KRAS G12D x KRAS G12S

KRAS是人体内最常见的致癌突变基因，每年造成全球超过300万的新增患者负担。FDA近期批准的药物sotorasib与adagrasib作为突破性疗法，通过共价结合KRAS-G12C突变蛋白的12位半胱氨酸，将其锁定在信号失能状态，实现抑制肿瘤增殖。G12D突变是人类肿瘤中最常见的KRAS突变，尤其在胰腺癌中普遍存在。然而，由于缺乏靶向天冬氨酸的共价弹头，靶向KRAS-G12D的共价抑制剂开发仍然面临挑战。近日，加州大学旧金山分校的研究人员发现了一类基于β-丙内酯的共价亲电弹头，与MRTX1133的化学骨架结合后，能够与KRAS-G12D形成稳定的共价络合物，并展现出对KRAS-G12D驱动的癌细胞增殖和小鼠异种移植肿瘤生长的高度选择性抑制效果。由于羧基侧链的低亲核性，天冬氨酸是公认最难以亲核反应进行共价修饰的氨基酸之一。KRAS-G12D共价抑制剂开发的关键挑战在于设计一种能够在生理pH条件下与天冬氨酸羧基侧链高效结合的共价弹头，同时保证该弹头在水溶液中的稳定性，且不会与谷胱甘肽（GSH）等具有高亲核性的内源物质发生反应。为了寻找合适的共价弹头，研究人员探索了一系列三元和四元杂环共价基团，这些基团是反应活性很强的应变释放亲电试剂（strain-release electrophiles），已有报道能够与羧基发生烷基化或酰基化反应。共价修饰速率实验结果显示，基于β-丙内酯的四元杂环弹头可在多个位点（包括Asp12）以剂量依赖的方式高效共价修饰KRAS-G12D蛋白。而氮丙环和环氧乙烷类弹头则展现了中等程度的KRAS-G12D共价交联效率（40%-60%）。在成功发现靶向Asp12的潜在共价弹头后，研究团队将此弹头与MRTX1133的化学骨架结合，得到了外消旋体化合物G12Di-1。全蛋白质组质谱分析显示，G12Di-1能够与KRAS-G12D·GDP形式的蛋白发生快速的共价偶联反应（半衰期=99s），而对KRAS野生型、KRAS-G12S、KRAS-G13D以及另一种酸性氨基酸突变蛋白KRAS-G12E均未显示出共价反应性。值得注意的是，G12Di-1对GTP结合状态下的KRAS-G12D蛋白同样展现出一定的共价反应性，这一发现与先前报道的KRAS突变体抑制剂存在显著的区别。鉴于上述发现，研究人员进一步探究了这种共价修饰是否会影响KRAS在活性状态下与效应蛋白（如Raf）的相互作用。TR-FRET分析结果表明，G12Di-1能够以剂量依赖地抑制Raf-Ras结合域（Raf-RBD）和KRAS-G12D之间的相互作用，而对KRAS野生型与Raf的结合无显著影响。此外，生物膜干涉实验进一步证实，与KRAS-G12D·GppNHp相比，KRAS-G12D·GppNHp·G12Di-1复合物与Raf-RBD的结合能力显著降低。这样的共价修饰特性对G12D突变体可能尤为有利，因为该突变型的GTP水解酶活性受到严重影响，导致大多数KRAS-G12D分子持续处于GTP结合的激活状态。为了深入探究G12Di-1与KRAS蛋白的共价相互作用机制，研究团队对KRAS-G12D·GDP与G12Di-1的复合物晶体结构进行了解析。结果显示，G12Di-1的分子结合构象与MRTX1133及AMG510类似，其中G12Di-1的β-丙内酯环打开，通过其β-碳原子与Asp12发生烷基化反应，从而实现共价交联。有趣的是，绝大多数G12Di-1分子以S型构象与KRAS-G12D结合，这引导研究者们推测，这一现象很有可能来源于R型构象的β-丙内酯弹头在结合Asp12时发生的SN2构型翻转。因此，研究团队通过手性拆分G12Di-1，获得了(R)-G12Di-2和(S)-G12Di-2两种对映异构体，并对它们与KRAS-G12D的反应性进行了评估。实验结果表明，(R)-G12Di-2对KRAS-G12D·GDP的共价反应性明显更强，这进一步证实了研究人员的假设。尽管(R)-G12Di-2作为KRAS-G12D的有效共价配体显示出良好的活性，其β-丙内酯共价弹头的高反应性却导致其在生理条件下的水溶液中稳定性较低，这限制了其在细胞实验中的应用。