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【导读】 术中放疗（intraoperative radiation therapy， IORT）引发的免疫反应的综合分析尚不完整。 11月4日，南方医科大学与中山大学以及南华大学研究人员合作共同在期刊《Advanced Science》上发表了研究论文，题为“Landscape of the Peripheral Immune Response Induced by Intraoperative Radiotherapy Combined with Surgery in Early Breast Cancer Patients”，本研究中， 研究人员对IORT前后的早期乳腺癌患者的外周血单个核细胞（PBMCs）进行单细胞RNA测序和单细胞T细胞受体测序。IORT联合手术（定义为IORT+手术）后，PBMC计数保持稳定，T细胞、单核吞噬细胞和浆细胞比例升高，中性粒细胞比例降低。术中放疗后CD8Teff_GZMK细胞的细胞毒性评分显著升高。IORT后CD8Teff_GZMK细胞与其他免疫细胞通过MIF_CD74和MIF_TNFRSF14的交流减少。治疗后T细胞克隆明显扩增。IORT+手术可部分抑制中性粒细胞的抗肿瘤作用。流式细胞术分析和共培养实验被用于更深入地研究T细胞的功能变化。IORT+手术显著增强了T细胞的细胞毒活性。阻断PD-1后，术中放疗后PBMC的T细胞活性高于术前PBMC。 这项研究强调了IORT对免疫细胞的影响，为乳腺癌的靶向免疫反应提供了新的见解。 https://onlinelibrary-wiley-com.libproxy1.nus.edu.sg/doi/full/10.1002/advs.202308174 背景信息 01 筛查技术的发展提高了早期乳腺癌的检出率。保乳手术联合外放疗已成为治疗早期乳腺癌的标准方法。放疗有助于提高局部疾病管理和总生存率。乳腺癌保乳术后辅助放疗是在伤口愈合或完成化疗后进行。全乳放疗常规计划为50Gy/25次，总治疗时间为5 ~ 7周。放疗给患者带来不便，增加了经济成本。部分患者可能因术后并发症导致放疗延迟。术中放疗（Intraoperative radiotherapy， IORT）是在外科手术过程中实施的高剂量照射。IORT避免了术后组织瓣移位导致的瘤床定位偏差，提高了瘤床推放的准确性。术中放疗可有效管理瘤床，而瘤床是肿瘤复发风险较高的区域。它还降低了因化疗而导致的放疗延迟而导致的肿瘤增殖风险。IORT与全乳放疗在生存和不良反应方面有相似的结果，但完成治疗所需的时间更短。在这种情况下，IORT是早期乳腺癌保乳手术患者的良好选择。 肿瘤微环境（tumor microenvironment， TME）受多种因素的影响。遗传改变、表观遗传修饰以及不同细胞类型之间的相互作用导致了TME调控的复杂性。此外，放疗可以改变细胞表型和组织成分，从而影响癌细胞生存和肿瘤微环境。辐射不仅影响靶细胞，也影响未受辐射的邻近细胞，这种现象被称为辐射诱导的旁效应。在一些已发表的研究中，IORT已被证明影响肿瘤细胞和伤口渗出液。单次高剂量IORT通过触发免疫系统诱导癌细胞的免疫原性细胞死亡。研究人员进行了流式细胞术检查，观察到IORT后3周，NK CD56+高CD16+亚群显著上升。然而，关于IORT触发的外周免疫反应的信息仍然未知。 IORT抑制了中性粒细胞的功能 02 研究人员通过单细胞RNA测序识别出三种中性粒细胞群：中性粒细胞_IFIT1细胞、中性粒细胞_DUSP6细胞和中性粒细胞_S100A1细胞。在图1B中展示了中性粒细胞群在IORT+手术前后差异表达基因的热图。