IKK complex

在药物研发的历史长河中，分子胶技术的发展堪称一部跌宕起伏的传奇。1971年，环孢素A的发现为器官移植开启了新纪元，而1987年FK506的问世进一步夯实了分子胶在免疫抑制领域的基础。然而，这项技术真正的转折点来自一个意外——沙利度胺。这个药物在2010年被发现具有分子胶活性，它通过与Cereblon E3连接酶结合来降解特定蛋白质的机制，为这一领域带来了革命性的启示。 从实验室的偶然发现到产业化的战略布局，分子胶技术走过了漫长而艰辛的道路。而今，在2025年的开年，当全球生物医药界的目光再次聚焦旧金山，第43届摩根大通医疗健康大会（JPM）的召开，标志着这项技术已经进入了一个全新的发展阶段。 从Revolution Medicines令人瞩目的RMC-6236临床数据，到Monte Rosa与诺华达成22.5亿美元的合作，分子胶技术正以前所未有的速度推动药物研发的新范式，或将成为下一个「重磅炸弹药物」诞生之地。 1 Monte Rosa Therapeutics：突破之路 蒙特罗莎是一家专注开发分子胶降解剂的创新药企，以阿尔卑斯山第二高峰命名，寓意攀登医药创新的巅峰。在第43届摩根大通医疗健康大会上，公司最新进展引发市场关注，股价强势反弹12.23%。 图1 蒙特罗莎制药公司药物管线 图片来源：蒙特罗莎制药公司官网 目前，公司市值约3.8亿美元，产品管线包括： 抗癌药物MRT-2359：已确定推荐2期剂量（0.5毫克/天，21天服用7天停药），并开展与前列腺癌、乳腺癌药物的联合治疗评估； 自身免疫病药物MRT-6160； 炎症药物MRT-8102。 近期，两大利好提振市场信心： 1.入选纳斯达克生物技术指数； 2.与诺华达成超20亿美元级合作，显著增强研发实力。 虽然目前亏损1.19亿美元，但这在生物科技初创企业中属正常现象。分析师给出12.67美元目标价，看好其发展前景。 2 中国力量：分子胶降解剂的创新探索 标新生物 标新生物是一家专注于开发口服蛋白降解小分子药物的生物科技公司，孵化自上海科技大学免疫化学研究所。公司聚焦肿瘤和自身免疫疾病等领域，致力于满足尚未被满足的临床需求。其独特的GlueTacs®双研发平台融合了分子胶和双功能降解剂技术，已成功推动多条分子胶降解剂管线进入临床阶段。 图2 标新生物产品管线 图片来源：标新生物官网 标新生物拥有自主知识产权的E3泛素连接酶配体文库，结合高通量多维度实验数据和人工智能辅助的机器学习模型，指导药物设计。通过湿实验筛选，积累了大量分子胶构效关系的专有知识。其开发的分子胶管线具有高E3连接酶亲和力和高靶点选择性。目前，已有两条产品管线获得中美临床批准，其中GT919和GT929在对应的复发难治血液瘤适应症中显示出疗效，且安全可控，正在进一步临床推进中。 在双功能降解剂领域，标新生物聚焦多种实体瘤和自身免疫疾病，重点关注现有疗法无效或耐药的细分患者群体。通过将专有的E3泛素连接酶配体与连接子和靶蛋白配体结合，开发出降解选择性高、口服生物利用度优异的候选化合物。这些项目正陆续进入临床前研究阶段。 标新生物的GlueTacs®双研发平台还拥有大量可用于抗体偶联降解剂的有效载荷候选分子，在多种血液瘤和实体瘤中展现了优秀的体内外活性。 达歌生物 在全球分子胶降解剂的创新竞赛中，达歌生物正展现出独特实力。这家中国领先的分子胶研发企业已构建了超过1万种化合物的专利分子胶库，并建立了创新的双轨筛选系统，结合表型和蛋白质组学方法发掘新靶点，通过基因敲除细胞株和CRBN人源化小鼠进行严格验证。 在研发突破方面，达歌已将两个全新靶点Protein A和WEE1推进至临床前研究，前者有望成为继来那度胺后的又一重磅产品，后者则有望克服传统抑制剂的选择性和毒性难题。 图3 达歌生物管线 图片来源：达歌生物官网 分迪药业 分迪药业是一家位于中国成都的制药公司，专注于开发创新的靶向蛋白降解剂，特别是分子胶药物。 图4 分迪药业研发管线 图片来源：分迪药业官网 分迪药业的代表性产品FD-001是一种口服分子胶药物，旨在治疗急性髓系白血病、多发性骨髓瘤和非霍奇金淋巴瘤等血液肿瘤。该药物是通过分迪药业的“ProDeDrug”分子胶合理设计平台开发的。临床前研究显示，FD-001在小鼠异种移植模型中具有显著的抗肿瘤活性。2023年6月，FD-001获得中国国家药监局的临床试验批准，标志着分迪药业在分子胶药物研发领域取得了重要进展。 