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摘要：类器官是一种3D细胞组织，能够重现原生组织的某些结构和功能。近期的研究使得类器官作为研究组织发育、药物发现和潜在临床应用的宝贵模型而日益受到重视。体外成功培养类器官的要求与传统的单层细胞培养大相径庭。生成和成熟高保真类器官需要开发和优化环境条件，以提供生长和3D成熟的最佳线索，如氧合、机械和流体激活、营养梯度等。为此，我们讨论了用于类器官培养的四大类生物反应器：搅拌生物反应器（SBR）、微流控生物反应器（MFB）、旋转壁容器（RWV）和电刺激（ES）生物反应器。我们的目标是概述商业化和自行开发的生物反应器系统的最先进技术，它们对来自不同细胞和组织的类器官培养的好处，以及生物反应器技术的局限性，包括灭菌、可访问性、适用性和长期培养的便利性。最后，我们讨论了现有生物反应器技术的改进方向，以及它们如何被用来增强特定应用的类器官培养。 1.引言 近年来，类器官因其为研究器官发育提供了复杂的模型，并且是强大的疾病模型而日益受到重视。经过数十年使用“简单”的2D单层细胞培养进行体外研究的经验，人们越来越清楚地认识到需要更复杂的组织培养系统来准确再现新生和成熟人体组织的结构和功能。此外，类器官可能有助于更真实地模拟原生组织中看到的复杂性，包括与外来微生物的相互作用。类器官的使用的最新进展导致它们在疾病建模、癌症研究和人类发育研究中的日益增多的应用。 在本文中，“类器官”一词被定义为能够重现一些原生组织结构和功能的3D细胞组织。如今，类器官通常来源于干细胞，可能包括胚胎干细胞（ESCs）、诱导多能干细胞（iPSCs）或各种组织特异性成体干细胞，如间充质干细胞（MSCs）或脂肪组织来源的干细胞（ASCs）。与传统的单层细胞培养相比，类器官在基因和蛋白质表达、细胞极化以及宏观和微观组织组织方面与原生组织有显著的相似性。虽然我们将讨论一些用于其他3D组织培养构建的生物反应器，如胚状体（悬浮生长的干细胞聚集体）和球状体（任何球形细胞簇，无论结构复杂性或功能如何），我们的主要关注点将是生物反应器如何被用来增强类器官研究。正如这里所呈现的，最近的进展主要集中在iPSC技术上，它带来了许多优势，包括允许患者特异性类器官的发展，简化最终的医疗用途，并避免了围绕使用胚胎干细胞的潜在伦理问题[7]。此外，值得注意的是，类器官培养的优化侧重于特定组织的发生，而不是从干细胞生成整个生物体。最近的进展已经引发了关于从人类干细胞生成胚胎的伦理问题的讨论。有关人工子宫技术的研究确实存在，但这些主题不在本综述的范围之内。 传统上，“生物反应器”一词被用来描述设计用于生产生物材料的容器。商业生物反应器通常是大型罐体，大小从1000到10000升不等，通常包含一个搅拌或泵送机制，用于将液体进出罐体。这些大规模反应器旨在促进生物过程，例如从活细胞和生物体中生产抗体或其他蛋白质。这些设备的一个基本特征是能够调节环境条件，如pH值、溶解气体浓度、流速/搅拌速率和系统中的营养成分。虽然许多这些生物反应器是为培养细菌、酵母或其他微生物而开发的，但在大规模哺乳动物细胞培养以生产生物活性蛋白方面也取得了重大进展。此外，许多需要翻译后蛋白质修饰的生物技术产品通常是在大规模哺乳动物细胞批次培养中生产的，如中国仓鼠卵巢（CHO）或仓鼠肾（BHK）细胞，因为这些细胞可以进行糖基化和蛋白质折叠，这在细菌蛋白质中不会发生。随着哺乳动物细胞生产的生物反应器应用变得普遍，已经开发了额外的策略来更好地适应哺乳动物细胞的要求，特别是在氧气供应、代谢废物（例如，CO2、乳酸）的去除和限制过度剪切应力方面。 在本文的背景下，“生物反应器”指的是用于增强体外3D细胞和组织培养的任何设备。具体来说，我们将讨论生物反应器以及它们与类器官培养的关系，尽管这些技术中的大多数也可以用于其他组织培养构建。与用于大规模蛋白质生产的商业生物反应器不同，目前用于类器官培养的大多数生物反应器都很小，使用的培养基量少至几毫升。由于细胞培养基和补充剂的成本很高，大多数研究旨在限制生物反应器的尺寸。这样的生物反应器可以用于这些缩小尺寸的特定优化，改善细胞或组织培养的特定方面，如氧气和营养成分的浓度，或确定特定组织的最佳流速和剪切力。然而，如果需要，通常会考虑扩大特定生物反应器设计。许多潜在的类器官应用，如高通量药物筛选和基于细胞的治疗，需要大量的细胞或成熟的类器官。虽然在低密度下一致且相对简单，但单层培养在扩大规模时可能面临挑战。能够在保持试点研究小而经济有效的同时方便地扩大特定生物反应器技术的能力是非常理想的。 动态生物反应器有助于克服静态培养的许多限制，静态培养仍然是组织培养的“金标准”。静态2D培养不能准确再现体内环境的许多方面，包括营养物的可用性、气体交换、基质属性、废物去除等。使用生物反应器进行3D培养允许研究人员模拟在2D培养中找不到的许多环境特征，如增加的流体流动、信号分子和生长因子的梯度以及各种类型的刺激。为此，我们将讨论用于类器官培养最常用的生物反应器，包括搅拌生物反应器、旋转壁容器、微流控装置和电刺激生物反应器，如图1所示。本综述将深入探讨生物反应器对类器官培养的潜在好处和局限性。 图1. 用于类器官培养的常用生物反应器。(A) 带有轴向搅拌器（左）和径向搅拌器（右）的搅拌生物反应器。箭头显示流体运动方向。(B) 微流控生物反应器，具有用于灌注不同培养基的独立通道。(C) 旋转壁容器（RWV）生物反应器：（左侧）慢速转动侧壁容器（STLV）和（右侧）高宽比容器（HARV）。箭头显示旋转方向。(D) 电刺激生物反应器显示两个平行板电极。详见正文。 2.