中性粒细胞_IFIT1细胞表达ISG15、MX1和IFIT1；中性粒细胞_DUSP6细胞表达PI3、CCR3和SIGLEC10；中性粒细胞_S100A12细胞表达S100A12、MMP9和RFLNB。图1C展示了每个样本中中性粒细胞_IFIT1细胞、中性粒细胞_DUSP6细胞和中性粒细胞_S100A12细胞的一般分布直方图。IORT+手术后，总中性粒细胞数减少，中性粒细胞_IFIT1细胞和中性粒细胞_DUSP6细胞均显示出减少的趋势。然后，研究人员进一步评估了每个中性粒细胞群在IORT+手术前后的功能变化。IORT+手术后，所有中性粒细胞群的趋化性、中性粒细胞激活和吞噬能力评分显著降低。IORT+手术对中性粒细胞衰老评分没有显著影响。根据KEGG分析，IORT+手术后的Neutrophils_IFIT1细胞在与NOD样受体信号通路、坏死性凋亡、抗原加工与呈递以及NF-κB信号通路相关的基因上显示出特定的富集。IORT+手术后的Neutrophils_DUSP6细胞在与趋化因子信号通路、细胞因子-受体相互作用、NF-κB信号通路、白细胞跨内皮迁移、催产素信号通路、IL-17信号通路、坏死性凋亡、Th17细胞分化以及NOD样受体信号通路相关的基因上显示出特别的富集。经IORT+手术处理后的中性粒细胞_S100A12细胞在与癌症相关的IL-17信号通路、中性粒细胞外泌体形成、NOD样受体信号通路、血小板激活、PD-L1表达和PD-1检查点通路、细胞凋亡、趋化因子信号通路、Th17细胞分化、HIF-1信号通路和TNF信号通路等方面显示出特定的富集。 图1：中性粒细胞的特性 IORT增强CD8+T细胞活性并与PD-1阻断产生协同作用 03 研究人员收集了六名乳腺癌患者在IORT+手术前后的PBMCs，用于后续实验。研究人员通过流式细胞术分析了PBMCs中CD8+ T细胞中GZMK+细胞的频率和CD8+ T细胞中IFN-γ+细胞的频率。结果显示，IORT+手术后CD8+ T细胞中GZMK+细胞和IFN-γ+细胞的比例显著增加（GZMK+ P <0.0001; IFN-γ+ P = 0.0012）。这些发现表明，IORT+手术后CD8+ T细胞的细胞毒性增强。PD-1是一种协同抑制分子，在T细胞功能中起着关键作用。阻断PD-1可恢复T细胞功能并促进有效的抗肿瘤反应。将激活的T细胞与MDA-MB-231或MCF-7细胞以E:T比例为3:1共培养48小时，不加或加入10微克/毫升的帕博利珠单抗（PD-1抑制剂），然后用结晶紫染色。研究人员发现，IORT+手术增强了人T细胞介导的细胞毒性。此外，在IORT+手术后用帕博利珠单抗培养的PBMCs表现出比在IORT前收集的PBMCs更强的人T细胞介导的细胞毒性。这些发现表明，当阻断PD-1时，接受IORT+手术治疗的外周T细胞会协同激活。 研究意义 04 这项研究描述了术中放疗+手术引起的系统性免疫反应，为识别增强免疫反应的潜在靶点铺平了道路。 【参考资料】 https://onlinelibrary-wiley-com.libproxy1.nus.edu.sg/doi/full/10.1002/advs.202308174 【关于投稿】 转化医学网（360zhyx.com）是转化医学核心门户，旨在推动基础研究、临床诊疗和产业的发展，核心内容涵盖组学、检验、免疫、肿瘤、心血管、糖尿病等。如您有最新的研究内容发表，欢迎联系我们进行免费报道（公众号菜单栏-在线客服联系），我们的理念：内容创造价值，转化铸就未来！ 转化医学网（360zhyx.com）发布的文章旨在介绍前沿医学研究进展，不能作为治疗方案使用；如需获得健康指导，请至正规医院就诊。 热门推荐活动 点击免费报名 🕓 上海｜11月15日-16日 ▶ 2024第一届中国类器官转化医学大会 🕓 上海｜11月21日-24日 ▶ 第七届上海国际肿瘤内科学论坛 🕓 全国｜2024年12月-2025年03月 ▶ 中国转化医学产业大会 🕓 上海｜2025年02月28日-03月01日 ▶ 第四届长三角单细胞组学技术应用论坛暨空间组学前沿论坛 点击对应文字 查看详情

