MHC II

摘要:癌症的特征是无限的增殖和转移，传统的治疗策略通常会导致药物抗性的获得，从而突出了对更个性化治疗的需求。mRNA疫苗通过转录和翻译将外源性目标抗原的基因序列传递到人体细胞中，刺激身体产生针对编码蛋白的特定免疫反应，从而使身体能够获得针对这些抗原的免疫保护；这种方法可能被用于个性化癌症治疗。自近期冠状病毒大流行以来，mRNA疫苗的开发取得了实质性进展并得到了广泛采用。在当前的综述中，讨论了mRNA疫苗的开发、它们的作用机制、影响其功能的因素以及疫苗当前的临床应用。重点放在mRNA疫苗在癌症中的应用，旨在突出这种新颖且有前景的治疗方式的独特进展和剩余挑战。 1.引言 癌症仍然是对人类健康构成严重威胁的疾病，其发病率持续上升。近年来，新发病例数和癌症相关死亡人数呈显著上升趋势。癌症的发生是一个多因素、多步骤和复杂的过程，其病因尚未完全明确；然而，人们普遍认为它与吸烟、感染、职业暴露、环境污染、不健康饮食和遗传因素等多种因素密切相关。随着生命科学和技术的快速发展，我们对肿瘤的理解更加深入。寻找更有效的治疗方法以提高癌症患者的生存率，仍然是医学研究的核心话题。 mRNA疫苗是一种核酸制剂，可以通过特定的递送系统，通过转录和翻译的方式，将外源性目标抗原的基因序列传递到细胞内，转录的蛋白刺激身体产生特定的免疫反应，从而使身体获得免疫保护。mRNA疫苗是在灭活疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗和病毒载体疫苗之后的新一代疫苗。随着基于RNA的技术不断进步，这种创新的治疗模式预计将取代传统疫苗，并可能有能力解决与小分子和抗体疗法相关的问题。除了在传染病中的应用，mRNA疫苗还为包括癌症、罕见病和神经系统疾病在内的疾病提供了更有效和持久的治疗机会。mRNA疫苗不仅一次覆盖多种肿瘤抗原，还通过同时递送人类白细胞抗原（HLA）-I和HLA-II分子，激活更广泛的T细胞反应，从而实现更全面的多角度攻击。因此，mRNA疫苗具有显著的抗癌潜力。目前，全球有数十项与mRNA肿瘤疫苗相关的临床试验正在进行，包括（但不限于）黑色素瘤、胰腺癌和结直肠癌，某些试验中，mRNA疫苗与其他肿瘤免疫药物联合使用。最近开发的mRNA-4157疫苗，已被美国食品药品监督管理局（FDA）宣布为“突破性疗法认定”，并被欧洲药品管理局纳入“优先药品”计划，预计将成为首个上市的mRNA肿瘤疫苗。 本文综述了癌症的当前治疗方法以及mRNA疫苗的开发和现状。在此基础上，还讨论了mRNA疫苗在肿瘤治疗中的价值。 2.癌症治疗  癌症是全球主要的公共卫生问题。根据美国癌症协会发布的最新全球癌症数据，预计2023年美国将有1,958,310例新癌症病例和609,820例死亡。在不同类型的癌症中，前列腺癌、肺癌、支气管癌和结直肠癌几乎占男性所有病例的一半（48%），其中仅前列腺癌就占所有诊断的29%。对于女性，乳腺癌、肺癌和结直肠癌占所有新诊断癌症的52%，其中乳腺癌（BCa）单独占女性癌症的31%。在预计的癌症死亡中，男性中肺癌、前列腺癌和结直肠癌死亡人数最多，女性中肺癌、乳腺癌和结直肠癌死亡人数最多（图1A）。 图1. (A) 不同性别癌症的基本流行病学特征。(B) 肿瘤疫苗的主要类型。 由于医学方法的不断进步，治疗癌症的方法越来越多。根据癌症的类型和阶段以及患者的具体情况，选择合适的治疗可以显著延长生存时间并提高生活质量。癌症的治疗方法主要包括手术、化疗、放疗和免疫疗法。然而，单一的治疗方法对癌症的治疗是不够的，简单的治疗方案增加无法达到目标。因此，需要合理和全面地使用各种方法来更好地控制和消除肿瘤；即，应尽可能采用当前的综合多学科方法。 随着疫苗接种因数字时代的新兴创新而得到推广，接种具有个体肿瘤突变的患者可能成为癌症的第一种真正的个性化治疗。所有能够刺激身体产生对抗肿瘤发生病原体因素的制剂或激活特定免疫以对抗癌症的免疫逃逸效应并治疗肿瘤的疫苗都可以称为肿瘤疫苗。预防性疫苗与传统疫苗类似，主要针对与癌症直接相关的病原体微生物，如人乳头瘤病毒（HPV）和乙型肝炎病毒（HBV）。此外，还有针对已经患有癌症的患者的疗效疫苗，这些疫苗通过主要针对肿瘤中存在的“自身抗原”的免疫反应，促进持久的免疫记忆和长期的抗肿瘤反应的建立。 目前，肿瘤疫苗的主要类型如下：i）全细胞疫苗；ii）树突状细胞（DC）疫苗；iii）蛋白质或多肽疫苗；iv）核酸疫苗，包括DNA疫苗和RNA疫苗（图1B）。 3.mRNA疫苗概述  mRNA疫苗的历史  在2019年冠状病毒（COVID-19）大流行期间，mRNA疫苗作为几家制药公司用于创建疫苗的尖端技术而受到关注。值得注意的是，第一个进入I期临床试验的潜在疫苗是mRNA疫苗。Brenner等人在1961年首次将mRNA识别为中枢神经系统中的中介遗传元素。Malone等人在1989年发现，当mRNA被包裹在阳离子脂质{N-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵}中时，可以成功转染并表达在各种真核细胞中，这是mRNA基药物概念首次被构想出来的时候。20世纪90年代，mRNA疫苗研究蓬勃发展，临床前试验被应用于包括传染病和癌症在内的一系列疾病。1990年，首次成功进行mRNA体内表达的努力是直接注射体外转录的mRNA足以将mRNA引入小鼠骨骼肌细胞。这证明了mRNA疫苗的可行性。1992年，Jirikowski等人发现，将编码催产素和抗利尿激素的mRNA注射到遗传突变的糖尿病小鼠中，可以在注射后几小时内短时间内治愈病情。Martinon等人在1993年报告了一种体外生成的mRNA疫苗，编码流感病毒的核蛋白以激活小鼠的细胞毒性T细胞。Boczkowski等人在1996年首次发现，用mRNA脉冲的DC是触发T细胞反应的可行方法。Zhou等人在1999年展示了mRNA疫苗对抗癌症的潜力，通过直接将糖蛋白100 mRNA包裹在日本血凝病毒脂质体中注射到脾脏，导致黑色素瘤小鼠模型中肿瘤生长受限和生存时间延长。随着研究的进展和实验程序的改进，mRNA疫苗的安全性、有效性和工业制造能力在过去几十年中不断提高。目前，几种mRNA疫苗正在临床环境中进行测试，或随时可用，以对抗癌症和几种传染病，包括寨卡病毒、巨细胞病毒、流感病毒、偏肺病毒和副流感病毒。为了满足及时有效疫苗的需求，自全球严重急性呼吸综合征（SARS）CoV-2大流行以来，核酸疫苗的研究和开发激增。此外，mRNA疫苗的市值已增长至数十亿美元，预示着mRNA基药物，特别是mRNA疫苗的未来发展充满希望（图2）。 图2. mRNA疫苗的研究历史及肿瘤治疗进展。 mRNA疫苗的机制 mRNA疫苗的制造涉及几个相对复杂的步骤。首先，需要设计并合成所需的mRNA序列；该序列通常包括编码目标抗原或其他治疗蛋白的核苷酸序列，并且应包含适当的5'端帽和3'端尾序列以提高mRNA的稳定性和翻译效率。通过体外转录，合成相应的mRNA，体外转录系统通常由RNA聚合酶、缓冲溶液、核苷三磷酸、锌离子和辅助因子组成，以促进转录。将DNA模板与体外转录系统的其他组分混合，构成含有合成mRNA所有必要组分的反应混合物。然后将这个反应混合物放入适当的反应管中，并在适当的条件下进行体外转录反应。在这个反应过程中，RNA聚合酶识别DNA模板并利用它合成mRNA。合成的mRNA需要被纯化和修饰，以去除杂质并提高稳定性，某些mRNA疫苗可能还需要被包裹在脂质体中以提高其稳定性并促进体内细胞摄取。脂质体通常由磷脂和胆固醇等成分组成，可以在水相中形成具有脂质双层结构的微小脂质囊泡。可以添加表面活性剂（如聚乙二醇）以提高脂质体的稳定性和细胞摄取效率。合成的mRNA与脂质体混合形成脂质体-mRNA复合物。这些复合物可以通过内吞作用机制转染到目标细胞中，细胞膜形成内陷以将脂质体-mRNA复合物带入细胞内。内吞的囊泡将脂质体-mRNA复合物包裹在内体中，然后与细胞质中的其他细胞器融合，并将它们的内容物释放到细胞质中。脂质体-mRNA复合物的内容物释放到细胞质后，mRNA分子被细胞内的核糖体识别并翻译（图3）。 图3. mRNA疫苗的生产过程和主要结构。ORF（开放阅读框）、UTR（非翻译区）、PEG（聚乙二醇）。 一部分外来mRNA逃避了普遍存在的核糖核酸酶的破坏，并被个别细胞特有的自然过程（如发育中的树突状细胞的巨胞饮作用）内化为内体途径，由内体释放到细胞质中。宿主细胞的翻译机制将mRNA翻译成抗原蛋白。信号肽决定了编码蛋白一旦产生后的最终位置。这些可能是为了将蛋白质定位到宿主细胞内的适当细胞器而重组创建的，或者它们可能是原始蛋白质序列固有的。作为替代方案，这种编码的蛋白质可能通过其分泌影响附近细胞的功能，如果它被释放到血液中，它也可以影响远处的器官。细胞质中的蛋白酶分解对细胞重要的抗原蛋白，产生抗原肽表位。内质网是抗原肽表位转移、装载到主要组织相容性复合体（MHC I）类分子上并向CD8+细胞毒性T细胞展示的地方。为了获得更强力和持久的免疫反应，需要将蛋白质产品引导到抗原呈递细胞（APCs）中的MHC II类装载区。这可以通过向mRNA添加编码路径信号的序列来实现。一旦产生的抗原肽表位装载到MHC II分子上，就诱导了抗原特异性的CD4+ T细胞反应，并且装载的MHC II肽表位复合物出现在细胞表面（图4）。此外，通过一种称为交叉启动的过程，被DCs摄取的外来抗原也可以被处理并装载到MHC I类分子上。这允许设计、体外生产和递送任何所需序列到任何类型的细胞。当mRNA作为外来基因的载体时，由于其自我佐剂效应，它可能表现出与mRNA病毒相似的某些特征。APCs可以在翻译前识别mRNA，这种识别触发了模式识别受体的激活，包括Toll样受体（TLR）3、TLR7和TLR8。TLR3、TLR7和TLR8可以检测单链和双链（ds）RNA链，而短的和长的dsRNA丝可以在细胞质中被视黄酸诱导基因I（RIG-I）和黑色素瘤分化相关蛋白5检测。因此，可能会激活I型干扰素（IFN-I）途径，可能会产生趋化因子和促炎细胞因子，并可能激活APCs，所有这些都可能触发强大的适应性反应。 图4. mRNA疫苗的一般作用机制示意图。MHC（主要组织相容性复合体）、TCR（T细胞受体）、PFN（穿孔素）、GzmB（颗粒酶B）。 mRNA疫苗的优势 mRNA肿瘤疫苗平台提供了其他癌症疗法所没有的独特优势。与传统的放疗和化疗不同，它们容易受到药物抗性的影响，mRNA疫苗允许同时覆盖多种抗原，从而克服了癌症治疗中的疫苗抗性。mRNA疫苗和免疫检查点抑制剂（ICIs）的结合可以在逆转抗性途径中发挥作用。因此，预计mRNA疫苗将是ICIs的有用辅助手段，两者的结合可能允许为患者实施精确和个性化的治疗。此外，传统的癌症治疗可能会对正常人体细胞造成重大损害，而mRNA疫苗可以更精确地针对肿瘤细胞。此外，mRNA表达的短暂性质确保了抗原刺激是暂时的，有效地降低了慢性炎症或自身免疫反应的可能性。与其他肿瘤疫苗平台相比，mRNA疫苗具有高度的免疫原性，能够刺激患者更广泛的免疫反应。 尽管mRNA肿瘤疫苗显示出临床潜力，但其经济价值也值得注意。作为一种新疗法，mRNA疫苗在方便性和生产成本方面优于其他细胞和基因治疗产品。市场上的其他基因/细胞疗法，如嵌合抗体受体T细胞免疫疗法（CAR-T），目前的价格为数百万美元，这对患者和社会构成了重大的经济负担。这是因为CAR-T需要为患者进行一系列过程，如细胞提取、修改、体外培养和重新输注，并且很难扩大生产规模，因此很难降低单一产品的成本。相比之下，mRNA疫苗是直接体外转录的。mRNA疫苗的合成和生产步骤是标准化的，允许产品的快速和大规模生产，这将导致产品的重大成本优势。因此，预计mRNA疫苗将为经济能力较弱的癌症患者提供福音，因此在当前的医疗环境中具有重要的经济潜力。 鉴于多种优势，mRNA技术比DNA甚至传统疫苗更具吸引力。体外转录（IVT）合成消除了对细胞的需求以及随之而来的监管障碍，使mRNA生产无疑比大规模蛋白质生产和纯化更容易、更快、更清洁，与传统的疫苗方法形成对比。抗原设计的准确性允许更快地响应新出现的大流行和流行病风险，及时有效地应对。mRNA之所以精确，是因为它只产生特定的抗原并触发定制的免疫反应，与减毒或灭活疫苗不同。mRNA可以通过结合模式识别受体触发和/或促进适应性免疫反应，无需佐剂，而亚单位疫苗需要佐剂来引发免疫反应。核酸疫苗受到HLA类型的限制较少，比肽疫苗更有可能引发更广泛的T细胞反应，因为它们可以编码全长肿瘤抗原，这允许APCs同时交叉呈现或呈现多个表位，具有I类和II类患者特异性HLA。 以下描述了mRNA疫苗相对于DNA疫苗的优越之处。由于DNA疫苗无法工作的核膜屏障被移除，因为只有mRNA需要在细胞质中转录，而DNA必须在细胞核中翻译。