cyclin-T1

合子基因组激活(zygotic genome activation, ZGA)作为生命起始后的第一个转录事件，是启动胚胎发育程序、推动早期胚胎发育由母源基因组控制转变为合子基因组控制的重要转折点。 由于研究材料有限，人们对 ZGA 的发生机制(尤其是在哺乳动物中)的发生机制知之甚少。随着单细胞和微量细胞基因表达和染色质分析技术的快速发展，近些年研究发现伴随ZGA的发生，表观基因组和转录组会经历剧烈的重编程现象。参与ZGA启动的多类调控因子也被陆续鉴定出来。这些ZGA调控因子具体是如何协同调控ZGA发生的？它们在其中分别起到了什么作用？伴随ZGA发生的表观遗传重编程现象是否也参与ZGA？这些问题均是领域内的热点研究问题。 2024年8月19日，清华大学生命科学学院颉伟团队在《欧洲分子生物学学会报告》(EMBO Reports)杂志发表题目为 “启动合子基因组：许可因子，特异因子及其他调控因子” (Kick-starting the zygotic genome: licensors, specifiers, and beyond) 的特邀综述文章。该综述将调控ZGA的因子总结为了两类：一类为ZGA许可因子(Licensors)，它们参与控制ZGA事件是否能被允许发生以及何时发生 ；另一类是特异性决定因子(Specifiers)，它们在ZGA过程决定了哪些基因被特异性激活。 该综述基于多个物种ZGA调控机制的相关研究，总结了ZGA许可因子和ZGA特异因子以及它们的工作机制，并讨论了表观遗传重编程对于ZGA的作用，为深入理解ZGA激活机制提供了新的见解。 作者首先讨论了ZGA附近的染色质重编程以及相关表观遗传调控因子在ZGA中的作用，包括DNA甲基化、组蛋白修饰(Histone acetylation，H3K4me3, H3K27me3 and H2AK119ub, H3K9me3等)、组蛋白变体的重编程，以及染色质重塑因子、染色质三维结构重编程在其中的作用。该综述进一步总结了各个物种中已知的ZGA 关键转录因子，包括果蝇中的Zelda、GAF、CLAMP，斑马鱼中的Nanog、 Pou5f3 、Sox19b，小鼠中的OBOX, DUX家族蛋白，人中的TPRX家族蛋白等，回顾了它们的发现和工作机制，并讨论了部分关键转录因子与重复序列之间的关系。 转录因子对于ZGA非常关键，但是过表达转录因子并不能提前引发ZGA发生。很多证据表明存在一类因子能够参与控制ZGA事件是否能被允许发生以及何时发生。因此作者提出ZGA 许可因子 (Licensor)的概念来代表这一类因子，转录因子则作为Specifier (特异性决定因子)提供基因表达的特异性。 作者同时提出了鉴定ZGA licensor的四条标准： 1，Licensor对于启动ZGA至关重要；缺乏该因子会导致ZGA出现严重缺陷； 2，ZGA之前，licensor在蛋白丰度、成熟度或核定位方面会发生单方向的变化；阻止这种变化会影响ZGA发生； 3，加速这种变化会促进ZGA发生(这也取决于其他licensor是否已经准备好)； 4，Licensor对于ZGA起到全局调控的作用，而非直接影响ZGA基因激活的基因特异性。部分可能的ZGA 许可因子包括斑马鱼的核孔复合体组分和小鼠转录机器的部分调控因子如Cyclin T1等。 最后，该综述对ZGA领域未来研究的重要科学问题和研究手段提出了展望，包括：各物种中ZGA关键转录因子是哪些？哺乳动物是否存在其他新的关键转录因子？关键转录因子与表观遗传调控因子如何协作？ZGA发生时间如何调控？有哪些新的Licensor？能否建立ZGA体外模型，开发生化和遗传筛选手段等来寻找新的ZGA调控机制和因子？这些问题都亟待未来更多的研究来解析。 