搅拌生物反应器  用于类器官培养的搅拌生物反应器（SBRs）的操作原理与传统的大规模生物反应器相似，后者经常用于商业生产生物分子。SBR培养的特点是其均匀的环境、简单的监测和关键培养参数的直接控制，特别是可扩展性。SBRs通常由一个圆柱形培养容器组成，该容器配备有一个搅拌器或搅拌器，可以由电机直接或间接驱动。通过两种类型的搅拌器产生流体动力学力：轴向流和径向流搅拌器。轴向流搅拌器的叶片以一定角度倾斜，将流向导向容器底部，而径向流搅拌器的叶片与搅拌器轴垂直，产生流向反应器壁的流动模式，如图1A所示。根据搅拌器配置、旋转速度和容器几何形状，可以调节流体动力学特性，如剪切力、营养交换和扩散，以满足培养的需要。这些的一些示例可以在表1中找到。这些搅拌器还执行各种功能，包括均质化、热质传递和通气。为了表征这些搅拌器的传递现象，包括氧气传递、营养混合和机械刺激，已经做出了重大努力。 2.1. 改善组织氧合 已经证明SBRs为细胞和类器官培养提供了许多优势，主要源于改善的质量传递和增强的氧合。研究工作表明，使用SBRs改善分化，介质搅拌可以导致细胞存活率增加和分化加速。Li等人证明，通过使用SBRs，在二维造血干/祖细胞培养中可以减少氧化应激。他们的结果显示，搅拌条件下改善了细胞存活率，并与静态条件相比，以更快的速率诱导分化。在三维组织培养（即类器官培养）期间，氧气和营养物质的静态扩散不足以满足发展中组织的需求，因为它们迅速增加大小和复杂性。直径超过1毫米的细胞球状体经常出现低氧、坏死的核心，周围有一层薄的活性细胞环（约100微米）。对于高氧消耗率的组织，如脑类器官，这个问题变得至关重要。Lancaster等人通过证明SBRs改善了氧气的可用性和营养吸收，从而产生了比在静态条件下生长的更大、更连续的复杂脑类器官来解决这个问题。 2.2. 实现适当的谱系进展和3D空间组织 祖细胞的增殖、分化和存活对于形成多层类器官组织至关重要。然而，由于类器官在早期和晚期分层阶段的不同需求，这一过程面临挑战。在静态体外培养中形成的复杂组织结构常因结构核心区域的缺血而停止发育，这是由于氧气和营养物的有限接触造成的。类似于移除建筑物的基础，这些内部组织层崩溃，可能损害更代谢活跃的外层的持续发展和组装。类器官组织层的结构复杂性通常取决于核心细胞存活的程度。为了改善类器官培养结果，有必要使用工具来增强氧气和营养物向内部组织层的扩散。使用SBRs实现这一目标的努力可以在钱等人的工作中看到，他们使用与12孔板结合设计的定制旋转生物反应器来生成前脑特异性脑类器官。与静止和轨道摇动条件相比，他们的SBR平台改善了氧气和营养物的扩散，促进了大而连续的皮层结构的形成。SBRs也被用于推进细胞培养中的谱系进展。Fluri等人表明，在搅拌瓶中培养的体细胞衍生的iPSCs，消除了对饲养细胞层、血清或昂贵的组织培养基质（例如，基底膜基质）的需求。他们的方法，称为悬浮培养重编程的iPSCs（SiPSCs），是通过在处理过的搅拌瓶中播种可诱导的次级小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs），并以65 RPM搅拌来实现的。次级MEFs在悬浮培养的前四天显示出比其对照组（粘附）更多的annexin V染色。当用多西环素培养时，发展了一群GFP阳性（具有重编程因子的细胞）和EdU阳性细胞，表明正在积极重编程的细胞。他们的结果显示，这些悬浮培养中重编程的细胞与使用传统的粘附单层条件的细胞相当。 2.3.类型和可定制性 最常见的SBR类型，搅拌瓶，是一个圆柱形的玻璃容器，其中单个细胞或小细胞聚集体被悬浮以形成所需的组织。作为最基础的生物反应器，搅拌瓶促进了培养基中氧气和营养物的混合，并减少了新生体外组织构建物表面的浓度边界层。对传统搅拌瓶设计的修改允许增加额外的功能，如营养物供应的连续灌注、废物移除、传感器探头的集成、pH控制系统和采样口。与其他培养系统（如传统的静态培养、旋转壁容器或微流控生物反应器）相比，SBRs可以轻松扩大规模。例如，钱等人使用齿轮驱动的搅拌平台组装改进的大脑区域特异性类器官。他们的SBR（SpinΩ）结合了十二个搅拌器，每个搅拌器都连接到一个齿轮上，由单个电机驱动，几乎所有3D打印组件都是使用3D打印技术在内部制造的。Schneeberger等人展示了使用搅拌瓶培养成熟肝类器官的多功能性。他们专注于大规模生产hiPSC衍生的肝脏类器官，以解决肝脏移植替代品的未满足的临床需求。他们的方法涉及从肝脏活检中分离出的单个细胞的扩增，并将它们播种在设置为85 RPM的搅拌瓶中，在11到14天内形成肝脏类器官。 为了诱导肝脏分化，将类器官转移到一个新的搅拌瓶中，并使用含有10% Matrigel的定制分化培养基进行分化，分化时间长达12天。如图2所示，第5天的光学显微镜图像以及苏木精-伊红（HE）和Villin-1染色表明，搅拌瓶中的类器官比对照组类器官展现出更多褶皱的形态和相同的极化。在搅拌瓶中培养始终导致肝细胞标记物（CYP3A4、ALB、MRP2）的上调和干细胞标记物（LRG5）的下调，对所有患者细胞均如此。分化第12天的广泛mRNA测序显示了多达（图2C）。通过增强MDR1特异性的Rhodamine123转运和增加在搅拌瓶中培养的类器官的糖原储存，证明了这些肝类器官的功能（图2D）。总体而言，这些结果表明，使用搅拌瓶大规模扩增患者特异性肝类器官以产生半功能性肝组织是一种有希望的方法，为更可行的临床应用铺平了道路。 图 2. 类器官在搅拌瓶中分化为功能性肝细胞。类器官在搅拌瓶中或在静态对照条件下分化了12天。(A) 光学显微镜图像、HE染色和对石蜡包埋类器官的管状标记物Villin-1的免疫组化分析。