3 分子胶领域技术创新与临床进展 在分子胶技术的发展历程中，近几年可谓是技术创新与临床突破并驾齐驱的关键时期。从设计策略的革新到临床数据的突破，这一领域正在经历前所未有的发展机遇。从分子机制来看，大环内酯类和酮类抗生素确实可以被视为一种早期的“分子胶”范例。 图5 三个大环类天然化合物的三元复合物晶体结构 图片来源：参考资料7 在设计策略方面，研发人员开创了多元化的技术路径。以大环内酯类药物骨架为基础的结构导向设计策略，不仅提高了分子胶的选择性，也显著改善了其药代动力学特性。 “化学手柄”策略的提出，更是为多靶点开发开辟了新途径，这种模块化的设计理念大大加快了先导化合物的优化速度。最近化学顶刊JACS就刊发了最新成果：“自组装纳米分子胶，可在癌症治疗中实现GSH/H₂O₂触发的靶向蛋白质降解”。就像是在分子世界中设计了一个精密的“钓鱼竿”：化学手柄就是钓钩，而目标蛋白就是我们要捕获的“鱼”。 这种设计的精妙之处在于其模块化的思路。首先，科学家们会选择一个能够精确识别目标蛋白的小分子配体，这就像是选择了合适的“鱼饵”。然后，他们在这个配体上巧妙地引入化学手柄（比如富马酸酯基），这个手柄能够与细胞中的E3泛素连接酶形成稳定的共价键。这就像是在鱼饵上安装了一个特殊的机关，可以将捕获的“鱼”（目标蛋白）送到细胞的“加工厂”（蛋白酶体）进行处理。 在实践中，这种策略已经取得了令人振奋的成果。研究人员成功地将这种“化学钓竿”应用于多种癌症治疗靶点，比如FGFR、TBK1和Bcr-Abl等。与此同时，从虚拟筛选到高通量筛选，再到DNA编码库技术，多样化的E3 ligase筛选方法为分子胶的靶向性提供了有力支撑。 技术平台的创新同样令人瞩目。分子内双价胶的出现堪称一个里程碑式的突破，其皮摩尔级别的降解效率刷新了人们对分子胶潜力的认知。双功能分子胶的开发则开启了多靶点协同治疗的新范式，特别是在复杂疾病的治疗中展现出独特优势。人工智能的引入更是为分子胶的设计注入了新活力，AI辅助药物设计平台不仅加速了先导化合物的发现，也提高了优化的效率。 图6 IBG1同时结合BRD4的两个溴域，并将BRD4黏附到DCAF16上 图片来源：Naure 在临床进展方面，Pin Therapeutics的CK1α降解剂项目展现出令人振奋的前景。通过TR-FRET技术，研究人员不仅验证了三元复合物的形成，更在动物实验中实现了超过90%的CK1α降解率。特别值得一提的是，其8,333的治疗指数远超传统的MDM2抑制剂，为安全性问题的解决提供了新思路。 其他临床项目同样捷报频传。BMS的BMS-986470项目启动了涵盖184例患者的大规模I期试验，这是分子胶领域迄今为止最大规模的临床研究之一。诺华的WIZ分子胶在镰状细胞病治疗中的初步数据也展现出突破性的治疗潜力，为这一困扰医学界多年的疾病带来了新的希望。 这些技术创新与临床进展的密集涌现，标志着分子胶技术正在从概念验证阶段迈向实际应用。随着更多临床数据的积累和技术平台的持续优化，这一领域有望在未来几年内诞生突破性的新药。 4 结语 从2025年初的摩根大通医疗健康大会到全年的研发进展，分子胶降解剂领域展现出强劲的发展势头，该领域在2024—2025年间实现了从概念验证到临床应用的重要跨越。IBG技术的突破性进展为该领域注入了新的活力，也为未来药物开发提供了新的方向。随着技术的不断成熟和商业化进程的推进，分子胶有望在更广泛的疾病治疗领域发挥重要作用。 参考文献 [1]Monte Rosa Therapeutics.Monte Rosa Therapeutics Provides Development Progress Update.https://ir.monterosatx.com/news-releases/news-release-details/monte-rosa-therapeutics-provides-development-progress-update,2024. [2]标新生物.