PI4KIIα

醉茄内酯（Withanolides）是一类植物来源的甾体内酯，其衍生物被报道通过调节NF-κB、MAPK和WNT等通路发挥抗炎和抗肿瘤作用，且有报道称withanolide D通过调节神经酰胺的产生诱导白血病细胞凋亡，寻找新的更有效的醉茄内酯衍生物用于治疗白血病并阐明其作用机制至关重要。 2024年6月21日，奥地利CeMM分子医学研究中心Georg Winter团队在Nature Chemical Biology（IF=12.9）发表题为“Orpinolide disrupts a leukemic dependency on cholesterol transport by inhibiting OSBP”的研究文章，从天然产物母核出发，设计和合成了一系列结构多样化的withanolide类似物，并通过表型筛选发现了活性最强的orpinolide。机制上，orpinolide直接靶向OSBP，干扰PI4P信号传导，破坏高尔基体稳态和白血病细胞胆固醇转运依赖性，抑制白血病细胞生长。 1、表型筛选确定Orpinolide对白血病细胞的抑制作用 作者从52个withanolide类似物的化合物库中，通过表型筛选鉴定出orpinolide在多种白血病细胞系中具有最强的抑制细胞生长活性，而对正常的外周血单核细胞毒性明显较低，表明其对肿瘤细胞有选择性（图1）。 图1 醉茄内酯衍生物的功能分析 2、多组学确定orpinolide破坏高尔基体稳态并抑制胆固醇合成 为探究orpinolide的作用机制，作者系统开展了蛋白组学和转录组学的多组学分析。蛋白质结果显示下调蛋白主要定位于高尔基体，参与糖蛋白生物合成等过程，提示orpinolide破坏了高尔基体的正常功能。接着通过RNA测序发现胆固醇生物合成基因大幅下调。多组学分析表明，orpinolide治疗会破坏胆固醇的生物合成，并影响一系列高尔基体相关蛋白的细胞丰度，表明高尔基体稳态的功能受损，这可能是其发挥抗肿瘤活性的主要机制（图2）。 图2 orpinolide破坏高尔基体稳态并抑制胆固醇合成 3、基因组CRISPR/Cas9筛选确定orpinolide抗肿瘤活性依赖于PI4P信号通路 作者在KBM7细胞中进行了全基因组 CRISPR-Cas9 敲除的功能丢失筛选，发现敲除内质网-高尔基体膜接触点磷脂酰肌醇-4-磷酸（PI4P）转运相关基因PITPNB、ARMH3可显著降低KBM7细胞对orpinolide的敏感性，靶向敲除实验进一步确证了PITPNB、ARMH3敲除细胞系对orpinolide的抗性。此外，PI4KB抑制剂可拮抗orpinolide的细胞毒性,而PI4K2A抑制剂PI-273无此效应。结果表明orpinolide发挥抗白血病活性依赖于由PI4KB介导的高尔基体PI4P信号通路（图3）。 图3 orpinolide在功能上依赖于PI4P信号传导 4、化学蛋白质组学揭示orpinolide直接结合并抑制OSBP介导的胆固醇转运 鉴于orpinolide影响高尔基体稳态发挥作用，作者推测其直接蛋白质靶标将参与高尔基体相关过程。随后作者通过TPP实验来确定orpinolide的细胞靶标，将31和候选靶标与高尔基体定位（UniProtKB SL-0266）和固醇结合（GO：0032934）蛋白叠加，该交集显示OSBP是orpinolide的推定靶标。有研究报道OSBP作为内质网-高尔基体接触位点的主要脂质转运蛋白，利用PI4P的代谢能量在膜之间交换胆固醇和PI4P。随后作者通过CETSA、体外荧光偏振实验证实了OSBP是orpinolide的直接蛋白质靶标。FRET实验进一步证实orpinolide抑制了OSBP介导的胆固醇在供体和受体膜泡间的转运（图4）。 