细胞核用苏木精进行对比染色。通过定量RT-PCR（B）和mRNA测序（C）确定分化类器官中肝细胞标记物的表达。(B) LGR5、CYP3A4、ALB和MRP2的转录水平。图表显示了五个不同供体的五次独立实验。使用冷冻保存的肝细胞作为阳性对照。* p < 0.05 (C) 来自三个独立供体的类器官在分化的第12天的mRNA测序。热图中显示了与相应静态对照相比，在搅拌瓶中第12天分化时上调超过四倍的基因。一些众所周知的肝细胞基因已进行了注释。(D) Rh123转运被确定为MDR1活性的读数，PAS染色表明类器官细胞中的糖原储存。详见正文。经Schneeberger等人许可改编。 2.4. SBRs的限制 尽管简单易行的SBRs具有吸引力，但高流体剪切和搅拌器不稳定等限制可能对剪切敏感的类器官培养引起关注。哺乳动物细胞对剪切敏感，可能会被过度的水动力力损坏。如果搅拌器的几何形状设计不当，可能会引入有害影响，抑制分化或破坏如纤毛和微绒毛等精细结构。例如，Ovando-Roche等人发现，尽管在SBRs中培养视网膜类器官改善了层状分化并增加了带有纤毛的光感受器的产量，但脆弱的晚期外段样结构有显著的损失。作者推测，由SBRs引起的剪切应力损害了这些精细结构的形成。然而，他们指出，通过确定平衡最大细胞产量和保护脆弱结构的最佳搅拌速率，可以限制这些影响。另一个限制，特别是对于定制构建和3D打印系统，如前述的SpinΩ，是增加的复杂性可能导致最终用户更多的技术困难。然而，这个问题一直在被研究人员考虑，正如后来研究创建的Spin∞，这是对SpinΩ系统的迭代改进，解决了一些关于灭菌和长期实验可靠性的问题。 3.微流控  微流控生物反应器（MFBs）是改善类器官培养的有前途的平台。MFBs结合了传统2D和3D培养方法以及其他生物反应器平台（例如，诱导流体动力力）的优势特征，同时提供了额外的好处，包括对微环境条件的增强控制和更高的通量。这方面的示例可以在表2中找到。通常，MFBs由一个或多个入口、一系列小通道和腔室以及一个或多个出口组成，如图1B所示。此外，它们通常使用光刻基模塑等微制造技术定制设计，具有从毫米到微米尺度的小的建筑特征。这些特性允许广泛的培养设备几何形状的可能性，为高度专业化的应用提供了一个动态平台。 3.1.功能和应用 MFBs的基本工作原理涉及使用泵将流体体积通过通道和腔室输送，这些泵可以是外部连接到设备或系统内部的。入口和输出访问端口在培养区域和外部环境之间进行接口。大多数MFB系统使用外部泵（例如，注射器或蠕动泵）通过管道连接到访问端口，产生一种灌注流。这种流的主要目的是持续提供氧气和营养物并清除废物。此外，次要入口（注射口）可以注入额外的补充物（例如，化学物质、生长因子、酶）。通道的几何形状强加的层流提供了一种机制，以定位和调节这些补充物的输送，允许对组织构建物周围的空间和时间微环境进行精确控制。在MFBs中实施了多种类型的传感器技术以提供实时实验数据。光学传感、光谱方法和电化学分析方法已用于监测关键过程变量，包括氧气、pH值、CO2、葡萄糖和温度。例如，张等人制造了一个集成了物理、生化和光学传感器的模块化传感MFB平台，用于肝脏和心脏类器官培养。该系统由蠕动泵、培养基储罐、生物电化学传感模块、物理/化学传感模块、流量控制面包板模块、气泡陷阱和类器官培养模块组成。这些组件通过管道依次连接形成完整的电路。培养基从储罐泵入，通过气泡陷阱，由流量控制面包板分配到类器官模块，然后泵入传感模块。生物电化学模块采用了一系列的电化学微电极传感器，这些传感器在抗体-抗原结合时检测氧化还原探针的电子转移活性。为了测量生物标志物，作者考虑了白蛋白和谷胱甘肽S-转移酶α作为肝脏生物标志物，肌酸激酶BM作为心脏生物标志物。这些微电极也可以清洗和再生以检测其他可溶性生物标志物。物理/化学传感模块与光学氧气和pH传感器以及温度探头集成。此外，在类器官培养模块底部集成的微型显微镜获得了实时原位形态图像。为类器官培养设计的模块由两个半腔室组成，嵌入在两层（顶层：PDMS，底层：PDMS/玻璃）之间，夹在两个刚性的PMMA支撑之间。肝脏类器官由聚集在明胶甲基丙烯酸（GelMA）中的人类原代肝细胞形成的肝小叶组成。使用类似的图案化技术，心脏类器官由hPSC衍生的心肌细胞（CMs）形成，这些细胞种植在富含纤维连接蛋白的GelMA的平行线（50-µm间距）中，然后用纤维蛋白凝胶层覆盖。3-4天后，作者观察到hPSC-CMs的排列和伸展，最终在平行线之间形成了细胞桥。他们的结果表明，肝脏类器官模块可以诱导肝细胞聚集成肝小叶（D5时细胞活性>85%），同时保持功能，如通过电化学生物传感器测量的白蛋白持续分泌所示。心脏类器官模块使种植的心肌细胞形成具有细胞桥的心脏类器官。使用迷你显微镜，他们观察到强烈且同步的跳动，速率约为每分钟60次，单批细胞内跳动速率均匀。 3.2. 类器官培养的优势 如前所述，使用微尺度几何形状精确调节微环境参数的能力是MFBs提供的独特优势，考虑到类器官培养的敏感性，这一点尤其重要。MFBs以受控方式输送氧气、营养物和其他补充物的能力对于改善类器官培养结果至关重要。因此，使用MFBs可能会提高类器官培养的质量，确保更均匀的发育，定向分化类器官细胞类型，并最小化传统培养技术或其他生物反应器平台通常导致的不可预测性、异质性和缺乏一致性。最后，鉴于类器官被特别培养以作为生理模型，模拟生理条件的能力（例如，产生梯度，应用时间信号分子，诱导或减少机械力）提供了一个动态平台，以模拟和研究细胞对特定刺激的响应。 3.3. 在类器官培养中的应用 最近，Fu等人展示了MFBs对多细胞球状体的形成、培养和分析的影响。