因此，有丝分裂和非有丝分裂细胞都可能成功转染mRNA疫苗。此外，mRNA很少整合到基因组DNA中，也不会经历插入突变。第三，由于mRNA被生物过程迅速分解，并且在2-3天后不留痕迹，编码抗原的生产只是暂时的。mRNA疫苗平台的灵活性也有助于生产，因为它允许标准化生产，因为对编码抗原的修改不会改变mRNA主干的物理/化学属性。第四，与其他平台相比，由于生产基于体外无细胞转录过程，因此病毒污染物和细胞衍生杂质的安全问题较少。此外，RNA疫苗通常比DNA疫苗引发更强的免疫反应。这一点的原因尚不完全清楚，但一些理论包括低表达DNA感应机制、不同的核酸感应模式识别受体的表达、DNA进入人类细胞的传递效率低下，以及DNA需要穿过细胞和核膜并在细胞核中转录才能成功转染细胞。 mRNA疫苗的潜在限制 尽管当前SARS-CoV-2 mRNA疫苗的成功促进了癌症mRNA疫苗的研究，但在以下章节中讨论了mRNA疫苗在癌症应用中仍然存在限制。 苛刻的保存条件。mRNA是一个不稳定的分子，由于核糖上的羟基存在，容易被环境中的生物核酸酶裂解。它可以在冷冻保存时保持稳定活性，但对于经济欠发达地区来说，存储成本太高。载体基保护剂如脂质纳米颗粒（LNPs）只能将mRNA疫苗保存最多3个月。Cichlidin也能保护mRNA免受酶促降解，但可能使其更难翻译，影响mRNA疫苗的效力。 单独使用时相对较低的抗肿瘤效果。由于mRNA疫苗的稳定性差、蛋白质的生产周期相对较短、肿瘤细胞的异质性以及晚期肿瘤的免疫微环境通常高度免疫抑制，单独使用mRNA疫苗很难在质量上提高抗肿瘤效果。因此，癌症mRNA疫苗的临床研究进展有限。 缺乏长期实验结果。癌症mRNA疫苗的临床试验目前正在进行，通常处于早期开发阶段。特别是个性化癌症mRNA疫苗的临床试验报告结果仍然有限，且治疗效果在患者之间差异很大。癌症mRNA疫苗的长期试验结果仍然缺乏，因此将其作为癌症常规治疗的路线图还很长。有报道称mRNA疫苗可能与某些罕见的致命血栓事件有关，因此mRNA疫苗接种的安全性也值得长期观察。总之，必须监测癌症治疗中mRNA疫苗的长期疗效和副作用。 监管挑战和伦理考虑。针对个体化新抗原的mRNA疫苗的开发和生产针对个人的基因组数据，因此疫苗可能带来监管和批准挑战。 影响mRNA疫苗的因素 尽管mRNA疫苗有所有的好处，它们的基本特性仍然对它们在癌症治疗中的使用施加了某些限制。例如，mRNA和细胞膜的负电荷使mRNA分布更具挑战性。皮肤和血液中含有胞外核糖核酸酶，这些酶容易分解mRNA。由于其固有的免疫原性，mRNA可能通过激活下游与干扰素相关的途径触发先天免疫。矛盾的是，这种固有的免疫原性促进了mRNA的降解，降低了抗原表达，尽管它可能被用作佐剂样效应来增加免疫反应。体外转录产品中经常发现dsRNA污染物。dsRNA可能通过增强I型干扰素的产生，进一步限制了mRNA的翻译并加强了先天免疫的激活。为应对这些问题，已经开发了几种技术来推进mRNA疫苗的科学。 mRNA疫苗的递送系统。众所周知，mRNA的半衰期约为7小时，没有递送系统的情况下其吸收很差。此外，mRNA是一个天然不稳定的分子，容易被内切核酸酶、3'外切核酸酶和5'外切核酸酶分解。将mRNA疫苗应用于癌症的最大挑战之一是在没有足够高的翻译水平的情况下，将mRNA送入足够数量的细胞。这需要高度针对性和有效的mRNA递送机制。迄今为止，已确定的癌症mRNA疫苗的递送载体包括LNPs、聚合物载体、肽载体、DC载体、细胞外囊泡载体和混合载体。 最发达、有前景且广泛使用的mRNA非病毒递送方法之一是LNP。它由四种组分组成，共同作用以包裹和保护脆弱的mRNA核心：胆固醇、辅助磷脂、阳离子或可电离脂质和聚乙二醇（PEG）化脂质。胆固醇用作稳定剂以增加LNP稳定性，可电离阳离子脂质可以促进mRNA的自主聚集形成约100纳米的颗粒，并通过电离在细胞质中释放mRNA，PEG可以延长LNP复合物的半衰期。天然磷脂支持纳米颗粒形成脂质双层结构。目前，有LNP-mRNA癌症疫苗正在进行临床试验，例如mRNA-4157。 mRNA疫苗的纯化。体外转录的mRNA产品主要是目标mRNA、非目标mRNA、核苷酸、寡核苷酸和蛋白质的组合。通常使用色谱法将目标mRNA从系统中的其他mRNA杂质中分离出来，而沉淀和提取技术则用于消除mRNA中的常见杂质。dsRNA可能通过增强I型干扰素的产生，而dsRNA是RNA病毒基因组复制中间体的模拟物。因此，通过纯化体外合成的mRNA产品，可以有效地减少mRNA疫苗对I型干扰素免疫反应，同时提高mRNA的翻译效率。在IVT期间，可以通过在更高温度下生成RNA或降低Mg2+含量来减少dsRNA物种。Engel等人检查了dT25共轭寡核苷酸亲和支持树脂（dT25-OAS）的纯化特性；由于其非常高的结合能力，dT25-OAS是大规模mRNA纯化的合适替代品。 mRNA疫苗的分子稳定化。提高蛋白表达通常涉及修改序列和/或结构以提高mRNA稳定性（增加半衰期）和翻译的技术。方法包括延长聚(A)尾、改变5'帽、设计非翻译区（UTR）和开放阅读框（ORF）序列模式以及改变特定的核苷酸序列。这些变化导致蛋白质的大量生产延长了一段时间，从几分钟到超过1周。PERSIST-seq，一个基于RNA测序的平台，最近被创建，用于全面表征各种mRNA库的细胞内mRNA稳定性。该平台已经并继续使mRNA药物增强的计算试验成为可能。 5'帽修饰。5'帽是一种保护结构，可以触发mRNA翻译，防止外切酶切割，并控制前mRNA剪接和核输出等功能。先天免疫系统使用5'帽来区分内源性RNA和外源性RNA。关于体外mRNA加帽，有两种标准方法。第一，通过在mRNA转录系统中加入正常的帽类似物m7GpppG结构，可以完成mRNA加帽和体外转录。第二，在第一次体外转录后，甲基转移酶将Cap 0甲基化为Cap 1以进行mRNA加帽。体外转录中用于mRNA加帽的最常用技术是使用帽类似物进行加帽。现在已经开发了几种帽类似物。在m7G内部的核糖部分改变的抗反向帽类似物（ARCAs）是最常报道的帽类似物。为了提高mRNA的质量，最近还开发了对ARCA结构的额外改变。例如，基于ARCA的磷修饰通过增加mRNA对eIF4E的亲和力，可能通过减少其对脱帽酶的敏感性并提高翻译效率来增加mRNA稳定性。在ARCA中插入一种新型化学改变的帽类似物可以增加mRNA的半衰期，防止它被mRNA脱帽酶2脱帽。2018年，‘CleanCap’，一种共转录加帽技术，被创造为另一种帽类似物。与传统的第一代帽类似物（如mCap和ARCA）相比，它们在较低的效率和反应产率下具有Cap 0结构，这要高效得多。 5'和3'-UTR的优化。mRNA编码区的上游（5'-UTR）和下游（3'-UTR）区域包括mRNA序列的非编码部分或UTR。UTR具有多种功能，包括控制mRNA稳定性、亚细胞定位、翻译效率和mRNA从细胞核输出。通过UTR优化，通常可以增加体内的mRNA表达水平，因此UTR是癌症mRNA疫苗设计的的关键部分。 ORF的密码子优化。ORF区域是mRNA的编码区，因此其翻译速率无疑非常重要。因此，通过选择该区域内的正确密码子，可以最大化mRNA的总翻译效率。为了实现序列优化的目标，使用的方法要么是选择高度表达的蛋白质共有的最佳密码子对，要么是保持目标细胞中高度表达的蛋白质自然存在的每种密码子的相同百分比。此外，为了加快翻译速度，ORF中不常见的密码子通常被替换为具有增加的转运RNA（tRNA）丰度的密码子。在这种情况下，可以确保在生产外来mRNA和/或使用宿主密码子增加高度表达基因的翻译时，具有足够的tRNA水平。为了控制翻译延伸速率，可以优化ORF的鸟嘌呤（G）和胞嘧啶（C）含量。另一种与更高GC含量直接相关的密码子优化技术是尿嘧啶枯竭。RIG-I可以识别富含尿嘧啶的区域，当它被激活时，蛋白质表达可能完全停止。 聚(A)尾修饰。在mRNA构建的3'端是一个被称为聚(A)尾的聚腺苷酸区域。它对mRNA的酶稳定性和翻译都很重要。为了控制翻译效率，它特别与几种聚腺苷酸结合蛋白结合，并与mRNA序列5'端的7-甲基鸟苷帽（m7Gppp）合作。根据早期研究，聚(A)尾在控制mRNA的稳定性和翻译效率方面至关重要。发现较长的尾巴可以在多种细胞类型中增加蛋白质表达水平。另一方面，根据Lima等人的研究，较短的聚(A)序列可能会促进这种封闭循环形状以实现有效翻译。总之，为了最大化mRNA的翻译效率，应该根据不同的细胞类型修改聚(A)序列的长度。 修饰核苷酸。某些mRNA核苷酸在mRNA成熟期间经历转录后修饰。可以使用这些天然存在的修饰核苷酸（如5-甲基胞嘧啶和伪尿嘧啶）合成IVT mRNA。当IVT mRNA具有如伪尿嘧啶等修饰核苷酸时，表现出更好的翻译效率和稳定性。这被假设是因为核苷酸防止TLR、RIG-I和RNA依赖性蛋白激酶R（PKR）被激活，使IVT mRNA对细胞质TLR（如TLR3、TLR7和TLR8）以及RIG-I和PKR不可检测。然而，有建议称，未修饰的mRNA疫苗可以帮助免疫系统识别肿瘤细胞，在这种情况下，不需要修改癌症mRNA疫苗。 佐剂。佐剂是一类物质，无论是天然的还是人造的，都能被免疫系统轻易识别并用来增强预期的免疫反应。注射其相应的佐剂可以提高对抗原的免疫反应，即使mRNA疫苗本身具有自我佐剂效应。目前，向mRNA中添加佐剂是一个热门的研究课题。 一种名为TriMix的mRNA佐剂由三种免疫调节分子组成：CD70、CD40配体和活性TLR-4。对III期或IV期黑色素瘤患者进行TriMix mRNA治疗，连同额外的肿瘤抗原mRNAs，这导致持久的临床缓解和增强的免疫反应。最近建立了一种用于c16-r848的mRNA疫苗NP技术的佐剂脉冲。这种技术显著提高了ova特异性CD8+的扩增，这使得激活的T淋巴细胞能够穿透体内的肿瘤床，而在没有佐剂的mRNA疫苗NP中没有观察到这一点。RNActive（curevac Ag）疫苗平台和RNAdjuvant是其他流行的佐剂。此外，某些mRNA递送载体，如精蛋白和阳离子脂质，可能增强佐剂的效果。Pam2Cys是一种合成的中性脂肪酸，可以通过TLR2/6途径发出信号，已被证明能触发体液和细胞应用免疫反应，这使其成为一个有前途的候选佐剂。最近的一项研究将Pam2Cys整合到mRNA-LNP中以提高mRNA疫苗的效力。在使用这种疫苗的预防性和治疗性肿瘤模型中，CD4+和CD8+ T细胞依赖的抗肿瘤反应显著增强，同时记忆抗肿瘤反应也得到了建立。因此，Pam2Cys在开发未来的癌症mRNA疫苗中具有重要价值。 4.mRNA疫苗在传染病中的应用  mRNA疫苗主要用于治疗癌症和传染性疾病。目前，约有140项临床研究正在评估mRNA疫苗治疗各种疾病。自我复制或复制RNA疫苗和非复制mRNA疫苗是已经评估的两种主要类型的RNA疫苗。复制体是自我复制的mRNA，由RNA病毒产生，其结构病毒蛋白被替换为编码RNA聚合酶和抗原的mRNA。因此，这些mRNA增强了免疫原性并延长了蛋白质表达，从而提高了效率。 自我复制的mRNA有两种ORFs，一种编码目标抗原序列，另一种编码病毒复制机制，与传统的非复制IVT mRNA的“成熟”真核mRNA不同。这允许细胞内长期RNA扩增。非复制mRNA疫苗的递送机制可能进一步被识别，因为它可以直接注射到一系列解剖区域或通过体外装载DCs。虽然现在有几种机会使用自我复制的mRNAs来预防传染病，但其作为癌症疫苗的使用主要限于临床前研究，并且只有少数临床研究已经进行。 由病毒感染引起的疾病。基于核酸的疫苗通过在免疫期间在体内表达疫苗抗原，模仿病毒感染来诱导体液和细胞毒性T细胞反应。这一好处对于消除感染或细胞内病原体至关重要，需要强烈的体液和细胞免疫反应来提供有效的保护（图5）。 图5. mRNA疫苗在治疗多种疾病方面展现出巨大潜力。NSCLC（非小细胞肺癌）、HIV（人类免疫缺陷病毒）、HSV（单纯疱疹病毒）、SARS-CoV-2（严重急性呼吸综合征冠状病毒2）。 引起流感的病毒。避免流感的最有效方法是接种疫苗。与传统疫苗相比，编码流感病毒效应蛋白（s）的保守区域的mRNA疫苗可能诱导产生特定抗体，改善预防和理想的治疗效果。此外，由于开发过程更快，mRNA疫苗对新型流感病毒的开发更简单。这表明mRNA疫苗可以作为管理流感的快速和适应性工具，无论是季节性还是大流行性。 人类免疫缺陷病毒（HIV）。在首次使用裸露的mRNA（ihivarna）结合新的HIV免疫原序列（HTI免疫原）进行的人类临床试验中，使用DC激活方法（trimix：CD40配体（CD40L）+ CD70 + 编码组成性活性TLR4（CATLR4）RNA）和疫苗接种，疫苗安全且耐受性良好。它迅速增加了外周CD4 T细胞中的HIV-1 DNA和RNA，并触发了适度的HIV特异性T细胞反应。