为了克服这一挑战，研究人员在β-丙内酯环的α碳原子上引入取代基，以降低水解反应发生的可能。结果显示，通过异丙基取代得到的G12Di-4，虽然它的共价反应速率在空间位阻的影响下有所下降，但其在PBS溶液中的稳定性显著提高。为了进一步提高G12Di-4对KRAS-G12D的亲和力，研究小组继续对其结构进行优化，通过整合MRTX1133的完整化学结构，得到了G12Di-6。该分子在亲和力和共价反应速率方面均获得了显著提升，更值得注意的是，G12Di-6是第一个展示出对KRAS蛋白在GTP结合状态下选择性优于GDP结合状态的共价分子，这一特性与MRTX1133存在显著的区别。细胞水平的Western Blot实验也进一步验证了G12Di-6能够在细胞内高效共价结合KRAS-G12D蛋白，并显著抑制下游ERK的磷酸化水平。基于共价标记动力学的构效关系研究表明，左侧萘环3号位的羟基取代是引起G12Di-6对GTP结合状态下的KRAS-G12D高选择性的关键因素，这与该羟基和KRAS蛋白的Asp69侧链形成的氢键密切相关。然而，G12Di-6在抑制多种癌细胞系增殖的实验测试中，并未表现出显著的KRAS突变特异性。经过研究发现，由于异丙基单取代的β-丙内酯结构在真核生物的蛋白酶体抑制剂中较为常见（如belactosin C），G12Di-6因与癌细胞内蛋白酶体的高效结合而发生脱靶效应。为了解决这一问题，研究团队在丙内酯结构的β-碳原子上再次引入了甲基取代，从而得到了新的化合物G12Di-7。这一改进不仅有效阻止了G12Di-6与蛋白酶体的脱靶结合，而且进一步提高了化合物的稳定性。更为重要的是，G12Di-7不仅展现了与GDP及GTP结合状态下的KRAS-G12D蛋白的高效共价结合能力，还表现出对KRAS-G12D突变型细胞的高度选择性。此外，G12Di-7在KRAS-G12D基因转化的小鼠BA/F3癌细胞模型中同样表现出显著的浓度依赖性抑制效果。无论是在传统的2D单层细胞培养，还是更为复杂的3D细胞培养模型中，G12Di-7均展现出了对KRAS-G12D突变驱动的癌细胞株（SW1990、AsPC-1和AGS）生长的显著抑制作用。而对非KRAS-G12D突变驱动的癌细胞株则均无明显影响，且在10μM浓度下未表现出明显的毒性，强调了其高选择性和安全性。接着，研究人员通过在小鼠体内模型中评估G12Di-7对KRAS-G12D转化细胞系衍生的异种移植瘤组织的抗肿瘤活性，进一步评估G12Di-7的体内有效性。结果显示，G12Di-7通过静脉滴注给药的方式，剂量依赖性地抑制了SW1990异种移植瘤的生长。与此同时，在治疗期间两组小鼠的体重增加情况相似，表明了G12Di-7治疗方案未引起明显的分子系统性毒性。综上，通过将改良后的β-丙内酯衍生物共价弹头与MRTX1133的化学骨架结合，研究人员成功设计了首个针对KRAS-G12D的共价抑制剂。这类分子能够有效地共价修饰GDP和GTP结合状态下KRAS-G12D的12位突变天冬氨酸，且具有出色的KRAS-G12D突变型细胞选择性和体内肿瘤抑制效果，为KRAS-G12D突变驱动的癌症治疗提供了一种新的策略。参考文献Zheng Q, Zhang Z, Guiley KZ, Shokat KM. Strain-release alkylation of Asp12 enables mutant selective targeting of K-Ras-G12D. Nat Chem Biol. Published online March 5, 2024. doi:10.1038/s41589-024-01565-w声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！长按关注本公众号   粉丝群/投稿/授权/广告等请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