在他们的工作中，使用雕刻的丙烯酸模具铸造（PDMS）通道微室制造了MFB。这篇论文强调了使用非传统光刻技术生成复杂几何形状的能力。简单来说，光刻技术用于在光敏聚乙二醇前体聚合形成微室内的U形结构阵列，从而制造了MFB。Balb/c 3T3成纤维细胞和人类肝癌细胞系HepG2悬浮液被装入MFB并困在其U形结构内。被捕获的细胞在8 µL/min的连续培养基灌注下使用蠕动泵培养，形成多细胞球状体。一旦形成球状体，流速降低到1.5 µL/min进行长期培养。他们的结果表明，在这个MFB中可以使用流体流动和单位重力沉降生成许多均匀的多细胞球状体。所使用的水凝胶的材料和几何形状允许有效的营养物和废物交换，同时保护类器官免受灌注引起的剪切应力的影响。 王等人介绍了另一种使用配备有可灌注微柱阵列的MFBs的方法，其中hiPSC衍生的肝类器官可以在长期培养中维持。他们的MFB是使用软光刻制造的，包括图案化的微柱和进出口端口，如图3所示。对肝类器官生长的分析涉及检查从第0天到第30天测量的平均直径的尺寸分布，如图2D所示。这些数据表明，类器官的分化进展与平均大小之间存在正相关。此外，与图3E中看到的静态培养相比，肝类器官在芯片上的灌注培养条件下表现出增强的细胞活性。这是通过第30天的活性半胱氨酸蛋白酶3的IHC染色确定的。定量分析揭示了静态培养中类器官内大量细胞死亡，大约12%的细胞显示出半胱氨酸蛋白酶3阳性染色（见图3F）。相比之下，使用MFB系统中的灌注培养可以提高细胞活性，这通过在动态环境中生长的类器官中半胱氨酸蛋白酶染色的显著减少来指示。 图 3. 使用简单的3D可灌注芯片系统从hiPSCs原位生成肝类器官的示意图，以及在芯片系统中hiPSC分化为肝类器官的特征分析。(A) hiPSC衍生的肝类器官体外分化过程。(B) 肝类器官芯片系统的配置。(C) 在肝类器官生成的不同阶段获得的球状体的代表性显微图像。比例尺：200微米。(D) 使用在芯片上生成的肝类器官的平均直径分析尺寸分布。(E) 在灌注或静态培养条件下，第30天肝类器官中凋亡细胞（绿色）的活性半胱氨酸蛋白酶3的免疫染色。比例尺：50微米。(F) 至少来自五个不同组织的类器官中半胱氨酸蛋白酶3阳性细胞百分比的定量分析。** p < 0.01，使用双尾学生t检验。经Wang等人许可转载。 使用MFBs培养类器官的优势的额外证据可以在Achberger等人进行的研究中找到。他们制造了一个MFB，被认为是一种视网膜芯片（RoC），以一种更接近生理条件的方式培养视网膜类器官（RO）和视网膜色素上皮（RPE）（见图4）。在这项工作中，在两个光刻PDMS晶片之间放置了一个多孔聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）膜，底部的一个包含培养基灌注通道，顶部的一个包含用于容纳RPE和RO的井。首先，在井底部的PET膜上涂覆了层粘连蛋白。随后，RPE种植在其上方并允许粘附到膜上。接下来，ROs放置在与RPE融合的膜上，每个井中添加了基于透明质酸的水凝胶。最后，培养基以20 µL/min的速率通过MFB灌注。他们的结果表明，与传统的静态培养条件相比，使用MFB平台形成外段的数量大约增加了三倍。有关更多详细信息，请参见图4。 图 4. 视网膜芯片。(A) 人类视网膜组成和体内细胞类型的示意图。RPE，视网膜色素上皮；(B) RoC（视网膜芯片）的照片（左）和RoC中RO（视网膜类器官）感光细胞和RPE相互作用的艺术家描绘（右）。(C) （上）RPE细胞被播种到装置中，（中）在培养24小时后形成密集的单层。（下）ROs和基于透明质酸的水凝胶直接从顶部装入到RPE上的井中。(D) 电子显微镜图像的代表性示例，展示了在RoC中培养7天后（上）的RO表面形成的类似外段的结构（箭头），在没有RPE的RoC中（中），或在培养皿中（下）。(E) 在RoC中与RPE一起培养181天后再加7天的RO的类似外段结构的高倍放大图像，显示了有组织的膜盘。(F) 每100微米RO周长上的段数比较RoC、没有RPE的RoC和培养皿培养的RO。* p < 0.05。比例尺表示(D) 5微米和(E) 1微米。经Acheberger等人许可改编。 3.4.MFBs在类器官培养方面的限制 尽管MFBs提供了诸多优势，但多重限制和相关挑战阻碍了它们的广泛应用。按照设计，需要复杂的结构来控制流体流动并产生最佳条件，这使得MFBs的制造变得困难且耗时。此外，生物反应器制造过程中使用的一些材料可能并非完全生物相容，可能会随时间降解，倾向于吸附和粘附不需要的生物分子。这些问题可以改变细胞行为，产生有害的副产品，并减少流体流动，这可能对类器官培养的成功产生不利影响。MFBs最突出的限制与其基础组件制造有关。例如，软光刻成型涉及在PDMS上图案化2D微特征，通常需要光刻胶模具制造。行业标准方法涉及使用光刻胶树脂（环氧树脂）在晶片（硅、石英）上形成模具，以实现高特征分辨率。这个过程需要洁净室、预处理设备（光罩制造、晶片准备）、专业的投影设备（UV、X射线、电子束）以及后处理（开发、清洁、表面处理）。尽管一些公司提供这种制造，但单位模具的价格高且根据图案复杂性和使用的材料而大不相同。此外，设计MFBs通常是一个需要多次修改以实现期望结果的迭代过程。因此，使用软光刻方法通常不可持续。 希望将MFBs纳入其工作流程的研究人员可能会遇到由于需要专门的知识和能力来制造或操作大多数定制或商业可用的MFB平台而造成的访问障碍。同样，由于需要保持流体动力学的精确控制并确保许多设备之间的一致性，扩大这些系统的规模进行更大规模的实验仍然是一个挑战。