上海科技大学孵化企业标新生物完成超亿元Pre-A轮融资.https://36kr.com/p/1480173950694149,2024. [3]Nature.Targeted protein degradation via intramolecular bivalent glues[J].Nature,2024,doi:10.1038/s41586-024-07089-6. [4]Chemical Abstracts Service.Molecular glues and induced proximity:solving the undruggable.https://www-cas-org.libproxy1.nus.edu.sg/resources/cas-insights/molecular-glues-protein-degraders,2024. [5]Molecular glue-mediated targeted protein degradation:A novel strategy in small-molecule drug development https://pmc-ncbi-nlm-nih-gov.libproxy1.nus.edu.sg/articles/PMC11409024/ [6]第43届摩根大通医疗健康大会会议资料https://www.jpmorgan.com/about-us/events-conferences/health-care-conference [7]药物中的分子胶https://html.rhhz.net/YXXB/html/20211010.htm [8]Degron Therapeutics与武田制药达成12亿美元分子胶降解剂研发合作https://www.degrontx.com.cn/DegronNews-34.html [9]Cyrustx公司官网：http://www.cyrustx.com/kr/about/cyabout.php [10]SK Life Science Labs降解剂管线https://sklslabs.com/science/#pipeline [11]好事成双Orum接连与BMS，Vertex合作开发降解剂https://www.orumrx.com/pipeline-page 友情推荐：医药行业深度技术内容，点击“博药”查看详情~ 声明：本内容仅用作医药行业信息传播，为作者独立观点，不代表药智网立场。如需转载，请务必注明文章作者和来源。对本文有异议或投诉，请联系maxuelian@yaozh.com。 责任编辑 | 史蒂文 合作、投稿、转载开白 | 马老师 18323856316（同微信）  阅读原文，是受欢迎的文章哦

研究背景       免疫检查点抑制剂（ICI）在癌症免疫治疗中的临床效果受到肿瘤中细胞毒性T淋巴细胞（CTL）浸润不足的限制。因此，制定有效的策略以引发有效的CTL反应变得日益重要。癌症疫苗越来越被认为是一种有希望的治疗方式，能够引发强大的肿瘤内CTL反应。然而，当前的临床试验研究癌症疫苗面临重大挑战，未能产生显著的临床结果，原因是CTL的激活、扩增和分化效果不佳。成功启动抗原特异性CTL依赖于成熟的树突状细胞（DCs）向T细胞同时传递三个信号：信号1——抗原肽-主要组织相容性复合体（MHC）(pMHC)-T细胞受体（TCR）信号，信号2——共刺激分子CD80/CD86-CD28信号，信号3——成熟DCs分泌的细胞因子。这些信号对于T细胞免疫是不可或缺的。信号1来自肿瘤抗原，信号2和3依赖于佐剂对DCs成熟促进效应。因此，有效地共同递送疫苗抗原和佐剂至DCs对于有效引发CTL反应至关重要。 成功地将抗原和佐剂递送到树突状细胞（DCs）需要满足两个关键条件：一是能够靶向淋巴结并被DCs内吞，二是在DCs内吞后能够从内体中逃逸，因为内质网是pMHC形成的主要场所，并且含有许多佐剂受体，例如STING受体。目前像基于肽或裂解物的疫苗往往因为无法有效共递送抗原和佐剂到DCs的细胞质中而无法引发强烈的免疫反应。肿瘤抗原通常是蛋白质或肽片段，在被DCs内吞后，它们容易在内体中被降解，这阻碍了它们在细胞质中的有效释放，并导致交叉呈递效率低下，进而影响信号1的表达。STING激动剂作为免疫佐剂显示出激活I型干扰素反应的潜力，能够刺激抗原呈递细胞成熟以及T淋巴细胞的增殖和激活。然而，自由的STING激动剂面临膜不透过性和易受内体中核酸酶降解的挑战，这限制了它们与内质网上的STING相互作用，以及对DCs成熟和信号2/3引发的影响。因此，DCs细胞质中抗原和佐剂的有效共递送对于癌症疫苗免疫疗法至关重要。基于阳离子聚合物的纳米颗粒被用来包裹肿瘤抗原和佐剂，增强稳定性并促进内体逃逸，通过质子海绵效应实现细胞质释放。