图1 . 许可因子 (licensors) 作为“电闸”，特异因子 (specifiers) 作为“开关”，共同参与调控ZGA 清华大学生命科学学院颉伟教授为本综述论文通讯作者。清华大学-北京大学生命科学联合中心2018级博士研究生邹卓宁（已毕业）和清华大学生命学院2020级博士研究生王秋艳为共同第一作者。清华大学-北京大学-北京生命科学研究所联合培养2020级博士研究生吴希为本综述的撰写提供了帮助。美国宾夕法尼亚大学Richard M. Schultz教授参与修改了论文。 论文链接：  https://doi-org.libproxy1.nus.edu.sg/10.1038/s44319-024-00223-5 原文链接： https://life-tsinghua-edu-cn.libproxy1.nus.edu.sg/info/1131/6146.htm 本文仅用于学术分享，转载请注明出处。若有侵权，请联系微信：bioonSir 删除或修改！

癌症研究领域随着二代测序（Next-generation sequencing）的发展，取得了显著进展，深入解析了癌症基因组（cancer genome）和转录组（transcriptome），极大地提高了我们对癌症生物学的理解。然而，尽管取得了这些进展，大多数癌症患者仍主要接受放疗和化疗，这些治疗方式伴随着较高的复发风险和毒性。靶向治疗（targeted therapies），如小分子药物（small-molecule drugs）、单克隆抗体（monoclonal antibodies）、抗体-药物偶联物（antibody-drug conjugates，ADCs）、蛋白降解靶向嵌合体（proteolysis-targeting chimeric molecules，PROTACs）、抗体导向酶前药疗法（antibody-directed enzyme prodrug therapies，ADEPTs）、癌症治疗疫苗（cancer treatment vaccines）、检查点抑制剂（checkpoint inhibitors）和T细胞治疗（T cell therapies），为实现更有效和精准的癌症治疗提供了希望。 由于蛋白质是这些治疗方法的主要靶点，并且是驱动癌症基因和表观基因异常的功能效应器，蛋白基因组学（proteogenomics）——即将无偏见的质谱（mass spectrometry，MS）基础蛋白质组学与基因组学、表观基因组学和转录组学整合——为探索现有和未来的癌症治疗靶点提供了一个强大的框架。临床蛋白质组学癌症分析联盟（Clinical Proteomic Tumor Analysis Consortium，CPTAC）对超过1000个前瞻性收集的未经过治疗的原发肿瘤进行了蛋白基因组学表征，覆盖了10种癌症类型，许多样本还包括匹配的正常邻近组织。CPTAC泛癌症资源工作组对这10种癌症类型的所有组学数据进行了统一化处理，以便进行泛癌症蛋白基因组学研究。 6月24日Cell杂志的报道“Pan-cancer proteogenomics expands the landscape of therapeutic targets”，将这一数据集与其他公共数据集整合，揭示了癌症治疗蛋白质靶点的全景。通过系统地识别过表达或过度活化的可靶向蛋白依赖性、与肿瘤抑制基因（tumor suppressor genes，TSGs）缺失相关的蛋白依赖性、以及新抗原（neoantigens）和肿瘤相关抗原（tumor-associated antigens），相关的分析为现有癌症药物靶点提供了新的见解，并系统性地识别了药物再利用或开发的新候选靶点。