激活性佐剂trimix和来自HIV-1结构蛋白的16个保守片段（GAG、pol、Vif和Nef）组成了HTI trimix。它编码了一个强大的激活信号和一个高效的HIV重组抗原，使其成为mRNA基治疗HIV-1的有前途的新型疫苗候选物。根据临床前的发现，它可能成功刺激T细胞，成熟DC的释放和抗病毒细胞因子的释放（特别是IFN-γ）。HTI-TriMix的I期和IIa期临床研究在2019年底完成。IIa期研究中的HIV-1阳性个体在0-2周和4周接受了三次疫苗接种，这是通过超声引导使用腹股沟淋巴结确定的。 单纯疱疹病毒（HSV）。最近开发了一种针对HSV-2病毒颗粒上发现的C、D和E糖蛋白的三价疫苗。在HSV-2侵袭后，疫苗可以保护动物免受生殖器感染和随后的病毒脱落。此外，疫苗产生了交叉反应性抗体，中和了HSV-1并提供了对HSV-1感染的保护。因此，这种疫苗为生殖器HSV-1和HSV-2感染提供了强大的保护，并且是适合人体测试的候选疫苗（图5）。 黄病毒。许多黄病毒，如寨卡病毒、波瓦桑病毒、登革病毒和蜱传脑炎病毒，已使用mRNA疫苗进行治疗并预防感染。对寨卡病毒的mRNA疫苗引起了极大的兴趣。Richner等人创建了一个包含野生型或突变型ZIKV结构基因的LNP包裹的修饰mRNA疫苗，以评估小鼠的免疫原性和保护。在I/II期人类临床研究中，一个类似的疫苗称为mRNA-1893，在10或30微克剂量的初次加强免疫后，导致超过90%的血清转化（图5）。 COVID-19。对COVID-19的mRNA疫苗引起了极大的兴趣。迄今为止，已经生产了几种疫苗，包括mRNA-1273、BNT162、ARCT-021和cvncov疫苗（cv07050101）。mRNA-1273和BNT162b2 COVID-19疫苗几乎相同的94至95%的疫苗效力，以及它们快速的开发和测试周期一年，是科学和医学领域的显著成就。 在开发中的mRNA疫苗中，目前只有针对COVID-19的mRNA疫苗上市。根据已公布的临床数据，COVID-19 mRNA疫苗提供了高水平的保护和安全性。接种mRNA疫苗后，接种者产生的中和抗体水平显著高于那些从COVID-19中康复且未接种疫苗的人，并且表现出增强的免疫反应和记忆。mRNA COVID-19疫苗为16岁及以上个体提供了95%的整体保护，并且能够有效地对20多种病毒变体产生反应。大多数接种mRNA COVID-19疫苗的患者中没有发现临床意义上的安全问题。在一小部分接种新冠mRNA疫苗的人中观察到心肌炎，特别是在年轻男性接种第二剂疫苗后发病率最高。 由细菌感染引起的疾病。针对细菌和寄生虫抗原种类的mRNA疫苗开发尝试有限，其中许多仍处于临床前测试阶段。 Maruggi等人检查了表达A组链球菌抗原（GAS）和无乳链球菌（GBS）的自我放大mRNA疫苗的有效性和免疫原性。自我放大mRNA载体能够有效地产生两种原型细菌抗原：GBS的2a型菌毛骨干蛋白和双突变的GAS溶血素O。在感染GAS和GBS的小鼠中，自我放大mRNA疫苗产生的抗体反应能够持续提供保护。Jawalagatti等人开发了一种创新策略，用于创建可口服的mRNA疫苗。 5.mRNA疫苗在各种肿瘤中的应用  大约25年前，首次展示了基于mRNA的癌症疫苗的可行性。从那时起，mRNA疫苗在癌症治疗中的应用已在多项临床前和临床研究中进行了探讨。到目前为止，只进行了少数几项mRNA癌症疫苗的临床研究。大多数试验集中在急性髓系白血病（AML）、多发性骨髓瘤、间皮瘤、胶质母细胞瘤、恶性胶质瘤和肾细胞癌，以及胰腺癌、黑色素瘤、乳腺癌（BCa）、非小细胞肺癌、前列腺癌、卵巢癌和结直肠癌的mRNA疫苗，并且仍处于早期阶段（I和II）（图5）。Moderna和默克夏普多美公司宣布，2023年7月，首个mRNA个性化癌症疫苗（mRNA-4157）和抗程序性细胞死亡1（PD-1）单克隆抗体（Keytruda）的组合疗法进入了III期临床试验。这是首个进入III期临床试验的mRNA癌症疫苗。表I总结了mRNA疫苗治疗癌症的临床试验。 胰腺癌。越来越多的数据表明，胰腺癌的肿瘤内和肿瘤间异质性，特别是与免疫微环境和基因改变有关，与治疗抵抗性相关。传统的癌症治疗方法通常会导致获得性抵抗，强调了需要针对性、个性化的护理。在患有胰腺导管腺癌的患者中，最近使用辅助定制的mRNA新抗原疫苗autogene cevumeran的I期临床研究表明，疫苗刺激了T细胞活性，这可能与疾病的复发延迟有关。在临床试验中，19名患者中有16名在接受了Atezolizumab治疗后接受了cevumeran治疗；接受mRNA疫苗的16名患者中有8名产生了持续产生IFNγ的T细胞易位，证明了mRNA疫苗的免疫持久性。对疫苗有反应的受试者的中位无复发生存期（RFS）在中位随访时间为18个月时尚未达到。反应者的RFS明显高于非反应者。因此，可以得出结论，Atezolizumab（一种抗PD-L1单克隆抗体）与mRNA疫苗结合，诱导了广泛的T细胞活性，并延迟了胰腺癌的复发。Kang等人表明，在进行手术切除并有延迟复发风险的胰腺导管腺癌（PDAC）患者中，个性化的mRNA新抗原疫苗autogene cevumeran（BNT122）与Atezolizumab和mFOLFIRINOX（PDAC手术后的标准辅助化疗方案）结合使用，诱导了显著的T细胞活性。 结直肠癌。针对结直肠腺癌的mRNA疫苗有限。一个重大困难是从几种疫苗候选中筛选出可能适合特定类型癌症的mRNA疫苗。Liu等人确定的潜在mRNA疫苗候选物包括靶向抗原血栓蛋白2、卵泡抑素样3、肌钙蛋白T1、大囊泡、胶原蛋白三螺旋重复含1和NADPH氧化酶4。该研究还描述了CRC的异常基因表达模式和突变景观。结果可能有助于确定适合免疫治疗的CRC患者，并为创建mRNA癌症疫苗提供理论基础。 黑色素瘤。为了开发mRNA疫苗并确定合适的疫苗接种人群，Ping等人分析了黑色素瘤中的潜在肿瘤抗原。他们的分析揭示了蛋白酪氨酸磷酸酶受体类型C、唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素11（SIGLEC11）、环状寡腺苷酸激活的单链核糖核酸酶和单链脱氧核糖核酸酶1、白细胞免疫球蛋白样受体亚家族B成员1和ADAM样解刀蛋白1可能是黑色素瘤mRNA疫苗的抗原靶标，为黑色素瘤mRNA疫苗的开发奠定了基础。根据Sittplangkoon等人的研究结果，在黑色素瘤模型中，未修饰的mRNA疫苗可能导致产生IFN-I或触发下游信号级联反应，这两者对于引发强效的抗肿瘤T细胞反应至关重要，这些反应调节肿瘤的发展和转移。最近的一项临床研究结果显示，实验性疫苗mRNA-4157/V940结合pembrolizumab可能作为高危黑色素瘤治疗的辅助治疗。与单独使用PD-1抑制剂治疗的患者相比，接受这种组合治疗的个体在手术后复发风险显著降低。 乳腺癌（BCa）。Li等人确定了可能适合mRNA疫苗接种的BCa患者群体以及用于创建抗BCa mRNA疫苗的潜在BCa相关抗原。总共鉴定出三种肿瘤相关抗原：CD74、干扰素调节因子1和蛋白酶体激活亚单位2。这些抗原经常出现突变、扩增或上调，并且与免疫细胞浸润和预后相关。具有B类免疫亚群的患者的肿瘤微环境（TME）可能对mRNA疫苗反应良好。在前列腺腺癌（PRAD）免疫亚型2和3组的患者更有可能从免疫接种中受益，PRAD mRNA疫苗的潜在抗原，包括Kelch样家族成员17、肉碱棕榈酰转移酶1B、IQ基序含有GTP酶激活蛋白3、Lck相互作用跨膜适配器1、YjeF N-末端结构域含有3、卷曲螺旋结构域含有180、MutS同源物5和钙粘蛋白EGF LAG七次跨膜G-型受体3。 肝细胞癌（HCC）。北京协和医学院医院正在进行针对肿瘤抗原mRNA治疗疫苗ABOR2014（IPM511）的首次人体临床试验。该疫苗编码了在HCC患者中经常上调的近20种HCC抗原。该研究旨在评估IPM511单独使用以及与PD-1抑制剂治疗结合使用在经过一线标准治疗后病情进展的晚期HCC患者的安全性、耐受性和初步疗效。该研究目前正在进行中，尚未公布结果，主要研究者表示，IPM511在使用这种方法治疗的第一位患者中已经显示出安全性和临床可行性。 食管癌。最近报道了一项针对晚期食管鳞状细胞癌的个性化mRNA癌症疫苗结合PD-1抑制剂治疗的研究。参与研究的患者首先使用来自病变组织的全转录组测序进行新抗原筛选。开发了一种针对这些新抗原的个性化mRNA癌症疫苗。随后，患者接受了mRNA癌症疫苗与PD-1抑制剂的组合治疗，患者获得了部分缓解；治疗方案的安全性在可控范围内。因此，mRNA疫苗可能是晚期食管癌患者有效的治疗策略。 6.mRNA疫苗在肿瘤治疗中的功能性实现  mRNA疫苗的免疫治疗  癌症现在可以通过免疫治疗有效治疗，鉴于早期临床结果积极，FDA已经授权越来越多的免疫疗法。癌症免疫治疗的基础是免疫系统识别和消除癌细胞的能力。随着近年来针对增强对恶性肿瘤的免疫反应的多类药物的出现，这一研究领域迅速扩大。这些包括各种疫苗接种方法、采用T细胞治疗、免疫检查点抑制剂和细胞因子。 肿瘤抗原。肿瘤相关抗原（TAAs）和肿瘤特异性抗原（TSAs）是两类由mRNA编码的抗原，传统上一直是免疫治疗的靶标。鉴于免疫记忆，专门针对TAAs或TSAs的疫苗可能会针对并杀死表达抗原上调的癌细胞，并提供持久的治疗反应。 TAAs。TAA对肿瘤细胞并不独特。虽然它们也可能存在于健康组织和细胞中，特别是在胚胎组织中，这些抗原在肿瘤中的表达显著升高。Conry等人开发了第一种mRNA癌症疫苗；这种疫苗表明，用编码癌胚抗原（CEA）的mRNA免疫的小鼠在受到CEA表达肿瘤细胞挑战时显示出抗CEA抗体反应。自从这一初步发现以来，TAA研究受到了显著关注，并取得了积极的临床研究结果。Huang等人在胆管癌中鉴定了三种肿瘤抗原，包括CD247、Fcγ受体Ia和转录域相关蛋白，这些抗原与改善的预后和抗原呈递细胞的浸润有关。这些抗原可能作为针对胆管癌的mRNA疫苗的潜在候选物。然而，TAA免疫方法确实存在一些缺点。TAA通常不在恶性细胞中发现。此外，由于并非所有发现的TAA都能诱导抗肿瘤免疫反应，选择TAA可能具有挑战性，疫苗开发成本高昂。肿瘤本身可能会下调TAA，允许在专注于特定抗原时逃脱。最后，TAA也可能存在于正常组织中，针对它们的疫苗可能会引起外周和中枢耐受反应，这可能导致疫苗效力差或针对正常组织的自身免疫。 肿瘤特异性抗原（TSAs），也称为新抗原，是肿瘤细胞因体细胞随机变化而独有的抗原，因此不存在于正常组织和细胞中。肿瘤特异性突变是癌症免疫治疗的诱人靶点，这些突变可能导致新抗原的产生，从而允许开发定制疫苗，因为这些突变的抗原在健康组织中不表达，因此可以被T细胞识别。基于新抗原的疫苗接种相对于基于TAA的疫苗具有以下特点，突显了它们的优势。由于新抗原仅由肿瘤细胞产生，它们只能触发特定于肿瘤的T细胞反应，限制了对非恶性组织的伤害。新抗原提供了通过逃避T细胞对自身表位的中央耐受来引发针对肿瘤的免疫反应的潜力。此外，由于这些疫苗增强的新抗原特异性T细胞反应的持久性，可能提供长期防止疾病复发的保护，并提供超出治疗的免疫记忆。为了使患者对转移性胃癌产生免疫，Cafri等人最近将经过验证和表征的新抗原和预测的新表位以及驱动基因突变结合到一个单一的mRNA构建中。开发的疫苗证明是安全的，并且产生了针对预期新表位的T细胞反应，这些新表位在免疫之前尚未被发现。尽管取得了进展，使用新抗原仍然面临几个挑战；这些障碍源于生物学和技术因素，包括潜在抗原和HLA分子的多态性，对我们对不常见HLA等位基因的HLA结合基序的理解存在差距，以及肿瘤的异质性。 mRNA疫苗的肿瘤抗原递送方法 mRNA转染的DC疫苗。DC可以转染表达肿瘤抗原的mRNA和总肿瘤mRNA，然后可以将其传递给宿主并启动免疫反应。将转染TAA mRNA或总mRNA的DC皮下应用于带瘤小鼠已被证明可以诱导T细胞免疫并抑制已建立肿瘤的生长，这也支持了这两种不同转染方法的可行性。接受顺铂治疗转移性去势抵抗性前列腺癌的患者，当Kongsted等人转染表达多种TAA的DC时，没有出现不良反应；约50%的研究参与者表现出免疫反应。现在正在进行一项针对肺癌患者的1期临床试验，评估MIDRIXNEO，这是一种针对肿瘤新抗原的定制mRNA加载的树突状细胞疫苗。 直接注射。有几种方法可以直接将编码肿瘤抗原的mRNA注入宿主体内。局部细胞，如APC，吸收mRNA并将其转移到细胞质中进行翻译。通过淋巴结内注射是传递肿瘤抗原的最常见方法之一。2012年对29名晚期黑色素瘤患者的1期研究开始了；这项试验的未发布数据显示，淋巴结内mRNA注射是安全和可行的（NCT01684241）。编码酪氨酸酶、前黑素体蛋白、MAGE家族成员A3（MAGE-A3）、MAGE-C2和肿瘤中优先表达的黑色素瘤抗原以及TriMix mRNA在静脉内注射时耐受性良好。