然而，它们的正电荷导致给药后在肝脏中显著积累，这对于肝外递送，尤其是到淋巴结和DCs，带来挑战，影响疫苗的效力和安全性。平衡抗原和佐剂共递送系统对阳离子电荷的要求给纳米疫苗的开发带来极大的难题。克服这些挑战，开发智能系统以有效实现DCs细胞质中共递送抗原和佐剂，是实现安全高效疫苗接种的主要障碍。 为了绕过上述共递送挑战，体外用抗原和佐剂喂养的活DCs已被用作基于DC的癌症疫苗。然而，活化的DCs在体内的寿命很短，只有一小部分最终迁移到引流淋巴结。尽管有希望，基于活DC的癌症疫苗呈现出不满意的临床结果和活细胞储存的困难。最近的研究显示，DC衍生的细胞外囊泡（dendrosomes）保留了原始DCs膜的原始构象、结构完整性和免疫活性，包括表面展示pMHC。与抗原蛋白共培养后，DCs在其表面呈现多个抗原表位，这些表位可以保留在它们分泌的细胞外囊泡（dendrosomes）中。提取的dendrosomes可以增加抗原负荷，进一步增强免疫反应。此外，作为DC衍生的囊泡，dendrosomes具有通过它们的同型靶向特性实现LNs归巢和与DCs相互作用的潜力。此外，阳离子纳米颗粒的正电荷可以在被dendrosomes吞噬后被屏蔽，有效地克服组织屏障并实现LNs趋向性。因此，抗原刺激的DC衍生的dendrosomes保留了亲本DCs的抗原呈递和免疫原性特性。此外，它们可以介导吞噬的纳米颗粒归巢到LNs及其与驻留DCs的相互作用。与传统的活DC疫苗相比，基于dendrosomes的无细胞疫苗在纳米尺度大小、良好的稳定性、方便的纳米颗粒功能化、储存和长距离运输方面展现出独特的优势。 主要内容     基于此，受细胞外囊泡dendrosomes仿生伪装的启发，该团队成功开发了基于聚合物聚酯酰胺（PEA）的纳米颗粒，该纳米颗粒共负载肿瘤抗原和STING激动剂cdGMP（NP（cG，OVA）），随后将NP（cG，OVA）负载到OVA表位自呈递dendrosomes（ODs）的空腔中，以构建包载纳米疫苗的dendrosomes ODs/NP（cG，OVA）。在自呈递抗原的细胞外囊泡和NP(cG，OVA)的联合作用下，与单独用细胞外囊泡或NP(cG，OVA)免疫的DCs相比，用ODs/NP(cG，OVA)免疫的DCs在其表面上展示了更多的抗原表位。它显著增强了信号1的水平，促进了DCs向T细胞的抗原呈递，并诱导了增强水平的抗原特异性T细胞。同时，细胞质递送的cdGMP可以在DCs的内质网膜上与STING相互作用，并刺激下游TBK1-IRF3信号通路，促进DCs成熟（信号2）和IFN-β（信号3）的分泌。在DCs的三个信号的共刺激下，用ODs/NP(cG，OVA)免疫在体内显著激活、增殖和分化了抗原特异性T细胞。免疫的T淋巴细胞展示了强大的杀伤肿瘤活性和强大的抗肿瘤免疫保护效果。这一平台可能普遍适用于有效递送各种抗原和佐剂作为纳米疫苗，用于广泛的肿瘤或其他疾病如病毒感染。 Scheme 参考文献：Xia J, Chen X, Dong M, et al. Antigen self-presenting dendrosomes swallowing nanovaccines boost antigens and STING agonists codelivery for cancer immunotherapy[J]. Biomaterials, 2025, 316: 122998. 原文链接： https://doi-org.libproxy1.nus.edu.sg/10.1016/j.biomaterials.2024.122998  识别微信二维码，可添加药时空小编 请注明：姓名+研究方向！

引言 在探索基因与表型之间复杂关系的研究中，基因组水平的扰动筛选（perturbation screening）已成为解锁生物学奥秘的重要工具。然而，传统基于富集策略的筛选方法存在显著的局限性，例如对细胞转录活性、胞质体积和低细胞密度的依赖，这使得它们难以在某些生物学环境中有效实施，尤其是在原代细胞或低转录活性的细胞类型中。为了突破这些瓶颈，研究人员开发了一种创新技术——核内原位测序（Nuclear In-Situ Sequencing, NIS-Seq），其显著特点在于通过在细胞核内生成亮度极高的测序信号，实现了细胞类型不可知的高密度光学筛选。