再修复成功治愈了一些点突变引起的疾病，但该方法的低效和不确定性限制了其应用。2016年，Komor等人认为遗传性疾病的治疗应纠正突变的碱基，而不是将其切除以允许其随机重组。胞嘧啶脱氨酶催化胞嘧啶脱酰胺转化为尿嘧啶，尿嘧啶随后通过复制分裂转化回胸腺嘧啶。因此，他们将CRISPR/dCas9与鼠源胞苷脱氨酶(APOBEC1)整合，成功实现了C→U碱基转换。这一碱基编辑技术也经过改进以提高碱基替换的效率和精度。单碱基基因编辑技术的发明不仅提供了一种可预测的碱基替换方法，也设计了一种碱基替换框架便于后续发明更多的碱基替换方法，而这对于治疗碱基突变导致的遗传病具有重要意义。RNA编辑工具Cas13a。CRISPR/Cas13a(以前称为C2c2)是从沙希纤毛菌(Leptotrichia shahii)中提取的第二类VI型CRISPR/Cas家族蛋白。其特征是包含两个高级真核和原核核苷酸结合(HEPN)结构域，该结构域可高效降解几乎所有单链RNA，而Cas13a对靶标RNA的识别是由sgRNA介导的。之前发现的Cas相关蛋白作用于DNA链，而Cas13a的发现为识别和检测RNA病毒(如SARS-CoV-2)提供了一种新方法。Cas13a还被证实以类似于RNAi的方式降低基因表达效率，但该方式具有更高的特异性。CRISPR/Cas9技术的首次临床试验。中国四川华西医院的卢铀及其同事开展了首项CRISPR/ Cas9临床试验。2016年10月，卢铀等人将CRISPR/Cas9基因编辑的T细胞回注到患者体内，这是世界上首次用于人类注射的基因编辑细胞。用于基因编辑的T细胞来自于患者，通过电穿孔将编码有靶向PD-1基因的Cas9和sgRNA的质粒转染到细胞中。数据显示，在基因编辑的T细胞中，PD-1的表达量显著降低。对接受T细胞注射的患者进行的随访研究表明，患者未因接受基因编辑的T细胞而发生显著不良反应，并且其中2例患者病情稳定。本研究表明了基因编辑技术临床应用的可行性和安全性，对促进基因编辑技术的临床应用具有重要意义。02基于CRISPR的基因编辑工具CRISPR基因编辑技术有助于真核细胞的基因编辑。研究者对Cas9的作用机制进行了研究，通过特殊修饰获得了具有不同功能的Cas9变异体和其他一些衍生基因编辑工具，并发现了Cas9家族中的其他Cas蛋白，丰富了利用CRISPR技术可编辑的基因类型。研究人员已经开发了一些载体，以协助转运并安全地将CRISPR系统递送到人体。2.1CRISPR/Cas9的组成sgRNA。含有CRISPR的细菌和古细菌在受到外源噬菌体或质粒入侵时，会获得插入间隔区的外源DNA片段。与间隔区同源的外源核酸重新进入细菌可激活CRISPR序列的转录并产生crRNA前体（pre-crRNA）。Pre-crRNA包含与tracrRNA互补碱基配对的序列，其中tracrRNA是CRISPR序列的重复区域。TracrRNA首次在转录后与Cas9蛋白结合；然后，pre-crRNA和tracrRNA之间的碱基互补配对形成双链RNA,并且pre-crRNA与Cas9结合。在结合发生后，RNaseIII在初级过程中构建pre-crRNA并且Cas9在次级过程中切割多余的重复序列和间隔序列。经过这两个过程后，crRNA成熟并获得靶向DNA链的能力。靶向特定序列的骨架RNA(tracrRNA)和crRNA共同构成sgRNA。为了简化上述过程，研究者构建了crRNA-tracrRNA融合转录本并促进了真核生物中CRISPR/Cas9系统的应用，而这极大地简化了crRNA的加工和成熟过程。通过设计一个仅针对PAM位点旁边20bp碱基的crRNA靶向序列，理论上几乎任何包含PAM位点的位置都可以靶向。基于CRISPR的基因编辑技术与ZFNs和TALENs之间的主要区别在于，基于CRISPR的基因编辑技术依赖于RNA介导的靶标DNA的识别。sgRNA的设计是决定CRISPR基因编辑在靶标位点能否成功的关键。Cas9。sgRNA负责引导基因编辑系统到达靶标位点，而靶标DNA链的修饰由Cas9完成。以SpCas9为例，SpCas9与靶标DNA的结合依赖于对靶标位点下游PAM序列的识别，从而触发双链DNA的分离。crRNA上PAM近端的10个碱基称为种子序列，而种子序列首先通过互补碱基配对与DNA链结合并开始形成其R-loop结构。PAM的远端DNA与Cas9的REC2和REC3的结构域相互作用以加速R-loop的形成，而完整的R-loop的形成促进催化双链DNA裂解的HNH和RuvC核酸酶结构域的激活。当使用野生型Cas9进行基因编辑时，如SpCas9(S.pyogenes Cas9)和SaCas9(Staphylococcus aureus Cas9)、脱靶效应、染色体易位、大片段缺失和其他异常时常发生。由于PAM的局限性，CRISPR/Cas9基因编辑系统经常不能靶向真正的位点。因此，对Cas9的修改主要集中在两个方面:增强Cas9的安全性和使其摆脱PAM的限制。(Tables 1, 2) 2.2CRISPR递送方法质粒DNA(Plasmid DNA, pDNA)具有不易降解、可大量扩增、易修饰等特点，是装载CRISPR系统的理想载体。携带CRISPR/Cas9的质粒进入细胞后在NLS的辅助下进入细胞核，转录编码Cas9和sgRNA的mRNA。这一过程非常繁琐，在mRNA上加载CRISPR/Cas9工具可能会极大地简化这一过程。然而，mRNA易被降解且稳定性较低。特别是，由于编码Cas9和效应器蛋白的mRNA中的碱基数量太庞大，因此将Cas9递送至与效应蛋白协同发挥作用的基因编辑工具难以应用。Cas9 RNPs，又称核糖核蛋白(ribonucleoproteins, RNPs)，是通过纯化的Cas9与sgRNA在体外融合形成的复合物，并且RNPs在进入细胞后立即发挥功能。然而，由于RNPs的复杂组成和电荷性质使其相对难以递送到细胞内，而蛋白质和核酸通常是在细胞穿透肽的辅助下通过电穿孔的方式递送。随着递送载体的不断创新，科学家已经确定外泌体是递送Cas9 RNPs的一种有前景的方法。2.3CRISPR工具的功能分类DNA链切割工具。CRISPR/Cas9最初被研究的原因是其强大的双链DNA切割功能。sgRNA将Cas9定向到一个指定的位点，并该位点处DSBs在HNH和RuvC核酸酶结构域存在的条件下形成平齐末端。随后DNA修复机制被激活，主要是NHEJ和HDR。通过NHEJ对DSBs的修复并不精确，并且经常导致碱基突变而导致靶向性突变。HDR修复是一个能够正确修复断裂DNA链的复杂而精确的过程。完美修复的DNA链与目标DNA无法区分，并将再次被Cas9切割直到sgRNA变得无法识别。幸运的是，成熟细胞发生HDR的机会远低于NHEJ。Cas9可有效切割双链DNA，但在实践中sgRNA常与双链DNA错配导致脱靶效应。此外，我们需要一种更有效的方法来介导基因的突变失活，以提高基因敲除的效率并减少不必要的裂解。Cas9 nickase(Cas9n,Cas9的一种变体,其核酸酶结构域RuvC(D10A)发生突变)仅导致与crRNA互补的DNA链断裂。DNA单链断裂通过高保真碱基切除修复(BER)途径进行修复，因此设计了两个相邻的sgRNA/Cas9n复合物来剪切单个位点，这有效地防止了Cas9介导的对非靶标DNA的损伤并极大地增强了Cas9的特异性。两个Cas9ns之间适当的距离偏移有助于提高基因编辑效率。张峰及其同事们设计了一个在线工具(http://www.genome-engineering.org/)用于两个Cas9n sgRNAs的设计，以便后续研究。2015年，张峰等人提取了Cpf1(CRISPR来自于普雷沃菌和弗朗西斯菌)，现被大家熟知为Cas12a。