caspase 7

导读：相比优化CD8+细胞毒性T淋巴细胞的抗肿瘤功能，激活自然杀伤细胞（NK 细胞）是另外一种新兴的肿瘤免疫治疗手段。迄今为止，工程化NK细胞主要是通过慢病毒载体和电穿孔进行制备。尽管它们效率高，但由于使用病毒成分、生产成本高以及电穿孔毒性高等限制因素，急需开发新的递送工具。采用mRNA-LNP技术在NK细胞表达任何感兴趣的靶蛋白是一种极具吸引力的非病毒递送方式。其中IL2是一种关键靶点，在激活、扩增NK细胞，增强NK细胞杀伤活性方面发挥非常关键的作用。 2024年6月24号，法国国家科学研究中心（CNRS）与赛诺菲公司团队合作在Molecular Therapy Nucleic Acids发表文章：Enhancing Natural killer cells proliferation and cytotoxicity using Imidazole-based lipid nanoparticles encapsulating interleukin-2 mRNA。他们开发了一种基于咪唑脂质的递送平台（ iCD-Lx和iD-LNP），可高效转染NK-92 细胞、KHYG-1 细胞和原代 NK 细胞，而不会产生细胞毒性。有趣的是，这种基于咪唑的脂质递送平台转染未修饰mRNA的翻译速率反而高于修饰mRNA。利用基于咪唑的脂质递送平台向NK细胞系和原代NK细胞递送IL2 mRNA，可延长存活期、维系激活标志物表达水平、增强细胞毒性。这项工作为构建工程化NK细胞提供了一种高效的非病毒载体方式。 01  研究背景：IL-2的免疫作用 IL2在激活、扩增NK细胞，增强NK细胞杀伤活性方面发挥非常关键的作用。IL2 主要由 T 细胞产生，与NK细胞表面存在由 IL2Rα和 IL2Rβ链组成的受体复合物结合，导致各种细胞内信号传导途径的激活，包括JAK-STAT途径，从而导致 NK 细胞的增殖和激活。通过增加激活受体的表达、释放细胞毒颗粒以及增强其他细胞因子的产生，IL2 能增强 NK 细胞对癌细胞和病毒感染细胞的细胞毒性。 IL2注射液是30 年前首次获批准的免疫疗法 。高剂量注射IL2会过度激活抑制性调节 T 细胞（Treg），展示出明显的毒性。在细胞移植治疗（ACT）中，低剂量IL-2与Treg耗竭策略结合使用，可降低毒性并维持转移细胞的活力。对于NK细胞疗法来说，寻找更加安全有效的IL2使用策略成为当务之急。 02  咪唑脂质递送平台的开发和优化 研究人员通过微流控设备制备了2种基于咪唑功能化脂质的递送系统：第一种称为iCD-Lx，由一种可电离咪唑脂质（IL）、携带咪唑鎓的阳离子脂质（CL）及不同的辅助脂质构成；第二种称为iD-LNP，由相同的可电离咪唑脂质和辅助脂质组成。 2.1 优化iCD-Lx递送系统 制备ARCA eGFP mRNA（无修饰） iCD-Lx制剂，转染NK-92细胞。当制剂配方中CL摩尔百分比从10%增加至20%时，转染细胞数量从20%增加到75%，荧光信号强度从400增加至800。一旦CL摩尔百分比超过20%，转染细胞数量会骤降。CL摩尔百分为10%时，对细胞毒性最强。随着制剂CL摩尔百分比增加超过10%，对细胞的毒性反而呈现下降趋势。 在ARCA eGFP mRNA（无修饰） iCD-Lx制剂配方中使用20%CL，用DMG-PEG替代DMPE-PEG后，转染细胞数量降低至50%，细胞毒性从5%上升至10%，荧光强度MFI无显著变化。 将iCD-Lx制剂配方中的胆固醇替换为β-谷甾醇后，细胞转染效率未发生改变，然而，如果iCD-Lx制剂配方采用β-谷甾醇和DMPE-PEG的组合，转染细胞数量会发生显著下降。 由20%CL，40%IL，胆固醇，DMPE-PEG制备的iCD-Lx制剂，其转染效率（75%）和mRNA翻译强度（MFE为800）是最佳的。 此外，当N/P比例为1时，iCD-Lx转染效率最高，而当N/P比例达到3:1时，不仅iCD-Lx转染效率发生骤降，细胞毒性也出现明显增加（20%）。 脂质体（iCD-Lip）与脂质体复合物（iCD-Lx）在PBS缓冲液中4℃条件下可稳定存放8周，脂质体尺寸大小和分散系数（PDI）均不会发生显著变化。4℃存放的iCD-Lx的转染效率与即时制备的iCD-Lx无显著差异。此外，iCD-Lx无论是否在血清中，在37℃条件均可稳定存放10h。 2.2 优化iD-LNP递送系统 根据不同比例的可电离咪唑脂质（IL）或者Dlin-MC3-DMA制备一系列LNP，包封0.2ug eGFP mRNA (5-MoU)，转染NK-92细胞。与IL-LNP相比，MC3-LNP转染NK-92细胞的效率极低。转染效率最佳（60%）的iD-LNP19制剂配方为：50% IL、39% β-谷甾醇、10% DOPE 和 1% DMG-PEG 以及 N/P 20。iD-LNP19制剂可在4℃条件下稳定存放8周。无论是否存在血清，在37℃条件可稳定存在10h。 03  mRNA修饰对咪唑脂质递送效率的影响 研究人员合成4种eGFP mRNA：ARCA UNR(未修饰)；UNR cap1（未修饰）；MNR 5-MoU cap1（5‘moU修饰核苷酸）；MNR PsiU Cap1(甲基甲尿嘧啶修饰核苷酸)，采用iCD-Lx或者 iD-LNP作为递送载体，转染NK-92或者KHYG-1细胞。