在另一项1期临床研究中，研究了针对III期和IV期黑色素瘤患者的新抗原特异性mRNA疫苗的淋巴结内递送，该疫苗由针对患者的20种突变组成（NCT02035956），这表明可以利用个体突变。 通过皮肤给药。通过皮肤可能实现由mRNA表达的肿瘤抗原的给药。小鼠通过基因枪将编码增强型绿色荧光蛋白和黑素细胞自身抗原TRP2的IVT mRNA注射到皮肤上。这成功地引发了针对抗原的细胞免疫，对B16肺转移和诱导类似白癜风的毛发脱色起到了保护作用。在一项涉及21名转移性黑色素瘤患者的1/2期临床试验中，将编码六种与黑色素瘤相关抗原的mRNA通过皮内注射，使用精蛋白凝聚的裸mRNA，安全且成功地注射到4名可评估患者中的2名。此外，在7名可测量疾病的患者中，有1名对疫苗表现出完全反应。 通过鼻内给药。通过mRNA编码肿瘤抗原的粘膜途径可以有效地引发全身免疫反应和局部粘膜免疫。通过鼻内递送可以达到鼻相关淋巴组织，这是一个有利的位置，可以促进抗原内化，以促进对癌细胞的保护反应。在侵袭性刘易斯肺癌模型中，Mai等人通过腹腔内免疫小鼠，使用阳离子脂质/精蛋白复合物携带编码角蛋白19的mRNA，这减缓了肿瘤的发展并引发了强大的细胞免疫反应。 通过静脉内给药。Sahin等人研究了编码四种非突变肿瘤相关抗原的黑色素瘤fixvac（bnt111）静脉内脂质体RNA（rna-lpx）疫苗。rna-lpx疫苗是一种成功的免疫治疗方法；针对疫苗抗原实现了强大的CD4+和CD8+ T细胞免疫，伴随着有利的临床反应。在某些反应者中，抗原特异性细胞毒性T细胞反应是持久的，并且常常记录采用T细胞治疗。 mRNA编码的免疫调节剂。肿瘤免疫疗法，也称为主动非特异性免疫疗法，是最早使用免疫系统调节剂的医学领域之一。体外靶细胞转染，或静脉内或肿瘤内递送，是体内通过mRNA产生免疫调节剂的主要方法。由于细胞因子，免疫系统的细胞可以在短距离内进行通信，细胞因子是先天和适应性免疫的重要调节剂。为了刺激癌症患者的免疫系统，细胞因子疗法已成为一种重要的治疗手段，并且是当前临床癌症研究的主要课题。mRNA编码细胞因子基免疫疗法的目标是以最少的毒性和系统暴露从递送重组蛋白中增加TME中的细胞因子数量。 鉴于其强烈的促炎特性，IL-12是癌症免疫疗法的一个有希望的选择。IL-12信号诱导1型T辅助细胞（Th1）分化、CD8+细胞获得细胞毒性活性以及激活IFN-γ的产生，所有这些都改善了吞噬功能和局部炎症。T细胞转染mRNA产生由p35和p40亚基组成的单链IL-12（scIL-12）是研究的主题之一。在同源和异种移植小鼠模型中，scIL-12表达T细胞的肿瘤内注射导致注射和远处肿瘤病变的完全排斥。通过与4-1BB配体（4-1BBL）mRNA共电穿孔，进一步增强了T细胞的抗肿瘤效果。已经显示，新型肿瘤内IL-12 mRNA治疗可以刺激Th1 TME转化和强大的抗肿瘤免疫。此外，在对检查点抑制剂有抵抗力的小鼠肿瘤模型中，将免疫检查点抑制剂与IL-12 mRNA结合使用，增加了抗癌反应，增强了总生存期（OS）和肿瘤退缩。 已经验证了多种mRNA编码不同细胞因子的免疫治疗效果。Hotz等人在肿瘤内给药后检查了编码四种细胞因子的mRNA，IL-12、IFN-α、IL-15 sushi和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子。这些细胞因子可能促进免疫记忆的发展，并具有强大的抗癌作用。Hewitt等人表明，在各种TME中，直接肿瘤内给药编码这些细胞因子的mRNA产生了强烈的抗癌反应。 肿瘤免疫疗法除了细胞因子外，还涉及mRNA编码的刺激配体和受体。免疫系统从刺激配体和受体接收炎症信号，这些信号可用于癌症免疫治疗。通过暂时为细胞提供刺激受体，mRNA可用于暂时激活强大的炎症信号。虽然这些免疫刺激剂不被视为癌症疫苗，但它们通常与其他免疫治疗方法（如检查点阻断调节剂）联合使用，以增强体液和细胞反应。一些研究表明，使用编码共刺激分子的mRNA电穿孔后，DC的免疫刺激活性显著增加，包括CD83、肿瘤坏死因子受体超家族成员4（也称为OX40）和4-1BBL。Trimix mRNA是一种由三个mRNA分子组成的mRNA基佐剂，编码CATLR4、激活刺激因子CD40L和共刺激分子CD70，该佐剂于2016年创建。Loomis等人表明，通过肌肉注射连接的体外转录mRNA-TLR7激动剂，可以在体内增强抗原特异性的细胞介导和体液反应。TriMix mRNA单独使用（TriMix mRNA加TAA mRNA，或自体单核细胞衍生的mRNA共电穿孔的树突状细胞与编码CD40配体、CD70和组成性激活的TLR4的mRNA，称为TriMixDC-MEL）以及与ipilimumab检查点抑制剂（一种阻断CTLA的单克隆抗体）联合使用，都能引发强大的免疫反应，从而带来有希望的临床反应和延长无病生存率（NCT01676779和NCT01302496）。这些II期研究是针对III/IV期黑色素瘤患者进行的治疗。 mRNA编码的抗体。自从首个抗体被批准用于癌症治疗以来，肿瘤学领域以越来越快的速度开发了基于抗体的治疗方法。因此，现在有几种获批的抗体和正在进行临床审查的其他候选物。Thran等人展示了mRNA在体外产生各种抗体和抗体类型的能力。此外，编码肿瘤抗体的mRNA可能引发强大的抗肿瘤免疫。 抗体在肿瘤治疗中的参与可以通过以下方法分类：i) 抗体在结合目标受体后，可能通过诱导凋亡信号或去除关键的生长信号，促进肿瘤细胞的直接死亡。ii) 通过附着于癌细胞特异性抗原，激活免疫介导的细胞死亡，诱导补体依赖性细胞毒性（CDC）或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）。iii) 阻断免疫检查点，涉及阻止PD1或CTLA4抗体，重新激活针对癌细胞抗原的T细胞反应，并触发免疫介导的细胞死亡。iv) 直接与癌细胞结合的T细胞，启动免疫介导的细胞死亡。 单克隆抗体（mAb）、mAb片段和工程变体（如二价抗体、三价抗体、小抗体和单域抗体）是参与肿瘤免疫治疗的抗体类别。单克隆抗体和双特异性抗体都经过了广泛的研究和使用。 首个获得癌症治疗许可的mAb，利妥昔单抗，靶向CD20并诱导CDC，以及较小程度的ADCC。它用于治疗慢性淋巴细胞性白血病和非霍奇金淋巴瘤。在体外前B细胞淋巴瘤模型中，编码这种mAb的mRNA是有益的。由于曲妥珠单抗抑制激酶活性、下游信号和人表皮生长因子受体2（HER2）/Erb-B2受体酪氨酸激酶2受体二聚体化，癌细胞饿死并最终死亡。通过与癌细胞上的诱导凋亡受体结合的拮抗性抗体，如肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体受体和抗体-药物偶联物，尤其是向癌细胞传递有毒有效载荷，也可能诱导直接肿瘤细胞死亡。当使用靶向肝脏的LNP配方鞘内给药时，从血清中检索到编码mRNA的曲妥珠单抗，并表现出ADCC。在HER2/neu阳性乳腺癌异种移植模型中，这种方法增加了存活率。通过将抗程序性细胞死亡配体1（PD-L1）mAb表达的自放大RNA注入小鼠肿瘤，可以促进转染细胞中PD-L1 mAb的翻译和CD8+ T细胞向肿瘤的浸润。尽管mAbs在癌症方面有多个积极的例子，但较差的组织穿透限制了完整抗体在肿瘤质量上均匀分布的能力。因此，已经努力修改抗体的结构，产生了具有改善的组织穿透性的新型抗体片段。抗体片段的发现在双特异性抗体（BsAbs）的研究中极大地帮助了，并被用作创建这些抗体的构建块。世界上第一个同时结合两种抗原的抗体是在1960年代由Nisonoff等人通过使用适度的再氧化方法将两个兔多克隆抗体血清的抗原结合片段结合起来创建的。 BsAbs相对于常规mAbs的一个可能好处是它们能够同时靶向两个不同的位点，并在一定程度上绕过肿瘤药物抗性。然而，由于BsAbs的血清半衰期很短（仅几个小时），它们必须不断使用输液泵给患者施用。克服这个限制的一个可能方法是使用mRNA直接在患者中产生治疗性抗体。 最近的一项研究强调了一种成功的双特异性靶向方法；一种临床上批准的LNP封装mRNA表达C-C基序趋化因子配体2（CCL2）和CCL5（bisccl2/5I），可以双特异性结合和中和。这显著促进了TAM向抗肿瘤M1表型的极化，并降低了TME中的免疫抑制。BisCCL2/5i与PD-1L抑制剂联合使用已被证明在小鼠模型中，原发性肝癌的胰腺、结直肠和肝脏转移中实现长期存活。Wu等人描述了使用mRNA编码具有消融Fc免疫学效应功能的BsAb。该抗体，也称为XA-1，靶向人PD-L1和PD-1。与直接用于癌症的抗体治疗不同，这项工作表明，使用XA-1 mRNA LNPs治疗可以有效地通过肝细胞产生内源性治疗性BsAbs。 mRNA编码的抗原受体。通过产生转基因T细胞受体（TCRs）或CARs，由于mRNAs的短暂性质，已经有可能为naïve T细胞提供肿瘤选择性。编码CARs或TCRs的mRNA已被证明具有价值；生成CARs或TCRs的短暂表达可以防止细胞因子释放综合征的发展，这是慢性T细胞激活的负面后果。CAR-T细胞作为最有前途的癌症过继免疫治疗方法引起了相当大的兴趣。 CAR-T治疗中，从患者体内提取免疫T细胞，通过体外基因改造，赋予其识别癌细胞表面的“嵌合抗原受体”（CAR）。这些改造后的细胞在实验室中扩增后，再输回患者体内。通常，细胞外的TAA特异性抗体结合域与细胞内的T细胞信号区域融合，形成嵌合受体。几乎每种肿瘤相关抗原都可能成为CAR-T细胞的靶标。然而，CAR-T治疗中也存在一些风险，包括针对非肿瘤组织的毒性。体外转录的mRNA CAR-T细胞作为一种安全的治疗方案正在兴起，因为它们可以避免针对性的抗肿瘤毒性。大多数研究使用mRNA电穿孔的CARs，这是一种实用且可扩展的方法，能够在不损害细胞产品活性的情况下实现淋巴细胞转染率超过90%。CAR表达在T细胞表面大约持续7天，并且在遇到目标细胞后内化的CARs不会恢复。然而，体外转录mRNA方法也有其缺点。包括较差的肿瘤浸润、当T细胞数量有限时制造困难、重复注射CAR-T细胞时副作用的风险，以及mRNA重定向T细胞的短寿命，导致编码蛋白的表达持续数天。最重要的是，电穿孔有各种缺点，可能严重影响生成的CAR-T细胞的质量。实际上，脉冲电场的应用可能会不可逆转地破坏细胞质膜的完整性。在存活的转染细胞中，可能会观察到转基因表达减少、异常的基因表达谱和较差的活性。实际上，研究表明，与未修饰和未纯化的mRNA相比，使用化学修饰的1mΨ mRNA和/或进一步纯化以去除dsRNA的mRNA，小鼠T细胞电穿孔的CAR编码mRNA显示出显著降低的检查点分子（PD-1和淋巴细胞激活基因3）上调。这赋予了免疫沉默的mRNA转染T细胞更大的杀伤力，即使在细胞的CAR表达消失后也能持续。当前结果必须在mRNA CAR-T细胞的生产中考虑，以满足临床试验的目标，目前正在进行mRNA CAR研究，针对血液和实体肿瘤恶性肿瘤。 目前，mRNA CAR-T细胞受到极大关注，并在肿瘤治疗研究中显示出有希望的结果。使用mRNA CAR-T细胞治疗血液恶性肿瘤已经看到了有利的临床前和临床结果。主要靶标包括CD19、CD37、CD33和CD123。已经进行了针对淋巴瘤和白血病的mRNA CAR-T细胞治疗的临床前研究。针对霍奇金淋巴瘤的CD19方法和针对复发/难治性急性髓系白血病的CD123方法都在临床研究中进行了测试。这两项研究表明mRNA CAR-T治疗是安全的。Jetani等人最近提出了一种新的mRNA CAR-T细胞治疗方法，他们确定了siglec-6作为AML中CAR-T细胞的新靶标。Lin等人创建了一种新的CD8+ CAR-T细胞产品Descartes-08，用于治疗多发性骨髓瘤；该产品初步显示出持续的反应和强大的治疗指数。间皮瘤、卵巢癌、结直肠癌、乳腺癌和黑色素瘤是已经研究了mRNA CAR-T治疗的实体恶性肿瘤。 组合疗法-免疫疗法和mRNA疫苗。mRNA治疗与另一种治疗方式的结合可能在肿瘤治疗中显示出巨大潜力。肿瘤抗原与免疫调节剂之间的相互作用是当前研究的主要焦点。 早期研究表明，将TAA和IL-12 mRNA转染到成熟的DC中可以增强TAA特异性CTLs，这可能被用来触发由NK效应细胞和CTLs介导的针对肿瘤的免疫反应。通过测试编码HLA-II类靶向信号（DC-LAMP）、黑色素瘤相关抗原、CD40配体、CATLR4和CD70融合蛋白的mRNA，证明了使用trimixdc Mel的细胞免疫疗法的安全性和免疫原性。在研究的IV剂量水平下，看到了具有持久疾病控制的抗肿瘤效果。 最近，在转移性肾细胞癌的3期研究中使用了Sunitinib和rocapuldencel-T。