Cas12a（属于第二类V型CRISPR-Cas Cas12a，）是一种第二类V型CRISPR-Cas系统，其剪切DNA双链的能力与Cas9相同，但与Cas9又有很大差异。在细菌中，Cas12a的crRNA成熟并不需要tracrRNA和RNase III的参与，并且当CRISPR序列转录被激活时pre-crRNA直接被Cas12a切割成一个43bp的核苷酸序列作为sgRNA。SgRNA/Cas12a识别位于目标位点上游的富含T的PAM序列（通常是5'-TTTV-3'），随后crRNA与DNA链结合。Cas12a只有一个核酸酶结构域RuvC，它介导双链DNA的切割。与Cas9切割双链产生的平齐末端不同，Cas12a产生一个粘性末端界面，类似于上述双sgRNA引导的Cas9n产生一段4-5个碱基的外伸量。这种方法的优点是，如果起初DNA链修复产生插入或缺失(indels)，目标位置仍然可以在下一次被HDR修复。产生的粘性末端界面可能对NHEJ中的基因插入产生积极影响，而这必须在后续研究中得到证实。总之，Cas12a的发现丰富了基于CRISPR系统的基因编辑工具，并且它是第一个被鉴定的无PAM而富含G的Cas蛋白，这在基因组中对一些未知基因具有重要的意义(图2a-c)图2 DNA链切割工具的示意图。a Cas9将DNA双链切割成扁平末端; b Cas9 切口酶(Cas9n)切割DNA单链。c Cas12a切断DNA双链形成黏性末端。d Cas13a识别并切割RNA链。(图是用Biorender创建的)基因表达调控和表观遗传修饰工具。CRISPR/Cas9切割双链DNA的能力取决于两个核酸酶结构域，突变这两个核酸酶结构域会导致失去酶介导的切割活性而变为dCas9。这些突变体仍然能够在RNA的引导下与DNA链上的特定位点结合而影响基因转录，但并没有严重的脱靶效应。由于Cas9已在其他研究中被证明可以装载大量蛋白到达基因组的特定位置并发挥其功能，因此设计一种结合转录因子的dCas9来调控靶基因的表达是实现CRISPR/dCas9系统应用的潜在研究方向。许多疾病在发展过程中往往伴有炎症因子或有害基因的高表达，抑制这一激活或恢复保护基因的表达对于靶向某些慢性疾病很重要。此外，与CRISPR/Cas9基因编辑不同，由于基因组未经过修饰，CRISPR激活(CRISPR activation, CRISPRa)和CRISPR干扰(CRISPR interference, CRISPRi)是可逆的，这大大减少了脱靶效应带来的未知问题。由于DNA的碱基序列没有直接改变，基因编辑的效率限制了CRISPR/dCas9的应用。真核生物的基因调控是一个复杂的过程，大多数基因由多个相互作用的调控元件进行控制。表观遗传修饰也影响基因表达。Gilbert等人将dCas9与多个抑制性染色质修饰结构域融合，并筛选了显著抑制基因转录的阻遏结构域KRAB(Krüppel-associated box)。CRISPR/ dCas9结合到激活的结构域也促进基因表达;无论是由四个转录激活因子VP16拷贝组成的VP64，还是激活结构域的p65都能增强转录。已开发出多种激活或抑制结构域来调节基因表达。CRISPR/ dCas9是一种通用的可以负载激活或抑制结构域来调控基因表达的转录调控平台。此外，表观遗传修饰还可能受到dCas9负载的表观遗传修饰酶(如DNA甲基转移酶DNMT3A和乙酰转移酶P300)的调控。CRISPR/dCas9的脱靶效应风险远低于Cas9且效应相对有效和温和，但调控基因表达的机制非常复杂。因此，设计一个靶向一个位点的sgRNA可能导致多个基因的表达改变，必须通过进行更深入的研究来进一步探索其风险(图3)。 图 3 基于dCas9的表达调控工具示意图。a dCas9融合物VP64、VPR及其他转录激活效应蛋白在基因转录起始位点附近结合，促进基因转录。b dCas9可能与KRAB或其他转录抑制效应蛋白融合，并与基因转录起始位点结合从而沉默基因转录。c dCas9与p300或其他组蛋白乙酰化酶融合形成的复合体与基因转录起始位点或增强子区域结合，促进组蛋白乙酰化，进而增强基因转录。d. dCas9与DNMT3和其他DNA甲基转移酶融合后可能结合基因转录起始位点，促进DNA甲基化，从而抑制基因转录。碱基编辑技术。许多已知的遗传性疾病都是由基因中某个碱基的突变引起的。治疗这些疾病的根本目的是将突变的碱基恢复到原来的碱基，而不是将DNA链切割从而发生HDR或NHEJ介导的随机修复，现有的基因编辑工具无法达到预期的功能。这5个核苷酸在结构上彼此相似;例如，胞嘧啶脱氨酶催化C脱氨变为U。在细胞核中，U在胞质分裂期间被T取代，导致C-G被T-A取代，这些试剂后来被归类为胞嘧啶碱基编辑器(CBEs)。Komor等人通过比较人类、大鼠和八目鳗的胞苷脱氨酶活性，选择了大鼠的APOBEC1作为第一代碱基编辑工具(BE1)。无催化活性的dCas9被选为携带过氧化氢酶的靶标递送载体，而16-残基XTEN也被添加为该系统的稳定剂。BE1对PAM远端4~8位核苷酸具有较好的脱酰胺活性，但在人类基因组实验中其转化率仅为0.8 ~ 7.7%。一种可能的解释是，U是一种不属于DNA的碱基，在DNA修复过程中很容易修复。在第二代碱基编辑工具(BE2)中，添加了U的稳定剂以预防BER。这一改进是成功的，使BE2的碱基替换效率提高了3倍。当BER发生时催化与突变位点互补的链断裂将G替换为A可进一步提高碱基替换效率。后续研究者对BE3进行了一些改进以提高碱基编辑效率，如修改和优化细胞核定位信号、改变密码子等方法，以提高BE3碱基编辑效率，减少插入缺失的形成，获得如BE4max和BE4-Gam等更高效的基因编辑工具。Kurt等人成功开发了一种基于BE4max诱导C→G替换的基因编辑工具。CBE在实现C-to-T置换的过程中经常发生C-G错突变，而两种UGIs的添加有效地阻止了这一过程。通过一系列改进，我们最终得到了一个新的碱基编辑器BE4max(R33A)ΔUGI-hUNG complex(CGBE1)。本研究改进了用于碱基间置换的基因编辑工具，并促进了C-to-G碱基编辑器的开发。实现C-G到T-A和C-G到G-C替换对于单基因编辑工作很重要，但多种类型的碱基突变会导致疾病，实现碱基之间的任意替换是将CRISPR技术应用于疾病治疗的迫切任务。2017年，Liu和他的同事完成了用C-G碱基对替换A-T碱基对的工作。不同于之前报道的仅发生在游离腺嘌呤（RNA中的腺苷或RNA-DNA错配中的腺苷上）的C→U置换，没有腺嘌呤脱氨酶能够在双链DNA上对A脱氨。TadA是一种tRNA腺嘌呤脱氨酶，由于其与APOBECs的同源性，对TadA进行修饰使其激活DNA双链上的腺嘌呤脱氨酶活性是一种很有前景的方法。当大肠杆菌中的抗生素抗性基因发生突变时，大肠杆菌只有在突变位点实现A到I替换时才能存活。利用这种方法，研究人员筛选了能够在DNA链上充当突变的TadA*。在大肠杆菌筛选过程中，异源二聚体TadA-TadA*存在的大肠杆菌存活率较高，异源二聚体的形成可能显著提高腺嘌呤碱基的编辑效率。经过多次修改，TadA-TadA*-Cas9n最终确定为ABE7.10。腺嘌呤在腺苷脱氨酶的催化下变成肌苷，最终导致A-T转化为G-C。在对ABE的后续研究中，研究者对ABE7.10进行了进一步改进，以获得一种更高效、副作用更少的碱基编辑工具。来自人类的胞苷脱氨酶AID与nCas9的C末端融合有效地实现了C-T编辑。然而在一些菌株中，研究人员已经检测到高频率的C-to-A突变。CBEs添加UGI抑制尿嘧啶DNA糖基化酶(ung)基因的活性以增加C-to-T突变的频率。在ung活性未受抑制的菌株中观察到高频率的C-to-A突变，该基因可能是导致C-to-A突变的原因。最后，构建了Ung-nCas9-AID复合物。该复合物实现了高效的C-to-A碱基替换，填补了单碱基基因编辑技术的空白。