长期激活IFN-I通路会导致自身免疫性疾病，许多炎症性自身免疫性疾病也是由促炎细胞因子的异常产生和功能引起的。因此，表征免疫细胞如何以内在方式发展以精确控制其 IFN-I 和促炎细胞因子的产生和效应反应将加深对自身免疫和耐受机制的理解。目前已证实多种代谢物除了具有代谢功能外，还在调节不同的免疫过程中发挥各种作用。因此，识别调节免疫的代谢物及其蛋白质靶点，然后开发它们的小分子模拟物是一种有前途的自身免疫性疾病治疗方法。然而，直接调节自身免疫中 IFN-I 等细胞因子促炎反应的细胞代谢物需要进一步鉴定。 2024年6月21日，中国医学科学院基础医学研究所曹雪涛院士团队在Immunity（IF=25.5）发表题为“Cellular spermine targets JAK signaling to restrain cytokine-mediated autoimmunity”的文章，发现精胺（spermine）广谱性地抑制JAK1介导的I型及II型细胞因子免疫应答及其炎症效应。机制上，精胺通过直接结合JAK1蛋白、抑制JAK1与相关细胞因子受体结合，进而阻断细胞因子下游信号转导通路的激活，发挥了免疫抑制与抗炎的作用，而体内应用精胺能够有效缓解自身免疫性疾病小鼠模型的疾病进程。此外，团队还基于天然精胺结构自行构建合成了精胺衍生物SD1，并证明其具有广谱免疫抑制与抗炎功能，有望成为新型免疫抑制剂药物。 Highlights 1）精胺抑制JAK1介导的I/II型细胞因子信号传导； 2）精胺占据JAK1 N端口袋，限制其与受体结合； 3）细胞内精胺含量低可增强SLE PBMCs 中的ISG和狼疮特征； 4）精胺及其衍生物SD1可减轻自身免疫小鼠的病理特征 1、功能筛选发现可抑制 IFN-I 反应的精胺 为了研究巨噬细胞在 IFN-I 刺激下的代谢物情况，作者利用靶向代谢组学方法分析了接受或未接受 IFN-b 治疗的小鼠骨髓来源的巨噬细胞（BMDM），发现73 种代谢物发生显著变化，并利用非靶向代谢组学分析方法在水泡性口炎病毒（VSV）感染诱导 IFN-I 产生后，在 BMDM 中发现了43 种代谢物发生显著变化。在两个实验系统中出现的这些变化的代谢物中，有5种代谢物发生了共同变化，接着利用报告基因筛选技术发现其中的精胺是巨噬细胞中干扰素-I（IFN-I）反应的有效抑制剂。 图1 精胺抑制巨噬细胞中的IFN-I反应 2、精胺抑制IFN-I、IFN-g、IL-2和IL-6诱导的JAK信号传导 在BMDM中，精胺显著降低IFN-b 刺激引起的p-JAK1、p-酪氨酸激酶2 (TYK2)、p-STAT1 和 p-STAT2。RNA-seq显示精胺预处理降低了IFNb诱导的ISG mRNA，对IFN-b刺激后精胺和DMSO处理的细胞之间差异下调基因的GO分析显示与细胞因子反应相关的基因主要富集。此外，精胺抑制了人类单核细胞 THP-1 细胞中的 IFN-b 信号传导。JAK-STAT 通路是多种细胞因子的关键下游信号传导事件，精胺广泛抑制了各种细胞中由 IFN-g、IL-6和IL-2触发的JAK-STAT通路的激活。这些数据表明，精胺通过阻断 JAK 激活来抑制细胞的细胞因子反应。 图2 精胺抑制不同细胞因子刺激后JAK1信号转导 3、精胺直接与JAK1的FERM和SH2结构域结合损害 JAK1-细胞因子受体互作 JAK1组成性地结合细胞因子受体的细胞内结构域，细胞因子触发受体二聚化和Janus 激酶的反式磷酸化，JAK1与细胞因子受体之间的相互作用对于信号激活至关重要。由于精胺抑制了细胞因子触发的JAK1磷酸化，作者猜测精胺有可能作用于JAK1与受体互作环节。