miR-122

摘要：RNA分子的生产、修饰和细胞传递方面的最新进展促进了基于RNA的治疗学的扩展。对RNA生物学的不断深入理解也引发了RNA治疗学的相应增长。在这篇综述中，将讨论五类基于RNA的治疗学的一般概念，包括基于RNA干扰的疗法、反义寡核苷酸、小激活RNA疗法、环状RNA疗法和基于信使RNA的治疗学。此外，我们还提供了已经获得监管批准或目前正在临床试验中评估的基于RNA的治疗学的概述，以及这些技术面临的挑战。基于RNA的药物在临床试验中显示出积极的结果，并有能力解决以前“无法成药”的靶点，这为实现其全部临床潜力提供了巨大的希望，作为一种颠覆性的治疗技术。 1.  引言 从1961年发现信使RNA（mRNA）到2021年首个mRNA疫苗获批上市，已经过去了60年。在这60年的时间里，RNA领域发生了巨大的发展。1977年，Roberts和Sharp发现了RNA剪接，并因此获得了1993年的诺贝尔生理学或医学奖。1982年，Cech发现了四膜虫RNA的自剪接核酸酶，并与Altman共同获得了1989年的诺贝尔化学奖，因为他们的发现。这一发现为RNA领域翻开了新的一页，RNA分子被公认为具有复制和催化双重功能的生物分子。1993年，Ambros发现了第一个微小RNA（miRNA）; 1998年，Fire和Mello发现了RNA干扰（RNAi）现象，并获得了2006年的诺贝尔生理学或医学奖。RNAi成为了基因功能研究的重要工具，20年后，首个RNAi药物成功获批上市。1999年，Ramakrishnan、Steitz和Yonath完成了核糖体晶体结构，证明了核糖体作为一种核酸酶，并因此获得了2009年的诺贝尔化学奖。2011年，Charpentier和Doudna发现了CRISPR基因编辑技术，并因此获得了2020年的诺贝尔化学奖，揭示了sgRNA引导的DNA切割作为关键的基因治疗工具。RNA分子短短60年的历史产生了五个与RNA科学发现相关的诺贝尔奖，这突显了它在化学和生物领域的重要性，并强调了它作为一种不可替代的技术，将彻底改变医学。 基于RNA的药物主要分为两大类：（i）通过化学方法合成的寡核苷酸药物，如反义寡核苷酸（ASOs）、siRNAs（小干扰RNA）和RNA适体；（ii）通过体外转录合成的大分子RNA药物，如mRNA药物。全球近108种寡核苷酸药物进入临床管道，包括ASOs、siRNAs、适体、单导向RNA（sgRNAs）和miRNAs。此外，全球还有56种mRNA药物也进入临床管道。截至本文撰写之日，全球共有16种核酸药物获批上市，见表1。随着Biogen和Ionis开发的Nusinersen的推出，世界上首个治疗脊髓性肌肉萎缩症（SMA）的寡核苷酸药物出现，目前是销售额最高的寡核苷酸药物。 表1 全球上市的基于RNA的药物 由于大分子结构和负电荷，寡核苷酸药物容易被核糖核酸酶降解，难以穿透细胞膜，2008年至2013年因安全问题和递送系统问题而陷入低谷。药物递送在保护RNA结构、增加靶向能力、降低给药剂量和减少毒副作用方面起着至关重要的作用。随着关键递送系统的技术突破，寡核苷酸药物行业迎来了蓬勃发展。RNAi治疗是治疗遗传疾病和“无法成药”靶点的重要策略。siRNA和miRNA是有意义的基因沉默工具；四种siRNA药物候选已经获批，然而许多miRNA药物大多因安全问题而终止，只有五个候选药物继续进入临床开发，没有一个进入III期临床试验。siRNA和miRNA药物之间最大的区别是它们的作用机制。siRNAs是完全互补的靶向基因沉默序列，进入体内作用于特定的目标基因。相比之下，一个miRNA可以调节成百上千个基因，一个基因也可以被许多不同的miRNAs调节。因此，很难指定miRNA来调节一个特定的基因，并可能导致意想不到的副作用。