同样，ung基因也参与C-to-G碱基置换，它们构建了允许高效C-to-G替换的APOBEC-nCas9-Ung复合物。研究人员将这种nCas9-胞苷脱氨酶-ung替换称为糖基化酶碱基编辑器(GBEs)。ABE和CBE都表现出有效的碱基替换，但不会随意实现碱基之间的插入、替换和删除。因此，可能需要一种新的单碱基编辑技术。引导编辑器(prime editor，PE)由两个部分组成，一个来自莫洛尼鼠白血病病毒(M-MLV)的与Cas9n(H840A)融合的逆转录酶(RT)蛋白和一个30bp的sgRNA(pegRNA)，包括一个引物结合位点(PBS)和一个RT模板。Cas9n在到达指定位置后会切割目标DNA链。PBS通过互补碱基配对固定游离3'DNA链，在RT的作用下与RT模板反转录新的DNA链。这种方法实现了碱基之间的任意替换，大大增加了单碱基基因编辑的适用范围，还可以引入碱基插入和缺失。在PE1的基础上通过优化M-MLV RT得到PE2，未编辑链上的碱基必须依赖于DNA修复机制而发生改变。通过剪切未编辑链对上述系统中的BE3进行修饰获得了远高于BE2的突变效率。因此，在改进的PE2中，我们加入了另一个新的sgRNA来切割未编辑的链来得到PE3和PE3b。尽管PE3/PE3b的编辑效率提高了约3倍，但Cas9无法区分这两种不同的sgRNA，这为该编辑系统带来了未知的风险。（图4）RNA链鉴定和裂解的工具。CRISPR/Cas13a是细菌抵御RNA入侵的一种获得性免疫防御机制。与Cas9不同，Cas13a识别RNA链并使用HEPN核酸酶结构域将其切割。在切割目标RNA后，RNase活性保留。显著降低的特异性导致其他非靶RNA发生裂解，这种现象称为侧支裂解（collateral cleavage）。RNA在细胞中具有重要作用，而基于基因功能筛选已经开发出一种相对简单的敲除RNA的方法。RNAi具有良好的敲除效率，但脱靶效应难以避免。基于CRISPR/Cas13a的RNA基因编辑工具发挥了与RNAi相当的作用，但脱靶效率要低得多。与dCas9相似，催化失活的dCas13a携带相应的效应器来调节RNA的功能或翻译，例如通过调节RNA上广泛的m6A甲基化、修饰RNA的碱基和调节蛋白质翻译(图2d)。CRISPR/Cas13a也被广泛用于检测RNA。2017年，张峰及其同事基于Cas13a设计了一种核酸检测工具，称为特异性高灵敏度酶报告解锁(Specific High Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing, 简称SHERLOCK)。他们设计了一种报告分子，当目标单链RNA(ssRNA)断裂时释放荧光信号并将构建的Cas13a、报告分子和crRNA与目标ssRNA共培养，成功观察到荧光;然而，这种方法不太敏感。通过重组酶聚合酶扩增(RPA)来提高Cas13a检测的ssRNA的数量，并通过T7转录本结合以提高基于Cas13a检测的灵敏度。2020年该方法进行了改进并用于SARS-CoV-2检测。2.4递送CRISPR技术的载体利用转染试剂、病毒介导的转染和其他技术，在体外以与普通核酸相同的方式将装载CRISPR/Cas基因编辑系统的质粒或mRNA转染到细胞中。RNP也可以通过电穿孔进入细胞。然而，这些方法大多不适用于动物或人类。CRISPR工具在体内经历了一个漫长的递送过程，包括三个主要阶段:(1)载体必须在血液中保持稳定，不被降解或免疫清除;(2)载体随后在目标组织中积累，并触发细胞内吞作用;(3)CRISPR系统逃逸溶酶体进入细胞质，进行基因组编辑或调节基因表达。特别是在递送的第二阶段，在靶组织中富集是成功递送的关键。这一复杂过程的实现需要多个递送载体的帮助(图5)。图4 单碱基替换工具原理图。a Cas9n与腺苷脱氨酶或胞苷脱氨酶的融合使我们能够在基因组中引入点突变，APOBEC1诱导C to U突变，TadA诱导A to I突变。b PE包含一个30bp的pegRNA片段，包括PBS序列和RT区。PBS与DNA链结合并在含有逆转录酶的情况下合成RT区互补链。PBS代表引物结合位点，RT代表逆转录酶，pegRNA代表引物编辑向导RNA。 图 5用于体内递送CRISPR系统的多种类型载体的示意图。中央区域显示了三种形式的CRISPR作用：pDNA、mRNA和RNP。中间的圆圈部分显示了递送载体的例子，最外面的区域显示了载体是如何生产的或组件。SU代表表面包膜蛋白，TM代表跨膜包膜蛋白。(图是用Adobe Illustrator和Biorender创建的)病毒载体。在以往的研究中，病毒载体通常被用于递送基因药物。AAV是最常用的递送病毒载体之一，因为它很容易跨越物种屏障感染细胞，并且免疫原性很低，从而不太可能触发炎症反应。然而，与普通基因药物相比，CRISPR/Cas9基因编辑系统非常大，超过了AAV载体的最大包装容量（4.7kb）。特别是，当Cas9携带效应蛋白时，需要进行特殊修饰才能将其装入AAV载体，例如使用较小的SaCas9或将递送系统拆分到两个载体。将较小的Cas9同源物SaCas9的编码序列纳入调控盒可以将效应子编码序列作为表观遗传调控因子纳入，从而促进Cas9的调控活性，同时将质粒大小保持在AAV的携带能力内。例如，Himeda等人建立了带有死亡SaCas9(dSaCas9)的CRISPRi系统，并在体外成功抑制了全长DUX4 mRNA(DUX-fl)的表达，减轻了面肩肱型肌营养不良(FSHD)。双AAV载体包括单独设计的编码分离Cas9的质粒以及sgRNA以适应有限的AAV携带能力。在共转染到细胞后，完整的Cas9蛋白和sgRNA生成来调节基因的表达；然而，该方法存在较高的脱靶效应风险。慢病毒是感染分裂和非分裂细胞的逆转录病毒，因此也经常用作递送载体。由于慢病毒的负载能力为10kb，因此整个CRISPR/Cas9系统可以被加载进去，但由于慢病毒随机整合到宿主基因组中使它们经常触发一些免疫反应，甚至导致癌症。杆状病毒(Baculovirus)也被用于CRISPR/Cas9递送。杆状病毒是一种具有超大载量(约38kb)的非致病性昆虫病毒。此外，由于这些病毒既不复制也不整合到基因组中，因此它们没有遗传问题。Nguyen等人将杆状病毒作为dCas9-VP64-p65-Rta(dCas9/VPR)递送载体，在骨髓间充质干细胞(BMSCs)和大鼠脂肪间充质干细胞(rASCs)中显著激活内源性长链非编码RNA(lncRNA)分化拮抗非蛋白编码RNA(DANCR)。基于脂质体的纳米载体。Felgner等人发现了利用脂质体进行基因转染的能力，并在1987年首次报道了阳离子脂质体用于DNA转染。在接下来的几十年里，脂质体经常被用作基因药物传递的载体，而基于脂质体的纳米粒(LNPs)被认为是有前景的CRISPR/Cas9转移工具。与脂质体不同，LNPs没有连续的脂质双分子层和较大的内部水池，但它们主要由天然磷脂、胆固醇和聚乙二醇等脂质成分组成。LNPs的简单合成及其在血清中的稳定存在使其经常适应基因药物的体内递送。遗憾的是，由于肝脏是代谢脂质的主要器官，脂质纳米颗粒总是在肝脏中高度富集。这种靶向性对于递送药物治疗肝脏疾病非常有益，但LNPs对于发生在其他器官的疾病并没有表现出很高的效率。血管生成素样蛋白3(Angptl3)是一种调节血浆脂蛋白水平的酶。Angptl3功能的丧失可降低血液中甘油三酯(TGs)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平而不会引起任何临床风险。Qiu等人设计了多个用于递送靶向Angptl3的Cas9 mRNA和sgRNA的LNP。以组合了胆固醇、DSPC和DMG-PEG的金标准MC-3 LNP作为对照以筛选最高效的306-O12B LNP，其中包含一个主要的尾分支生物可还原类脂质(306-O12B)和一个优化的赋形脂分子混合物。