图4 Orpinolide靶向氧固醇结合蛋白OSBP 5、基因敲除与化学抑制实验证实OSBP抑制是orpinolide的关键抗肿瘤机制 作者最后开展了一系列的基因敲除和化学抑制实验验证了OSBP抑制在orpinolide抗肿瘤活性中的作用。免疫荧光结果显示orpinolide处理导致OSBP在高尔基体上聚集，破坏了高尔基体的完整性。II型前胶原蛋白（type 2 procollagen，PC2）实验发现orpinolide影响ER和高尔基体之间的货物顺向运输，即orpinolide治疗显著延缓了PC2的运输。结果表明orpinolide诱导的OSBP抑制对 Golgi 正常功能的功能性影响。此外，过表达OSBP及其P191R突变体均可降低KBM7细胞对orpinolide的敏感性，且单独敲除OSBP即可模拟orpinolide的增殖抑制效应，表明OSBP是其主要药效靶点（图5）。 图5 OSBP抑制是orpinolide的关键抗肿瘤机制 总结 该研究通过表型筛选发现醉茄内酯衍生物orpinolide具有选择性抗白血病活性，并通过整合多组学分析揭示其通过破坏高尔基体稳态和胆固醇转运发挥抗肿瘤效应，进一步通过基因组CRISPR/Cas9筛选确定了PI4P-PITPNB-ARMH3信号通路在orpinolide作用中的必要性，接着通过化学蛋白质组学方法鉴定出胆固醇转运蛋白OSBP是其直接作用靶点。最后通过基因敲除和化学抑制实验确定OSBP抑制是orpinolide发挥抗白血病活性的主要作用机制（图6）。 图6 orpinolide靶向OSBP干扰PI4P信号传导破坏高尔基体稳态治疗白血病 参考文献 Cigler M, Imrichova H, Frommelt F, Caramelle L, Depta L, Rukavina A, Kagiou C, Hannich JT, Mayor-Ruiz C, Superti-Furga G, Sievers S, Forrester A, Laraia L, Waldmann H, Winter GE. Orpinolide disrupts a leukemic dependency on cholesterol transport by inhibiting OSBP. Nat Chem Biol. 2024 Jun 21. doi: 10.1038/s41589-024-01614-4. Epub ahead of print. PMID: 38907113. 声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！ 长按关注本公众号  粉丝群/投稿/授权/广告等 请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓

脂质磷酸肌醇是细胞各种生命活动的主要调节剂，由磷酸肌醇激酶严格调控产生。目前主要集中在I类磷酸肌醇3-激酶 (PI3K) 的药物治疗上，但近年来已经揭示了靶向几乎所有人类疾病中磷酸肌醇激酶的可能性，包括癌症、免疫缺陷、病毒感染和神经退行性疾病，开发更多磷酸肌醇激酶的强效和选择性抑制剂成为自然趋势。磷酸肌醇激酶可大致分为三个家族：第一个家族包含所有类别的磷酸肌醇3-激酶（PI3K）和III型PI4K，第二个家族包含PIP激酶，最后一个家族包含II型PI4K（图 1）。 本文将对这三个家族的前沿进展进行详细分析。 图1 磷酸肌醇和产生它们的磷酸肌醇激酶I类PI3K抑制剂磷酸肌醇激酶是多种人类疾病的治疗靶点，包括癌症、病毒感染、神经退行性疾病、发育障碍、糖尿病和炎症性疾病。目前，有许多I类PI3K抑制剂在临床上被批准用于治疗多种癌症。I类磷酸肌醇3激酶(PI3K)产生磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸(PIP3)，是细胞生长、代谢和免疫功能的主要调节剂。