通过电穿孔自体免疫，使用成熟的单核细胞衍生的DCs制备的放大肿瘤RNA和CD40L RNA，并没有提高接受组合治疗的患者的总生存期。然而，与总生存期相关的免疫反应得到了增强。 mRNA疫苗的蛋白质疗法 诱导癌细胞死亡的方法。通过使用mRNA疗法，可以使得癌细胞产生一种致命的细胞内蛋白，导致细胞自我毁灭。Van Hoecke等人通过宫内传递编码混合谱系激酶结构域样蛋白的mRNA，导致肿瘤生长停滞和诱导坏死性肿瘤细胞死亡。 蛋白质替代疗法。IVT mRNA在蛋白质替代疗法中的使用是基于产生可以激活或抑制细胞途径的外来蛋白，以及补充缺失或表达不足的蛋白质。自1992年首次用于蛋白质替代的临床前评估以来，IVT mRNA注射已被用于针对几种蛋白质。 鉴于它们的可及性，肝脏、肺和心脏是IVT mRNA基于蛋白质替代治疗的主要靶标。然而，其他组织和器官，如皮肤、眼睛的背面或鼻腔，也被视为潜在的靶标。罕见和遗传性疾病是这种治疗方式的主要目标。疾病引起的下调蛋白与遗传异常有关，并由治疗性IVT mRNA编码。 IVT mRNA作为蛋白质替代疗法正在作为癌症治疗的一种方式进行研究。然而，这是非常困难的，因为它需要反复给药，有时甚至是全身分布，以及靶向mRNA表达。据我们所知，目前在蛋白质替代领域还没有开始使用IVT mRNA的临床试验。 在96%的高级别浆液性卵巢癌患者中存在肿瘤蛋白（TP53）的突变。由TP53基因表达的p53蛋白识别并修复细胞中的DNA损伤，并在损伤无法修复时诱导细胞死亡，从而避免异常细胞的增殖，防止癌症的发生。当TP53基因突变时，表达的突变p53蛋白失去了其致癌效应。在最近的一项研究中，一个团队合成了编码正确p53蛋白的mRNA，并将其装载到脂质体中进行传递，从而允许mRNA在癌细胞中表达功能性p53蛋白。经过上述mRNA治疗后，来自患者的卵巢类器官开始萎缩和死亡，小鼠模型中的原发性肿瘤和转移瘤几乎完全消失。这些发现表明，基于IVT-mRNA的蛋白质替代疗法可能重新激活癌细胞中的致癌蛋白，因此可能成为癌症治疗的宝贵治疗选择。 基因编辑的mRNA疫苗。mRNA技术表达可编程核酸酶，如锌指核酸酶、转录激活因子效应物核酸酶和成簇的规则间隔短回文重复序列（CRISPR）-CRISPR相关内切酶（Cas）9系统，允许基因编辑作为一种潜在的治疗手段。通过向细胞基因组提供特定部位的变异，例如纠正有害突变或引入保护性变化，这些基因组工程技术允许替换或修改基因表达。CRISPR-Cas9由Cas9核酸内切酶和单导向RNA（sgRNA）组成，是一种广泛使用的基因编辑工具。CRISPR-Cas9治疗可用于永久性地消除癌细胞存活基因，避免了重复给药的需要，从而提高治疗效果。癌细胞或T细胞被转染了封装在脂质纳米颗粒（LNPs）中的Cas9 mRNA和sgRNA。mRNA在细胞质中翻译以产生Cas9蛋白，然后与sgRNA复合形成对特定DNA序列有亲和力的核糖核蛋白。接下来，核糖体复合物转移到细胞核以破坏肿瘤存活基因。当这种情况发生在T细胞中时，PD-1和内源性TCR基因被敲除以在肿瘤细胞中诱导凋亡。Ling等人使用针对E6或E7致癌基因的Cas9 mRNA和gRNA治疗宫颈癌。结果表明，这种方法不仅有效地敲除了致癌基因，还逆转了免疫抑制微环境以实现抗肿瘤效果。 再生医学 再生医学的目标是通过重新建立或恢复其正常功能来替代、再生或恢复受损或被破坏的组织、器官或细胞。调节细胞生物活性的蛋白质，如细胞分裂、迁移和分化以及生长因子、细胞因子和转录因子，对再生过程至关重要。将体外转录mRNA转染到体细胞中表达转录因子，是传统的体细胞重编程和转分化的有吸引力的替代方法。在再生医学中使用体外转录mRNA的主要目标是增加1型糖尿病患者分泌胰岛素的能力。使用细胞和间充质干细胞工程进行肿瘤治疗尚未得到广泛关注。已经证明，使用前列腺素E2受体拮抗剂从干细胞中诱导出具有转移干细胞特性的干细胞外泌体，并用于癌症治疗和再生医学。干细胞外泌体可以降低肿瘤抗性。是否可以使用mRNA疫苗表达具有转移干细胞特性的干细胞外泌体用于癌症治疗，这是一个考虑点。 7.结论和未来展望  由于新型抗肿瘤药物和疗法的不断发展，癌症患者的生存几率有所提高；然而，包括肿瘤药物抗性、剂量毒性等问题在内的一些问题，不断带来新的困难。与标准治疗方法相比，大多数恶性肿瘤的生物治疗旨在通过刺激自身免疫和阻断关键信号转导来预防肿瘤生长和发生。人们对于mRNA基技术的长期效果缺乏一些担忧；研究人员正试图使用mRNA治疗挑战目前的疾病治疗方法。 自从Wolff等人证明体外转录的mRNA可以在活细胞中产生蛋白质以来，mRNA疫苗在几个应用中已显示出成功。作为一种有前途的新型平台，基于mRNA的疫苗需要克服冷链保存的限制，并提供更好的适应性、有效性、简便性和可扩展性，以及降低成本。mRNA疫苗在传染病方面已显示出益处，癌症是mRNA技术的预定目标。在未来2-4年内，使用定制癌症疫苗的几项积极的临床研究应该完成。 在肿瘤治疗中使用组合mRNA治疗似乎有着有希望的前景。包括手术、放疗和化疗在内的目前肿瘤治疗方法效果很好。作为一种新型生物治疗，mRNA治疗需要额外的临床试验，以提供一个更好的整合计划，然后才能有效地纳入当前程序。此外，mRNA技术可以与免疫疗法结合使用；目前，大多数研究集中在免疫调节剂上。由于其独特的优势，mRNA也预计将取代ILs、IFNs和细胞集落因子等重组蛋白药物。由于体外转录mRNA在基因编辑技术中减少误差的能力，肿瘤基因治疗可能会取得进展。假设通过将目标基因引入载体来完成肿瘤基因治疗，mRNA治疗最终可能会降低遗传家族性肿瘤的流行率。因此，更广泛的癌症患者可能会从这些新解决方案中受益。 未来对癌症mRNA疫苗的研究应该集中在治疗性和预防性疫苗的开发上。个性化mRNA疫苗为对当前治疗无反应的肿瘤，如胰腺癌，提供了新的治疗策略。此外，mRNA技术可以用来开发针对癌症重要原因的病毒的疫苗，如HPV和HBV。研究表明，在动物研究中，HPV mRNA疫苗比HPV重组蛋白疫苗和HPV DNA疫苗对肿瘤更有效，支持使用mRNA技术开发预防肿瘤的预防性疫苗的未来，这将在临床试验中进一步评估。 此外，mRNA疫苗的灵活性、适应性和快速生产能力将为未来预防和治疗传染病和癌症提供激动人心的可能性，这将有助于减少全球疾病负担。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

摘要:程序性细胞死亡1（PD-1）信号通路是免疫检查点调节的关键因素，已成为癌症免疫治疗的焦点。在癌症的背景下，肿瘤细胞上上调的PD-L1可能导致T细胞耗竭和免疫逃逸，促进肿瘤进展。PD-1/PD-L1抑制剂的出现通过解除T细胞的耗竭显示出临床成功。然而，诸如抗药性和不良反应等挑战促使人们探索创新策略，双特异性抗体（BsAbs）作为有希望的前沿出现。BsAbs通过同时靶向PD-L1和其他免疫调节分子，为癌症免疫治疗提供了一种多方面的方法。我们重点关注PD-1/PD-L1治疗的最新进展，特别强调BsAbs的开发和潜力，尤其是在实体瘤的背景下。讨论了针对PD-1信号的各种BsAb产品，突出了它们独特的作用机制和治疗潜力。值得注意的例子包括抗TGFβ×PD-L1、抗CD47×PD-L1、抗VEGF×PD-L1、抗4-1BB×PD-L1、抗LAG-3×PD-L1和抗PD-1×CTLA-4 BsAbs。此外，我们还总结了正在进行的临床研究，评估这些创新BsAb药物的疗效和安全性。通过揭示肿瘤微环境的复杂性并利用抗PD-1/PD-L1 BsAbs的协同效应，有潜力提高癌症免疫治疗的精确性和有效性，最终实现针对个体患者档案量身定制的个性化治疗策略的发展。 1.背景 程序性细胞死亡1（PD-1）信号作为一种基础的免疫检查点机制，能够降低炎症反应并维持免疫稳态。PD-1中的关键结构，即免疫受体酪氨酸基抑制/开关基序（ITIM/ITSM），促进信号传导并在细胞内招募磷酸酶（SHP1/2）。PD-1/PD-L1信号不仅作为预防自身免疫疾病的关键途径，而且显著影响肿瘤免疫监视与免疫耐受之间微妙的平衡。肿瘤细胞或浸润淋巴细胞上PD-L1的增加可能导致T细胞耗竭，抑制肿瘤特异性免疫并促进肿瘤进展。PD-1/PD-L1抑制剂通过阻断负性调节信号，有效释放T细胞的耗竭状态，成为开创性的治疗方法。自2014年FDA批准首个抗PD-1抗体（帕博利珠单抗）以来，PD-1/PD-L1阻断疗法已经彻底改变了临床实践，展现出对难治性肿瘤特别有效的强大且持久的抗肿瘤效果。PD-1/PD-L1抑制剂通过破坏肿瘤利用的免疫抑制信号，使免疫细胞更有效地识别和杀死癌细胞。抗PD-1/PD-L1药物的临床成功强调了免疫检查点阻断在癌症治疗中的重要性。然而，诸如抗药性、有限的响应率和不良反应等挑战促使人们探索创新策略以优化和扩大治疗影响。与此同时，双特异性抗体已成为癌症免疫治疗中有希望的前沿。通过同时靶向PD-L1和参与免疫调节的其他关键分子，双特异性抗体（BsAbs）提供了一种多方面的方法来增强抗肿瘤免疫反应。本综述深入探讨了PD-1/PD-L1阻断的最新进展，并探索了双特异性抗体的潜力，重点关注它们在实体瘤中的开发和应用。通过阐明针对PD-L1 BsAb开发的进步，特别是为实体瘤量身定制的那些，本综述旨在为癌症免疫治疗的不断发展的理解做出贡献，并为更有效和个性化的治疗策略铺平道路。 2.BsAb的进步 2.1.BsAb的开发 针对肿瘤相关抗原（TAAs）的单克隆抗体，如Her2或EGFR，在乳腺癌和肺癌治疗中的成功，促使人们探索创新方法，包括开发BsAbs。BsAbs自20世纪80年代引入以来，因其在癌症治疗中的潜力而受到广泛关注。从功能上讲，BsAbs作为免疫效应细胞和肿瘤细胞之间的有效连接，或同时阻断两种不同的致癌分子。此外，一些BsAbs通过引导各种效应细胞以非MHC限制的方式杀死肿瘤细胞来增强肿瘤杀伤（图1）。技术的进步已经产生了各种BsAb格式，根据Fc结构域分类为非IgG格式和IgG格式。IgG样制剂保留Fc介导的抗体效应功能，而无Fc的BsAbs缺乏这些功能。双特异性T细胞引导剂（BiTEs）和TriomAbs是著名的BsAb格式。BiTEs缺乏Fc结构域，表现出短的血清半衰期，限制了它们的临床应用。TriomAbs具有IgG样结构，显示出更慢的清除率，但面临免疫原性和由于Fc结构域导致的渗透性受损的挑战（图2）。 图1 双特异性抗体（BsAbs）通过非MHC限制性方式引导各种效应细胞向肿瘤细胞，增强了肿瘤杀伤能力。BsAbs促进了T细胞与肿瘤细胞之间的相互作用，触发了一系列导致T细胞激活的事件。活化T细胞在癌细胞裂解中采用的主要机制涉及Granzyme-B和Perforin（改编自BioRender 2023的“双特异性抗体作用机制”）。 图2 blinatumomab和TriomAbs的杀伤肿瘤机制。Blinatumomab是一种抗CD3×CD19的双特异性T细胞引导剂（BiTE）抗体。Blinatumomab旨在结合B细胞的CD19和T细胞的CD3。通过连接这两种细胞类型，blinatumomab有助于促进T细胞对癌细胞的反应，导致B细胞白血病细胞的破坏。Catumaxomab是基于TriomAbs技术的抗CD3×EpCAM BsAb，结合癌细胞的EpCAM和T细胞的CD3。值得注意的是，Fc结构域可以结合效应细胞（包括NK细胞、巨噬细胞和树突细胞）的Fcγ受体，触发抗体依赖性细胞毒性或吞噬作用，以及对癌细胞的补体依赖性毒性（改编自BioRender 2023的“双特异性抗体设计”）。 在过去十年中，BsAb的开发主要由BiTEs主导。这些抗体同时结合T细胞的CD3和肿瘤细胞的TAAs，激活T细胞信号级联并启动依赖目标的肿瘤细胞杀伤。与检查点抑制剂不同，BiTEs克服了T细胞受体（TCR）的主要组织相容性复合体（MHC）限制，在临床上通过FDA批准的blinatumomab（抗CD3×CD19）得到了验证。此外，抗CD3×CD20 BsAb mosunetuzumab也已获准用于难治性或复发性滤泡性淋巴瘤。然而，尽管在血液恶性肿瘤中观察到有希望的结果，但在实体瘤中的双特异性抗体治疗效果，这些占所有癌症的90%，仍然是一个挑战，主要是由于抑制性肿瘤微环境（TME）损害了T细胞活性并促进了免疫缺陷。 另一条BsAb研究途径涉及同时靶向肿瘤细胞上的两个表位或TME中的细胞因子（图3）。与BiTEs不同，这些双特异性抗体旨在阻断两条促肿瘤信号通路，产生协同抗癌效果或最小化药物抗性。例如，双功能抗体M7824，靶向PD-L1和TGFβ，在非小细胞肺癌（NSCLC）患者中显示出显著的临床疗效。