该LNP的基因编辑效率达38.5%，是MC-3LNP的12倍。对LNPs进行修饰以增加其在肝外组织中的富集可能会提高LNPs递送CRISPR/Cas9用于疾病治疗的应用范围。例如，Mohanna等人构建了基于LNP的新型切割递送系统(DS)，该系统在小鼠角膜中检测到广泛的基因组编辑,而Rosenblum等人设计了用于肿瘤细胞的CRISPR-LNPs(sgPLK1-cLNPs)并在体内肿瘤细胞中观察到约80%的基因编辑效率。聚合物纳米颗粒。聚合物纳米粒子具有免疫原性低、生物相容性好、修饰潜力高等优点。PLGA、壳聚糖等常用来构建聚合物纳米粒子壳，提高了细胞对聚合物的摄取效率。核心的PEI常被用作质粒转染（被细胞内吞并触发质子海绵效应进入细胞质）的转染试剂。此外，识别细胞膜表面受体的多肽和在特定pH、ATP和过氧化氢水平下通过分解代谢释放的聚合物被设计在基于聚合物的纳米颗粒壳上。Liu等人构建了用于递送CRISPR-dCas9系统的多级递送纳米颗粒(MDNP)。他们建造了核壳结构。以经苯基硼酸(PBA)修饰的PEI纳米粒形成的阳离子聚合物为核心。然后将该核心与编码dCas9和sgRNA的质粒融合。使用2,3-二甲基马来酸酐(DMMA)修饰的聚(乙二醇)-b-12聚赖氨酸(mPEG113-b-PLys100/DMMA)作为包裹上述阳离子聚合物的外壳使纳米粒子在不同阶段表现出不同的表面性质。纳米粒子通过尾静脉注入血液，由于壳表面聚乙二醇化修饰而带负电荷，纳米粒子在血液中稳定。肿瘤组织具有酸性微环境(pH6.5)，其中聚合物壳迅速解离，聚合物的核心由于癌细胞表面较高的唾液酸化水平而暴露。核心的PBA部分与唾液酸结合，增强肿瘤细胞的内吞作用。在癌细胞中，多聚体核心中的PEI通过质子海绵效应从溶酶体逃逸，导致溶酶体中的水分子和氯离子向内流动，质粒DNA(pDNA)成功进入癌细胞的细胞质。MDNP通过多次改变表面化学成分来克服生理屏障，最终有效地进入肿瘤细胞。改变携带MDNP的质粒将使其成为一种治疗癌症的新技术。双锁纳米颗粒(DLNP)是开发MDNP的同一团队报道的另一种聚合物粒子。DLNPs具有靶向肿瘤细胞中PD-L1的CRISPR/Cas13a核心。Cas13a进入肿瘤细胞，并在特异性识别PD-L1 mRNA后被激活。活化的Cas13a非特异性切割RNA并触发肿瘤细胞凋亡。肿瘤微环境具有许多典型特征，微酸性环境可作为聚合物基纳米粒子鉴别肿瘤的标志物。此外，活性氧(reactive oxygen species, ROS)在肿瘤环境中的水平也高于正常组织，而ROS还促进细胞DNA突变和肿瘤发生。作者设计了一种仅在特定ROS和pH条件下分解的响应壳，以最大限度地减少由于DLNP脱靶而对其他器官细胞造成的不可逆损伤。当DLNPs通过血流进入体内后，由于其表面存在聚乙二醇，因此可以免受免疫清除。当DLNPs通过血液到达肿瘤时，肿瘤内的微酸性环境和高ROS浓度驱动DLNP外壳崩解，暴露PEI/Cas13a复合物的聚合物核心。最终，核心被肿瘤细胞内化并通过质子海绵效应释放到细胞质中。CRISPR/dCas9系统在再生医学中的应用是目前研究的热点。在纳米纤维上制备了一层一层自组装肽(SAP)涂层，并用于递送CRISPR-dCas9系统以促进大鼠神经元的轴突生长。聚己内酯(PCL)具有几个优点使其成为递送CRISPR-dCas9系统的理想材料，包括良好的稳定性、易于处理、良好的生物相容性和生物降解能力。然而，受贻贝粘附化学启发的实验表明PCL不容易粘附到细胞。Zhang等利用一层带负电荷的两亲性SAP开发了一种新的PCL附着方法，编码CRISPRa系统和SAP-RGD的pDNA通过静电相互作用被吸收。RGD多态性支持细胞黏附和增殖，有效解决PCL黏附缺陷。SAP对许多其他生物肽具有良好的亲和力，将SAP涂层附着在PCL上有望成为体内靶向递送CRISPR/Cas9的惯用策略。天然和功能化的外泌体。外泌体是起源于细胞器内多泡体(multivesicular bodies, MVBs)的直径为30 ~ 100nm的膜结合囊泡。在活体组织中，外泌体是蛋白质、脂质、核酸和其他细胞内因子在细胞间转移的介质，几乎携带任何生物成分(包括质粒)，且副作用很小。由于外泌体还直接包装sgRNA和Cas9，从而有效降低了转运过程中脱靶副作用的风险，因此它们是CRISPR/ dCas9系统递送的一个很有前景的载体。此外，由于外泌体保留了反映亲本细胞的蛋白质和脂质，因此它们优先与亲本细胞类型相互作用和融合。肝星状细胞(Hepatic stellate cells, HSCs)分泌大量外泌体，这些永生化细胞分泌的外泌体彼此之间差异较小，更具有可操作性。RNP通过电穿孔包装在外泌体中，获得基因组编辑系统exosomeRNP。Wan等人设计了靶向p53上调凋亡调节因子(PUMA)、细胞周期蛋白E1(CcnE1)和K(赖氨酸)乙酰转移酶5(KAT5)的sgRNA并与cas9结合构建了RNP（这些因子/蛋白/酶在肝脏疾病的发生发展中起重要作用）。检测发现这三个基因的表达均显著降低。ExosomeRNP在肝脏中高度富集，是靶向治疗肝硬化、肝纤维化等肝脏疾病的理想载体。尽管如此，仍需要人工修饰来增强外泌体载体对某些外泌体分泌较低的细胞类型的靶向能力。为了提高dCas9/VPR的递送效率和精确度，我们开发了利用设计的细胞外囊泡(GEDEX)进行基因组编辑的方法。肝星状细胞(HSCs)转化为肌成纤维细胞(MFBs)是肝纤维化形成的重要标志。内源性肝细胞中生长因子表达上调可有效修复小鼠肝损伤。GEDEX类似于天然存在的外泌体，因此可以通过修饰来靶向体内广泛的细胞，突出了其未来临床应用的巨大潜力。Li等人通过将CD9的C末端与人抗原R(human antigen R, HuR)融合构建了一种新型外泌体提高外泌体的包封能力。dCas9 mRNA的长度增加了使用电穿孔等方法在外泌体中封装分子的难度，而这种新型外泌体上的HuR识别基序有助于dCas9装载，从而在靶向递送CRISPR/dCas9系统治疗疾病方面显示出重要的前景。外泌体是内源性递送载体。由于它们的组成与细胞膜相似，因此受到的阻碍较小，因此与病毒载体、脂质纳米载体和多晶型纳米载体相比，它们在货物递送过程中不太可能被免疫系统清除。金纳米粒子递送系统。金纳米颗粒可以定制尺寸，不同的尺寸具有不同的物理化学性质。其中最典型的特征之一是，金纳米粒子(AuNPs)的表面电子按照由NP大小决定的频率共振，这种现象在科学界被称为表面等离子体共振。表面等离子体共振是金纳米粒子最重要的应用，用于制备各种可以用肉眼观察到的低成本传感器。此外，金纳米颗粒具有良好的稳定性和生物相容性，并且易于添加表面修饰，这使其成为递送基因药物的理想载体。在肿瘤等疾病的治疗中，例如，AuNPs的表面可以用特定的癌细胞配体进行修饰，以增强其对癌组织的识别。此外，金纳米颗粒本身具有抗炎、抗菌的特性，有利于肿瘤的治疗。Wang等人将稳定性好、载药率高的脂质纳米粒与体外可控释放的AuNPs结合。构建一种脂质包裹的AuNP/Cas9-sgPlk-1质粒(LACP)靶向递送至黑色素瘤荷瘤部位。首先，作者制备了直径为~20nm的AuNPs并将其附着在TAT肽上，增加了细胞对NPs的摄取。AuNPs通过与带负电荷的pDNA的静电相互作用形成聚合物的核心，最后用阳离子脂质体包裹核心，再用PEG2000-DSPE修饰形成LACP。脂质壳稳定了LACP结构并增强细胞内化。TAT指导核靶向，而AuNP核心作为载体和光热条件下释放pDNA的响应器。仿生纳米材料。纳米材料在循环中的稳定存在及其在体内特定位点富集的能力可增强CRISPR基因编辑药物的治疗效果。然而，精心设计的有机或无机载体不可避免地会被体内的免疫系统部分清除。