对于未修饰的eGFP mRNA来说，携带Cap1结构要比ARCA表现出更高的转染效率和翻译效率。令人感到惊奇的是，与未修饰mRNA相比，修饰mRNA居然会表现出更低的转染效率和翻译效率。值得注意的是，iCD-Lx的翻译效率要高于iD-LNP，这与mRNA类型无关。在荧光显微镜下观察到，采用 iD-LNP或者iCD-Lx递送不同类型的mRNA均不会影响转染NK-92细胞的形态。 对于 iD-LNP或者iCD-Lx递送系统来说，转染效率均在3-4天达到平台期，但是，eGFP mRNA的翻译效率自转染后第一天开始后持续下降。与修饰eGFP mRNA相比，携带Cap1的无修饰eGFP mRNA（UNR）的转染效率和翻译效率均是最高的。 04  咪唑脂质与其他转染试剂或递送系统的比较 对于NK-92细胞来说。市售商业化转染试剂（ScreenFect,mRNA-Fect,Lipofectamine）的转染效率和翻译效率均明显低于 iD-LNP或者iCD-Lx。与SM102、ALC0315、MC3可电离脂质制备的LNP相比， iD-LNP转染NK-92细胞的翻译效率和转染效率明显处于最佳，相比之下， iD-LNP转染Jurkat细胞的效率与其他LNP类似，但翻译效率是最高。上述数据说明，可电离咪唑脂质（IL）非常有希望成为一种通用型的可电离脂质。 05  NK细胞靶向的IL2 mRNA咪唑脂质递送平台 NK-92细胞是一种IL-2依赖性的细胞系，培养基中需要添加IL-2以维持NK-92细胞的存活和增殖。当培养基中缺乏IL-2，培养3天后，NK-92细胞全数死亡。在培养基中加入IL-2重组蛋白后，NK-92细胞可存活6天。洗涤细胞，并且耗尽培养基中的IL-2，采用iD-LNP或者iCD-Lx向NK-92细胞中递送cap1 UNR IL-2 mRNA，NK-92细胞同样也可存活6天。有意思的是，iCD-Lx作为递送载体，可使得转染cap1 UNR IL-2 mRNA的NK-92细胞存活时间延伸至8天。此外，iCD-Lx共递送等量的UNR eGFP mRNA与IL-2 mRNA，可在NK-92细胞中实现IL-2与 eGFP的正常表达。 K562是一种人类慢性髓系白血病细胞系，对NK细胞杀伤极其敏感，激活Caspase-3/7可诱导K562细胞凋亡。与IL-2饥饿NK-92细胞相比，添加重组蛋白IL-2，IL-2 mRNA iCD-Lx，IL-2 mRNA iD-LNP均会增强K562癌细胞中Caspase3/7表达，同时，维持CD69、NKG2D或者NKP30、TNF-α水平不会发生下降。总的来说，在NK-92细胞中转染IL-2 mRNA可达到补充IL-2重组蛋白同样的效果。 06  咪唑脂质递送系统在原代NK细胞中的转染效率 对于eGFP mRNA转染原代NK细胞来说，iCD-Lx转染效率可达到80%，而iD-LNP转染效率大致在50%左右。同时，这两种咪唑脂质递送系统均不会对原代NK细胞的存活率造成不利影响。与NK-92细胞类似，缺乏IL-2会导致原代NK细胞相比转染IL-2 mRNA或者补充重组蛋白IL-2的细胞中的CD69、NKG2D、NKP30表达水平减少。转染IL-2 mRNA或者补充重组蛋白IL-2的原代NK细胞增殖能力类似，均高于缺乏IL-2的饥饿原代NK细胞。无论是添加重组蛋白IL-2还是转染IL-2 mRNA均会导致原代NK细胞中的TNF-α表达水平相比于饥饿细胞有所升高，这导致与原代NK细胞共同孵育的K562细胞中的caspase3/7表达显著提升，引发非常显著的细胞毒性反应。 07  总结 NK细胞免疫疗法的一般流程为：分离NK细胞，并在体外合适的条件下扩增NK细胞，然后，输送会患者体内，以此抑制或者杀死肿瘤细胞。工程化NK细胞表达靶向特定肿瘤抗原的嵌合抗原受体制备的CAR-NK细胞具有更低的潜在毒性和更广泛的抗肿瘤效果，近年来备受关注。随着CAR结构的不断升级，引入细胞因子或趋化因子受体结构的第四代CAR结构能够改善免疫细胞一些固有缺陷并赋予其额外的特定功能，从而促进肿瘤免疫治疗效果。 但是，要实现NK细胞的工程化改造，必须借助于递送载体。由于电穿孔和病毒递送载体的局限性，科学家希望借助正处于风口之上的mRNA-LNP技术，更加高效地对NK细胞实现基因改造。这项工作最为重要的贡献在于优化了基于咪唑脂质的递送系统：iCD-Lx和iD-LNP，使其高效转染NK细胞系和原代NK细胞。令人感到欣喜的是，咪唑脂质递送系统的在细胞水平的转染效率和翻译效率明显优于市售的转染试剂和已知的可电离脂质制备的LNP（SM102、ALC0315、MC3）。同时，利用iCD-Lx和iD-LNP向NK细胞系和原代NK细胞递送IL2 mRNA，可明显提升NK细胞的增殖能力和细胞毒性。未来，还需要再体内进一步验证咪唑脂质递送系统的效率和毒性。 参考文献  [1] Christophe Delehedde, Ivan Ciganek, et al. Enhancing natural killer cells proliferation and cytotoxicity using imidazole-based lipid nanoparticles encapsulating interleukin-2 mRNA. 2024, 35(3): 102263 DOI: 10.1016/j.omtn.2024.102263. 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