此外，尽管BsAb在实体瘤中的临床结果与血液恶性肿瘤相比不太令人满意，但正在进行的研究和临床试验，特别关注通常表达的抗原（例如EpCAM、HER2、PSMA和CEA），展示了BsAb在癌症免疫治疗中的巨大潜力。最近，同时靶向PD-L1和其他免疫抑制分子的BsAbs已经开发出来。这些BsAbs在临床前和临床研究中显示出强大的抗肿瘤活性，被视为下一代免疫检查点抑制剂（ICIs）。 图3 同时靶向肿瘤细胞上的两种免疫抑制分子或肿瘤微环境中的细胞因子的双特异性抗体。与BiTEs不同，这些双特异性抗体旨在阻断两条免疫抑制信号通路（4-1BB激动剂抗体除外），产生协同抗癌效果或最小化药物抗性（使用Biorender创建）。 2.2.BsAb在实体瘤中的挑战 在解决实体瘤恶性肿瘤时，BsAbs遇到了阻碍其临床成功的重大障碍。主要挑战包括管理与治疗相关的不良反应，减轻靶向和非靶向毒性，并应对免疫抑制性TME的复杂性。与BsAbs相关的关键问题，特别是那些具有完整Fc结构域的BsAbs，是非靶向毒性的风险，以细胞因子释放综合征（CRS）为例。CRS是一种系统性炎症反应，其临床表现范围从轻微症状到严重的、潜在致命的情况，通常以细胞减少等实验室标志为特征。CRS的病理生理学涉及由活化T细胞释放的IFN-γ触发的免疫级联反应，随后促使巨噬细胞产生过量的炎症细胞因子。这个问题的一个重要贡献者是无意中的T细胞激活，这可能通过非靶细胞上的FcγR结合等机制发生。 标准的缓解策略包括皮质类固醇预处理和优化剂量。此外，针对CRS发病机制中的关键细胞因子IL-6，使用tocilizumab等拮抗剂已显示出在不损害BsAb治疗的抗肿瘤效果的情况下减轻这些不良影响的希望。此外，BsAb设计的创新，如采用无Fc格式或具有修改Fc结构域的抗体，对于减少这些风险至关重要。此外，靶向毒性直接与BsAbs的靶向特异性相关。虽然某些肿瘤相关抗原（TAAs）表现出适用性，但其他由于在正常组织中的存在而带来风险，导致显著的毒性。例如，靶向EpCAM的BsAbs已经显示出这个问题。此外，BsAbs对其靶标的强亲和力可能导致靶向CRS。然而，与组织毒性不同，靶向CRS通常是短暂的，可以通过剂量调节和支持性治疗进行管理。 此外，BsAbs在实体瘤中的有效性受到TME的严重影响。一个重大挑战是免疫沙漠肿瘤中T细胞浸润不足，这限制了BsAb的效力。创新的干预措施，如使用溶瘤病毒，已被用来提高T细胞浸润，将“冷”肿瘤转化为更具反应性的“发炎”肿瘤，从而克服对T细胞参与BsAb治疗的抗性。此外，TME的免疫抑制特性，以BsAb治疗期间PD-1和PD-L1的上调为标志，呈现了另一个障碍。BiTEs在实体瘤中的中等效力导致了探索辅助疗法，如检查点抑制剂和T细胞共刺激因子，以增强其抗肿瘤活性。这些组合在临床前研究中通过克服T细胞耗竭和放大BiTE效果显示出希望。此外，将BiTEs与4-1BB激动剂等T细胞共刺激因子结合使用的策略，在提高BiTE性能方面已经有效。总之，将BsAbs与其他免疫疗法结合可以增强治疗效果，尽管结果因BsAb组成、靶标抗原和肿瘤类型而异。因此，BsAbs与实体瘤TME之间的复杂动态需要多方面和创新的治疗策略，以充分发挥其潜力。 3.抗TGFβ×PD-L1 BsAb 3.1.TGFβ在癌症免疫学和免疫治疗中的作用 转化生长因子β（TGFβ）信号通路在癌症生物学中表现出双重性质，根据特定的细胞和组织环境，既发挥肿瘤抑制作用，也发挥促进肿瘤的作用。在正常细胞中，TGFβ的功能是维持细胞稳态并防止肿瘤起始，主要通过阻断细胞周期、促进细胞分化和触发细胞凋亡。该途径在不同细胞类型中的响应因Smad蛋白等因子的差异表达而异。相比之下，在癌细胞中，TGFβ的调节作用通常因突变或表观遗传变化而受到干扰或改变，导致从控制增殖转变为促进癌症进展。在肿瘤微环境中，过度活跃的TGFβ信号，通常在正常上皮细胞中具有抑制作用，反常地支持肿瘤生长、侵袭和转移行为。值得注意的是，TGF-β诱导的上皮-间充质转化（EMT）在癌症发展、侵袭和扩散中至关重要。EMT对TGFβ水平的灵活性和可逆性强调了它作为潜在治疗靶点的重要性，特别是因为它促进了与肿瘤进展和化疗抗性相关的干细胞样表型。全面了解TGFβ在不同癌症类型和组织中的对比作用，以及其对肿瘤微环境的影响，对于设计靶向治疗以遏制癌症进展至关重要。 值得注意的是，越来越多的证据表明，TGFβ在癌症免疫学和免疫治疗的复杂格局中扮演着核心角色，对肿瘤发生和免疫调节发挥双重作用。其在肿瘤微环境中的作用是多方面的，它不仅有助于促进肿瘤发生，还建立了一个免疫抑制环境，保护癌细胞免受免疫监视。TGFβ的免疫抑制功能通过其能力抑制各种免疫细胞的激活和功能来体现，包括自然杀伤细胞、T细胞和树突细胞。此外，TGFβ增强了免疫抑制性调节性T细胞（Tregs）的分化和扩增，进一步倾向于免疫逃逸，有利于癌细胞。在癌症免疫治疗的背景下，TGFβ的免疫抑制性质构成了一个重大障碍。旨在中和或抑制TGFβ信号的策略已成为提高免疫疗法效果的有希望途径。值得注意的是，抗TGFβ×PD-L1 BsAb的发展代表了一种开创性的方法，同时靶向肿瘤微环境中的多个免疫抑制途径，从而释放免疫系统对抗癌症的全部潜力。 值得注意的是，TGFβ在癌症中的双重作用强调了理解其在有效患者选择中的情景影响的必要性。TGFβ信号的多效性活动在开发癌症治疗的拮抗剂中提出了挑战，特别是由于缺乏特定的生物标志物和确立的剂量方案。为了将TGFβ阻断剂有效地整合到前线癌症治疗中，未来的临床试验需要专注于生物信息学和识别分子生物标志物，用于患者分层和治疗优化。 3.2.M7824和其他双功能抗体 M7824是一种新型双功能融合蛋白，代表了PD-L1×TGFβ双重阻断疗法的重要进展（表1）。这种创新药物结合了Fab中的抗PD-L1域和Fc中的TGFβ受体，允许同时靶向两种免疫抑制途径。M7824旨在靶向肿瘤细胞上的PD-L1分子，将陷阱分子定位在肿瘤微环境中以捕获免疫抑制性TGF-β。然后，M7824被表达PD-L1的细胞内化，导致去除M7824结合的TGF-β。理论上，由于其物理桥接效应，M7824预计对肿瘤细胞的特异性比两种单克隆抗体的组合要大。在动物模型中，M7824显示出强大的抗肿瘤效果，明显延缓肿瘤生长并延长存活。除了其直接的抗肿瘤效果外，M7824诱导了肿瘤微环境的大量重塑，包括预防或逆转TGFβ介导的癌细胞上皮-间充质转化。这种改变增强了肿瘤细胞对免疫介导攻击和化疗药物的敏感性。融合蛋白增加了细胞毒性淋巴细胞的数量和活性，同时减少免疫抑制亚群的比例，包括Tregs、骨髓源性抑制细胞（MDSC）和M2样巨噬细胞。此外，M7824诱导肿瘤基质重塑，有助于改善免疫细胞浸润，并加强其作为多方面免疫治疗剂的潜力。此外，当与放疗、化疗和其他免疫治疗剂结合使用时，它增强了整体抗肿瘤活性。在1期试验中，M7824提供了有希望的响应，特别是在高PD-L1表达的NSCLC中（NCT02517398）（表2）。 M7824的成功促进了额外的抗TGFβ×PD-L1双功能蛋白的探索和发展。其中，SHR-1701的结构让人想起M7824，结合了抗PD-L1域和N末端截短的TGFβRII。在1期临床试验（NCT05179239）中，SHR-1701在复发性转移性宫颈癌中表现出抗肿瘤活性。同样，由抗PD-L1抗体和TGFβRII外细胞域组成的双功能蛋白BR102，在小鼠肿瘤模型中展示了抗肿瘤活性。这些新兴的抗体，包括SHR-1701和BR102，为潜在的抗TGFβ×PD-L1阻断疗法的不断扩大的武器库做出了贡献，为癌症免疫治疗的复杂格局提供了新的治疗策略。 3.3.YM101和BiTP YM101被誉为世界上首个公开报道的抗TGFβ×PD-L1 BsAb，标志着癌症免疫治疗领域的关键进步。利用Check-BODY™技术平台设计，YM101代表了用于对抗PD-L1和TGF-β双重挑战的创新策略。临床前研究揭示了YM101有效抵消TGF-β和PD-1×PD-L1信号通路效应的能力。此外，在体内证据表明，YM101在抗肿瘤活性方面优于单独的抗TGF-β和抗PD-L1治疗。我们假设这种改善的抗肿瘤效果可能归因于YM101独特的物理桥接效应带来的增强的肿瘤特异性。然而，必须承认，我们目前的推测缺乏实验证据来证实它。在未来的研究中，必须使用同位素标记等技术进一步验证并展示YM101的优势，特别是在其增加肿瘤特异性和相关增强抗肿瘤效果的潜力方面。 此外，YM101在塑造肿瘤微环境方面发挥了变革性作用，促进了以增加的肿瘤浸润性淋巴细胞（TIL）数量和活性为特征的炎症肿瘤的形成。YM101还将巨噬细胞的极化平衡转向抗肿瘤的M1表型，进一步增强了其免疫治疗潜力。此外，在临床前研究中，STING激动剂和YM101的组合通过针对三条独立且互补的途径，展示了强大且持久的抗肿瘤免疫保护。STING激动剂诱导树突细胞成熟并激活巨噬细胞，重新点燃免疫学上的冷肿瘤，并增强全身的先天和适应性免疫反应。与YM101结合使用时，STING激动剂协同作用，使肿瘤微环境正常化并阻碍非炎症模型中的肿瘤生长。 受到临床前结果的鼓舞，随后开发了用于临床试验的替代分子（BiTP）。BiTP与YM101具有相似的结构，并使用Check-BODY™平台构建，在小鼠三阴性乳腺癌（TNBC）模型中证明了其有效性。在人源化TNBC模型中的有效性实验表明，BiTP显示出比相应单一疗法更好的抗肿瘤效果。BiTP减少胶原蛋白生成，增强T细胞渗透，并增加淋巴细胞向肿瘤的浸润。目前，正在进行多项BiTP的临床试验，包括CTR20211776（用于实体瘤）和CTR20223410（用于胰腺癌）。总的来说，以YM101、BiTP和M7824为代表的抗TGF-β×PD-L1 BsAb的开发，代表了癌症免疫治疗的变革性方法。这些创新药物旨在同时靶向多条免疫抑制途径，在临床前和临床环境中显示出显著的效果。在组合疗法中观察到的协同效应进一步强调了这些抗体克服抗性机制并扩大其在不同肿瘤类型中的适用性的潜力。 4.抗CD47×PD-L1 BsAb CD47在癌症中发挥关键作用，通过与其配体肿瘤细胞上的信号调节蛋白α（SIRPα）结合传递“不要吃我”信号。破坏CD47或其配体的抗体在临床前研究和临床试验中显示出治疗效果。CD47阻断增强了各种肿瘤模型中的抗原呈递、吞噬作用和免疫浸润，支持了CD47阻断免疫治疗药物的开发。此外，CD47/SIRPα和PD-1/PD-L1信号的双重阻断，分别抑制先天和适应性免疫反应，在多种癌症类型中显示出增强的治疗效果，为刺激免疫系统的两个分支提供了有希望的治疗途径。基于纽扣-入洞（KIH）平台，Wang等人开发了一种抗CD47×PD-L1 BsAb 6MW3211，该抗体设计有一个通用轻链，对CD47具有低亲和力，对PD-L1具有高亲和力。这种独特的亲和力配置文件允许优先结合肿瘤细胞的PD-L1，抑制CD47信号通路。6MW3211在多种小鼠模型中展示了强大的治疗效果，并在体内展示了有希望的药代动力学和安全性。通过多重荧光免疫组化染色确认的多种人类肿瘤上CD47和PD-L1的共表达，支持6MW3211针对PD-L1+ CD47+癌症的临床试验的潜力。 此外，Chen等人构建了一个亲和力调整的抗CD47×PD-L1 BsAb（hBisAb），以提高抗体选择性和治疗效果。hBisAb利用纽扣-入洞技术和通用轻链结构开发，采用IgG1格式。这种人性化抗体对CD47表现出中等亲和力，对PD-L1表现出高度有效的亲和力，这一点通过表面等离子共振和基于细胞的实验获得的动力学速率常数得到证实。特别设计用于优先结合PD-L1，该抗体有效阻断PD-1/PD-L1相互作用，也抑制了CD47/SIRPα轴。这种双重作用机制不仅增强了T细胞功能，还显著提高了巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用，超过了单独针对任一检查点的单一疗法。体外和体内研究表明，hBisAb对肿瘤细胞具有显著的选择性，超过了红细胞，解决了CD47靶向疗法常见的挑战，通过最小化不必要的血液学效应。这种选择性进一步由抗体在肿瘤微环境中对表达PD-L1的细胞的优先结合所强调，减少了非靶向效应，提高了治疗安全性。特别是IgG1形式的双特异性抗体在促进抗体依赖性细胞吞噬（ADCP）和DC介导的T细胞激活方面显示出优越的效力，导致同种异体小鼠模型中显著的肿瘤生长抑制和提高的生存率。值得注意的是，这种方法通过维持治疗小鼠的正常红细胞计数和体重，减轻了与CD47靶向相关的潜在毒性，突出了双特异性抗体增强的抗肿瘤效果和减少的副作用。 此外，还有一些其他的抗CD47×PD-L1 BsAbs已被报道。例如，IBI322被设计为通过优先结合PD-L1+CD47+肿瘤细胞，诱导肿瘤细胞吞噬，同时最小化对CD47+PD-L1−细胞（如红细胞）的影响，以提高治疗选择性和效果。