PI3K通路是癌症中突变最频繁的通路，PI3K的体细胞突变是多种人类癌症、原发性免疫缺陷、发育障碍和过度生长综合征的致病因素。PI3K 抑制剂的研发将为其他磷酸肌醇激酶抑制剂的设计提供信息。表1  I类PI3K抑制剂进展情况I 类PI3K以外的磷酸肌醇激酶抑制剂2.1  PIP激酶演化家族2.1.1 PIKfyve● 结构PIKfyve是真核生物中唯一催化从磷脂酰肌醇3-磷酸(PI3P)生产磷脂酰肌醇3,5-二磷酸(PI(3,5)P2)的蛋白质。除了脂质激酶活性外，PIKfyve还具有蛋白激酶活性，并受抑制性自磷酸化调节。PIKfyve复合体在离子稳态，内吞途径的内体运输、细胞迁移和溶酶体功能中发挥作用。对小鼠突变体和敲除模型以及患者临床突变的研究揭示了PIKfyve复合体所有成员在中枢和周围神经系统中的关键作用。 图 2：PIKfyve 的结构-功能、抑制和治疗靶向● 药理抑制剂PIKfyve抑制剂通过破坏内溶酶体运输来阻断病毒进入宿主细胞质，从而显示出作为抑制病毒感染靶点的前景。能够改善神经退行性疾病，抑制病毒感染和癌症。目前已开发出多种PIKfyve抑制剂。大部分PIKfyve抑制剂还处于临床前阶段，如YM201636，MF4，APY0201，WX8，NDF和MOMIPP。第一个被发现的强效和选择性PIKfyve抑制剂YM201636源于针对I类PI3K的药物发现，它对PIKfyve非常有效，选择性是I类PI3Kp110α的100倍。PIKfyve抑制剂Apilimod和ESK981正在进行针对癌症和病毒感染的临床试验。PIKfyve抑制剂YM201636和Apilimod都阻断了帕金森病体外模型HEK293细胞中α-突触核蛋白的单体聚集。表2  PIKfyve抑制剂总结2.1.2 PI4P5Ks和PI5P4Ks● 结构PI(4,5)P2是哺乳动物细胞中最丰富的双磷酸化磷酸肌醇，而且还是基本癌症和代谢激酶PI3K的底物。负责产生PI(4,5)P2的激酶被分为两个亚家族，即I型和II型激酶。在哺乳动物中，I型PI4P5K家族由三种亚型（PI4P5Kα、PI4P5Kβ和PI4P5Kγ）组成，也存在三种哺乳动物II型PI5P4K亚型（PI5P4Kα、PI5P4Kβ和PI5P4Kγ）。 图 3：PI4P5K 和 PI5P4K 的结构-功能和抑制● PI4P5Ks的药理学抑制剂迄今为止，已经报道了有限数量的有效和特异性PI4P5K抑制剂，并且仍处于临床前开发的早期阶段，它们被报道抑制癌症和炎症性疾病（表3）。其中最好的是ISA-2011B，它以高亲和力结合PI4P5Kα并在多种模型中抑制其蛋白质表达和癌症生长以及抑制炎症，但它具有显着的脱靶效应，进一步优化ISA-2011B，或开发另一种对PI4P5Kα具有更高选择性的基团，将是推进PI4P5Kα抑制剂超越临床前研究的必要条件。●PI5P4Ks的药理学抑制剂PI5P4K已成为p53无效肿瘤中有吸引力的药物靶标，并被认为是代谢的关键调节剂。临床前研究正在探索早期阶段的小分子抑制剂，包括泛PI5P4K抑制剂和亚型特异性PI5P4K抑制剂（表3），它们表现出抑制糖尿病，免疫性疾病，神经退行性疾病和抗癌效果，但目前尚未进入临床阶段。表3  PI4P5Ks和PI5P4Ks抑制剂总结2.2  PI3K−III型PI4K进化家族2.2.1 PI4KA和PI4KB● 结构有四种哺乳动物磷脂酰肌醇4-激酶(PI4K)，由II型（PI4KIIα和PI4KIIβ）和III型（PI4KIIIα和PI4KIIIβ，）组成，它们一起从磷脂酰肌醇中产生PI4P。PI4P在多种细胞器中介导了蛋白质的膜募集、整合膜蛋白活性的调节和细胞器之间的脂质转运。PI4KA和PI4KB蛋白具有与PI3Ks进化相关的同源螺旋和脂质激酶结构域（图4a、b）。