病理学（Pathology）是从疾病的发病原因、病理变化的过程、病变部位及病理形态等方面进行研究，是了解疾病发生的本质及其变化规律的重要手段，是医学科学的重要组成部分。长期以来，病理学被形象地比喻为“桥梁学科”和“权威诊断”，这充分表明了它在医学中，特别是在临床医学中占有不可替代的重要地位。病理学可以回答疾病状态下的形态结构、机能代谢的改变，这些改变与临床上出现的症状、体征之间的关系、疾病的诊断、转归和结局等临床医学中的种种问题。病理诊断（Pathological Diagnosis）在医学诊断中具有权威性，病理诊断在明确疾病性质，解释临床症状、决定治疗原则、评估预后以及明确死亡原因等方面起至关重要的作用，是疾病诊断的金标准。病理诊断是在对器官的进行大体观察、镜下观察组织结构和细胞病变特征而做出的疾病诊断，因此它比临床上根据病史、症状和体征等做出的分析性诊断（常有多个诊断或可能性诊断）以及利用各种影像（如超声波、X射线、CT、核磁共振等）所做出的诊断更具有客观性和准确性。尽管现代分子生物学的诊断方法（如PCR、原位杂交等）已逐步应用于医学诊断，但到目前为止，病理诊断仍被视为带有宣判性质的、权威性的诊断。在现代科技的支撑下，创新药物的研发的效率已取得了明显的进步，但仍然面临巨大挑战。病理学在创新药物研发领域逐渐发挥了举足轻重的作用。它可以通过对疾病组织进行病理解剖、免疫组化及分子生物学研究，探讨组织、细胞和分子水平疾病发生机制，从而为寻找新的治疗靶点、提出新的治疗策略，为创新药物的安全性评价、药效评估、剂量选择、作用机制等提供有力的科学依据。越来越多的研究表明，分子病理涉及肿瘤的早期诊断、预后判断及个体化分子靶点检测等多个方面，在肿瘤分子靶向创新药物研发中发挥重要作用。病理学是一门古老的学科，但是随着科技不断进步，病理诊断技术也在不断追求基础理论的探索和应用实践的创新。已发展为传统的解剖、组织形态学和免疫组织化学及原位杂交等分子技术相互补充、综合应用的新阶段。当代的病理诊断建立在细胞、组织结构和蛋白质、核酸分子改变共同构成的组织病变基础之上，从而为疾病的预防、早期诊断、精准治疗提供重要的理论和技术支撑。本文将从病理诊断技术的分类、技术流程、在创新药研发中的应用、在临床试验中的合规性要求以及在创新药物研发中的应用案例分享等方面进行阐述，以期帮助大家全面了解病理诊断技术及其在创新药物研发中的应用。同时也热切地期待这门古老的学科的不断进步能够推动实现创新药精准治疗的研发进程，为人类健康事业做出更大的贡献。病理诊断技术分类肉眼的大体观察和光学显微镜水平的形态学研究方法，是病理学诊断和研究中最经典、最基本的方法。随着生物医学新技术的快速发展与广泛应用，一些新的先进技术手段也逐渐应用在疾病的研究和病理学诊断中。病理诊断通过分别与免疫诊断、分子诊断结合，形成了免疫病理和分子病理，将病理诊断从组织、细胞水平的形态学观察深入到蛋白与分子水平。下面介绍几种常用的病理诊断技术。图1 病理诊断分类1、常规病理（1）组织病理是病理学最重要、最基础、应用最广泛的技术。通过将病变组织制成切片，经不同的方法染色后用显微镜观察，分析和综合病变特点，做出疾病的病理诊断。组织病理的样本一般通过开放手术、内镜检查或经皮穿刺活检获取。常用的制片方式有常规石蜡切片、快速冰冻切片等。常用的染色方法是苏木素-伊红（Hematoxylin and eosin，HE）染色。（2）细胞病理是研究组织碎片、细胞群团、单个细胞形态和结构以及细胞间比邻关系。采集病变处的细胞或自然分泌物、体液、排泄物等，涂片染色后进行细胞学诊断。细胞病理的样本一般通过体液、拉网、细针穿刺、脱落细胞等途径获取。细胞病理常用制片技术分为巴氏涂片及液基薄层细胞学制片技术。2、免疫病理免疫组织化学（Immunohistochemistry，IHC）和免疫细胞化学（Immunocytochemistry，ICC）是临床病理诊断中常用的技术和手段，是应用免疫学基本原理抗原抗体反应，即抗体和抗原之间的结合具有高度的特异性，先将组织或细胞中的某种化学物质提取出来，以此作为抗原或半抗原。然后通过免疫动物后获得特异性的抗体，再用此抗体去探测组织或细胞中的同类抗原物质。由于抗原与抗体的复合物是无色的，因此还必须借助于组织化学的方法（荧光素、酶、金属离子、同位素）将抗原抗体结合的部位显示出来，以其达到对组织或细胞中的未知抗原进行定性、定位或定量的研究。图2使用Leica BOND III全自动免疫组化仪进行免疫组化染色的流程图由于具有特异性强、敏感性高、定位准确、形态与功能及代谢相结合等特点，免疫组化已经成为医学基础研究和临床病理诊断中不可或缺的技术手段之一，广泛应用于各种蛋白质或肽类物质表达水平的检测、细胞属性的判定、淋巴细胞免疫表型分析、激素受体和耐药基因蛋白表达的检测、细胞增殖和凋亡、细胞周期及信号传导的研究等。