随后，通过邻位标记技术（PLA）、免疫共沉淀及生物素精胺Pulldown、分子对接和分子动力学分析等实验体系验证了这一猜想，即精胺通过直接结合JAK1蛋白精胺直接与JAK1的N-末端FERM和SH2结构域结合，从而阻断了JAK1与细胞因子受体的结合，进一步在JAK1蛋白N端结构区域内鉴定到两个精胺结合的关键口袋，并通过突变验证证实了上述口袋对于精胺调控的JAK1/受体互作起到关键作用。 图3 精胺直接与JAK1的FERM和SH2结构域结合损害JAK1-细胞因子受体互作 4、异常的精胺代谢途径会干扰 JAKSTAT 信号传导和细胞因子反应 细胞内的多胺浓度由一组酶精细调节。鸟氨酸脱羧酶（Odc1）和亚精胺/精胺N1-乙酰转移酶1（Sat1）是多胺代谢中的限速酶。在巨噬细胞中，IFN-b 刺激后，ODC1 表达降低，而 SAT1 表达增加。当暴露于细胞因子刺激时，细胞会经历增强的多胺分解代谢或减弱的多胺合成代谢，作者通过代谢流实验发现IFN-b刺激下精胺分解代谢被激活，而补充精胺而不是亚精胺是补充细胞内精胺池的有效方法，尤其是在炎症环境下。作者接着发现精胺代谢途径的扰动显著影响了JAK-STAT信号传导和细胞因子反应。操纵参与精胺代谢的关键酶，如ODC1、SMS和SAT1，可以改变细胞对IFN-β刺激的反应。这些发现突出了代谢过程和免疫调节之间的复杂关系。总之，当细胞对细胞因子应激作出反应时，细胞内的精胺池和代谢途径受到严格控制，而且异常的精胺代谢途径会干扰 IFN-I 和相关的细胞因子反应。 图4 扰乱精胺代谢途径会干扰细胞 IFN-I 反应 5、精胺会削弱 SLE 患者PBMCs 中的IFN-I反应 作者接着检测了SLE患者的外周血单核细胞（PBMC），发现SLE 患者的PBMCs显示出异常的多胺代谢酶表达，例如SAT1和ODC1 mRNA水平增强，表明SLE患者的多胺代谢途径总体激活。随后，对精胺浓度低或高的 SLE 患者的 PBMCs进行RNA-seq分析表明，发现与精胺浓度高的SLE患者相比，精胺浓度低的SLE患者的PBMCs显示出增强的IFN-a和IL-4反应特征。此外，较低的精胺浓度与T细胞和B细胞中狼疮特征的表达呈正相关，表明精胺是识别SLE进展的潜在关键因素。总之，数据证实了精胺在抑制SLE 患者PBMCs中IFN信号传导方面的作用，表明精胺消耗可能与SLE等自身免疫性疾病的发病机制密切相关，并暗示体内注射精胺可能通过抑制异常的 IFN-I 反应对SLE患者产生治疗作用。 图5 精胺会削弱SLE患者PBMCs中的IFN-I反应 6、精胺可抑制体内 IFN-a反应并减轻小鼠SLE模型中的皮肤病变 体内用精胺预处理可降低静脉注射hIFNa-1b的小鼠肝脏和肺脏中的 Cxcl10 和 Isg15 mRNA 或 PBMCs 中的 Mx1 和 Isg15 mRNA。此外，注射 hIFNa-1b 后，Sat1-/-小鼠肝脏和肺脏中 Cxcl10 和 Isg15 的表达或 PBMCs 中 Mx1 和 Cxcl10 的表达低于 Sat1+/+ 小鼠。因此，体内施用精胺可有效抑制 IFN-I 反应，表明精胺在SLE或其他I型干扰素病中具有潜在的治疗价值。于是，作者采用了pristane诱导的SLE小鼠模型，使用野生型或Ifnar1缺陷型小鼠以确定精胺在体内控制自身免疫性疾病中的作用。RNA-seq分析发现，精胺预处理或Ifnar1缺失显著降低了ISG表达，Reactome通路分析表明，体内施用精胺导致的通路重塑与Ifnar1缺失导致的通路重塑非常相似。精胺预处理或Ifnar1缺陷的SLE小鼠模型表现出较轻的皮肤损伤、减少的皮肤损伤和表皮增生。总的来说，体内注射精胺可以抑制体内IFN-I反应并减轻Pristine诱发的SLE小鼠模型中的自身炎症损伤和疾病进展。 