(12月19日 Nature Biotechnology “NIS-Seq enables cell-type-agnostic optical perturbation screening”) 该研究的亮点在于，NIS-Seq技术不仅克服了传统方法对细胞特性的依赖，还能在各种细胞类型中生成一致且清晰的信号。这一技术通过引入T7启动子的反向转录步骤，从基因组DNA中生成大量RNA拷贝，结合锁环延伸（padlock elongation）、滚环扩增（rolling circle amplification）和多轮合成测序，实现了高效、精准的基因扰动识别。研究团队在包括HeLa细胞、THP1来源的巨噬细胞和初级人巨噬细胞在内的八种细胞类型中对NIS-Seq进行了验证，结果显示其在高密度细胞筛选和复杂库映射方面表现出极高的准确性和适用性。 此外，该技术不仅被应用于解码炎症相关通路的关键基因，还成功完成了在原代人巨噬细胞中的小规模筛选，甚至实现了在人皮肤组织中的条形码识别。这些突破展示了NIS-Seq在基础研究和临床转化中的广阔前景，例如细胞迁移、蛋白质复合物形成、动态信号转导等复杂生物过程的研究。 基因扰动筛选的新时代：从传统到创新 在生命科学研究中，基因扰动筛选（perturbation screening）被视为探索基因功能和表型联系的关键工具。这种方法通过随机扰动细胞中的基因组，筛选出与特定生物学现象相关的基因，帮助研究人员解码复杂的遗传网络。然而，传统的基因筛选方法，尽管在推动基因组研究方面取得了显著进展，却仍然面临诸多挑战。 传统方法大多依赖富集策略，例如通过荧光标记或细胞分选技术（如FACS）对特定表型的细胞进行筛选。随后，这些细胞中的基因扰动因子（如CRISPR单链向导RNA, sgRNA）会通过下一代测序（NGS）进行识别。然而，这些方法的效率高度依赖于细胞的转录活性和胞质体积。在低转录活性的细胞类型（如原代细胞）中，信号可能不足，难以进行精确分析。此外，传统方法通常需要将细胞分离到单独的孔或空间中进行测定，这种操作繁琐且容易引入实验偏差。同时，在高细胞密度的环境中，准确定位基因扰动的来源也极具挑战性。 NIS-Seq技术如何颠覆基因组筛选？ 核内原位测序（NIS-Seq）是一项突破性技术，它从根本上颠覆了传统基因组筛选的方式，以全新的角度解决了多年来存在的技术瓶颈。 NIS-Seq的核心原理围绕在细胞核内生成明亮且稳定的信号。传统的原位测序依赖于细胞胞质中的信使RNA（mRNA），然而mRNA的表达水平高度依赖细胞的转录活性，在低活性或原代细胞中往往无法生成足够的信号。而NIS-Seq则将信号生成的过程转移到了细胞核内，其关键在于引入了T7反向转录系统。研究人员在单链向导RNA（sgRNA）表达盒中添加了反向的T7启动子，从而使大量sgRNA的RNA拷贝能够直接从基因组DNA转录生成。接下来，这些RNA拷贝通过逆转录形成cDNA，并进一步通过锁环延伸（padlock elongation）、连接（ligation）和滚环扩增（rolling circle amplification, RCA）生成显著增强的信号。 NIS-Seq的另一独特之处在于其多轮荧光测序步骤。通过三色激光的合成测序，每轮测序生成的信号能够明确地标记单细胞核内的基因扰动条形码。这种方法不仅在单细胞水平上提供了极高的分辨率，还避免了传统方法在高细胞密度环境中信号分配模糊的问题。例如，在实验中，研究人员对THP1来源的巨噬细胞进行了14轮测序，生成了精准且一致的核内荧光信号，为基因扰动的高效识别奠定了基础。 通过这些技术创新，NIS-Seq显著提高了基因组筛选的效率和广泛适配性。它突破了传统技术对细胞类型和转录活性的限制，使得在低活性细胞和原代细胞中也能稳定生成清晰信号，为探索基因功能开辟了全新路径。 NIS-Seq技术在核内识别基因条形码的能力（Credit: Nature Biotechnology） a. NIS-Seq反应步骤概述 图a总结了NIS-Seq技术的工作流程。NIS-Seq在传统基于mRNA的原位测序方法基础上，增加了一个T7启动子的转录步骤，直接在细胞核内生成大量信号。这一设计绕过了对细胞转录活性和胞质体积的依赖，为多种细胞类型的适配奠定了基础。 b. 第一轮NIS-Seq成像结果与传统方法对比 图b比较了NIS-Seq与传统细胞胞质原位测序方法在八种细胞类型中的成像效果。结果显示，NIS-Seq在所有细胞类型（包括THP1来源的巨噬细胞和初级人巨噬细胞）中都能生成清晰的核内信号，而传统方法在某些细胞类型中未能产生足够的信号。