图3免疫组化染色的代表性图像:a鸟氨酸转氨基甲酰基酶（高表达）；B精氨酸琥珀酸合成酶（低表达）[1]3、分子病理分子病理是应用分子生物学方法，以组织学/细胞学标本为载体，从基因水平上检测受检个体或其携带病毒、病原体的遗传物质的结构或含量的变化而做出诊断的技术，被广泛应用于传染性疾病、血液筛查、遗传性疾病、肿瘤伴随诊断等领域，以协助病理诊断和分型、指导靶向治疗、预测治疗反应及判断预后。目前分子病理技术主要包括原位杂交、荧光原位杂交（FISH）、基因重排、实时定量PCR、DNA测序、基因芯片技术等。不同技术路线各有优劣，其中PCR与FISH技术平台发展相对较为成熟。分子病理技术也可应用于肿瘤标志物的检测，在肿瘤微环境研究、肿瘤细胞克隆演化进程追踪等方面有着不可替代的作用。图4 病理诊断技术特点病理诊断技术流程病理诊断技术流程主要包含取材、制片、诊断和报告四个步骤。制片是病理诊断过程中相当重要且最复杂的阶段，包括组织脱水、包埋、切片、染色、封片。图5 病理诊断流程对免疫组化染色组织进行评分并不是一项简单的任务，因为在不同的细胞和组织类型中可能观察到不同的模式。需要仔细观察染色模式、强度和面积，并将其纳入评分方案。在肿瘤药物研发中，多使用免疫组化评价蛋白表达，将细胞的染色特征，如细胞质、细胞核或膜染色，根据染色强度级别（0-3分）、着色细胞占比或合并评分并建立阈值（cutoff value) 的方法进行免疫组化表达的评价[2, 3]。免疫组化结果解读时需要考虑假阴性和假阳性。如果抗体已失活或浓度不合适；或由于组织自溶或操作步骤不当导致的抗原丢失等，都有可能产生假阴性结果。如果抗体与组织非特异性结合（所用抗体浓度过高或染色过程中切片干燥导致抗体与组织产生非特异性结合或在应用多克隆抗血清时抗体特异性较差），或组织或细胞中有内源性过氧化物酶、碱性磷酸酶及生物素等产生非特异性显色则可能得到假阳性结果。为了避免假阴性和假阳性结果，免疫组化的各个步骤须保持一致，包括样本固定，脱蜡（会对FFPE组织），抗原修复，尽量减少背景结合HRP或ALP，选择适当抗体（种类和交叉活性）等。其次，可以通过图像分析工具对IHC图像采集进行量化，使样本之间判断标准统一。病理诊断技术在创新药研究中的应用病理诊断在药物研发的各个阶段均有使用。无论是在药物发现早期的靶标筛选和靶标验证，还是临床前药效和药理毒理研究，以及临床试验过程中的病理检测和诊断，生物标志物的组织学检测和判读等，均需要使用病理诊断技术。表1 免疫组化在药物研发各阶段的应用（1）  在早期研发及动物实验中应用安全、有效、质量可控是药物的三大属性，也是新药能否成功上市的标准。病理学诊断在药物非临床研究中发挥着重要的作用。在毒理学研究中，病理诊断是评价新药潜在毒性的重要手段，不仅可以提供药物剂量与毒性反应的关系，还可以确定药物毒性作用的靶器官。在药理学研究中，免疫组化试验可以用于阐明药物的药效作用及机制，对试验结果进行科学的解读。在抗肿瘤药物评价中，我们可以通过免疫组化技术检测肿瘤核增值抗原ki67的表达情况并评估药效，通过Caspase3/7等蛋白的表达，来判断药物治疗是否引起了肿瘤细胞凋亡。在干细胞产品评价中，成瘤性是评价干细胞治疗产品安全性的一个重要指标。因为实验使用免疫缺陷动物，个别动物可自发形成肿瘤，干扰结果判定。因此，试验过程中，对接种干细胞的动物形成的肿瘤，可通过免疫组化技术检测肿瘤是否表达人的抗原，来判断肿瘤是否来源于干细胞，从而排除自发肿瘤对结果判定的影响。免疫组化的结果不仅可以用于辅助诊断，还用于选择合适的体内肿瘤模型进行药物疗效研究。与其它生物标志物检测平台一起评估，也有助于理解药物的药代动力学-药效学（PK-PD）关系，为临床试验入组患者的选择及确定临床实验首次给药剂量的确定提供参考。（2）  在临床用药及创新药临床试验中的应用免疫组化可为临床用药提供治疗方案。随着越来越多的肿瘤药物相关基因和蛋白的发现，可以通过免疫组化的方法来检测相关基因和蛋白的表达水平。免疫组化不仅提供了蛋白质丰度的半定量评估，而且还对表达的细胞进行定位[5]。一方面，在免疫抑制剂PD-1/PD-L1的用药上，免疫组化是目前临床诊断级别评估肿瘤组织PD-L1表达水平的唯一方法学，另一方面可以初步判断患者化疗和分子靶向药的适用范围，为下一步更精确的检测提供筛检依据。目前应用最多的是乳腺癌中ER、PR、HER-2检测，另外包括ALK阳性的肺腺癌可以使用靶向药克唑替尼、胃肠道间质瘤CD117阳性可以使用格列卫治疗等。免疫组化可以通过分析肿瘤标志物，从而辅助诊断和鉴别诊断。仅需特异性抗体即可在常规实验室内完成，准确度高且方便快捷。肿瘤标志物是指由肿瘤组织或其与宿主相互作用所产生的一类活性物质，特征性存在于肿瘤细胞，多存在于体液及组织中，对肿瘤早期诊断、治疗与预后分析等有重要临床意义。目前常见的肿瘤标志物有癌胚抗原类、酶类、激素、糖类抗原、癌基因及抑癌基因、细胞表面肿瘤抗原、miRNA、lncRNA、ctDNA、外泌体、循环肿瘤细胞等[6]。许多肿瘤标志物的伴随诊断产品可以采用免疫组化平台、PCR或原位杂交等分子病理平台进行检测，最终指导患者对药物的治疗。由于个体差异，癌症患者要找到适用的药物，就必须得到自己独特的基因或表达，这种检测常常与精准治疗药物绑定使用，称为伴随诊断（CDx，companion diagnosis）。体外诊断在医疗领域被誉为“医生的眼睛”，伴随诊断正是体外诊断技术的一种。