研究人员对使用来自生物体本身的材料展现出广泛的兴趣，这种材料是一种生物膜，充当细胞包膜内容物的“口袋”，以防止被免疫系统识别。当疾病发生时，免疫细胞通常会被触发进入疾病部位并发挥抗炎作用。纳米材料被这些细胞的细胞膜装载不仅阻止了可能的免疫清除，而且增强了基因药物在疾病部位的富集。Yan等人将阳离子聚合物聚(β-氨基酯)(PBAE)与编码CRISPR系统的质粒组成的复合物作为核心，并用巨噬细胞膜包裹PBAE/pDNA复合物。最后，将ROS响应元件(BAM-TK-TMP)融合到细胞膜外表面。在这种生物纳米材料中，巨噬细胞膜靶向炎症病变，而TMP识别高水平的ROS以促进纳米颗粒的细胞内吞行为。TMP可作为对多种病理或生理条件作出反应的效应物而量身定制。体内疾病的发生涉及多种基因、生化特性和微环境的改变。这一复杂的机制给药物递送载体带来了极大的困难，因此LNPs、金纳米颗粒和生物纳米材料各有其优势和局限性。此外，各种纳米载体可以连接在一起，复合纳米粒子的构建可以利用载体的不同优势，提高递送效率。例如，Zhang等人将基于(PEG-b-PLGA;PP)的纳米粒子与PEI融合得到复合脂质和聚合物纳米粒子:PP/PEI。PP/PEI可防止脂质纳米颗粒在肝脏中的富集增加，并可在单次给药后的成年小鼠的肺、心脏和血管中进行高效的基因组编辑。在后续研究中，研究人员还发现聚乙二醇化纳米颗粒具有抑制基因药物在单个器官聚集的能力，并增加体内循环的持续时间。此外，上述递送载体LACP也是一种由脂质体和AuNPs组成的复合纳米颗粒。综上所述，合理利用各种纳米颗粒的优势来设计纳米载体结构，有利于将几种优秀的基因药物递送平台单独结合起来，从而提高基因药物的递送效率，有助于优化基因药物的治疗效果(表3)。03基因编辑工具的应用在前面的章节中，我们总结了涉及CRISPR系统的各种改变基因组的基因编辑方法，并总结了可用于体内或体外递送CRISPR工具的载体，包括对这些载体的特征、改进方案和适用性的一些简要描述。其次，我们从疾病的角度分析了某些疾病发病时疾病微环境的改变或病变细胞的显著特征。本文总结了针对不同类型疾病具有靶向递送载体的最有前景的CRISPR基因编辑工具，以促进后续研究。3.1治疗疾病的尝试癌症。癌症是一种发病率和死亡率都很高的疾病，其标准治疗方法是手术切除、放疗和化疗;但后两种治疗方法均有严重的副作用。癌症的发展过程通常伴随着大量基因的异常表达，如P53、Notch、PD-L1等。此外，肿瘤发生的微环境也表现出一些异常变化。这些特性被用来构建可以在特定的环境中释放的纳米颗粒，并有效地将基因药物递送到肿瘤细胞。在肿瘤细胞中，使用CRISPR技术可以使异常表达的基因沉默或过表达(图6b)图6 将CRISPR/Cas9系统用于治疗癌症、肝纤维化、肥胖和心血管疾病。a APACPs、外泌体、PICASSO和CHO-PEGA静脉注射到小鼠体内，AAV9腹腔注射。b APACPs通过血液循环转运到肿瘤组织，低氧条件促进APACPs进入肿瘤细胞。NPs释放RNPs，沉默hsp90α的表达，降低肿瘤细胞的热耐受。外用近红外诱导的光热疗法杀灭肿瘤细胞。PICASSO对肿瘤细胞膜上的MMP-2做出反应，外壳解体，核心通过内吞作用进入细胞。质粒通过质子海绵效应从溶酶体逃逸到细胞质中。c AAV9将靶向Mef2d和klf15的sgRNA递送至dCas9-VPR转基因小鼠。d Cas9-VPR与MYh6协同转录，从而特异性激活心肌细胞中Mef2d和klf15的表达。脂质纳米颗粒CHO-PEGA将CRISPR/Cas9递送到主动脉缩窄的血管平滑肌细胞以敲除Fbn1。d脂肪细胞靶向序列9-聚精氨酸(ATS-9R)识别在脂肪组织中高表达的禁用元件，将质粒递送到含有巨大脂滴和大量甘油三酯和胆固醇的白色脂肪细胞中，并释放大量炎症因子。干扰脂肪酸结合蛋白4(Fabp4)的表达后，白色脂肪细胞内脂滴大小减小，抑制炎症因子的释放，从而达到治疗肥胖的目的。e提取lx -2细胞分泌的外泌体，通过电穿孔将RNPs装载到外泌体中。在靶向敲低PUMA、CcnE1和KAT5的研究中，外泌体可有效缓解肝纤维化等肝脏疾病。体外将编码sgRNA和dCas9/ vp64的质粒转染小鼠肝脏aml12细胞，产生携带CRISPR/dCas9系统的aml12外泌体。这些外泌体递送到hsc后，hnf4α的表达升高，并促进细胞向肝细胞分化。细胞快速增殖是癌症发展的一个显著特征，这一过程需要消耗大量的氧，使肿瘤处于缺氧微环境中。光热疗法的定义是将红外光响应性纳米材料递送到机体，并在体外施加红外光以在机体内产生局部热并消融肿瘤。然而，肿瘤可耐受高达50℃的高温，这可能导致癌旁组织的损伤。因此，降低肿瘤细胞对温度的耐受性，并在中低温下使用光热治疗可能有效地阻碍肿瘤的发展。通过筛选获得了与细胞热耐受相关且在肿瘤细胞中过表达的热休克蛋白90α(HSP90α)。Li等人基于金纳米棒构建了一种缺氧响应型纳米颗粒，该纳米颗粒携带CRISPR/Cas9系统，以靶向HSP90α进行敲除。在载体进入肿瘤细胞后，Cas9/sgRNA RNP释放到细胞中沉默HSP90α，导致细胞失去热耐受。最后，红外光激活金纳米棒来消融肿瘤。T淋巴细胞在肿瘤免疫治疗中发挥着重要作用。T细胞膜表面的T细胞受体(TCR)可识别与MHC分子结合的多肽或抗原，从而识别和杀灭肿瘤细胞。例如，骨髓瘤、黑色素瘤和肉瘤细胞的表面含有NY-ESO-1作为与MHC分子结合的抗原。然而，T细胞中的治疗性TCRα和β链与内源性TCR链(TRAC和TRAB)之间的不匹配降低了表面TCR的表达。此外，一项研究发现，来自PD-1缺陷小鼠的T细胞具有更强的抗癌能力。随后，我们利用CRISPR在体外敲除TRAC、TRAB和PD-1(如PDCD1)的编码基因，以提高工程T细胞的安全性和疗效。这种被称为TCR-T疗法的治疗策略显著抑制了血液系统肿瘤和实体肿瘤的生长。此外，另一项研究修饰T细胞治疗肿瘤，称为CAR-T细胞。将靶向CAR基因的CD19插入T细胞可杀死肿瘤细胞，但实验已表明对实体瘤无效。TCR-T细胞和CAR-T细胞都已被FDA认可，并证实在临床试验中安全有效。肿瘤组织或细胞的其他特征也具有应用于靶向药物识别的潜力，如膜表面受体、肿瘤微环境、经过特异性修饰的蛋白质等。肝脏疾病。肝脏是体内代谢脂质的主要器官，未经特殊修饰的脂质体和脂质纳米颗粒更容易在肝脏中富集。此外，肝脏中的许多细胞分泌大量外泌体，这些具有同源组织靶向能力的肝细胞源外泌体将更容易在肝脏中富集。与人工合成的脂质纳米颗粒不同，这些天然产生的外泌体最初是蛋白质、核酸和其他分子在细胞间递送的载体。因此，天然的外泌体非常安全，很少被免疫系统清除(图6e)。肝脏中各种类型的细胞产生或摄取外泌体。因此，由于肝星状细胞来源的外泌体参与建立肝纤维化，肝细胞来源的外泌体可能携带治疗药物递送至肝星状细胞。因此，小鼠肝脏AML12细胞系来源的内源性肝脏外泌体作为载体更安全、更有效。将CRISPR-dCas9-VP64系统包裹到AML12来源的外泌体中，成功激活了肝星状细胞和肝纤维化小鼠模型中肝细胞核因子4α(HNF4α)的表达，从而显著减轻肝纤维化。HNF4α是肝细胞分化的转录调节因子。在另一项治疗肝纤维化的实验中，Luo等人将表达dCas/VP64和sgRNA的质粒转染到小鼠肝细胞系AML12中。在外泌体中检测到dCas9的存在，表明具有转录活性的RNPs可以负载在外泌体中。苯丙酮尿症(Phenylketonuria, PKU)是一种常染色体隐性遗传的肝脏疾病，苯丙氨酸羟化酶(phenylalanine hydroxylase, PAH)缺乏导致苯丙氨酸代谢降低，引起高苯丙氨酸血症。使用将C-G碱基对转换为T-A碱基对的单碱基编辑器对突变碱基进行修复可恢复PAH表达，并提高血液中已降低的苯丙氨酸水平。