这些结果为伴随诊断、药物再利用和治疗开发提供了一个全面的蛋白质和肽靶点资源。 癌症研究的飞速发展使我们对癌症的基因组和转录组有了更深入的了解，但大多数患者仍主要依赖于传统的放疗和化疗，这些治疗方法存在高复发率和显著的毒性。为了实现更有效和精准的治疗，靶向治疗（targeted therapies）应运而生，其中包括小分子药物（small-molecule drugs）、单克隆抗体（monoclonal antibodies）、抗体-药物偶联物（ADCs）、蛋白降解靶向嵌合体（PROTACs）、抗体导向酶前药疗法（ADEPTs）、癌症治疗疫苗（cancer treatment vaccines）、检查点抑制剂（checkpoint inhibitors）和T细胞治疗（T cell therapies）。这些方法的共同点是它们主要靶向癌症细胞中的特定蛋白质，而蛋白质组学（proteomics）结合基因组学、表观基因组学和转录组学的整合，即蛋白基因组学（proteogenomics），为探索癌症治疗的新靶点提供了一个强有力的框架。 该研究利用了临床蛋白质组学癌症分析联盟（Clinical Proteomic Tumor Analysis Consortium，CPTAC）的数据，涵盖了10种癌症类型的超过1000个前瞻性收集的未经过治疗的原发肿瘤样本，许多样本还包括匹配的正常邻近组织。研究团队将这些数据与其他公共数据集整合，系统性地识别了过表达或过度活化的可靶向蛋白依赖性、与肿瘤抑制基因（TSGs）缺失相关的蛋白依赖性、以及新抗原（neoantigens）和肿瘤相关抗原（tumor-associated antigens）。 研究团队综合使用了多种组学数据，包括蛋白质组学（proteomics）、基因组学（genomics）、表观基因组学（epigenomics）和转录组学（transcriptomics），并结合细胞系数据和计算预测分析，揭示了癌症治疗的蛋白质靶点全景。 数据收集和处理：研究首先整合了来自CPTAC的蛋白基因组学数据，这些数据涵盖了10种癌症类型的1043个肿瘤样本和524个正常组织样本。数据整合还包括来自GTEx、TCGA、DepMap等公共资源的数据，这些数据提供了广泛的基因组和蛋白质组信息。 蛋白质表达和活性分析：研究通过质谱（mass spectrometry, MS）数据，识别出在肿瘤中过表达或活化的蛋白质。这些蛋白质的过表达或活化可能是由基因突变（mutation）、低甲基化（hypomethylation）或拷贝数扩增（copy-number amplification）驱动的。具体方法包括利用PepQuery工具验证蛋白质鉴定，并结合mRNA和蛋白质的表达数据进行相关性分析。 基因依赖性分析：通过使用CRISPR-Cas9基因敲除（knockout, KO）实验数据，研究团队识别了癌细胞在某些关键蛋白上的依赖性，这些依赖性使得这些蛋白质成为潜在的治疗靶点。基因敲除实验数据来自DepMap数据库，通过分析基因敲除对细胞生长的影响，确定了关键的基因依赖性。 合成致死性分析：研究团队通过蛋白基因组学数据，识别了合成致死性（synthetic lethality）现象，即当两个基因同时失活时会导致细胞死亡，而单独失活一个基因时细胞仍能存活。这种分析提供了一种针对肿瘤抑制基因缺失的治疗策略。例如，TP53基因缺失的肿瘤对某些蛋白质表现出更高的依赖性，提示可以通过靶向这些蛋白质来治疗TP53缺失的肿瘤。 新抗原和肿瘤相关抗原的预测和验证：通过计算预测和实验验证，系统性地识别出潜在的新抗原和肿瘤相关抗原。这些抗原可以作为疫苗和T细胞治疗的靶点。研究使用了NeoFlow工具和HLA（人类白细胞抗原）结合亲和力预测，筛选出具有潜力的新抗原，并通过实验验证其免疫原性。 