此外，长期实验可能会因为与环境的长时间接触而受到污染，主要是如果设备没有得到适当的密封或灭菌。因此，需要耗时的清洁和灭菌小型、复杂组件的程序，并带来额外的维护问题。 成功的长期类器官培养需要不断监测培养条件，并定期或持续评估类器官的发展和成熟。然而，MFBs的复杂性常常妨碍了快速且重复确定培养状态的能力，需要耗时的干预，通常包括从灌注系统中断开连接和从设备中移除培养组织。这种方法的替代方案将涉及额外的设备或技术，如专用传感器或原位显微镜；然而，这些通常昂贵和/或难以集成。此外，总体成本可能令人担忧，因为定制设备的制造或商业MFBs的获取可能很昂贵。如果生物反应器需要持续的设计修改、专有材料如低污染连接器，或者昂贵的消耗品如过滤器、试剂和培养基，尤其令人担忧。 4.旋转壁容器 旋转壁容器 （RWVs）起源于clinostat，这是一种可以使物体在轴（或多个）上旋转的装置，最早在19世纪初开发用于植物培养。RWVs最初由NASA开发，其工作原理类似于clinostat，它们使用圆形或圆柱形容器的旋转来产生低剪切混合和模拟微重力。RWVs通常有两种类型，一种是慢速转动侧壁容器（STLV，圆柱形）或高宽比容器（HARV，圆形），如图1C所示。已经证明，在任何类型的RWV中，细胞培养（细胞/细胞组装和培养液）与整个容器的同步旋转允许容器内液体的“整体”旋转，这导致这些生物反应器特有的温和、低剪切混合，同时也创造了模拟微重力的连续翻滚运动。STLV和HARV主要由于它们的整体形状和气源不同，STLV中的中央圆柱形氧气器和HARV壁上的气体渗透膜。它们还不同在于STLV可以容纳更大的体积，通常包括向生物反应器中/外持续灌注培养基。相比之下，HARVs提供更多的氧合，因此是类器官培养的首选设备，而STLVs经常用于需要精确控制氧水平的培养（例如，缺氧）。 4.1. 在类器官培养中的应用 RWVs对细胞培养和特别是类器官培养有多种好处（见表3中的示例）。作为RWVs最关键的方面之一，低剪切环境中混合的显著增强导致细胞性能提升。例如，通过在RWV中培养细胞，与搅拌瓶培养相比，人类细胞系中的重组蛋白产量增加了七倍。虽然传统的搅拌瓶也增强了细胞的营养可用性，但这些瓶中的高剪切环境对细胞造成了足够的损害，降低了它们的活性。关于RWV设计的多种变体，通过建模和实验，已经证明RWVs中的流体剪切应力明显低于其他类型的混合容器。RWVs中的低剪切混合对类器官培养至关重要，因为随着球状体的增大，它们往往会因为营养供应不足而发展出一个坏死核心。增强的培养基混合有助于缓解这种情况，但只有在不引入高剪切的不利影响的情况下才能实现。这种较低剪切的一个限制是，它可能限制了细胞的质量传输，从而限制了营养的可用性。 RWVs在类器官培养方面有多种特定用途。首先是球状体形成，通常通过在RWV中高密度培养细胞并允许它们自聚集来完成。RWVs中球状体的形成已经得到了很好的记录，显示了随时间的初始聚集和生长。另一个用途涉及体外扩增多能干细胞。一个挑战是，传统的2D干细胞培养通常需要昂贵的培养基和昂贵的基质来涂覆组织培养塑料以增加细胞粘附。RWVs可能是在悬浮中生长大量干细胞的有效工具，同时保持多能性，因为悬浮培养消除了对昂贵基质蛋白作为细胞培养基质的需求。Rogers等人在55 mL商业RWV系统中使用廉价的基于明胶的微载体培养人类间充质干细胞（hMSCs），以帮助胚状体培养。他们证明，使用7.5%明胶甲基丙烯酸（GelMA）微载体在RWV中，hMSC细胞群体在八天内可以扩大16倍。细胞保持了它们的脂肪生成和成骨分化能力，以及它们的免疫调节潜力。因此，RWVs已经成功地提供了一种不需要昂贵基质蛋白的可扩展的干细胞扩增方法。 使用RWVs将类器官分化为特定组织类型已经得到了广泛研究。例如，Wilkinson等人使用小型（4 mL）HARV型RWV通过将胶原蛋白包被的海藻酸盐珠和iPSC衍生的肺成纤维细胞或胎儿肺成纤维细胞播种到RWV中，并允许类器官自组装成复杂结构，来开发肺组织类器官。在这种情况下，使用RWV有助于形成用于疾病建模和药物筛选的肺组织模型。在另一项研究中，DiStefano等人尝试在RWV培养中生长视网膜类器官。在静态悬浮培养条件下进行10天的初始3D球状体形成后，一些新生的类器官被转移到生物反应器中，而对照组留在静态悬浮培养中。RWV中的类器官生长速度明显快于静态培养中的类器官，并且成熟得更早，如图5所示。具体来说，RWV类器官在第25天显示出的成熟度在对照组中直到第32天才能看到，减少了一周所需的培养时间。RNA-seq转录组分析被用来确认在RWV中维持的类器官的基因表达模式与体内视网膜的早期时间点相匹配。作者推测，增强的氧气、营养和废物交换导致了更快的生长和成熟。 图 5. 不同培养条件下类器官的生长。(A) 整个分化过程中的视网膜神经生长曲线。每两天测量一次每个类器官的最大横截面积（单位：微米²）。SSCi，静态悬浮培养中的完整类器官；SSCd，静态悬浮培养中的解剖神经视网膜；RWV，旋转壁容器生物反应器中的解剖神经视网膜。数据来自三次独立的生物实验（n = 3；每次实验量化三个类器官），并以均值 ± 标准误差表示。* p < 0.05 表示 SSCi 与 RWV 之间；# p < 0.05 表示 SSCi 与 SSCd 之间；t p < 0.05 表示 SSCd 与 RWV 之间。(B) 神经视网膜（NR）的形态，显示分裂细胞。磷酸组蛋白 H3（PH3，绿色）是增殖细胞的标记。细胞核用 DAPI（蓝色）染色。显示的是代表性图像。箭头指示与 PH3 相关的免疫染色。AP 显示类器官的顶端。比例尺：左侧 500 微米，右侧 50 微米。经 Distefano 等人（2018 年）[65] 许可转载。 