所谓“精准治疗、检测先行”，伴随诊断可以辅助判断某一特定治疗产品对患者是否受益，从而调整治疗方案或用药方案，最终达到提高治疗效率并降低无谓治疗开支的目的。肿瘤的精准治疗可以通过激活人体自身免疫系统，让免疫系统重新识别出逃逸的肿瘤细胞，从而抵抗并治愈癌症。实现个体化医疗，首先需要精确检测病理组织或者血液中特定生物标志物的水平，来预测患者对特定药物的敏感性与毒副反应的大小，从而对每个病人选择合适的药物和剂量进行治疗，以求达到最佳的治疗效果。近年来，随着免疫组化技术的发展和各种特异性抗体的出现，许多疑难肿瘤得到了明确诊断，尤其是免疫组化在肿瘤诊断和鉴别诊断中的实用价值受到了普遍的认可，其在低分化或未分化肿瘤时的鉴别诊断准确率可达50%-75%。目前不仅在肿瘤治疗领域，在神经系统、血液疾病以及免疫系统疾病领域，都开始重视通过生物标志物的检出来指导用药。同时，伴随诊断对于新药研发的意义也愈加凸显。随着新药研发难度和成本的不断增长，创新药企开始将伴随诊断引入其研发环节，帮助更好的筛选出有效病人，提高临床试验的成功率。根据ARK研究，伴随诊断的新药研发可将研发成本降低60%左右，同时也有助于提高新药的获批概率。病理诊断技术在临床试验中的合规性要求正如前文所述，病理诊断技术在新药的研发和临床试验过程中扮演着重要的角色，关乎临床试验的进度、药品的疗效和安全等重要指标，故国内外的药政部门对病理检测机构的资质、质量体系、技术体系、生物安全等方面均有较高的要求。1、 资质要求临床试验过程中的病理检测和诊断在实施过程中需要满足《药物临床试验质量管理规范》、《药品注册核查要点与判定原则（药物临床试验）》、《抗肿瘤药物临床试验中心实验室使用专家共识（2019版）》等指导原则的相关要求，如：病理检测实验室或所属组织应具备独立的法人资格、不参与临床的诊断和诊疗、定期参与能力验证活动并获得满意结果等。图6 临床试验过程中的病理检测和诊断相关指导原则2、质量体系作为参与临床试验中的病理检测的中心实验室，其质量体系各个要素应满足ISO15189《医学实验室质量和能力认可准则》及其在病理相关领域的应用说明要求，以及满足CAP认证的标准中相关要求。首先，中心实验室的设施设备、场地环境、通讯、仓储空间和供电等硬件设施应符合相关要求，且应具备质量管理、方法学建立/验证、文件管理、仪器设备管理、数据管理、样本管理和人员管理等完善的管理体系。质量要素通常包含：人员、环境、设备、试剂耗材、生物安全、信息系统到检测服务全过程，通常涉及14个要素；其次，监管机构为了促进病理学科向规范化、精细化和现代化发展，通常要求病理检测机构的质量体系应通过ISO15189的认可或CAP认证。图7 病理学检测良好操作规范核心质量要素3、 生物安全要求病理检测中经常会接触到患者或实验动物病变的器官、组织、细胞、体液及分泌物等，许多标本都是新鲜的病变标本，可能含有传染性的微生物和病原体，在标本处理不当时，容易通过呼吸道或皮肤粘膜进入人体引发生物安全事故。故病理检测实验室还应满足《病原微生物实验室生物安全管理条例》、《病原微生物实验室生物安全环境管理办法》、《人间传染的病原微生物目录》生物安全的管理要求和备案要求。4、技术标准要求由于病理检测采用的技术不同，涉及的层面不同，故病理检测的技术标准需要根据检测手段、应用的范围逐一对应技术类的指导原则或操作规范。按照病理技术分类、以及应用范围去选择和遵循不同的指导原则。图8 病理技术标准要求遵循的指导原则5、AI病理的规范性要求近年来，AI技术以其高效和精准的数据处理能力，在数字病理领域发挥着越来越多的应用价值，但由于AI病理参与临床的检测和诊疗，涉及医学数据准确性、受试者隐私保护、数据安全等各种问题也需要得到解决，AI病理规范性方面也逐步纳入药政部门的监管。2023年7月10日国家药监局发布了关于人工智能病理相关审批要求：《影像超声人工智能软件（流程优化类功能）技术审评要点》、《病理图像人工智能分析软件性能评价审评要点》、《病理图像人工智能分析软件临床评价审评要点》、《血液病流式细胞学人工智能分析软件性能评价审评要点》。参与临床试验的病理检测实验室临床试验中的病理检测通常是在中心实验室或研究机构的病理科(或检验科)来完成的，由于三种类型实验室存在各自的优势和劣势，如何选择合适病理检测实验室是很多申办者或CRO面临的难题。图9 临床试验在中心实验室和病理科或检验科中的流程（1）中心实验室是指在多中心试验中，为避免临床试验机构临床实验室无法检测某个或多个涉及安全性和疗效指标的检验项目，或各个实验室的检查方法、正常值范围不同而对试验数据造成大的检测偏倚而建立的一种实验室，也是一种合同研究组织（Contract Research Organization，CRO）。其目的是为临床试验提供特殊服务，应有严格的质量体系，有良好的质量控制，方法应进行合理验证，确保评价工具的科学性和可靠性并经有关的药政部门定期审查确认，试验过程应满足药物临床试验相关法规的要求。中心实验室采用相同的测试方法和设备，统一测试来自所有研究中心的样本，采用统一严格的质量控制措施，可以有效地避免不同实验室存在的差异，提高临床试验的质量。（2）检验科。《医疗机构临床实验室管理办法》中对临床检验科的定义为对取自人体的各种标本进行生物学、微生物学、免疫学、化学、血液免疫学、血液学、生物物理学、细胞学等检验，并为临床提供医学检验服务的实验室。