图6 精胺可抑制体内 IFN-a 反应并减轻小鼠 SLE 模型中的皮肤病变 7、体内施用精胺及其衍生物SD1可减弱自身免疫发病机制 最后，作者尝试从天然精胺中开发具有广泛免疫抑制功能的药理活性化合物。选择通过药效团杂交和骨架跳跃策略设计的69 种候选化合物，通过功能筛选，确定了一种有吸引力的精胺衍生物（spermine derivative 1，SD1）。体外实验发现SD1在IFN-b刺激后有效抑制 RAW-Lucia 细胞中的ISG启动子活性，在IFN-I刺激后抑制PM中的JAK1信号传导，生物层干涉测定表明SD1与小鼠JAK1的N端结合。接着体内实验显示精胺和SD1对MRL/lpr狼疮易感小鼠的具有免疫抑制作用，SD1治疗后观察到病情进展减轻，且SD1 具有广泛的免疫抑制特性。此外，在咪喹莫特 (IMQ) 诱导的银屑病样小鼠模型中，SD1 更能诱导皮肤病变缓解、减少免疫细胞浸润并防止体重减轻。数据表明，精胺及其衍生物 SD1 可能是一种免疫抑制化合物，可广泛用于预防与过度 I/II 型细胞因子反应和 T 细胞过度激活相关的病理疾病。 图7 精胺衍生物SD1对细胞因子信号传导和自身免疫小鼠模型表现出广泛抑制作用 总结 研究通过对IFN-β激活的巨噬细胞进行代谢组学分析和 IFN 刺激反应元件报告基因筛选，确定精胺是Janus 激酶 (JAK) 信号传导的代谢物制动器。精胺直接与JAK1的FERM和SH2结构域结合，从而削弱 JAK1-细胞因子受体相互作用，从而广泛抑制由细胞因子 IFN-I、IFN-II、白细胞介素 (IL)-2 和 IL-6 触发的JAK1磷酸化。SLE患者的外周血单核细胞 (PBMC) 中精胺浓度降低，表现出增强的IFN-I和狼疮基因特征。精胺治疗可减弱 SLE 和银屑病小鼠的自身免疫发病机制，并降低SLE患者单核细胞中的IFN-I信号传导。最后，作者合成了一种精胺衍生物（SD1），并表明它具有强大的免疫抑制功能。研究结果表明，精胺是细胞稳态的代谢检查点，也是控制自身免疫性疾病的潜在免疫抑制分子。 图8 精胺及其衍生物直接靶向JAK信号通路抑制自身免疫 原文链接： https://doi-org.libproxy1.nus.edu.sg/10.1016/j.immuni.2024.05.025 声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！ 长按关注本公众号  粉丝群/投稿/授权/广告等 请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓

撰文：中国药科大学杨勇/林昂团队带状疱疹是由潜伏在体内的水痘-带状疱疹病毒（Varicella Zoster Virus, VZV）再激活引起的急性感染性皮肤疾病，在50岁以上及免疫功能不全人群中高发。目前，葛兰素史克(GSK)旗下的蛋白亚单位疫苗Shingrix 霸占全球带疱疫苗市场，在2023年第二季度就为GSK带来近12亿美元的收入。虽然该疫苗市场定价高、供应不足且临床副作用相对较大，但其高达90%以上的保护效力使其仍备受市场青睐。近年来，包括Moderna, BioNTech 在内的国内外数十家mRNA药物研发企业聚焦带状疱疹疫苗赛道。然而截至目前，mRNA技术在带疱疫苗研发中的具体优势及与Shingrix的系统药效比对研究仍是空白。近日，中国药科大学杨勇/林昂团队基于自主mRNA技术开发出一款新型带状疱疹mRNA疫苗（命名: ZOSAL），并在小鼠及恒河猴模型中完成了与Shingrix的头对头系统药效学比对及免疫机制学研究，研究成果在预印本BioRxiv上线：“Herpes zoster mRNA vaccine induces superior vaccine immunity over licensed vaccine in mice and rhesus macaques”。