4.2. 微重力模拟 最初，RWV 生物反应器是由 NASA 开发的，作为可能在地球上模拟微重力的细胞/组织培养场所。尽管这篇综述中之前的讨论集中在对一般类器官培养的益处上，但重要的是要记住，如果使用得当，RWV 还将产生约等于某些减少重力方面（约 10-3 × g），也称为“模拟微重力”（SMG）的类似物。例如，神经/神经内分泌 PC12 细胞（来自大鼠肾上腺肿瘤）已在 SMG 条件下进行了广泛研究。在对神经内分泌相互作用的进一步研究[67]中，在将单个细胞播种到 RWV 后，细胞聚集形成神经内分泌类器官，这些类器官被培养了长达 30 天。在 RWV 中 SMG 一天后，与静态条件（VueLife@ 袋子）相比，包括 ERK、p38 和 jnk 信号通路以及肾上腺素酶 PNMT 在内的几个通路被上调。在不同条件下培养 30 天后，将类器官皮下植入小鼠。只有在 RWV 中培养的类器官发生了显著的血管化。这项研究试图解释剪切应力和混合与微重力的效应。值得注意的是，在与 RWV 相同剪切应力的搅拌生物反应器中培养的 PC12 确实聚集了；然而，它们并没有显示出 RWV 培养类器官中的分化和组织。这些结果表明，微重力的效应可能独立于流体混合的效应。这一观察让人想起 Lelkes 实验室在 RWV 生物反应器动态环境中培养的神经内分泌类器官的早期研究，表明在 RWV 生长环境中的类器官中血管生成因子（例如，VEGF）的上调（见图 6）。在这项研究中，与静态悬浮培养相比，在 HARv 中生长的类器官看到了显著更多的血管化。 图 6. 在 RWV 中动态培养后植入小鼠模型的神经内分泌类器官中增强的血管生成。Bag：在组织培养袋中静态对照培养。HARV：在 HARV 型 RWV 生物反应器中动态培养。（上）使用与 FITC 偶联的 Griffonia simplicifolia 凝集素（绿色）标记血管的整个类器官成像，与相差（左）叠加。HARV 条件下显示出更密集的血管。（下）来自 Bag 和 HARV 条件类器官的切片的荧光成像，显示出 HARV 条件类器官中更好的形成的血管。经 Lelkes 等人许可转载。 4.3. 限制 尽管RWVs对类器官培养具有潜在优势，但存在一些限制，首先是对用户能力要求相对较高。细胞播种和培养基交换需要特别小心，以避免向容器中引入气泡。计算模型显示，RWV中存在一个气泡可能会产生相对于周围环境显著升高的局部剪切力区域。这是因为气泡倾向于停留在RWV的顶部，而液体继续围绕它旋转。由于它们的有害影响，从设备中去除任何气泡是必要的。去除气泡的一种方法是使用最近描述的“气泡隔离”HARV型RWV（见图7），在其中气泡不断地被隔离在一个沿着HARV总周长约80%的细外部同心通道中，并由一个细入口与主体连接。这种设计可以由低成本材料定制构建。此外，这种设计的变体将灌注纳入HARV，因此使用气泡捕获设计。通过不断地将来自更大储液器的培养基混合到HARV中，这种设计减少了频繁更换培养基的需求，简化了最终用户的操作。这对于将来可能需要扩大规模的项目尤为重要。 图 7. 新型气泡隔离生物反应器。(A) 无气泡时传统 HARV 设计的计算流体动力学（CFD）。(B) 无气泡时气泡隔离 HARV 的 CFD。(C) 由于存在气泡（箭头指示），传统 HARV 的 CFD 显示流体流动受到显著干扰。(D) 存在气泡（箭头指示）的气泡隔离 HARV 的 CFD。气泡被隔离在通道中，导致没有流动干扰。(E) 在传统设计中形成后带有气泡的球状体，显示小型、破碎的球状体。比例尺 2.5 厘米。(F) 在气泡隔离设计中形成后带有气泡的球状体，显示大型、形态良好的球状体。经 Phelan 等人许可改编。 用户的另一个挑战是确定正确的速度，以保持固体体旋转和RWV内类器官的连续自由落体之间的平衡。基于聚集体/类器官的大小/密度及其在容器中的沉降系数，最佳低剪切旋转所需的确切速度会有所不同。对于均匀培养，随着时间的推移，类器官的大小会增加，必须随着时间增加旋转速度以保持上述平衡。例如，DiStefano等人表明，他们需要在两周内将RWV旋转速度从20提高到27 RPM，以在视网膜类器官生长时保持固体体旋转。然而，对于在RWV中类器官大小和密度显著不同的异质类器官培养，可能无法找到一个适合所有颗粒的旋转速度。 RWVs的最后一个限制是它们设计内在的，即微重力模拟。虽然RWVs可以并且已经用于模拟各种组织中的微重力效应（如前所述），但用户必须考虑，当微重力模拟不是研究的预期焦点时，SMG环境实际上可能对培养产生有害影响。SMG的一些记录效应包括改变心脏细胞中的钙处理，减少软骨形成，以及干扰细胞分化途径，例如在SMG中进行的成骨分化期间成骨标记ALPL和OMD的下调。因此，必须设计适当的对照，以确定在RWV中培养的细胞的任何变化是由于增强的混合、低剪切应力还是微重力模拟。然而，由于SMG效应可能对特定的细胞和组织类型有害，并非所有类器官都适合在RWV中培养，特别是肌肉骨骼类器官，除非目的是研究SMG对那种组织的影响。 5.电刺激生物反应器  电刺激（ES）生物反应器在这里被定义为能够为在设备内培养的细胞和类器官提供某种类型ES的任何生物反应器。尽管向细胞提供ES有几种方法，如电容耦合和感应刺激，但最常见的方法是直接刺激。这涉及将电极直接插入感兴趣的细胞的培养基两侧，如图1D所示。使用这种方法，电流可以直接通过细胞和类器官/组织。一些组织被认为是“电刺激可兴奋的”，包含可以响应或产生电信号的细胞。体外培养的一些组织已经从外部电刺激中受益，作为调节生长、分化和成熟的一种工具。这些的一些示例可以在表4中找到。 