通过泛癌症分析，研究团队识别出2863种药物可靶向蛋白质，并揭示了影响mRNA与蛋白质相关性的生物学因素。这些蛋白质中，有许多在不同癌症类型中表现出过表达或过度活化，提供了潜在的治疗靶点。例如，在非小细胞肺癌（LUAD）中，EGFR基因的突变和拷贝数扩增导致了EGFR蛋白质和mRNA水平的显著增加。 样本和组学特征的概览：图A展示了10种癌症队列中肿瘤和正常组织样本的数量，以及每种组学类型（基因组学、转录组学、蛋白质组学等）中识别到的特征总数。 目标基因的分类：图B显示了每个目标层级中基因的数量，并将重叠的基因分配到最高层级。图中将这些基因分为五个层级，分别是： 层级1：已获任何癌症类型的药物批准的主要抑制靶点。 层级2：获批用于其他适应症的药物的主要抑制靶点。 层级3：处于实验或临床试验阶段的药物的靶点。 层级4：经常被小分子药物靶向的蛋白家族中的其他基因。 层级5：细胞表面膜蛋白。 功能家族分布：图C展示了每个层级中基因所属的功能家族的百分比。 各组学类型中的基因数量：图D显示了在至少一个癌症队列中每种组学类型中识别到的基因数量。 蛋白质丰度热图：图E为每个癌症队列中目标蛋白的中位log2 MS1强度（蛋白质丰度）热图，展示了不同癌症类型中蛋白质丰度的变化。 蛋白质丰度排名：图F根据每个队列中蛋白质丰度的中位值，对所有蛋白质进行排名，并标注了最高和最低丰度的药物靶点，以及被最多药物批准靶向的靶点。 mRNA和蛋白质相关性：图G展示了所有样本中可靶向蛋白质的中位log2 RNA表达和中位log2蛋白质丰度的散点图，并计算了Spearman相关系数。 各队列中的相关性系数热图：图H显示了在任一队列中基因与蛋白质丰度不相关的基因的mRNA和蛋白质相关性热图。 特定蛋白质的相关性分析：图I分析了在肺鳞状细胞癌（LSCC）队列中，CDK9蛋白质丰度与CDK9 mRNA丰度及其结合伙伴CCNT1蛋白质丰度之间的Spearman相关性。 基因集合富集分析（GSEA）：图J展示了基于CDK9蛋白质共表达或全球mRNA共表达的GSEA富集分析结果。 研究发现，在肿瘤中过表达的蛋白质往往是由基因突变、低甲基化或拷贝数扩增驱动的。例如，GATA3突变导致乳腺癌中GATA3蛋白质和mRNA水平的显著增加；CTNNB1突变导致子宫内膜癌中CTNNB1蛋白质水平的显著增加，而mRNA水平未发生显著变化，这与突变蛋白逃脱蛋白降解的机制一致。 研究通过蛋白基因组学分析，识别出合成致死性提供了一种针对肿瘤抑制基因缺失的治疗策略。例如，TP53基因缺失的肿瘤对拓扑异构酶IIα（TOP2A）表现出更高的依赖性，提示可通过靶向TOP2A来治疗TP53缺失的肿瘤。研究发现，TP53缺失的子宫内膜癌细胞对拓扑异构酶抑制剂多柔比星（doxorubicin）和米托蒽醌（mitoxantrone）表现出更高的敏感性，提示TP53状态可以作为选择治疗方案的生物标志物。 研究系统性地预测并验证了新抗原和肿瘤相关抗原。例如，KRAS基因突变产生的肽被预测为有潜力的新抗原，这些新抗原在多个癌症类型中具有公共性，提示其作为免疫治疗靶点的潜力。研究通过计算预测发现，KRAS G12D突变肽在多个癌症类型中都有新抗原潜力，并在实验中验证了其结合HLA的能力和免疫原性。 该研究通过整合多种组学数据，揭示了癌症治疗的新靶点，并为药物再利用和新疗法的开发提供了重要资源。这些发现不仅有助于理解癌症的生物学机制，还为个性化治疗提供了新的方向。未来的研究可以进一步验证这些靶点的临床应用潜力，并开发相应的靶向治疗和免疫疗法。 数据整合的重要性：通过整合蛋白质组学、基因组学、表观基因组学和转录组学数据，研究能够全面了解癌症的分子机制。这种多层次的数据整合方法为发现新的治疗靶点提供了广泛的视角。 