同样，一种双重靶向融合蛋白IAB有效地结合了CD47和PD-L1，展示了强大的抗肿瘤活性，并在激活先天和适应性免疫对抗肿瘤中发挥了至关重要的作用。这些创新方法强调了双重检查点阻断的潜力，同时靶向CD47和PD-L1，以改善治疗结果，同时减轻与传统抗体相关的毒性。 5.抗VEGF/PD-1和抗VEGF/PD-L1 BsAb VEGF是由低氧肿瘤微环境诱导的，刺激内皮细胞增殖和血管生成。此外，VEGF具有免疫抑制作用，促进免疫抑制细胞的招募并阻碍免疫细胞浸润。将抗血管靶向药物与ICIs结合使用已在多种癌症中显示出协同抗肿瘤效果，突出了双重治疗策略在癌症治疗中同时解决血管生成和免疫反应的潜力。目前，已有多种抗VEGF×PD-1和抗VEGF×PD-L1 BsAbs成功开发用于癌症免疫治疗。 Hassanzadeh等人构建了一种双价抗PD-L1×VEGF纳米抗体，证明了其在体外有效抑制血管生成。此外，针对PD-L1和VEGF的BsAb HB0025是利用mAb-Trap技术开发的。临床前研究表明，HB0025在抑制肿瘤生长方面比单独使用抗PD-L1抗体或VEGFR1D2融合蛋白更有效。而且，Xiong等人开发了一种全人源双特异性单链双抗体（BsDb），靶向VEGF165和PD-1。这种BsDb展示了高度特异性，抑制了VEGF165诱导的人脐静脉内皮细胞中的活动，并增强了T细胞增殖和IFN-γ的产生。在小鼠模型中，BsDb通过抑制血管生成和激活免疫反应，表现出强大的抗肿瘤活性，表明其作为双重靶向BsAb用于癌症治疗的潜力。重要的是，2期临床试验评估了AK112（一种人源化IgG1抗VEGF×PD-1 BsAb）与化疗联合用于晚期NSCLC的疗效和安全性。该研究包括具有不同治疗历史和基因组改变的三个队列。1、2和3队列中确认的客观反应率（ORR）分别为53.5%、68.4%和40.0%。研究结果表明，AK112加铂类药物显示出有希望的抗肿瘤活性和安全性，为晚期NSCLC患者提供了一种潜在的新治疗选择。 6.抗4-1BB×PD-L1 BsAb 4-1BB（CD137）是一种由活化的NK和T细胞表达的诱导性共刺激分子。4-1BB信号，由其在专职抗原呈递细胞（APCs）上的配体相互作用触发，激活了通路，导致增强的细胞因子产生、存活、增殖和免疫记忆。在肿瘤微环境中，4-1BB作为肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）的标志物，通常与PD-1共表达。4-1BB激活在临床前模型中显示出有希望的抗肿瘤反应，4-1BB激动剂抗体与PD-1/PD-L1抑制剂的组合协同增强了抗肿瘤免疫。目前，4-1BB激动剂与抗PD-1治疗的组合使用面临重大挑战，尤其是系统毒性。例如，由于系统激活4-1BB途径导致的剂量依赖性肝炎，一种治疗性CD137激动剂抗体的临床开发被中止。从理论上讲，BsAb技术具有潜力，因为它可能通过PD-L1结合激活4-1BB，从而增强肿瘤特异性T细胞反应。这种方法看起来很有前景，因为PD-1和4-1BB都在肿瘤特异性CD8+CTLs上共表达。 为了通过将4-1BB激动剂与这些抑制剂结合来增强ICIs的治疗效果，已经开发了几种抗4-1BB×PD-L1 BsAbs。MCLA-145被设计为一种IgG1分子，对Fc CH3域进行了特定修改以鼓励重链异二聚体化，并对CH2域进行了修改以防止Fc受体结合。体外实验表明，MCLA-145可以有效地激活T细胞，加强T细胞启动、分化和免疫记忆，并显示出比ICI对照组更好的抗肿瘤活性。重要的是，MCLA-145在非人灵长类动物中显示出没有移植物抗宿主病和最小的不良影响。在机械上，MCLA-145通过结合肿瘤细胞上的PD-L1和T效应细胞上的CD137，促进了“免疫突触”的创建。在这个突触中，T细胞可以在接受增强的TCR信号的同时解除PD-1抑制，并且CD137激活得到加强。随后的研究已经证实，MCLA-145通过PD-L1邻近细胞表达超过5000份PD-L1时有条件地激活CD137信号。这种有条件的激活提供了安全性和有效性的潜在优势。重要的是要注意，即使在最大饱和条件下，MCLA-145也不能在没有邻近细胞表达PD-L1的情况下触发CD137信号。另一种双特异性抗体ABL503，仅在PD-L1的背景下选择性激活4-1BB信号，避免了用抗4-1BB激动剂抗体治疗的患者观察到的剂量依赖性毒性。ABL503在临床前模型中展示了强大的抗肿瘤活性和改善的安全性。 PRS-344/S095012是为了阻断PD-1/PD-L1通路并定位于PD-L1阳性的肿瘤微环境中的4-1BB共刺激而开发的。这种双特异性分子有效地将免疫检查点抑制剂(ICI)与肿瘤微环境中定位的4-1BB介导的免疫刺激相结合，在小鼠模型中展示了比单克隆抗体组合更优越的T细胞刺激和抗肿瘤活性。此外，HK010，一种Fc突变的IgG4抗4-1BB×PD-L1 BsAb，通过同时阻断PD-1/PD-L1信号和刺激4-1BB信号，展现出强大的抗肿瘤效果。HK010在临床前模型中显示出强大的抗肿瘤免疫，诱导持久的抗原特异性免疫记忆，并且耐受性良好，为癌症免疫治疗提供了一个有希望的选择。另外，PM1003是一种针对4-1BB的独特表位的单域抗体，用于构建多特异性抗体，例如抗PD-L1×4-1BB BsAbs，以在肿瘤微环境中定位4-1BB激活，导致PD-L1活性和体内抗肿瘤活性的有效抑制以及最小的毒性。 值得注意的是，在1期临床试验(NCT03917381)中，研究了DuoBody-4-1BB×PD-L1 (GEN1046)，这是一种首创的双特异性免疫治疗剂，在晚期难治性实体瘤患者中的潜力。在临床前模型中，GEN1046在T细胞增殖、细胞因子产生和细胞毒性功能方面展示了比临床批准的抗PD-1/PD-L1药物更优越的效果。正在进行的人体首项研究揭示了可管理的安全性、与其作用机制一致的药效学免疫效应以及早期临床活性，在患者中观察到的疾病控制率为65.6% (40/61)，包括对先前抗PD-1/PD-L1免疫治疗有抗性的患者。GEN1046的鼓舞人心的临床前和临床结果表明其有潜力填补临床空白，为免疫治疗复发或难治性疾病的患者提供治疗选择，使其成为与其他免疫治疗剂联合治疗的有希望的候选者。总之，这些发展共同为癌症免疫治疗提供了增强的疗效和安全性的新策略。 7.抗LAG-3×PD-L1 BsAb LAG-3是激活的T细胞和NK细胞上的已识别跨膜蛋白，传递抑制信号以抑制T细胞增殖。目前正在评估阻断LAG-3和MHC-II相互作用的单克隆抗体的潜在抗肿瘤效果。然而，LAG-3和PD-1在肿瘤中的共表达意味着它们参与了T细胞耗竭。抗PD-1/PD-L1和抗LAG-3抗体的联合给药显示出协同抑制肿瘤生长的能力，在2/3期试验中，relatlimab和nivolumab的联合使用与单独使用nivolumab相比，显著延长了PFS。目前，relatlimab和nivolumab的联合使用已被批准用于晚期黑色素瘤。此外，如ieramilimab（一种抗LAG-3抗体）和spartalizumab（一种抗PD-1抗体）的组合，在包括非小细胞肺癌(NSCLC)、黑色素瘤、肾细胞癌、间皮瘤和三阴性乳腺癌(TNBC)的各种患者群体中展示了持续的积极反应。这些反应在未接受过抗PD-1/L1治疗的患者以及接受过抗PD1/L1治疗的黑色素瘤和肾细胞癌患者中观察到。开发抗LAG-3/PD-L1双特异性抗体的合理性源于在肿瘤中观察到的共表达，表明其在T细胞耗竭中的潜在作用。 IBI323和ABL501是针对LAG-3和PD-L1的有前途的BsAbs，旨在克服在抗PD-1/PD-L1治疗中对晚期肿瘤观察到的有限效果。IBI323不仅保持了其亲本抗体的阻断活性，还引入了一种新的细胞桥接功能。这种创新机制转化为混合白细胞反应中增强的免疫刺激活性和在人源化小鼠模型中更强的抗肿瘤反应，与肿瘤特异性T细胞的增加相关。同样，ABL501是由一种抗LAG-3 IgG4抗体通过(G4S)3连接子链接到PD-L1靶向scFv构建的，具有战略性的S224P氨基酸替换以增强稳定性。它有效地结合其靶标而不引发Fc介导的效应功能，如ADCC和CDC，将其作用集中在检查点阻断上。体外实验表明，ABL501有效地靶向了LAG-3和PD-L1途径，在增强效应T细胞的激活方面优于单独的抗LAG-3和抗PD-L1抗体。ABL501在人源化异种移植模型中展示了引人注目的体内抗肿瘤效果，强调了其潜在的临床意义。对周围血液中的免疫档案的检查突出了在接受了化疗的复发性胆管癌患者中LAG-3+PD-1+记忆CD4+T细胞亚群的增强存在。值得注意的是，这个亚群预示着对ABL501增加的反应性，为其正在进行的人体首项试验(NCT05101109)提供了有价值的支持。在机械上，ABL501促进了DC的成熟和启动T细胞的能力，导致改善的抗原交叉呈递和更强大的CD8+T细胞激活。此外，ABL501直接增加了CD8+T细胞对肿瘤的细胞毒性。其效果取决于LAG-3和PD-L1的同时参与，促进有效的T细胞-肿瘤细胞相互作用。通过作为T细胞引导剂，促进T细胞激活，同时阻断抑制信号，ABL501协调了强大的抗肿瘤免疫反应。 抗LAG-3×PD-L1 BsAb FS118在临床前和临床研究中展现出了有希望的结果，为癌症免疫治疗提供了一种新的方法。在临床前研究中，FS118展示了对LAG-3和PD-L1的高亲和力同时结合，超越了抗LAG-3和抗PD-L1抗体组合的抗肿瘤活性。在同源肿瘤小鼠模型的机制研究中，使用替代的mLAG-3×PD-L1抗体显示了显著的肿瘤生长抑制。值得注意的是，小鼠替代品导致T细胞上LAG-3的丰度降低，而单独抗体的组合增加了LAG-3的表达。此外，替代mLAG-3/PD-L1抗体的结合导致小鼠LAG-3迅速脱落到血液中。在临床研究中，1期试验(NCT03440437)证明了FS118在晚期、抗PD-1/PD-L1耐药癌症患者中的安全性和耐受性。FS118显示了10 mg/kg每周的推荐2期剂量，持续的药效学活性，以及46.5%的总体疾病控制率，特别是在对PD-1/PD-L1靶向治疗获得性耐药的患者中。这项研究支持了对难治性癌症患者FS118的持续研究，突出了其作为有效的双重PD-L1×LAG-3阻断策略的潜力。除了实体瘤，针对LAG-3的BsAbs也在血液肿瘤中展示了有希望的疗效。在1期临床试验NCT03219268中，探索了抗LAG-3×PD-1 BsAb Tebotelimab在实体瘤或血液肿瘤患者中的疗效。值得注意的是，34%的患者显示肿瘤缩小，包括对抗PD-1治疗有抗性的各种癌症类型的积极反应。 8.抗PD-1/CTLA-4 BsAb CTLA-4和PD-1是抑制各种T细胞功能的免疫检查点，它们的激活通过多种机制导致T细胞功能抑制。CTLA-4在激活时诱导，与CD28介导的激活竞争，并从APCs中移除共刺激配体。PD-1在T淋巴细胞表达时，作为抑制剂减少细胞毒性和细胞因子生成。这两个检查点都被肿瘤用于免疫逃逸。阻断CTLA-4或PD-1的抗体在临床前和临床环境中都显示出抗肿瘤活性，并且组合疗法在各种癌症中展示了改善的反应。此外，TME分析揭示了与正常组织相比，肿瘤中PD-1+CTLA-4+细胞的比例更高，支持了针对PD-1+ CTLA-4+细胞的合理性，以选择性地在TME中阻断检查点，同时避免对正常组织的影响。 PD-1/PD-L1轴的系统阻断在癌症免疫治疗中是基础性的，特别是考虑到其临床意义和良好的安全性。因此，一个优越的组合疗法应该确保它保留了PD-1阻断的效果，而不影响其阻断PD-1与其配体相互作用的能力。然而，CTLA-4的系统性抑制带来了更高的不良反应风险。为了降低这些风险，抗PD-1×CTLA-4 BsAb提供了改进的CTLA-4抑制功能，专门针对在TME中共同表达PD-1和CTLA-4的细胞。例如，MGD019是一种先进的BsAb，设计用于同时靶向PD-1和CTLA-4。这种BsAb具有独特的四价结构，使用高亲和力的抗PD-1单克隆抗体，以及具有类似于众所周知的ipilimumab阻断配体特性的抗CTLA-4单克隆抗体。MGD019的构建在Dual-Affinity Re-Targeting平台上，采用2×2对称格式，结合了铰链稳定的IgG4骨架。MGD019的独特结构允许对PD-1进行强大的阻断，并适应性地抑制CTLA-4，专门针对TME。它模仿了其抗PD-1前体体外阻断PD-1的效果，同时调节CTLA-4阻断，使其在表达PD-1和CTLA-4的细胞中最有效。这种特异性确保了TME中CTLA-4的局部抑制，通过避免广泛的Treg耗尽可能提高了安全性。值得注意的是，MGD019阻断PD-1与其配体的相互作用的能力，结合其适应性CTLA-4阻断策略，在晚期实体瘤患者中显示出显著的抗肿瘤活性和可管理的安全性。 