Villiger等将携带单碱基基因编辑器的AAV递送至Pahenu2小鼠模型并使得63%的mRNA具有校正的碱基序列，这一结果证实了该基因编辑系统治疗PKU的有效性。乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)严重威胁人们的健康，长期使用干扰素等药物治疗可能导致病毒耐药性显著增加。此外，这些治疗不能清除HBV共价闭合环状DNA(cccDNA)，使用Cas9靶向破坏cccDNA是治疗HBV的有效方法。Wang等人设计了一种红外光响应型纳米粒子，用于将CRISPR/Cas9系统递送到HBV感染细胞。该递送系统能有效灭活HBV cccDNA。基于CRISPR的编辑技术在多种肝脏疾病的治疗中显示出显著的疗效，是未来治疗这些疾病的有效策略。心血管疾病。心血管疾病是人类死亡的主要原因之一。常见的心血管疾病包括动脉粥样硬化、心肌肥厚、心脏病发作和主动脉夹层。然而，与肿瘤和肝脏疾病不同，心脏和血管中的血流更快，血压更大，这给病变部位的纳米颗粒富集带来了挑战 (图6c)。在胎儿发育过程中，心肌细胞数量迅速扩张，而随着年龄的增长，心肌细胞逐渐失去增殖能力。尽管已经在许多哺乳动物中获得了心肌细胞再生的证据，但逆转心肌病导致的心肌细胞丢失是不够的。恢复成年动物心肌细胞中与心肌细胞增殖相关的基因，如肌细胞增强因子2d(Mef2d)和Krüppel样因子15(Klf15)的表达可能对治愈心肌细胞相关疾病有积极作用。将CRISPRa系统直接递送至心肌细胞相对困难，也可能导致广泛的脱靶效应。Schoger等首先构建了dCas9/VPR转基因小鼠，该序列插入到肌球蛋白重链(Myh) 6启动子后，并与Myh6协同转录。由于Myh6是心肌细胞特异性基因，因此dCas9/VPR系统只在心肌细胞中表达。随后注射携带sgRNA的AAV9可激活细胞中心肌细胞增殖相关基因的转录。利用该方法获得了心肌细胞特异性表达激活系统，并控制了转录激活的时间，为心血管研究或难以直接获取的其他器官或组织的研究提供了重要参考。主动脉疾病的发生发展通常伴随着血管内皮细胞的炎症反应和血管中胚层平滑肌细胞的表型转化。Zhang等构建了一种能够将CRISPR/Cas9递送至血管平滑肌细胞的富含羟基的脂质纳米颗粒。在另一项研究中，Zhao等将脂质纳米粒子和聚合物纳米粒子结合起来，构建了内皮细胞的递送载体。尽管基于CRISPR的基因药物已成功递送至VSMCs和内皮细胞，但纳米颗粒仍被肝脏大量摄取。此外，CRISPR/Cas9技术还被广泛用于骨再生以及CFTR、阿尔茨海默病、肥胖等疾病的治疗(图6d)。3.2FDA批准的临床治疗和诊断工具SARS-CoV-2检测。冠状病毒可在人类中引起危及生命的呼吸道感染，在21世纪已引起三次疫情:严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)、中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)和至今未被击败的SARS-CoV-2。然而，高致病性并不是人类要克服的最大困难。人类对SARS-CoV-2的易感性、容易传播以及较长的潜伏期使该病毒难以根除。因此，开发可快速检测SARS-CoV-2患者的检测法比治疗更重要。RT-PCR技术是一种专为RNA检测而开发的PCR方法，方便可靠，是目前检测的金标准。然而，这种检测需要一个严格、高水平的检测平台，这限制了可被检测的人数。抗原抗体检测法也已用于SARS-CoV-2检测，但成本高，不适合大规模应用。因此，必须开发一种新的不需要仪器平台的低成本方法。SHERLOCK是张峰等人之前基于Cas13a构建的RNA检测工具。然而，SHERLOCK检测依赖于RNA提取和液体处理的多个步骤，如果操作不当，很容易导致交叉污染甚至是检测人员的感染。基于SHERLOCK改进的STOP(SHERLOCK testing in one pot)方法简化了检测方法，使用等温扩增(LAMP)提高了检测病毒的灵敏度。LAMP的工作温度为55 - 70℃，因此来自嗜酸环孢杆菌的耐热Cas12b (AapCas12b)成为stop的首选蛋白。研究者随后采用磁珠纯化的方法获取RNA，并将收集的样本浓缩到STOPCovid反应混合物中，通过直接使用磁珠吸附RNA进一步缩短了检测时间。最后,STOPCovid.v2是基于CRISPR技术开发的SARS-CoV-2检测方案。在临床检测中，该方法的灵敏度为93.1%，特异度为98.5%，均高于RT-PCR。STOPCovid.v2是一个显著的突破，它只需要几个简单的仪器来进行检测，结果很容易通过试纸来区分。它可能成为人类战胜新型SARS-CoV-2的一把“利剑”。镰状细胞病和β地中海贫血。镰状细胞病(SCD)和输血依赖型β地中海贫血(TDT)均由血红蛋白β亚单位基因突变引起，是全球最常见的单基因遗传病之一。镰状细胞病的特征是血红蛋白链失衡和溶血性贫血，通常通过输血和铁螯合治疗来治疗。β-地中海贫血患者的镰状红细胞携带的氧气较少，通常会疼痛，因此他们通常在临床上接受羟基脲、止痛药和输血治疗。骨髓移植也被用于治疗这两种疾病，但匹配困难。当从基因水平研究这两种血液病的发病机制时，转录因子BCL11A被确定为胎儿血红蛋白和γ-珠蛋白表达的抑制因子，保持这两种蛋白的高水平表达可缓解镰状细胞病和β-地中海贫血的症状。2019年，Wu等利用CRISPR/Cas9切割HSCs中的BCL11A增强子序列成功下调其表达且未引起明显副作用。2020年12月，一种名为CTX001的基因疗法发布了临床数据，它是CRISPR Therapeutics与Vertex pharmaceuticals联合开发的用于SCD和TDT的一次性疗法。这项临床试验使用Cas9切割造血干细胞和祖细胞(HSPCs)中的BCL11A增强子区域，使其失去增强子活性。该技术降低了BCL11A的表达，恢复了γ-血红蛋白和胎儿血红蛋白的产生。随后，研究人员将编辑后的HSPCs移植到患SCD和TDT的两例患者体内。随访研究发现，注射后12个月，两例患者的胎儿血红蛋白水平均显著升高。在18个月和15个月后的最后一次随访中，2例患者的胎儿血红蛋白水平均达到正常。随后8例患者的治疗结果与前2例患者相似，表明该策略具有普遍适用性和有效性。然而这种方法并不是绝对无害的，因为初始患者都经历了不同程度的不良反应，但没有危及生命，并在治疗后消退。在另一项治疗SCD的临床研究中，我们使用了RNAi敲除BCL11A的方法。他们构建了携带短发卡结构RNA(shRNA)的慢病毒载体，并使用该慢病毒转导SCD患者的CD34+细胞，也获得了临床成功。转体基因淀粉样变。转甲状腺素蛋白(TTR)淀粉样变性是一种常染色体显性遗传病，主要由细胞周围的淀粉样原纤维沉积引起，威胁人类的神经系统和心脏。在正常状态下，TTR单体在肝脏中合成，形成参与甲状腺激素运输的四聚体复合物。突变型TTR不能稳定四聚体结构，并且在重组成淀粉样原纤维之前解离。然而，TTR淀粉样变患者并未表现出明显的甲状腺激素缺乏症状，提示TTR可能不是甲状腺激素的主要载体，降低TTR的表达可能是治疗该病的一种可能的方法。主要的临床治疗方案是肝移植和使用小分子氯苯唑酸（Tafamidis）稳定四聚体;但是，后者并不是一种稳定和有效的方法。FDA还批准了siRNA药物帕蒂西兰（Patisiran）用于治疗这种疾病。Patisiran阻断TTR的翻译以减缓疾病进程，但在患者的一生中需要反复注射。由于TTR低表达没有显著的副作用，因此采用永久性消除突变的TTR基因的方法可能能够根除TTR淀粉样变性。2021年6月，Gillmore等报告了体内递送名为NTLA-2001的基于CRISPR的基因编辑药物的临床试验结果。NTLA-2001由包裹针对TTR基因和SpCas9 mRNA的sgRNA的靶向肝脏的LNP组成。