检验科检测的目的主要有为疾病诊断提供依据；为疗效观察和预后判断提供依据；为预防疾病提供资料；为科学研究提供数据，如新药研发过程中疗效的判断。（3）病理科在医疗过程中主要承担病理诊断工作，通过活体组织检查、细胞学检查等，为临床提供明确的病理诊断，确定疾病的性质。临床科室需要根据病理诊断结果或报告来确定疾病的诊断，以及确定临床治疗方案。图10 中心实验室与病理科或检验科的比较鉴于临床试验机构的临床实验室和中心实验室各自的优缺点，涉及临床试验样本检测是由研究机构还是委托中心实验室进行统一检测，申办者和研究者需根据检测目的、样本特点进行充分评估。对一致性要求高的疗效或预后指标，可以选择在中心实验室检测；对于临床常规检验项目，受试者需承担额外的诊疗风险和经济负担的，不符合质量管理要求的，应该在临床试验机构内检测。随着药物研发的飞速发展，国际和国内多中心临床试验项目日益增多，越来越多的临床试验已在全球范围开展，研究规模越来越大，更多的研究机构分布在更多的国家。全球几乎所有主要地区都已成为临床试验结构的一部分。随着中心实验室在临床研究中的广泛使用，全方位的检测技术平台越来越受到重视。北京阳光德美医药科技有限公司自成立以来，始终坚持高质量的服务，可提供统一的覆盖采集包制作、采集培训、样品物流、样本管理、样品检测、数据传输、检测完毕样品永久保存等一站式的中心实验室的定制化服务。阳光德美中心实验室拥有生化、免疫、血液、流式、病理、质谱、细胞等多个检测平台，可满足客户在安全性分析、生物标志物分析、药代动力学（PK）研究、药效学 （PD）研究等不同研究目的检测需求，确保以国际一流水准助力高质量临床研究。病理诊断技术在创新药物研发中的应用案例北京阳光德美病理学服务平台符合中国CCPI认证、北欧NordiQC、CAP PT、GLP/GCP认证要求。拥有全套先进的病理制片和分析设备，包括全自动组织脱水机、组织包埋机、全自动轮转式石蜡切片机、全自动玻片染色机、全自动封片工作站、全自动免疫组化染色机、正置显微镜、荧光显微镜 、Opal荧光多标技术（AKOYA）等，可提供临床试验样本检测、伴随诊断产品开发、实验动物病理检测和宠物病理检测等服务。图11 阳光德美病理平台仪器具体服务内容包括常规病理和特殊病理。常规病理服务包括：常规及特殊取材组织脱水（实验动物）、组织包埋（石蜡或OCT）、组织切片（单张组织或组织芯片）、苏木素伊红染色（HE）；特殊病理服务包括：特殊染色、免疫组化、多重荧光（mIHC）。可以提供多靶点蛋白的定量、免疫细胞的分型、信号通路研究、小分子与蛋白之间的关系等相关药物研发、个性化医疗以及伴随诊断CDx产品开发等方向的服务。平台还拥有专业的病理学专家，可为临床试验中的病理学诊断、生物标记物检测、受试者筛选、疗效评估提供高质量的病理阅片服务。团队成员在病理学领域拥有雄厚的行业沉淀，尤其在Claudin18.2、PD-L1、Her 2、STING、COX-2、EP4、HPV、TIL（CD4+、CD8+）、CD47、CD3、EGFR（T790M突变）、VEGF等指标的研究上具有丰富的经验。典型案例介绍DLL3是Notch通路配体家族的成员，在小细胞肺癌（SCLC）中，DLL3通常被过度表达，作为治疗小细胞肺癌的“明星”靶点，目前，靶向DLL3的药物有单/双抗、ADC、双特异性T细胞接合剂(BiTE)和CAR-T。根据肿瘤类型和细胞生长环境的不同，DLL3的激活可以发挥促癌或抑癌作用。有报道，DLL3在小细胞肺癌、乳腺癌、垂体瘤、急性髓系白血病中有促癌作用，但在肝癌、神经胶质瘤和恶性胶质瘤中却发挥了抑癌作用。在小细胞肺癌中，DLL3在超过80%患者中高表达，并且在肿瘤的细胞膜和细胞质中都高表达；但是，在正常组织中少量表达或不表达。临床研究表明，SCLC中的DLL3高表达与患者的生存期呈现负相关，即DLL3表达量越高，患者的生存期越低。在原发性肝癌中，有研究提示，DLL3的表达被乙肝病毒诱导的DNA甲基化和组蛋白乙酰化所抑制。抑制组蛋白去乙酰化酶的抑制剂可以使DLL3在HCC中重新表达。重表达的DLL3可以抑制HCC细胞的生长并诱导细胞凋亡。因此，在原发性肝癌中，DLL3可以抑制癌细胞的生长。更多研究显示DLL3在多种癌症中异常表达，发挥不同作用。比如，DLL3在异柠檬酸脱氢酶IDH突变的神经胶质瘤细胞中表达，特别是在1p/19q缺失的神经胶质瘤细胞中高表达；在胰腺癌中，激活的DLL3可以刺激Notch信号从而促进癌细胞的生长；在黑色素瘤中，DLL3/MAPK通路可以促进黑色素瘤细胞的增殖和迁移；在子宫内膜瘤中，高表达的DLL3与较差的生存期和较差的无进展生存期相关。近年来，以DLL3为靶点的治疗方法已在临床试验中得到验证。其中，靶向DLL3进展最快的抗体药为Rova-T（Rovalpituzumab Tesirine），目前正处于临床III期。虽然该抗体药在临床II期治疗中的表现没有达到预期效果，但是艾伯维公司（AbbVie）还在进行III期临床实验。AMG-757（Tarlatamab）是由安进公司（Amgen）研发的靶向DLL3/CD3的双特异性抗体，用于增加免疫细胞，促进肿瘤细胞凋亡。目前AMG757治疗SCLC的I期临床研究正在进行中。同时，处于临床阶段的还有HPN-328和89Zr-DFO-SC16.56。