然而，这两种蛋白质通过一组独特的蛋白质结合分子和翻译后修饰具有不同的调节模式。 图 4：PI4KA 和 PI4KB 的结构-功能、抑制和治疗靶向● PI4KA的药理学抑制剂PI4KA在HCV感染中的关键作用促进有效和特异性PI4KA抑制剂的开发。PI4KB抑制剂可预防病毒感染，寄生虫感染，PI4KA和PI4KB抑制剂具有抗癌作用。表 4  III型PI4K和II、III类PI3K的抑制剂总结2.3  II类PI3K● 结构II类PI3K，也称为PI3KC2，存在α、β和γ三种亚型。PI3KC2s催化PI和PI4P的3-OH磷酸化；因此，它们似乎既是用于PI3P合成的III类PI3K的替代品，也是I类PI3K和5-OH磷酸酶介导的PI(3,4)P2生产的替代品。研究最深入的II类亚型是PI3KC2α，它在发育中起着至关重要的作用，PI3KC2α生成的PI(3,4)P2作为内吞作用的关键驱动因素。PI3KC2β中激酶死亡突变的纯合小鼠表现出葡萄糖耐量增强。 图 5：II类PI3K的结构-功能、抑制和治疗靶向● 药理抑制剂PI3KC2的初始抑制剂是从I类PI3K抑制剂PIK-90的衍生物开发的，得到4-氨基烟酰胺衍生物MIPS-19416，它显示出对PI3KC2α和PI3KC2β的效力。高通量筛选和迭代药物化学优化的结合促成了高选择性PI3KC2α抑制剂(PITCOIN)的开发。PI3KC2α抑制剂能够抗血栓形成，抑制肺癌和黑色素瘤模型的血管生成和肿瘤生长。表5  II 类 PI3K抑制剂总结 2.4  III类PI3K：VPS34● 结构III类PI3K，VPS34是真核生物中的原始PI3K酶。它在体外和体内专门催化PI产生PI3P（图1），并且被发现为两种不同的四聚体复合物，即复合物I和复合物II。这两种复合物具有本质上相同的激活机制：通过每个复合物独有的一系列相互作用，将VPS34域从受抑制的构象中释放出来。这两个复合物在功能上是不同的，复合物I启动巨自噬，而复合物II调控内吞途径的流量。 图 6：III 类 PI3K 的结构-功能、抑制和治疗靶向● III类PI3K的药理学二十多年前发现的自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)可抑制VPS34，但选择性极差。最近，已经开发出几种有效且高度选择性的VPS34抑制剂用于临床前研究。最近的临床前研究也表明这些化合物可有效治疗癌症。表6  III类PI3K抑制剂总结展望许多磷酸肌醇激酶与各种血液学、神经学和传染病以及各种癌症有关。它们已被证明适合小分子抑制剂的开发，预示着作为真正治疗靶点的巨大潜力。已经为大多数PI3K超家族以及PIKfyve开发了高效和选择性抑制剂；这些都处于高级临床前研究阶段，甚至进入临床试验阶段，针对PI4P5Ks和PI5P4Ks以及II型PI4Ks也开发了有前景的工具化合物。参考资料：1. Burke, J.E., Triscott, J., Emerling, B.M. et al. Beyond PI3Ks: targeting phosphoinositide kinases in disease. Nat Rev Drug Discov (2022). https://doi-org.libproxy1.nus.edu.sg/10.1038/s41573-022-00582-52. 智慧芽数据库https://synapse-zhihuiya-com.libproxy1.nus.edu.sg/3 摄图.新视界