临床应用的潜力：尽管该研究主要基于实验室数据，但其发现具有显著的临床应用潜力。例如，识别出的新抗原可以用于开发癌症疫苗和T细胞疗法，过表达和活化的蛋白质可以作为靶向药物开发的基础。 未来研究方向：该研究揭示了许多潜在的治疗靶点，但还需要进一步的实验验证和临床试验来确定其有效性和安全性。未来的研究可以集中在这些靶点的功能验证、药物筛选和临床应用上。 综上，跨癌种蛋白基因组学的研究为癌症治疗提供了新的视角和方法，通过系统性地识别和验证新的治疗靶点，有望推动个性化治疗和精确医学的发展。这些发现不仅深化了我们对癌症生物学的理解，也为未来的癌症治疗提供了重要的科学依据和实践指导。 参考文献 Savage SR, Yi X, Lei JT, Wen B, Zhao H, Liao Y, Jaehnig EJ, Somes LK, Shafer PW, Lee TD, Fu Z, Dou Y, Shi Z, Gao D, Hoyos V, Gao Q, Zhang B. Pan-cancer proteogenomics expands the landscape of therapeutic targets. Cell. 2024 Jun 17:S0092-8674(24)00583-X. doi: 10.1016/j.cell.2024.05.039. Epub ahead of print. PMID: 38917788. https://doi-org.libproxy1.nus.edu.sg/10.1016/j.cell.2024.05.039 内容来源于网络，如有侵权，请联系删除。

感谢关注转发，欢迎学术交流请点击此处链接观看CyberSAR系统详细使用教程转录失调是许多癌症的一种标志，MYC癌基因家族的基因组扩增就是证据之一，至少20%的成人实体瘤发生过这种情况。靶向转录辅助因子和转录细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK9）已经成为一种阻止转录活性失调（包括致癌MYC）的治疗策略。Kronos Bio公司经过小分子微阵列筛选到苗头化合物1，通过多轮分子优化评估化合物的CDK9选择性，提高靶向效力及整体的物理化学性质和药代动力学特征等相关指标，得到有效、选择性高、可口服的CDK9抑制剂28（KB-0742）。化合物28在小鼠异种移植模型中表现出体内抗肿瘤活性，根据PK曲线实验结果有望成为有效的口服药物。目前正在对复发或难治性实体瘤或非霍奇金淋巴瘤患者开展I/II期剂量递增和队列研究临床试验（NCT04718675）。本篇文章主要介绍了KB-0742发现和分子优化过程，可为类似项目结构优化提供宝贵经验。图1. KB-0742发现和分子优化过程细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）是丝氨酸/苏氨酸激酶家族，和细胞周期蛋白（cyclin）协同发挥作用。CDKs按生理功能分为两类，负责细胞周期进程（CDK1、2、4、6）和细胞转录调节（CDK7、8、9、12、13）。细胞周期蛋白依赖性激酶9（CDK9）属于丝氨酸类激酶，主要在转录延伸的调控中发挥作用，而不影响细胞周期过程。CDK9/cyclin异二聚体作为一种正性转录延伸因子b（p-TEFb）中的重要催化亚基，转录调节CDKs。CDK9抑制剂可通过降解、抑制CDK9来阻断p-TEFb对RNA聚合酶II羧基末端区域的Ser2磷酸化，抑制转录，迅速降解mRNA水平，从而引起肿瘤细胞凋亡，使CDK9成为一个有吸引力的靶点。目前进入临床阶段的集中CDK9抑制剂包括atuveciclib、VIP152、AZD4573、PRT2527和GFH009，这些化合物都需要静脉注射给药。