DLL3作为一个重要的Notch配体与多种肿瘤的发生发展密切相关，吸引着药企尝试开发DLL3靶向药。阳光德美已经在小细胞肺癌组织中完成免疫组化检测方法的建立及优化工作，通过免疫组化法检测表达DLL3的肿瘤细胞占比，通过高表达DLL3个体的判定来协助筛选临床试验的目标受试者，大幅提高临床试验达到临床药效终点的成功率。Claudin 18.2是Claudins蛋白质家族中的一个亚型，广泛分布于胃、胰腺和肺组织。在胃癌、胰腺癌、肺癌、食管癌等消化系统恶性肿瘤中高表达，使得Claudin18.2成为恶性肿瘤治疗的一个潜在靶点。目前，针对该靶点开发的药物，包括单克隆抗体（mAb）、双特异性抗体（BsAbs）、嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）疗法和抗体偶联药物（ADCs）等。阳光德美病理平台采取Claudin 18.2高表达的胃腺癌组织，建立了该靶点的免疫组化分析方法，可以支持相关药物的研发和伴随诊断产品的研制。同时，阳光德美还建立了PD-L1的免疫组化方法。通过免疫组化法检测肿瘤细胞或免疫细胞（IC）PD-L1的表达量，进而评估PD-L1抑制剂的疗效。需要注意的是不仅仅肿瘤细胞表达PD-L1，肿瘤浸润的免疫细胞也会表达PD-L1，因此在界定PD-L1阳性率的时候是否需要考虑这些免疫细胞的含量。对于PD-L1免疫组化结果的判读，阳光德美也有丰富经验。此外，阳光德美还利用脾脏组织建立了CD4的免疫组化方法。上述靶点阳光德美均已有完整的免疫组化解决方案，可以支持临床样本分析。结语近年来，病理诊断这个赛道在国内逐渐火热。一方面，随着老龄化持续演进、癌症发病率不断增长，病理诊断的重要性愈发凸显。靶向治疗药物及精准医疗不断地发展及自动化设备也随之不断普及，病理诊断领域增长潜力巨大。随着肿瘤发病人数不断上升，肿瘤大分子创新药物研发在近年呈现爆发的势头，由此促发检测蛋白靶点的免疫组化伴随诊断市场进入爆发前夕。目前，从技术层面伴随诊断市场可细分为免疫组化和分子诊断。依托分子诊断技术的小分子药开发已经成为红海，而依托免疫组化技术的肿瘤大分子药物研发正在被挖掘之中。另一方面，目前国内肿瘤诊断水平相对较低，免疫组化产品市场仍由国外企业主导，其中65%-70%市场份额被罗氏、徕卡等国外企业占据，在主要市场中还处在相对垄断的地位。剩余30%-35%市场份额被国内企业占有。国家也在提倡国产替代进口，这也给国内公司的未来发展提供了一个比较好的机会。虽然与国外相比，中国的病理诊断市场还处于初期阶段，但随着精准医疗的发展，预计很快会迎来高速发展期。- 上下滑动查看参考文献 - 参考文献[1] Chan S L, Cheng P N M, Liu A M, et al. A phase II clinical study on the efficacy and predictive biomarker of pegylated recombinant arginase on hepatocellular carcinoma[J]. Investigational New Drugs, 2021, 39: 1375-1382.[2] Jiang F, McKeegan E M. Immunohistochemistry in the Study of Cancer Biomarkers for Oncology Drug Development[J]. Technical Aspects of Toxicological Immunohistochemistry: System Specific Biomarkers, 2016: 73-94.[3] Immunohistochemistry in diagnostic surgical pathology: contributions of protein life-cycle, use of evidence-based methods and data normalization on interpretation of immunohistochemical stains：Int J Clin Exp Pathol. 2010; 3(2): 169–176.[4] Smith N R, Womack C. A matrix approach to guide IHC‐based tissue biomarker development in oncology drug discovery[J]. The Journal of pathology, 2014, 232(2): 190-198.[5] Zhu CQ, Shih W, Ling CH, Tsao MS. Immunohistochemical markers of prognosis in non-small cell lung cancer: a review and proposal for a multiphase approach to marker evaluation. J Clin Pathol. 2006 Aug;59(8):790-800. doi: 10.1136/jcp.2005.031351. PMID: 16873561; PMCID: PMC1860456.[6] 肿瘤标志物在临床病理学应用中的研究进展[J].中国癌症防治杂志. 2020. 李佳静 郑湘予 孙淼淼.[7] Guidelines for Regulating Pathology Laboratory Good Practices.北京阳光德美医药科技有限公司是一家集大/小分子药物临床前/临床PK/PD服务于一体的综合性研究平台，可提供全方位的药代动力学-药效学和GLP生物分析服务，专注于解决客户药代药效研究及生物分析中所遇到的挑战。