这种LNP已多次用于携带基因药物到肝脏。在动物模型的初步实验中，NTLA-2001显示出有效的永久性敲除。本试验共选取6例患者进行治疗，所有患者均接受药物注射治疗，治疗过程中无不良反应发生。用药第7天，患者血液指标和肝功能指标均在正常范围内。为了确定NTLA-2001的疗效，3例患者接受了0.1 mg/kg的剂量，另外3例接受了0.3 mg/kg的剂量。在第28天，3例接受小剂量治疗的患者血中TTR浓度下降了47%、52%和56%，3例接受大剂量治疗的患者血中TTR浓度下降了80%、84%和96%。这一发现表明NTLA-2001的疗效是剂量依赖性的，并且非常成功。几个月后，FDA将该方法认定为孤儿药，这不仅承认NTLA-2001，而且承认基于CRISPR的基因疗法的体内递送。其他。2019年，Maeder等开发了一种基因组编辑疗法(EDIT-101)，用于治疗Leber先天性黑蒙10型(LCA10)。他们使用负载靶向saCas9和CEP290突变内含子的sgRNA的AAV5载体，通过视网膜下注射将这一基因编辑系统递送到光感受器细胞中，从而删除或灭活突变内含子，并恢复CEP290的正常表达。EDIT-101于2020年3月完成首次临床给药。同年9月，EDIT-101的临床结果显示，在接受不同剂量的两组中，中剂量组的治疗效果较明显，但低剂量组的治疗效果较差。幸运的是，没有患者出现任何严重的不良反应。人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus, HIV)是一种逆转录病毒，感染后会整合到宿主基因组中并随之复制。抗逆转录病毒治疗(ART)在抑制HIV复制和改善免疫功能方面显示出良好的效果，但ART只能控制HIV的进展。要彻底治愈HIV感染，必须从人类基因组中去除HIV基因组。2020年，Mancuso等报道了在非人灵长类动物中使用AAV递送CRISPR/Cas9治疗HIV的研究结果，结果表明这是一种可行的策略。2021年9月，FDA批准了一种基于CRISPR基因编辑技术的治疗HIV感染的疗法(EBT-101)。此外，2022年8月，FDA批准了CRISPR疗法CRD-TMH-001用于治疗杜氏肌营养不良(DMD)的临床申请。总之，这些结果表明，构建高效、安全、稳定的靶向载体将CRISPR-Cas9系统递送到体内是一种有希望的治疗疾病的新方法。因此，已经设计和制造了一些递送工具根据疾病的具体特征有针对性地运送到疾病部位。这些药物显示出良好的载药量和良好的临床转化前景。未来的研究方向包括根据疾病类型改进载体靶向和设计更高效的CRISPR基因编辑系统(图7)。图7 FDA批准的可用于临床治疗的CRISPR疗法汇总表。正文包括FDA批准的日期、治疗的名称和应用疾病的类型。DMD Duchenne代表肌营养不良，SCD代表镰状细胞病，TDT代表输血依赖型β地中海贫血，LCA10代表Leber先天性黑蒙10型，TTR代表转甲状腺素蛋白04局限性和挑战将CRISPR/Cas基因药物靶向递送到体内具有在实验室和临床治疗疾病的潜力。其高特异性、有效性和易于操作的优点使其成为未来最受欢迎的技术之一。然而，研究人员在使用CRISPR技术编辑基因时发现了一些意想不到的情况。4.1CRISPR/Cas9的局限性脱靶效应。sgRNA与非靶序列的碱基错配可能导致脱靶效应。在修复一个错误时引入一个甚至多个未知突变显然是不可接受的。当sgRNA与DNA链结合时，PAM近端的种子序列严格按照碱基互补配对与目标链结合。当错配发生时，远端3-5个碱基有时并不像想象的那样分离，而是在强作用力下形成不寻常的双链构象。这种导致错配的机制可能源于细菌的进化，目的是对抗入侵噬菌体的突变。全基因组测序和GUIDE-Seq等方法已被开发用于检测脱靶效应的发生。Cas9在大量细胞中的持续表达增加了脱靶效应的可能性，而控制Cas9激活可能减少脱靶效应的发生(表2)。解决这一问题的关键是提高sgRNA的特异性，并在发生错配时将其与DNA链分离。Cas9的REC3结构域对于感知PAM远端产生的错配至关重要，研究人员通过对REC3结构域进行突变来检测哪些变异可能提高Cas9的准确性。然而，突变的REC3与PAM-远端双链的相互作用减弱，降低了Cas9的效率。Bravo等发现碱基18-20的错配会形成Ruv环结构，从而稳定错配形成。他们突变了所有参与稳定的残基，并获得了Cas9变异体(SuperFi-Cas9)，其在sgRNA的第18-20个碱基错配处的DNA双螺旋的切割效率降低了500倍，而不影响sgRNA介导的具有完全互补碱基的双链切割。在sgRNA中添加一个特定的结构片段以增加其特异性也是可行的。Kocak等在sgRNA的5'端设计了一段发夹结构;这种结构降低了错误匹配过程中的能量，并防止了错误匹配发生时R-loop的形成。R-loop是Cas9激活所必需的，因此这种结构也可以防止在错误匹配情况下发生DNA双螺旋裂解。总之，脱靶效应是基于CRISPR的基因编辑技术广泛应用的最大障碍，使用Cas9修饰sgRNA使其更特异可能预防未知突变的发生。有效性。当携带激活或抑制结构域的CRISPR/dCas9被用于调控基因表达时，基因的上调或敲除可能不足以达到治疗效果。CRISPRa系统分为两个部分:发挥靶向作用的sgRNA/Cas9复合物和增强转录的激活结构域。一般而言，在进行基因编辑时只会设计一个靶向靶点的sgRNA。Maeder等将sgRNA设计在靶基因转录起始位点附近的4个位置，以获得更高的基因激活效率。多个sgRNA的转录激活效率具有一定的协同作用，且sgRNA数量越多，转录激活效率越高。此外，sgRNA在每个位置的转录激活效率并不相同，但与细胞和基因密切相关。初始的转录激活结构域是由4个转录的VP16复合体形成的VP64或p65激活结构域，该结构的激活作用不强。Tanenbaum等构建了一个合成系统，该系统的结构组成包含一条多肽链，该多肽链可以组建多达24个拷贝的蛋白质，以获得更高的激活效率。该结构被用于组建多个拷贝的VP64，以形成dCas9-SunTag-VP64转录激活系统。在对细胞周期抑制因子细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1B(CDKN1B)激活的研究中，dCas9/VP64不影响细胞周期进程，而携带dCas9- SunTag-VP64的相同sgRNA显著抑制细胞周期进程并降低细胞生长。VP64、p65和Rta已被报道具有激活转录的能力。Chavez等以dCas9/VP64为骨架，加入p65和Rta构建转录复合体dCas9-VP64-p65-Rta(dCas9/VPR)作为转录激活系统。dCas9/VPR结构简单、效率高，是靶向递送CRISPRa最常用的激活系统之一。其他的转录激活系统，如dCas9/SAM、dCas9/SPH和dCas9/VP192，也能够显著提高基因激活的效率。基因的激活或抑制与许多条件相关，如sgRNA的位置、效应结构域的选择、细胞类型和靶标基因(表4)。适用性。理论上，CRISPR/Cas9可以靶向基因组中的任何位置，但仅限于PAM序列，这阻止了Cas9到达某些位置。特别是，当使用碱基编辑工具CBEs或ABEs时，被编辑的碱基位于PAM位点的特定相对位置，如果没有合适的PAM位点，CBEs或ABEs可能无法执行碱基更改功能。研究人员努力对Cas9进行修饰，以确保其不局限于PAM，并且他们已经获得了Cas9的多种变异体，这些变异体不局限于通过突变Cas9位点或添加经过修饰的结构域来识别NNG(表1)。Walton等突变了Cas9的多个氨基酸位点获得了几乎不受PAM限制的SpCas9变异体(SpRY)。他们首先构建了一个富含嘌呤的PAM位点，SpRY能够在PAM为NRN(R为A或G)的位点上实现部分基因编辑，而编辑效率并不低于野生型SpCas9。