Kronos Bio使用公司内部的小分子微阵列（SMM）平台，筛选了在细胞裂解环境中与转录复合物结合的小分子库，发现化合物1（KI-Arv03）表现出优异的激酶组和CDK亚型选择性，通过多轮分子结构优化，发现有效、高选择性、可口服的CDK9抑制剂28（KB-0742）。化合物28在多种小鼠异种移植模型中表现出体内抗肿瘤活性，尤其是侵袭性MYC驱动的TNBC。经动力学实验研究发现，Kronos Bio公司筛选获得的苗头化合物1与CDK9的ATP竞争。同时，CDK9/cyclinT1共晶结构（PDB:3MY1）也证明化合物1在ATP竞争结合位点的催化裂缝隙中并以type I型与蛋白结合（如Fig1所示）。因此，公司利用基于结构的药物设计方法进一步增强对ATP竞争性结合位点的结合活性。从晶体结构中分析，该化合物吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-胺母核与铰链Cys106（NH和C=O）形成氢键作用。母核与铰链结合后末端伯胺指向溶剂暴露区的Glu107和Asp109的主链羰基和Asp109的侧链形成氢键作用或离子键。吡唑并嘧啶的5-丙基与Leu156侧链形成疏水作用。经结合模式分析，Kronos Bio公司假定化合物1的三个关键区域，即C-3（R3）、C-5（R1）和C-7（R2）位置进行分子优化。首先R1固定为异丙基，重点研究ATP竞争结合位点R2基团的空间要求，特别是化合物与Asp109和Glu107的相互作用（如表1所示）。将1的氨基环戊烷收缩为环丁烷（化合物2）维持CDK9/cyclin T1结合活性。氨基氮杂环丁烷类似物3结合活性降低5倍。甲基化氮杂环丁烷（化合物4）失去了与Glu107氢键作用，且暴露于溶剂区引入疏水作用，降低结合活性。氮杂环丁烷（5）与氮杂环丁烷（3）表现出相似的效力。羟基环丁烷（6）IC50为183nM，恢复部分结合活性。羟基烷基化（如化合物7）对结合活性没有明显影响。而氨基替代羟基，如化合物8结合活性明显增强（IC50达到25nM），推测化合物8与Asp109和Glu107形成更强的氢键作用。化合物8经CDK激酶谱筛选，显示出对CDK4和CDK7的活性，对CDK9的选择性分别为195倍和360倍。吡唑并嘧啶（9）3位氯原子取代对CDK9（IC50为12nM）更有效，但失去了选择性，特别是对CDK4，选择性倍数从195倍下降到18倍。单甲基取代10与化合物8相比失去效力，这说明在Asp109和Glu107之间需要两个能够形成氢键的氢原子。改变R2中与Asp109和Glu107形成氢键的距离和电子要求会产生混合效应。将氢键供体/氢键受体基团进一步向具有羟基亚甲基的溶剂区延伸，如化合物11，近似于其非亚甲基类似物6。相比于单甲基化胺10，乙酰胺12和酰胺13几乎没有变化，这表明仅以电子效应改变氮上的氢键受体能力对效力影响不大。甲基磺酰胺17进一步验证了这一想法，该类似物结合活性仅有微小改变和类似的选择性特征。然而，甲基脲14结合活性增加至46nM，并且CDK选择性提高。认为两个尿素N-H基团都可以与Asp109有效结合形成氢键。使用氰基胍15也可以看到类似结果，与其它测试的CDKs相比，选择性均≥32倍。苯胺16与氰基胍和脲具有同等效力，但对CDK2的选择性较低。接下来，Kronos Bio公司研究五元环对结合活性的影响，从3-氨基吡咯烷18和19开始，R-对映异构体的效力比S-构型强大约6倍。回到二氨基环戊烷系列，正如最初筛选得到的化合物1类似结果，发现（S, S）构型（20）非常有效，可与二氨基环丁烷化合物8相媲美。母核3位氯取代类似物21的IC50为4nM，但失去了选择性，特别是针对CDK3、4和7。