这表明NIS-Seq在低转录活性和多样化细胞类型中的显著优势。 c. 14轮NIS-Seq测序的原始图像 图c展示了THP1细胞经过14轮NIS-Seq循环测序后的原始图像。实验中在第1、4、7、10和13轮进行了核染色，结果显示每轮测序的核内荧光信号清晰且稳定，表明NIS-Seq能够在多轮测序中保持高分辨率和可靠性。 d. 定量分析核内信号强度 图d对THP1细胞的两个核（Nucleus I和Nucleus II）进行了定量荧光信号强度分析。信号强度和碱基读取结果与条形码序列库中的两个条形码匹配，验证了NIS-Seq在条形码识别上的精准性。 e. 细胞条形码映射率 图e分析了细胞映射到已知条形码库成员的比例。结果表明，在使用NIS-Seq时，高达96.6%的细胞条形码能够被精确映射，而对照组（使用随机排列条形码参考库）中几乎没有信号。这表明NIS-Seq在条形码匹配上的高特异性。 f. NIS-Seq的特异性和灵敏度 图f通过混合细胞实验（表达GFP或NIS-Seq条形码的细胞）评估了NIS-Seq的特异性和灵敏度。实验对比了标准NIS-Seq方法和PFA固定后的改进版，结果显示NIS-Seq在两种固定方法下均能保持极高的特异性和灵敏度。 g. NIS-Seq的基因文库覆盖率 图g将NIS-Seq检测到的基因条形码与基于PCR的下一代测序（NGS）结果进行对比。结果显示，两种方法在基因库覆盖率上具有高度一致性，且相关性高达0.863，进一步验证了NIS-Seq的准确性和可靠性。 八种细胞类型的实验验证：一个技术适配性的突破 NIS-Seq技术的适配性和普适性在基因组筛选领域展现了令人瞩目的潜力。研究人员通过对八种不同类型的细胞进行实验验证，成功证明了NIS-Seq在多种生物学环境中的高效表现。这些细胞类型包括经典的实验室细胞系（如HeLa细胞）、肿瘤细胞（MaMel 65、B16-F1）、免疫细胞（THP1来源的巨噬细胞）以及极具挑战性的原代人巨噬细胞。结果表明，NIS-Seq在所有这些细胞中均能生成亮度极高且分辨率清晰的核内信号，无论细胞的转录活性或形态特性如何。 尤其值得一提的是，NIS-Seq在低转录活性细胞中的表现令人耳目一新。传统的基因组筛选方法在处理这些细胞时往往难以生成足够信号，导致筛选结果受限。而NIS-Seq通过直接在细胞核内对sgRNA的序列条形码进行转录、扩增和测序，有效绕过了对细胞转录活性的依赖。例如，在THP1来源的巨噬细胞和初级人巨噬细胞中，传统的原位测序几乎无法生成清晰的信号，而NIS-Seq却能够产生亮度显著增强的核内信号。此外，即使在高细胞密度的环境中，NIS-Seq依然能实现精准的细胞核映射，使得不同条形码能够被可靠地分配到正确的细胞。 数据进一步验证了这一技术的广泛适用性。研究表明，在所有测试的细胞类型中，NIS-Seq的条形码匹配率和灵敏度均显著高于传统方法。实验中，96.6%的已知序列库条形码能够通过NIS-Seq检测到，而传统原位测序在某些细胞类型中甚至完全丧失信号。这种技术的稳定性和普适性使得研究人员可以在从肿瘤细胞到原代免疫细胞的广泛环境中实施基因组筛选。 通过这次跨越不同细胞类型的实验验证，NIS-Seq不仅展现了强大的技术适配性，更为研究复杂的细胞系统、低转录活性细胞和原代细胞提供了一种高效、精准的工具。 高密度筛选的利器：NIS-Seq的精准度与可靠性 在基因组筛选中，高细胞密度实验一直是技术的试金石——如何在有限空间内精准分配和解读基因条形码信号，直接决定了筛选的成功与否。NIS-Seq凭借其独特的核内信号生成机制和高灵敏度，成为应对这一挑战的“利器”，在高密度细胞环境中展现了前所未有的精准度与可靠性。 传统的筛选方法在高密度条件下容易出现信号交叉或分配错误，因为这些方法依赖于胞质信号，而在密集的细胞环境中，胞质边界常常模糊不清。然而，NIS-Seq通过在细胞核内生成强荧光信号，完全规避了这一问题。在实验中，研究人员利用NIS-Seq对THP1来源的巨噬细胞和其他类型细胞进行了高密度筛选测试，成功地在单核分辨率下映射了多轮测序产生的基因条形码。这一技术能够在核内信号的位置和颜色上做到精确匹配，即使在复杂的细胞排列中也能准确区分每个细胞的基因扰动条形码。 实验数据进一步凸显了NIS-Seq的可靠性。结果显示，在高密度条件下，NIS-Seq的条形码映射率达到96.6%，显著高于传统的原位测序方法。