接下来，他们构建了嘧啶富集的PAM位点，在此之前，几乎所有的Cas9变异体都不能识别C或T富集的位点，并且SpRY对所构建的31个位点中的13个发挥了基因编辑作用。虽然SpRY仍然表现出对G富集PAM位点的更强的侧重，但使用携带碱基编辑效应的SpRY靶向嘧啶富集PAM位点也促进了高效的碱基替换。不受PAM限制的SpRY更容易发生脱靶效应。之前报道的Cas9-HF变异体可有效避免脱靶效应，而在突变相同位点后，SpRY-HF1可消除几乎所有脱靶效应。通过对脑膜炎奈瑟菌Cas9变异株Nme2Cas9进行修饰使其能够识别更多种类的PAM序列是一种有前景的方法。与SpCas9相比，Nme2Cas9更小，靶向递送的潜力更大，而且Nme2Cas9在哺乳动物细胞中也具有很强的基因编辑活性。研究人员建立了一个新的选择平台，以筛选识别单个特定碱基的Nme2Cas9变异体。最后筛选产生了4种可靠的变体:eNme2-C和eNme2-C.NR, eNme2-T.1和eNme2-T.2。与SpRY相比，这些变异不仅不依赖于PAM，而且体积更小。除了eNme2-C.NR，其他3种突变均表现出更强或相似的基因编辑效率和更少的脱靶效应。综上所述，将Cas9从PAM位点的限制中解放出来，可以满足单碱基编辑、双链靶向切割等方法的需要，对于治疗单基因突变引起的疾病具有重要意义。染色体解体。基于CRISPR的基因编辑技术的安全性是研究者关注的关键话题。通常Cas9对双链DNA的切割会触发NHEJ修复，而这些修复后的DNA链通常会缺失一些碱基对或增加一些碱基对，这是预期的结果。然而，在验证编辑效率时，研究者发现有时会发生大量碱基缺失和染色体结构易位。这些错误可能导致诸如恶性肿瘤等疾病，虽然发生的概率很低，但在临床应用中显然是不可接受的。CRISPR/Cas9对靶基因的重复切割是导致染色体易位和缺失的重要原因之一。Yin等将核酸外切酶结构域与Cas9结合以减少这些突变的发生。这种结构在切割完成后立即进行端面加工，减少了生产完整端面的可能性。这种方法有效地防止了DNA链的完全修复，从而引发Cas9对基因组的多次切割。通过将spCas9与优化的TREX2融合构建Cas9核酸外切酶(Cas9TX)。在对经过改造的T细胞和其他细胞进行的实验中，Cas9TX能够显著抑制相对于高保真SpCas9变异体的染色体易位。4.2靶向输送的局限性偏离预期位置。病毒和非病毒载体通常通过全身给药的方式递送给动物，这些载体使CRISPR基因药物对血液和组织降解产生免疫。然而，未经修饰的载体容易被体内的代谢器官捕获。CRISPR/Cas系统在进入非靶细胞时不会失去活性，但会对健康细胞进行遗传修饰，这可能导致不可预测的后果。为了减少基因药物进入非靶细胞，需要改进递送载体。改善递送功能的方法包括用生物膜覆盖载体或添加可被靶细胞受体识别的肽。根据靶器官微环境设计环境响应性纳米颗粒可增强基因药物富集，如pH、活性氧(ROS)和三磷酸腺苷(ATP)水平的变化。纳米材料外壳在特定环境中分解而暴露出核心，然后核心通过内吞作用进入细胞。然而，当某些病变组织的微环境与其他组织的微环境无明显差异时，构建一种由多种条件诱导释放其内含物的纳米颗粒是一种可行的疾病特异性靶向方法。此外，已经开发了光、磁和超声响应的CRISPR/Cas9递送系统，以支持精确递送。当用于治疗人体疾病时，通过原位注射给药可防止药物随血流输送到全身。调控靶基因的表达可能需要更温和的CRISPR或CRISPRi方法，而基于CRISPR/dCas9的转录调控系统所施加的变化与改变基因组序列沉默基因相比是可逆的。生物相容性。必须为候选细胞构建合适的载体以减少CRISPR/Cas9系统脱靶引起不良反应的可能性。从进入细胞到发挥作用的复杂过程要求载体必须具有生物相容性，具有较高的包封能力，并能够穿越细胞膜。在设计递送体系时，还必须考虑由于将材料递送到体内而产生的免疫应答。据报道，来源于化脓性链球菌和金黄色葡萄球菌的常用Cas9蛋白可触发人类的免疫应答。为了克服这一挑战，我们通过AAV建立了一种响应型的改良Cas9缺失外显子的递送方法，从而有效地避免了幼年和成年小鼠的体液和细胞免疫应答。此外，经过修饰的Cas9也必须在载体中递送，以避免触发宿主免疫应答。在体内，病毒、脂质和外泌体可有效避免免疫清除，而合成的化学纳米颗粒需要在表面涂有保护性涂层，例如修饰PEG可使聚合物在血液环境中稳定，或者包含修饰的CD47蛋白。此外，由于植物外泌体是纯天然的，它们更有可能逃脱免疫系统的检测。由于植物和哺乳动物病原体之间的巨大差异，使用植物外泌体递送CRISPR/ dCas9系统也更容易被接受。然而，利用植物外泌体递送基因药物的研究尚不成熟，尤其是许多植物产生的外泌体具有不同的特性。总体而言，为了促进基因药物在临床中的靶向递送，需要开发具有低免疫原性的递送载体，以及带有有效阻止载体被免疫系统清除的表面修饰蛋白或多肽，而植物外泌体对免疫清除的天然抗性及其低致病性突出了其在这方面的光明应用前景。展望与结论经过几十年的发展，CRISPR/Cas不再局限于切割DNA链，而是产生了一大类单碱基基因编辑、转录调控和RNA链切割方法。因此，这些系统可用于治疗大多数人类疾病，如癌症、慢性疾病和由单一基因引起的遗传病。在细胞中，CRISPR/Cas9和其他系统已经显示出无与伦比的基因编辑能力。然而，开发一种安全、稳定和高效的策略，将基因编辑工具在体内递送至患病细胞，是将其应用于临床的一大挑战。CRISPR通常以质粒、mRNA或RNP的形式递送，但所有三种形式均可从血液和消化系统中通过免疫清除。AAV是递送基因药物最常用的载体之一，即使不考虑负载能力，AAV整合到人类基因组中也可能导致疾病，可能难以接受。具有更高载量和良好安全性的非病毒载体也成为理想的递送载体，尤其是LNPs，已被用于临床试验。由于LNPs和AuNPs等载体并非来源于生物体，因此它们通常在体内触发免疫原性。这些载体也容易被消化器官错误摄取，但研究人员通过添加修饰或多肽以防止免疫清除。生物来源的外泌体或生物膜作为非病毒载体膜可有效避免免疫清除，生物膜中富集的蛋白质和肽可能有助于基因药物到达靶细胞。当疾病发生时，区别于正常组织，疾病部位细胞周围的微环境发生改变，并为递送载体的发展创造了有利条件。疾病的发生还伴随着细胞内炎症因子或其他疾病相关膜蛋白的过度表达。通过添加特异性识别这些膜蛋白的肽，纳米材料可以特异性识别病变细胞，并将CRISPR/Cas递送到细胞中以实现基因编辑功能。此外，对特定疾病条件做出反应的纳米材料的使用也可能增加纳米材料在目标位点的富集。因此，深入研究疾病的发病机制，以及涉及的各种通路、各种蛋白的表达变化以及疾病细胞所在的微环境，可能对构建靶向递送基因药物的载体非常有帮助。此外，CRISPR/Cas9本身的效率和安全性是临床应用中需要考虑的关键方面。脱靶CRISPR/ Cas9效应可能导致严重后果，临床应用前应识别并改进可能的不良后果。科学家已经充分研究了Cas9的裂解机制，并开发了Cas9的几种变体使得脱靶效应降低，而编辑效率没有降低。通过修饰sgRNA可以有效避免脱靶效应。总之，深入研究疾病发生机制、开发更高效和更特异的递送载体以及改进Cas9变异体，使其具有更广泛和更安全的适应性具有重要意义。有了这些基础，CRISPR/Cas技术将全面进入临床应用，帮助治疗人类疾病。来源：Li, T., Yang, Y., Qi, H., Cui, W., Zhang, L., Fu, X., ... & Yu, T. (2023). CRISPR/Cas9 therapeutics: progress and prospects. Signal Transduction and Targeted Therapy, 8(1), 36.END