此外，MGD019的IgG4 Fc区域赋予了降低的Fc介导的ADCC能力，从而减少了无意中消除活化的T细胞和Treg。Treg耗尽对ipilimumab的治疗效果和安全性的影响仍在考察中，然而，抗CTLA-4抗体的Fc区域诱导这种耗尽的潜力在临床前研究中与有益和有害的结果都有关联。通过避免Treg耗尽，同时在TME中保持有效的CTLA-4阻断，MGD019旨在提高患者安全性并维持CTLA-4拮抗的有益效果。Treg的免疫抑制作用主要涉及CTLA-4介导的T细胞耗竭。因此，MGD019在TME中对CTLA-4的阻断预计将足够强烈，以补偿缺乏Treg耗尽。这种策略，防止Treg减少，并确保在TME中强烈CTLA-4抑制，旨在优化这些免疫检查点在癌症免疫治疗中的关键功能，可能比传统抗体治疗提供增强的治疗益处，同时最小化不良反应。 抗PD-1/CTLA-4 BsAb QL1706在1/1b期研究中对标准治疗无效的晚期实体瘤显示出可管理的安全性。在推荐剂量下的所有患者中，客观反应率为16.9%，反应的中位持续时间为11.7个月。值得注意的是，未接受过免疫治疗的患者，特别是那些患有非小细胞肺癌、鼻咽癌和宫颈癌的患者，显示出有希望的抗肿瘤活性，反应率分别为24.2%、38.7%和28.3%。QL1706目前正在随机2/3期试验中进行进一步的疗效评估。此外，MEDI5752，一种新型单价双特异性抗体，通过选择性抑制PD-1+活化T细胞上的CTLA4来增强PD-1阻断。它减少了所需的剂量，以分泌IL-2，并迅速内化和降解PD-1。MEDI5752偏好肿瘤定位，与抗PD-1和抗CTLA4抗体组合相比，在体内显示出更优越的活性。两名晚期实体瘤患者对MEDI5752治疗显示出强大的部分反应。这代表了癌症免疫治疗的重大进步，通过选择性靶向PD-1+T细胞上的CTLA4提供独特的好处。 Cadonilimab是一种四价双特异性IgG1抗体，具有创新的Fc-null设计，旨在消除Fc介导的效应功能，以考虑安全性和有效性。它展现出与CTLA-4和PD-1抗体组合相当的生物活性。值得注意的是，Cadonilimab在高密度PD-1和CTLA-4环境中显示出更高的结合亲和力，为肿瘤样环境提供了潜在的优势。在1b/2期试验NCT03852251中，探索了Cadonilimab在晚期实体瘤中的疗效。Cadonilimab显示出令人鼓舞的疗效，宫颈癌的客观反应率为32.3%，食管鳞状细胞癌为18.2%，肝细胞癌为16.7%。这些发现强调了Cadonilimab在实现多种晚期实体瘤类型的积极肿瘤反应中的潜在有效性。目前，Cadonilimab已在中国获得批准，用于治疗铂类化疗后的复发或转移性宫颈癌。 9.其他靶向PD-1/PD-L1信号的BsAbs 除了上述的药剂外，其他BsAbs已经开发并在临床试验中进行评估，如抗PD-L1/CD3、抗PD-1/PD-L1和抗TIM-3/PD-L1 BsAbs。例如，针对现有T细胞引导剂的关键挑战，抗PD-L1/CD3 BsAb的发展取得了最新进展。一个值得注意的创新是Protease-Activated PSTAGylated BiTE (PAPB)，它为实体瘤设计。PAPB结合了一个屏蔽多肽域(PSTAG)、一个蛋白酶激活的链接器和一个带有针对PD-L1和CD3的scFvs的BiTE核心。PAPB展示了BiTE核心对PD-L1和CD3的剂量依赖性结合，能够响应TME中的MMP2释放核心，显著延长其血浆半衰期。此外，一种新型基于纳米抗体的抗PD-L1/CD3 BiTE在与PD-L1表达水平相关的黑色素瘤细胞上显示出细胞毒性活性，突显了其在治疗PD-L1过表达黑色素瘤中的潜力。总的来说，这些进展标志着在实体瘤免疫治疗领域提高抗PD-L1/CD3抗体的安全性、作用持续时间和有效性的有希望的步骤。 TIM-3作为癌症免疫学中的一个关键角色，作为免疫反应的负调节器。在癌症中，TIM-3表达特别识别了最功能障碍的CD8+ T细胞亚群，表明它们的耗竭。在临床前癌症模型的研究中，联合阻断TIM-3和PD-1途径在实体瘤和血液肿瘤中显示出显著的疗效。正在进行的临床试验，特别是在实体瘤中，正在探索抗TIM-3与抗PD-1联合使用的潜力，展示了其作为癌症免疫治疗目标的前景。在1期研究NCT03752177中，评估了TIM-3/PD-L1 BsAb LY3415244在晚期实体瘤患者中的安全性和有效性。虽然一些患者显示出有希望的结果，例如PD-1耐药NSCLC患者(-29.6%)接近部分反应，但试验面临挑战。值得注意的是，16.7%的患者经历了临床意义的过敏性输注相关反应。所有患者都发展出治疗出现的抗药物抗体(TE-ADA)，影响了可溶性TIM-3目标参与，并导致研究提前终止。尽管存在这些挑战，患者结果，特别是在PD-1耐药癌症的背景下，突显了LY3415244的潜在临床影响，值得在未来的研究中进一步探索和考虑。 10.结论和展望 针对PD-1/PD-L1轴以及其他免疫调节分子的BsAbs的出现和临床验证标志着癌症免疫治疗领域的一个关键发展。本综述深入探讨了BsAbs领域的创新进展，特别关注了它们在开发、作用机制以及治疗潜力方面对实体瘤管理的贡献。探索如抗TGFβ×PD-L1、抗CD47×PD-L1等BsAbs，突显了扩大抗肿瘤免疫、克服免疫逃逸以及解决单一疗法固有局限性的战略努力。尽管这些药物的治疗前景得到了临床前和新兴临床成功的强调，但将它们最佳整合到癌症护理中的旅程将需要仔细的研究和对细节的关注。 首先，未来的研究必须集中于提高BsAbs的特异性、有效性和安全性。这包括开发下一代BsAbs，具有减少的免疫原性、改善的肿瘤穿透力和定制的药代动力学特性。先进的分子工程技术可以促进设计在肿瘤微环境中选择性积累的BsAbs，最小化系统暴露和相关的毒性。此外，肿瘤微环境的复杂性仍然是免疫疗法有效性的巨大挑战。能够调节抑制性肿瘤微环境、增强抗原呈递、并促进肿瘤内T细胞的浸润和激活的新型BsAbs尤其令人感兴趣。将BsAbs与破坏肿瘤微环境中物理屏障或中和抑制性细胞群体的药物结合起来的策略，可能会产生协同的抗肿瘤效果。此外，识别对BsAb治疗反应的预测性生物标志物至关重要。对肿瘤进行全面的基因组、蛋白质组和免疫学分析可能会揭示预测治疗反应的生物标志物，指导患者选择，并促进个性化治疗方法。这种精准医疗方法将优化治疗结果并降低不良反应的风险。此外，将BsAbs与其他治疗方式相结合，包括化疗、靶向治疗、放疗和其他免疫疗法，有着巨大的前景。基于机制合理和临床前证据的组合策略可以增强抗肿瘤效果，对抗耐药机制，并扩大BsAbs的治疗窗口。 BsAbs在癌症免疫治疗中的探索为我们对抗癌症开辟了新的前沿，承诺增强免疫介导的抗肿瘤反应的精确性、效力和持久性。BsAbs在癌症治疗中的未来预示着一个范式，其中针对多个免疫检查点的协同或将免疫调节与其他治疗策略相结合，可以为全球患者提供持久、有效和更安全的治疗选择。BsAbs在癌症护理中的实质性前景不仅突出了有希望的治疗途径，也强调了我们通过免疫手段共同致力于扭转对抗癌症的潮流。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

CGT产业何去何从？8月底，北京！九大论坛将直面产业创新与监管挑战。国药集团中国生物副总裁孙京林老师将在本次会议讲解“创新生物药的分段生产管理”。武汉科技大学生命科学与健康学院院长，波睿达生物董事长张同存教授将与会报告“CAR-T细胞治疗现状和展望”。 先看几个时髦的药物名词：γδT药物、TCR-T细胞药物、TCR药物、双抗/BiTE！ 这几种药物形式，不知道大家能否看出来有什么共同点呢？ 这个问题看上去非常简单，实际上也不难回答：他们都和T细胞有关！ 但问题再进一个深度，他们在T细胞的哪个“关键元件”上有共同交集？ 答案就是我们今天的主题：T细胞受体（TCR）复合物！ 想必很多人从题目中能猜到这个答案。但这里面有的是对TCR进行编辑、有的把TCR作为靶点，有的把TCR作为药物，要是把些关系捋清楚，机制说明白，确实就有些让人头晕目眩了。 今天这一篇，咱们就努力把这个事情掰扯扯明白！ 1 T细胞受体（TCR）复合物 T细胞受体是一个非常大的复合物，包含TCR、CD3复合物、共受体（CD4或CD8）三部分。 01 T细胞受体（TCR） TCR是T细胞表面的跨膜的受体，起到识别抗原，是激活T细胞的触发元件。TCR结构是两条通过二硫键结合的异二聚体链，每条链的胞外区都包含两个Ig类似的结构。 TCR链的远端的Ig结构类似抗体的可变区，包含3个CDR区，具有特异的识别能力，当然这个区的形成也需要VDJ重排、体细胞突变等流程。这样TCR两条链的外端Ig结构就形成了类似Fab的结构，起到识别不同抗原的作用。 图注：αβ（A）和γδ（B）两种TCR的结构比较 TCR的按照两条链的不同分为：αβ和γδ两种。表达γδ TCR的T细胞含量较少，仅仅占血液和外周淋巴系统T细胞数目的1-5%；但在表皮组织中比较多，可以占到50%，如皮肤、小肠绒毛、肺部等。γδ TCR识别抗原不需要MHC分子的帮助，除了识别多肽外，他还可以识别脂质、磷脂、核酸以及其它非肽类抗原。 02 CD4和CD8共受体 在TCR结构外，还存在共受体。共受体的作用是在TCR识别MHC递呈的多肽时提供帮助。共受体在胞外可以特异的和MHC分子结合，在胞内和Lck激酶关联，在TCR信号中起到放大和增强的作用。 图注：CD4和CD8的二维（a）和三维（b）结构示意图。 共受体包括两种，CD4和CD8。CD4是由4个Ig结构的棒状结构，CD8是通过二硫键形成的异二聚体，每个单体都是一个类Ig结构。每一个T细胞只能选择CD4或者CD8中的一种作为共受体。 不同的共受体可以辅助TCR识别不同MHC分子递呈的多肽。MHI-I递呈的多肽由CD8辅助识别，这类细胞是杀伤性T细胞CTL；MHC-II递呈的多肽由CD4辅助识别，这类细胞是辅助T细胞（Th）。 03 CD3复合物 CD3复合物是TCR复合物必不可少的组成部分。其包括CD3γ 链、CD3δ链和两条CD3ε链。CD3复合物、TCR以及CD3-zeta（ζ 链）共同完成T细胞激活功能。 图注：CD3亚基的2D（左侧）和3D（右侧）示意图 TCR的胞内结构非常短（几乎没有），其胞内信号的转导必须需要CD3复合物的辅助，因此TCR必须和CD3复合物连接。因此，T细胞的CD3是阳性表达的。结合上文的共受体，引出了另外一个常见知识点，CD3+CD4+T细胞默认为是Th细胞，CD3+CD8+T细胞默认为是CTL杀伤T细胞，这两类细胞也通常以CD4细胞和CD8细胞的名称出现。 CD3复合物的胞内结构包含多个ITAM（γ 链、δ链和ε链各有一个ITAM，ζ 链有三个ITAM，且是二聚体，是主要的激活原件），当TCR和MHC-多肽复合物结合后，负责激活T细胞的下游通路，引起对应的T细胞反应。 2 T细胞受体（TCR）相关药物 01 γδT药物 γδT药物顾名思义就是以γδ TCR T细胞为基础的药物。现在炒的比较火的是γδT细胞治疗。和传统CAR-T不同（αβT），选用γδT作为CAR-T疗法，其差异是基于γδT的不同生物学特点。但是难度也是并存的，就如上文所述，其数目非常少，如何分离扩大培养将会是非常大的技术难题。 当然，也可以根据γδT的特殊表型，开发靶向γδT的药物，如：γδT的免疫检查点药物、信号激活/抑制药物等，本文就不展开讲了。 02 TCR-T细胞药物 TCR-T和CAR-T傻傻分不清，是不是您也有类似的困惑？ 其实非常简单，TCR-T是通过基因工程把改造的TCR给到T细胞（主要改造上文所述的Fab），而CAR-T是把基因工程改造好的抗体scFv给到T细胞。 03 TCR药物 TCR药物本质上是蛋白药物，其结构和BiTE类似，一端是靶向T细胞CD3的scFV，然后通过Linker连接识别肿瘤MHC-多肽的工程化TCR结构。通过把T细胞和肿瘤细胞拉倒一起，强制产生免疫突触，干掉肿瘤细胞。 因此TCR药物涉及到上述的两个知识点，CD3和TCR，您看懂了么？ 04 双抗/BiTE 双抗/BiTE这部分就不再说了，前面写了好多，大家可以参考之前写的合集。其药物逻辑和TCR药物类似，只不过是两个scFV连在一起。 — 写在最后— 这篇文章简单的把TCR相关药物原理梳理了一下，很多不足的地方欢迎大家批评指正。 这些点经常在和“业界人士”交流时都能说的天花乱坠，但是深入的问一下，很多小伙伴就有点抓耳挠腮了。希望能对大家有帮助，看懂了就可以淡定的游走在各种药物社交场合！ 最后出一个题目：CAR-T治疗也和T细胞有关，为什么没有归类到本篇文章中？欢迎大家留言区讨论！ 同写意媒体矩阵，欢迎关注↓↓↓