同时，特异性与灵敏度的测试表明，NIS-Seq在不同固定方法下（如甲醇和PFA固定）都能保持高水平的信号特异性（接近100%）和低噪声背景。此外，通过对混合细胞群进行测试，研究人员发现NIS-Seq能够清晰地区分表达不同sgRNA的细胞，几乎没有误报或信号重叠现象。 更重要的是，NIS-Seq还能高效处理高复杂性基因文库。在多轮测序的实验中，它能够区分超过69,000种基因条形码，与下一代测序（NGS）结果的相关性高达0.863。这种能力使得研究人员在基因文库覆盖率和准确性上达到了前所未有的高度。 通过这些数据可以看出，NIS-Seq不仅在高密度筛选中具备优越性能，还极大地提升了基因扰动分析的准确性和稳定性。 从炎症通路到巨噬细胞：揭示关键基因的秘密 炎症反应是免疫系统应对病原体和组织损伤的核心机制，而解码炎症通路中基因的具体作用，一直是现代医学研究的重要课题。NIS-Seq技术的问世，为这一复杂生物过程提供了全新的解析工具。该研究中，研究人员利用NIS-Seq对炎症通路的关键基因进行了系统性筛选，揭示了多个基因在炎症调控中的核心作用，并在原代巨噬细胞的研究中取得了开创性突破。 在实验中，研究人员以HeLa细胞为模型，通过NIS-Seq技术解码了NF-κB信号通路这一经典炎症通路的基因作用机制。NF-κB是一组诱导性转录因子家族，其活化过程涉及复杂的信号传导网络。研究人员通过CRISPR文库对超过18,000个基因进行了全基因组水平的扰动，并使用NIS-Seq结合荧光标记的p65蛋白对细胞核的信号转导进行了精准量化。筛选结果确认了IL1R1、TNFRSF1A等经典受体基因，同时也揭示了多个新基因（如TRAF6、CHUK）的作用，进一步完善了NF-κB通路的基因网络图。 更值得一提的是，该研究首次成功将NIS-Seq应用于原代人巨噬细胞的基因筛选。这种细胞类型生物学意义重大，但由于其低转录活性、难以转染等特点，一直难以被传统筛选技术有效研究。研究人员通过优化CRISPR载体与NIS-Seq技术，成功完成了巨噬细胞中NLRP3炎症小体（inflammasome）的筛选实验。结果显示，NLRP3、IKBKB和IRAK1等基因对炎症小体的形成和功能至关重要，同时揭示了若干新基因（如HDAC5、RNF31）的调控作用，为理解炎症小体的分子机制提供了新视角。 这项研究的重要性在于，NIS-Seq不仅揭示了经典炎症通路中新的基因调控机制，还填补了原代巨噬细胞筛选的技术空白。通过这种创新性的基因筛选手段，研究人员不仅能够深入理解炎症通路的复杂网络，还为治疗炎症性疾病提供了潜在的新靶点。 首次尝试：人皮肤组织中的条形码识别 在复杂的活体组织中进行基因筛选一直是生物医学研究的前沿挑战之一。相比于细胞培养体系，组织中的细胞具有高度复杂的空间结构和多样的生理状态，这对传统筛选技术提出了严峻的挑战。NIS-Seq技术的出现，不仅突破了单细胞筛选的限制，更首次成功实现了在活体组织中对基因扰动条形码的精确识别，为组织水平的遗传研究开启了新篇章。 研究人员在人皮肤组织中进行了这一前沿实验。他们首先从健康捐献者的皮肤活检样本中分离出上皮细胞层，并用经过优化的CRISPR载体库对其进行转导。这些载体不仅携带了NIS-Seq兼容的条形码，还编码了炎症相关信号通路的基因扰动因子。随后，研究团队利用NIS-Seq技术在经过多轮荧光测序后，精准识别了每个细胞核内的条形码序列，成功将基因扰动信息映射到皮肤组织的细胞层。 在多轮条形码测序中，NIS-Seq信号显示了高度的特异性和可靠性，能够清晰地区分转导细胞和未转导细胞，且没有出现显著的信号重叠或背景噪声。此外，研究人员还通过组织变形补偿算法，成功解决了活体组织在固定和测序过程中可能产生的图像畸变问题。这些技术优化使得条形码的空间映射达到了前所未有的精准度。 这一突破意义深远。首次在人皮肤组织中实现条形码的精确识别，不仅展示了NIS-Seq在活体组织研究中的应用潜力，也为未来深入研究组织水平的基因功能和疾病机制奠定了基础。例如，通过这一技术，研究人员未来可在复杂的组织微环境中系统性地研究基因扰动对细胞行为的影响，甚至进一步探索疾病组织中的遗传调控网络。 光学筛选的未来 随着生物学研究逐步迈向大数据时代，如何将高通量数据转化为深刻的生物学洞察，成为科学界面临的核心挑战之一。NIS-Seq技术的问世，为这一挑战提供了前所未有的解决方案。