五元环系列的甲基脲变体（24）与四元环（14）具有相似的效力，对CDK9与其它测试的CDK激酶的选择性≥31倍。羟基化氨基环戊烷25比其环丁烷类似物6更有效，但未能表现出比二氨基环丁烷（8）或二氨基环戊烷（20）更优。与环丁烷8和环丁烷20相比，二氨基环己烷26的效力降低，这意味着类似物结合的环最好为四元环和五元环。根据优化结果，可以确定任何与Asp109和Glu107相互作用的R2取代都会改善吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-胺母核的铰链结合，增加结合活性。仅结合一个氨基酸残基（尤其是Asp109）的R2取代基结合活性降低，可能是由于母核与铰链残基Cys106的相互作用较弱或较短暂。在评估R2不同片段后，发现（S, S）-二氨基环戊烷系列最佳。接下来评估吡唑并嘧啶母核5位不同R1取代基团（如表2所示）。根据晶体结构分析，这些片段将指向由Leu156侧链，与CDK9/cyclin T1蛋白形成疏水作用。公司采用最小药效基团方法并逐渐扩大化合物20的异丙基。首先测试了单甲基延伸，2-丁基化合物27增强效力，IC50为10nM。3-戊基28结合活性进一步增强达到6nM。CDK激酶组筛选证明与其他CDK激酶相比，该化合物对CDK9具有≥66倍的选择性。3-氯取代化合物29并未表现出针对CDK9显著改善活性。接下来，评估芳基R1基团，发现邻位取代，尤其是较小的基团，如甲基（32）可以维持与化合物28相似的效力和整体选择性。氟化甲基化合物33对CDK9的结合活性IC50为9 nM，并且表现高选择性，对CDK9的选择性是其他测试CDK激酶的233倍以上。与氟化物33相比，改用氯取代（34）保持CDK9效力，但丧失了对CDK4和CDK7的选择性。鉴于CDK9效力和CDK亚型选择性，选择基于化合物28进一步优化。二氨基环戊烷立体化学要求如表3所示进行评估，显示（S, S）构型是最有效的构型。然后对每种异构体进行选择性分析。表4说明了测试的CDKs中化合物28的选择性，具体如表4所示。Kronos Bio公司将四种异构体对接到CDK9的ATP竞争性结合口袋中，其中（S,S）构型在能量上最受青睐（如Fig2所示）。化合物28与CDK9/cyclin T1的共晶结构（PDB:8K5R）证实了配体结合如模型预测一样（如Fig3所示）。化合物28的氨基-吡唑并嘧啶母核与ATP竞争性结合口袋的铰链区Cys106结合，二氨基环戊烷的末端胺与Asp109形成氢键相互作用。3-戊基指向由Leu156侧链形成的疏水作用。化合物28在631种激酶（375种野生型、232种突变型和24种非典型激酶）的激酶组中筛选发现，与SMM筛选得到的化合物1相比，化合物28保留了选择性，对CDK9/cyclin T1显示出更强的效力，对所有分析的CDKs选择性超过66倍，对CDK1、3、4的选择性超过100倍。使用TNBC细胞培养模型，利用荧光标记抗体和高内涵荧光成像来测量细胞增殖和凋亡，对化合物28的细胞活性进行体外评估。发现化合物28可抑制细胞生长，在测试的TNBC细胞系中显示出细胞抑制（GI50值范围为530nM至1μM）和细胞毒性（IC50值范围为600nM至1.2μM）。值得注意的是，化合物28在5个测试细胞系中的4个中有效诱导细胞凋亡（如表5所示）。此外评估了化合物28的化学性质和ADME性质（如表6所示）。该化合物在2、10和50μM浓度的Caco-2测定中表现良好的渗透性，流出比范围1.48至1.85。对CYP450酶的抑制表明均不抑制。化合物28在小鼠、大鼠、犬和人微粒体中表现出低的体内清除率。在肝细胞中表现出低至中等的清除率，导致这些测定的t1/2≥2小时。