该研究系统揭示了紫色色杆菌利用效应蛋白CopC催化全新骨架的蛋白质翻译后修饰靶向宿主细胞死亡信号通路的分子机制，并首次于体内外全面阐述了宿主特异性辅因子CaM调控CopC活性的机理 华中农业大学生命科学技术学院、生物医学与健康学院李姗教授课题组与南方科技大学傅暘研究员课题组合作，在Molecular Cell在线发表题为“Structural insights into caspase ADPR-deacylization catalyzed by a bacterial effector and host calmodulin”的论文。该研究综合运用生物质谱、结构生物学、生物化学、细胞生物学等多学科手段，揭示了病原细菌催化全新骨架的蛋白质翻译后修饰ADP-核糖脱氨环化（ADPR-deacylization）修饰caspase进而调控宿主程序性细胞死亡的分子基础，为开发相关细菌感染性疾病药物提供了新靶点和理论基础。 病原细菌利用Ⅲ型分泌系统（Type III Secretion System，T3SS）向宿主“注射”效应蛋白，模拟或操纵宿主的信号转导通路，促进侵染和定殖，是许多革兰氏阴性病原细菌的核心感染策略。紫色色杆菌是一种新兴的人类致病菌，具有多重耐药性，感染致死率高，然其致病机制尚不明晰。李姗教授实验室围绕“病原-宿主”互作分子机制进行研究，在紫色色杆菌致病机理方面取得一系列进展。 紫色色杆菌效应蛋白CopC作用机理 早前李姗教授实验室研究发现紫色色杆菌T3SS效应蛋白CopC可催化一种全新骨架的蛋白质翻译后修饰靶向宿主细胞多个半胱天冬酶（caspase），从而调控多种程序性细胞死亡信号通路，促进自身感染与繁殖。课题组将CopC催化的新型蛋白质翻译后修饰命名为ADP-核糖脱氨环化（ADPR-deacylization），并发现与CopC具有相同酶学活性的效应蛋白还存在于其它病原菌中，表明 CopC家族蛋白通过ADP-核糖脱氨环化修饰caspase蛋白来干扰宿主细胞死亡信号通路是病原菌普遍使用的一种致病策略。值得注意的是，这一新颖的蛋白质翻译后修饰，需要在人类宿主特异存在的钙调蛋白（Calmodulin，CaM）帮助下完成，保证了病原细菌毒力蛋白只在进入宿主后才发挥功能。 为了进一步研究CopC如何催化ADP-核糖脱氨环化这种新型蛋白质翻译后修饰以及辅因子CaM如何调控CopC的酶学活性，李姗教授课题组又和南方科技大学傅暘研究员课题组合作展开了进一步研究。研究人员首先利用串联质谱鉴定到CopC对caspase-7/-8/-9进行多位点修饰，而对caspase-3只进行单一位点修饰，于是caspase-3被选为合适的底物蛋白进行后续结构研究。研究人员利用单颗粒冷冻电镜技术成功捕捉到CaM-CopC-caspase-3三元复合物与配体NAD+在反应前、反应中和反应后三种状态下的高分辨率结构，结合生化实验分析和功能验证，全面揭示了CopC识别配体/底物/辅因子的机制，通过不同反应状态的结构比对，又阐明了CopC独特的酶学催化反应的分子基础，以及反应完成后底物离去的分子机制。 紫色色杆菌效应蛋白CopC调控机理 真核宿主中特异存在的钙调蛋白CaM是控制CopC活性的开关，那CaM是如何帮助CopC发挥功能的呢？研究人员比较了CopC-caspase-3二元复合物和CaM-CopC-caspase-3三元复合物的结构发现，在有CaM存在时，CopC的NCD催化结构域才可以正确折叠、有序组装。体外生化分析表明，Ca2+-free形式的CaM能够明显促进CopC催化活性，增进与底物caspase-3的结合能力，Ca2+-bound形式的CaM则使CopC处于无催化活性的状态，这一发现与宿主细胞静息状态处于低钙环境是一致的。研究人员在细胞中上调或下调钙调蛋白的表达量，对病原菌感染时CopC的活性有对应的调控作用。紫色色杆菌感染小鼠模型中也表明CopC与CaM的结合能力，对病原菌在小鼠肝脏的定殖以及对小鼠的感染致死能力至关重要。紫色色杆菌选择CaM来作为自身毒力因子的辅因子是一个很机智的选择，它巧妙地运用宿主细胞体内Ca2+浓度的变化来实现对毒力蛋白的活性调控。 该研究系统揭示了紫色色杆菌利用效应蛋白CopC催化全新骨架的蛋白质翻译后修饰靶向宿主细胞死亡信号通路的分子机制，并首次于体内外全面阐述了宿主特异性辅因子CaM调控CopC活性的机理，为深入理解病原细菌的致病机制提供了全新的视角，为开发基于“病原-宿主”互作过程的特异性抗菌药物提供了潜在靶标和理论基础。 李姗教授和傅暘研究员为论文共同通讯作者。傅暘课题组张阔博士、田苗博士，李姗课题组博士研究生彭婷、陶新园为共同第一作者，李姗课题组多位硕博研究生参与了该研究。