在一项新的研究中，来自美国匹兹堡大学的研究人员首次描述了一种细胞修复受损溶酶体的途径。这些发现是理解和治疗由溶酶体泄漏驱动的年龄相关疾病的重要一步。 在细胞中，溶酶体是一种通过回收细胞垃圾来促进长寿的细胞器。在一项新的研究中，来自美国匹兹堡大学的研究人员首次描述了一种细胞修复受损溶酶体的途径。这些发现是理解和治疗由溶酶体泄漏驱动的年龄相关疾病的重要一步。相关研究结果于2022年9月7日在线发表在Nature期刊上，论文标题为“A phosphoinositide signalling pathway mediates rapid lysosomal repair”。 论文共同通讯作者、匹兹堡大学医学院细胞生物学的助理教授Jay Xiaojun Tan博士说，“溶酶体损伤是衰老和许多疾病的一个标志，特别是神经退行性疾病，如阿尔茨海默病。我们的研究确定了一系列步骤，我们认为这是一种普遍的溶酶体修复机制，我们将其命名为PITT（phosphoinositide-initiated membrane tethering and lipid transport, 磷脂肌醇引发的膜栓系和脂质运输）途径，以示对匹兹堡大学的赞扬。” 作为细胞的回收系统，溶酶体含有强大的消化酶，可降解分子废弃物。溶酶体中的消化酶被膜隔离开来，以免破坏细胞的其他部分。虽然溶酶体膜可能发生断裂，但健康的细胞会迅速修复这种损伤。为了进一步了解这一修复过程，Tan与论文共同通讯作者、匹兹堡大学医学院衰老研究所主任Toren Finkel医学博士合作。 首先，Tan通过实验破坏了实验室培养的细胞中的溶酶体，然后测量到达现场的蛋白。他发现一种名为PI4K2A的酶在几分钟内积聚在受损的溶酶体上，并产生高水平的信号分子PtdIns4P。 Tan说，“PtdIns4P就像一面红旗。它告诉细胞，‘嘿，这里有一个问题’。这个警报系统然后招募了另一组叫做ORP的蛋白。”Tan解释说，ORP蛋白的工作方式就像系绳。该蛋白的一端与溶酶体上的PtdIns4P结合，另一端与内质网结合，内质网是另一种参与蛋白和脂质合成的细胞器。 Finkel补充说，“内质网像一条毯子一样包裹着溶酶体。通常情况下，内质网和溶酶体几乎不互相接触，但是一旦溶酶体被破坏，我们发现它们在拥抱。” 通过这种拥抱，胆固醇和一种叫做磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine）的脂质被运输到溶酶体中，并帮助修补溶酶体膜上的损伤。磷脂酰丝氨酸还激活了一种叫做ATG2的蛋白，它就像一座桥梁，将其他脂质转移到溶酶体，这是这种新描述的PITT途径中最后的膜修复步骤。 无偏蛋白组学筛选发现pi4k2a介导的PtdIns4P信号快速修复溶酶体。图片来自Nature, 2022, doi:10.1038/s41586-022-05164-4。 Finkel说，“这种修复系统的美妙之处在于，已知PITT途径的所有组成部分都存在，但它们不知道以这种顺序相互作用，或者起着发挥着修复溶酶体的功能。我相信这些发现将对正常衰老和年龄相关疾病产生许多影响。” 这些作者猜测在健康人中，溶酶体膜的小破损会通过PITT途径迅速修复。但是，如果损伤过于广泛或修复途径由于年龄或疾病受到损害，那么破损的溶酶体就会累积。在阿尔茨海默病中，从受损的溶酶体中渗出tau蛋白纤维是这种疾病进展的关键步骤。 当Tan剔除了编码该途径中的第一个酶---PI4K2A---的基因时，他发现tau蛋白纤维的扩散急剧增加，这表明PITT途径的缺陷可能有助于阿尔茨海默病产生。在未来的研究工作中，这些作者计划开发小鼠模型，以了解PITT途径是否能保护小鼠不患阿尔茨海默病。（生物谷 Bioon.com） 参考资料： Jay Xiaojun Tan et al. A phosphoinositide signalling pathway mediates rapid lysosomal repair. Nature, 2022, doi:10.1038/s41586-022-05164-4.