在那些可兴奋的组织中，最重要的是神经组织（包括视网膜和其他周围神经组织）和肌肉（包括心脏组织）。心脏内源性电场有助于细胞分化、定向、增殖和各种信号因子的上调。在器官/组织层面，电场有助于组织和细胞的模式形成。 ES生物反应器系统在设计和使用的材料方面有所不同，但大多数包含相同的基本组件，即电极和一些专门提供刺激电力的系统。在大多数情况下，电刺激不是连续传递的；相反，它是使用特定频率、持续时间和幅度的电脉冲传递的。虽然一些ES生物反应器设计是基础的，即基本上由感兴趣的细胞/类器官两侧的两个电极组成，但一些设计可能更复杂。多电极阵列（MEAs）已广泛用于刺激和记录来自细胞单层的电信号，但最近已开发出用于向脑类器官提供ES的变体。这些最近的MEA发展集中在创建一个更复杂的3D MEA，能够在不刺激整个类器官的情况下刺激类器官的特定区域。 5.1. 类器官电刺激 ES的应用有助于可兴奋组织类器官的分化和成熟（见表4）。例如，干细胞衍生的心肌细胞在标准体外培养条件下无法完全成熟，因为它们缺乏成熟心肌细胞在体内的增强形态、电生理学、钙处理、收缩性和代谢。电刺激是用于增强3D类器官中心肌细胞成熟的方法之一。使用心脏胚状体/类器官，一项研究使用了一个定制的生物反应器，由嵌入到PDMS（聚二甲基硅氧烷）井侧面的碳棒组成（见图8A）。在分化的第23-30天，类器官受到电刺激，使用5 V/cm的幅度和2 ms脉冲，频率为0.5、1或2 Hz。总的来说，ES导致心脏基因表达和细胞-细胞连接的增加，如图8中总结的数据所示。此外，随着频率的增加，作者报告了对更高频率跳动的适应。对于2 Hz，停止ES后，类器官继续自发收缩在2 Hz或接近2 Hz，而非刺激的类器官表现出更慢的自发收缩。此外，在2 Hz条件下调节类器官使它们能够在3 Hz刺激下存活，而非调节的类器官在3 Hz ES下存活率降低。在另一项研究中，将刺激频率从1 Hz增加到2 Hz导致由hiPSC衍生的心肌细胞形成的心脏类器官中心脏肌钙蛋白表达和肌节组织的增加。 图 8. 用于电刺激的PDMS微生物反应器。(A) 微生物反应器设置示意图，显示嵌入PDMS中的碳棒电极。横截面视图显示PDMS井边缘的电极，中心有用于类器官的空间。细胞在特定频率下接受ES处理7天。(B-G) 通过免疫染色测量心脏分化和成熟标志物的量化，包括肌钙蛋白T（B）、连接蛋白43（D）、肌节计数（F）、肌钙蛋白I（C）、间隙连接蛋白α1（E）或肌蛋白（G）的qPCR。所有误差条显示均值的标准误差（SEM），* p < 0.05。经Eng等人许可改编。 虽然这些研究试图确定ES是否会增强心脏类器官的成熟，但ES也已被用于诱导早期心脏分化。例如，Ma等人使用IonOptix C-Pace商业刺激系统，在类器官形成后七天开始ES，并观察到在ES开始后仅两天就出现了跳动的心脏类器官（与无ES的7天相比）。在ES培养2周后，与对照组相比，自发的钙离子通量增加，使用受心脏肌钙蛋白报告器控制的工程化GCaMP钙指示剂观察到这一点。有了ES，表达心脏肌钙蛋白和Nkx2-5细胞的比例增加，许多离子通道和心脏转录基因上调，通过RNA-seq分析显示。作者得出结论，电刺激本身，即不使用任何外部化学信号，可以改善早期心脏分化。 ES生物反应器也已被用于增强神经类器官的培养。旨在刺激从小鼠皮层神经元培养的皮层脑类器官，Zhang等人设计了一种交错电极系统，如图9[89]所示。该系统被用于对野生型（WT）和神经调节蛋白1基因敲除（NRG1-KO）神经类器官施加ES。比较了有无电刺激的WT和NRG1-KO系。ES暴露导致NRG1-KO类器官的神经突数量和长度改善，并增加了突触形成标志物的表达，包括NCAM和PSD95，表明ES能够挽救表型并促进功能障碍神经元的发展（见图9了解更多细节）。 图 9. 电刺激对初级神经类器官的影响。(A) 使用3D共聚焦成像拍摄的MAP2免疫荧光图像。条件为WT（野生型）、NRG1（神经调节蛋白1基因敲除）、WT ES和NRG1基因敲除后进行ES。所有细胞均为小鼠前额叶皮层的初级神经元。(B) 量化的神经突长度 (C) 神经元数量。(D) 每个聚集体的细胞数量。* p < 0.05 与野生型基线相比；** p < 0.01 与野生型基线相比；*** p < 0.001 与野生型基线相比；# p < 0.05 与NRG1-KO基线相比；## p < 0.01 与NRG1-KO基线相比；### p < 0.001 与NRG1-KO基线相比。误差条表示标准误差（SEM）。经Zhang等人许可转载。 Sefton等人研究了电刺激对由小鼠神经前体细胞形成的神经球的形成和分化的影响。使用由铂丝制成的电极，他们发现体外刺激增加了细胞存活率和形成的神经球大小。此外，电刺激导致显示神经元和少突胶质细胞标志物的细胞比例增加，而表现出星形胶质细胞标志物的细胞比例下降。这表明电刺激可能影响神经细胞在早期阶段的命运决定。 5.2. 商用系统与定制系统 已有多种商用设备用于细胞和类器官的电刺激；据我们所知，最常见的系统是IonOptix公司的Culture Pacing System (C-Pace)。该系统包括一系列使用碳电极的定制组织培养板，这些电极从板盖延伸至培养表面。这还包括用于创建ES脉冲的信号发生器，这些脉冲已被用于提供ES至定制电极。具体来说，IonOptix系统已在多项使用ES培养类器官的研究中使用，因为它作为即插即用解决方案，用于为细胞/类器官培养提供ES的便利性。然而，一些研究人员更倾向于开发完全定制的ES设置，本文前面提到了一些。选择这样做的原因可能包括能够进一步定制系统，包括使用不同的电极材料、不同的培养容器，以及对刺激参数更具体的控制。