研究显示，在成年小鼠和老龄小鼠中，低、中剂量的VZV mRNA疫苗既能够明显激活病毒特异性T细胞应答，且显著优于Shingrix。此外，IL-21分泌型滤泡辅助T细胞应答也得到明显活化 （图1和2）。图1. 成年C57BL/6小鼠中，ZOSAL诱导出显著高于Shingrix的病毒特异性Th1型细胞应答。图2.  老龄C57BL/6小鼠中，ZOSAL诱导出显著高于Shingrix的病毒特异性Th1型细胞应答。接下来，团队进一步使用非人灵长类动物模型开展全方位系统免疫学研究。结果显示，ZOSAL接种后的恒河猴体内产生了显著高于Shingrix组的Th1型T细胞应答。值得注意的是，单针mRNA疫苗免疫2周后既能够诱导明显的病毒特异性T细胞活化（图3）。图3.  在恒河猴中，ZOSAL诱导出显著高于Shingrix的病在此基础上，团队进一步围绕疫苗应答的发生机制展开研究。通过对二次免疫接种后24小时的恒河猴外周血淋巴细胞进行RNA测序分析，发现两款疫苗均能够显著激活以髓系细胞活化、I型干扰素通路活化、抗原加工提呈增强为主要特征的天然免疫应答指征。而意外的是，Shingrix接种在诱导T细胞活化相关基因上调的同时，也伴随诱导T细胞功能负调基因的上调。相比之下，mRNA疫苗接种后未产生该负调效应。此外，通过对疫苗接种前后共45项关键免疫指标的多变量相关性和聚类分析，发现了疫苗特异性T细胞应答的早期相关标志物。Mx1, isg20, b2m等与IFN通路活化和抗原加工处理相关的基因与T细胞应答呈现显著正相关性。而抗体ADCP功能，中性粒细胞/淋巴细胞比例（NLR）水平则与之呈现负相关，提示特殊的吞噬细胞群体在疫苗接种后的一过性升高可能影响mRNA疫苗免疫效力。该团队目前围绕这一现象正开展后续研究工作。图4.  2种疱疹疫苗接种后早期天然免疫基因图谱变化和多参数相关性分析。本项研究中，团队还依托中国药科大学新药安全评价研究中心（GLP）平台，针对ZOSAL的初步安全性进行了分析。结果显示，恒河猴血清中包括肝脏、肾脏酶在内的系列血清生化指标在疫苗接种后保持稳定。值得注意的是，Shingrix接种后，血小板激活相关、疼痛相关基因出现了明显上调。相比较，mRNA疫苗接种后，这两类基因群体并未出现显著变化 （图5）。初步安全性评价结果显示了该新型带状疱疹mRNA疫苗的安全性优于已上市疫苗Shingrix。图5.  ZOSAL与Shingrix在恒河猴体内的初步安全性分析。该研究的第一通讯作者中国药科大学林昂研究员介绍到 “带状疱疹病毒的特殊性在于其初次感染后的终身潜伏，且T细胞介导了绝对的免疫保护，抗体完全不发挥作用，这恰恰对应了mRNA疫苗的优势。后疫情时代，mRNA技术如何得到科学合理的应用，在哪一类疾病的药物开发中发挥优势，是需要思考的问题。”该研究由中国药科大学、山东大学、大连医科大学、瑞典卡洛琳斯卡医学院等多家院校合作完成，并得到炉石生物在脂质分子开发等方面的技术支持。研究获得中国药科大学兴药青创启动基金、国家自然科学基金、江苏省自然科学基金、国家自然科学基金（中国-瑞典）国际合作项目等资助。参考资料https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2023.08.16.553640v1.识别微信二维码，添加小编，符合条件者即可申请加入微信群！请注明：姓名+单位！遇声明：本文旨在传递更多信息，版权归原作者所有。原创文章转载均需经过授权并注明来源，如涉及内容、版权或其他问题请时联系小编删除！文章仅代表作者个人观点，并不代表公众号立场。本公众号拥有对此声明的最终解释权！投稿邮箱：yck19876@163.com