在小鼠和人血浆蛋白测定中表现出高游离分数，并且在所有测试物种的血浆中稳定性超过360分钟。与其良好的理化和体外ADME特征一致，化合物28在小鼠、大鼠和犬中表现出良好的总体PK特性（如表7所示）。静脉给药后的血浆T1/2，小鼠为1.2h，大鼠未2.4h，犬为4.7h。在所有临床前物种中，相对于肝血流量，血浆清除率低至中等。表观稳态分布容积（Vd, ss）在不同物种之间略有差异，范围从小鼠的3.9L/kg到大鼠的7.3 L/kg。化合物28表现出可口服。结合体内外推法和异速生长方法来预测人体PK参数。基于70kg体重，平均预测人血浆清除率（CL）和Vd, ss分别为2.0mL/min/kg和6.0L/kg假设单室药代动力学，估计终末半衰期为35小时（半衰期=[ln 2]×Vss/CL）。来自非临床物种的预测人口服生物利用度为75%。当在临床中探索剂量递增至药理学活性剂量时，预计的长血浆半衰期应使化合物28能够实现持续暴露，同时避免出现高峰 (Cmax) 浓度（如Fig4所示）。接下来评估化合物28在MYC扩增的TNBC患者来源的异种移植模型（PDX）中对体内肿瘤生长的药效（PD）影响。为了评估化合物28的靶向PD，检测了MYC水平和RNA聚合酶II Ser2磷酸化水平作为异种移植肿瘤样本中CDK9活性的下游指标。化合物28终末剂量2小时后，MYC和pSER2均显著降低，而化合物28的血浆浓度仍然很高（如Fig5所示）。携带已建立的皮下PDX肿瘤无胸腺Nude-Foxn1nu小鼠接受对照、标准化疗药物或化合物28治疗。在所有模型中均观察到化合物28的肿瘤生长抑制，其中两种CTG-1017和CTG-0437模型的化合物28肿瘤生长抑制与SOC相比，靶向PD效果与显著的体内抗肿瘤效果相对应（如Fig6所示）。从发现苗头化合物1开始，使用基于结构的药物设计方法对SMM筛选命中的优化，从而发现了临床候选物28 (KB-0742)，这是一种有效的、选择性的、可口服的CDK9抑制剂。化合物28在TNBC小鼠异种移植模型中表现出体内抗肿瘤活性。在体外，化合物28以浓度依赖性方式降低肿瘤裂解物中的 MYC和pSER2，并在降低这些PD标志物水平的相同剂量下显着抑制体内肿瘤生长。此外，化合物28的aPK曲线预测人体持续暴露有利于临床上有效的口服给药。目前化合物28已经开展针对复发性或难治性实体瘤或非霍奇金淋巴瘤患者的I/II期剂量递增和扩展临床试验（NCT04718675）。文章来源10.1021/acs.jmedchem.3c01233请点击此处链接观看CyberSAR系统详细使用教程1.药渡CyberSAR结合药物设计思想，挖掘了文献及专利报道的活性的结构，通过CyberSAR以方便快速获得研发人员兴趣靶向结构，以供开拓思路，就CDK9抑制剂举例如下：2.在靶点界面选中“化学空间”选项标签下级联“聚类结构视图”选项卡，可以将CyberSAR平台收录的文献和专利具有关于CDK9/cyclin T1相关实验测试活性的分子以“母核结构聚类 “的形式展示。其中绿色字体高亮的”为文献报道的体外酶、细胞活性测试实验中IC50<100nM的活性分子结构、具体实验、实验结果及实验来源。3.在靶点界面选中“化学空间”选项标签下级联“原始结构视图”选项卡，可以将CyberSAR平台收录的文献具有关于CDK9/cyclin1相关实验测试活性的分子以“研发阶段时光轴“的形式展示。其中绿色字体高亮的”数据挖掘“即为潜力Hit。登录方式CyberSAR在电脑浏览器端登录网址：https://data.pharmacodia.com/cybersar/，欢迎猛烈试用。请点击此处链接观看CyberSAR系统详细使用教程如需进一步沟通，请扫码添加微信联系药渡赵博士或药渡CyberSAR沟通群。