此外，定制设计的系统可能允许纳入商用系统中没有的功能，例如添加培养基灌注或结合电刺激和机械刺激。另一个因素是成本，因为许多定制系统可以内部制作，成本相对较低。如上所述，最基本的ES系统主要只涉及将电极插入组织培养板，这可能以非常低的成本完成。 6.讨论/未来展望  生物反应器在体外培养类器官方面变得越来越有价值。与传统的静态培养相比，生物反应器更能支持许多组织类型的类器官的生长、分化和成熟。此外，先进的生物反应器技术已开始解决类器官培养固有的许多问题，例如为更大的3D组织构建物提供足够的氧气和营养物供应。我们讨论的大多数生物反应器的主要目的，即搅拌式、微流控和旋转壁容器生物反应器，是为更大的类器官和其他组织构建物提供所需的增强混合和质量传递。实现这种质量传递的方法在不同的生物反应器技术之间有显著差异，每种生物反应器技术都有其优点和缺点。搅拌生物反应器（SBRs）提供的简单性降低了进入门槛，吸引了来自不同研究领域的研究和研究人员。然而，这种简单性可能阻碍了一些用户引入修改（例如，连续灌注和局部应用试剂/生物分子）的能力。微流控生物反应器（MFBs）提供的控制水平允许用户精确调节流体流动和组成（例如，试剂、生长因子）；然而，高制造成本、操作复杂性和维持无菌性的挑战限制了它们在类器官培养中的广泛应用。同样，旋转壁容器（RWVs）也允许调节流体流动，并有提供模拟微重力环境的额外好处，但它们也遭受了一些与MFBs相同的挑战。 电刺激在这里有点不同，因为许多电刺激设置不提供任何介质混合或流体流动。这些平台的主要目标“只是”提供电刺激。然而，这让我们想到了我们认为类器官生物反应器技术中缺少的一个方面：组合生物反应器。很难找到任何设计用于提供多种类型刺激的生物反应器系统的示例，这些刺激适用于类器官培养。事实上，有一些生物反应器，例如设计用于通过2D支架进行电刺激和间质流动的生物反应器。像许多其他生物反应器一样，这个生物反应器并不是为球形类器官培养设计或优化的。未来研究结合多种技术，如带有嵌入式电极以进行刺激和电监测的微流控装置，可能对类器官培养有所帮助。我们认为生物反应器技术中缺乏的另一个值得注意的方面是缺乏为类器官提供机械压缩/张力刺激的生物反应器。这可能的一个原因是大多数类器官培养发生在悬浮中。然而，尽管许多体外组织构建物和细胞已被证明从机械刺激中受益，但这些通常在缺乏我们先前所述的类器官结构和功能要求的2D或基本3D构建物上进行。 我们已经讨论了各种不同生物反应器的商业和定制版本。需要注意的是，尽管定制的生物反应器通常代表着与商业销售系统相比成本显著降低的替代方案，但它们也带来了自己的挑战。这些挑战始于生物反应器的构建，特别是关于材料选择。当准备与细胞培养直接接触的材料时，重要的是确保材料对细胞兼容，并适合长期暴露于细胞培养条件。虽然商业生物反应器可能利用聚苯乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯和玻璃等材料，但这些材料在实验室环境中代表着重大的制造挑战。相反，大多数定制的生物反应器是由相对容易制造的如亚克力、PDMS和3D打印材料制成。然而，这些定制生物反应器的灭菌可能是一个挑战。虽然商业设备通常是一次性使用并销售无菌包装，或设计为可高压灭菌的，但实验室制造的生物反应器必须通过其他方式进行灭菌。虽然微流控生物反应器常用的玻璃和PDMS可以高压灭菌，亚克力和3D打印材料必须使用乙醇、氢氧化钠或微波炉的协议进行灭菌，正如其他地方所描述的。在灭菌输入/输出端口和连接器时必须小心，因为这些通常是污染的来源，特别是在长期培养中。尽管存在这些困难，定制的生物反应器通常代表着低成本和更易接近的替代昂贵的商业解决方案。由于它们在设计上的灵活性，与商业生物反应器相比，它们提供了更大的控制和定制。 我们期望在未来看到显著发展的一个领域是将更先进的基因工程方法纳入类器官培养。虽然类器官发展中肯定有一些使用基因编码荧光标记的例子（如前所述），但它们的使用尚未普及。鉴于基因编码标记的许多优点，特别是在监测基因表达变化方面，以及新基因工具允许如此轻松地生成这样的细胞系，这些工具的使用在未来几年应该会变得更加普遍。同样，如单细胞RNAseq等强大的工具，允许更全面地测量基因表达，价格迅速下降；因此，它们可能会被广泛用于分析类器官培养。 虽然这篇综述讨论了许多目前正在用于生成和培养类器官的生物反应器技术，但重要的是要讨论这些类器官的一些潜在应用。从理论上讲，这篇综述中讨论的每一种技术进步都使该领域更接近于成功地将类器官技术用于移植、药物发现和治疗各种疾病的个性化医疗。允许更快、更便宜地制造类器官，并能更好地重现原生、健康和病变组织的技术，将有助于促进类器官在临床环境中的应用。然而，以这种方式使用类器官带来了许多重大的技术挑战。任何新的类器官系统都必须经过验证，以证明它与原生系统相当，并能够以可比的方式反应。来自不同患者的iPSCs的差异可能导致患者特异性类器官的质量变化。当使用iPSC衍生的类器官进行植入时，任何未分化的干细胞仍然存在肿瘤或畸胎瘤形成的风险。由于这些原因及更多原因，生物反应器代表着强大的工具，可以用来生成更一致的批次类器官，并且在它们在体内植入后的分化和可塑性方面更明确，从而带来更好的转化和临床结果。 总之，已经使用了各种生物反应器来改善类器官培养的许多方面，包括组织特异性类器官的存活、分化和成熟，以及多能干细胞的维持和扩增。使用生物反应器精细控制和操纵体外环境对于成功培养类器官至关重要。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。