它不仅能够在单细胞水平上生成海量的基因扰动数据，还能通过结合多维度的高通量分析，深入挖掘复杂的生物学问题，揭示潜藏在细胞和组织中的遗传机制。 NIS-Seq技术以其超高通量和分辨率，使研究人员能够在短时间内生成覆盖数十万细胞和数万基因条形码的数据集。例如，在对NF-κB信号通路的筛选中，NIS-Seq成功解析了超过18,000个基因的扰动效果，并通过精确的单细胞核信号量化，构建出一幅详细的基因功能网络图。在炎症小体研究中，NIS-Seq进一步揭示了许多未被充分研究的调控因子，为深入理解炎症反应的分子机制提供了关键线索。 此外，NIS-Seq的强大之处在于其能够同时捕获单细胞分辨率的表型和基因型数据，并通过统计分析和机器学习技术，从复杂数据中提取关键特征。例如，研究人员利用NIS-Seq生成的超过70万张单细胞图像，采用零知识嵌入（zero-knowledge embedding）算法，成功挖掘了传统筛选方法中被遗漏的关键基因（如RELA），展现了人工智能与光学筛选结合的强大潜力。 未来，NIS-Seq技术的应用范围远不止于实验室研究。其能够以高精度解析基因功能的能力，在临床研究中具有广阔前景。例如，NIS-Seq可用于精准筛选疾病相关基因，为癌症、免疫性疾病等提供潜在的治疗靶点。此外，该技术在组织水平的高效应用，预示着它将在组织工程、药物筛选和再生医学中扮演重要角色。 NIS-Seq通过其独特的光学筛选能力，正在为基因组学研究开辟新的路径。从单细胞到组织，从实验室到临床，NIS-Seq为研究人员提供了一个强大的平台。 下一步在哪里？ 尽管NIS-Seq技术以其独特的核内信号生成和高通量筛选能力，推动了基因组学和生物医学研究的前沿，但它仍存在一些局限性需要进一步改进。 首先，NIS-Seq的信号检测效率仍有提升空间。研究中发现，大约40%至60%的细胞核能够被成功映射到基因库中的条形码。这一限制可能源于几个因素：例如，有些细胞可能未能成功转导完整的CRISPR载体，或者条形码在病毒包装和转导过程中发生了突变。此外，在高密度筛选中，尽管NIS-Seq在单细胞分辨率上的表现优异，但对于部分多重转导细胞或条形码重叠现象，仍可能出现信号噪声或识别错误。 其次，NIS-Seq的实验过程较为复杂，需要严格控制固定和测序步骤。例如，不同的固定方法（如甲醇或PFA）对信号特异性的影响尚需进一步优化。此外，尽管该技术已成功应用于组织研究，但在更复杂的三维结构和动态组织环境中的表现仍需验证，这对技术的稳定性和适配性提出了更高的要求。 针对这些挑战，未来的改进方向可能包括优化CRISPR载体设计以提高转导效率和条形码完整性，同时探索新型信号放大技术（如CoolMPS抗体标记），以进一步提升信号强度和降低噪声。此外，自动化实验流程和人工智能算法的引入，也将有助于提高数据处理效率和结果的准确性。 在潜在应用领域方面，NIS-Seq展现了广阔的前景。从基础研究到临床应用，该技术可用于解码更多复杂的遗传网络，如癌症中的多基因协同效应或神经退行性疾病的关键调控因子。在再生医学领域，NIS-Seq还可用于探索干细胞分化和组织修复的动态机制。 总的来说，NIS-Seq技术虽尚处于发展初期，但它的出现已经为基因组学和生物医学研究打开了新的窗口。随着技术的不断迭代，我们有理由相信，NIS-Seq将在未来释放更大的潜力，成为生命科学研究不可或缺的核心工具之一。 参考文献 Fandrey, C.I., Jentzsch, M., Konopka, P. et al. NIS-Seq enables cell-type-agnostic optical perturbation screening. Nat Biotechnol (2024). https://doi-org.libproxy1.nus.edu.sg/10.1038/s41587-024-02516-5 责编|探索君 排版|探索君 转载请注明来源于【生物探索】 声明：本文仅用于分享，不代表平台立场，如涉及版权等问题，请尽快联系我们，我们第一时间更正，谢谢！ End 往期精选 围观 Nature | 单细胞分析技术的革命性进展 热文 Nature | 环状RNA（circRNA）为何成为基因调控的新宠？ 热文 Cell | AI取代科研人员还有多远？ 热文 新英格兰 | 司美格鲁肽（semaglutide）又有新发现：助力关节炎治疗 热文 CRISPR技术进化史 | 24年Cell 综述