只有解决miRNA药物的特异性问题，miRNA才能在临床环境中应用。 作为一种具有巨大潜力的技术平台，基于mRNA的治疗可用于传染病预防、肿瘤免疫治疗、蛋白质替代治疗，甚至基因编辑。mRNA的治疗途径可分为三类：预防性疫苗、治疗性疫苗和治疗药物。Pfizer和BioNTech开发的Comirnaty，以及Moderna开发的Spikevax，分别于2020年12月获得美国食品药品监督管理局（FDA）的紧急使用授权，以预防由SARS-CoV-2引起的COVID-19。2021年，Comirnaty和Spikevax的销售额分别达到368亿美元和177亿美元。这两种疫苗在全球大流行病的预防中大放异彩，标志着mRNA技术正式进入商业化时代。 RNA分子长期以来被认为在细胞过程中发挥着重要作用，从基因调控和表达到酶促反应。RNA治疗学是一个迅速扩大的药物和治疗类别，从实验室到临床实践的速度前所未有。最初认为RNA分子由于其不稳定性和相对较短的半衰期，将是一种较差的治疗剂。然而，随着稳定化学的进步和对其瞬时特性的应用，RNA分子作为治疗剂在临床上显示出价值。在这里，我们简要回顾了五类基于RNA的治疗：（i）基于RNAi的治疗，（ii）ASO治疗，（iii）小激活RNA（saRNA）治疗，（iv）环状RNA（circRNA）治疗，和（v）基于mRNA的治疗，以及其在后期临床开发中的药物候选。有数百种寡核苷酸和mRNA药物候选正在进行发现和临床前开发，目前有超过150种寡核苷酸药物和mRNA治疗正在进行临床试验。2018年和2020年是RNAi和mRNA领域的里程碑，因为基于RNA的治疗获批上市。随着更多的RNA治疗正在开发中，RNA基础治疗的未来是光明的。 2.  RNAi基治疗 近几十年来，小非编码RNA的发现及其在基因调控中的作用彻底改变了RNA生物学领域。RNAi最初由Andrew Fire和Craig Mello描述，他们因对RNAi的贡献而获得了诺贝尔生理学或医学奖。他们在秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)中发现了由外源RNA介导的基因沉默机制。像siRNA这样的小非编码RNA形成称为RNA诱导的沉默复合体(RISC)的复合物，它指导目标信使RNA(mRNA)的降解，如图1所示。RNAi的转录后基因沉默机制使其成为通过抑制基因的特定碱基序列来控制基因表达的强大工具，彻底改变了药物的发现和开发。 图1 siRNA生物生成的示意图，用于沉默目标mRNA。siRNA前体是一个双链RNA，可以由病毒、转座子或其他来源在内源或外源产生。前体被酶切割，以便正确装载Argonaute蛋白，并由一个双链RNA结合蛋白协助，这允许导向链与Argonaute结合，随后乘客链被排出。最后，沉默活动可以通过目标结合和切割发生。 鉴于RNAi的特异性和效力，许多基于RNAi的策略已经开发出来用于治疗目的，包括siRNA和miRNA治疗，它们在临床试验中作为医疗干预药物显示出有希望的结果。截至2021年底，已有四种RNAi药物获得欧洲委员会(EC)和FDA的批准和授权，为RNAi治疗的有效性和安全性提供了概念验证。siRNA和miRNA治疗的作用机制及其候选药物的例子将在讨论中。 3.  siRNA治疗 2018年，美国FDA和欧洲药品管理局(EMA)批准了patisiran(ONPATTRO; Alnylam Pharmaceuticals)，这是一种siRNA药物，用于治疗由遗传性转甲状腺素(hATTR)淀粉样变性引起的多发性神经病变的成年患者。这种siRNA药物是首个获批的基于RNAi的治疗药物，标志着RNAi治疗的新时代。目前，已有四种siRNA药物获批上市，还有许多正在进行临床试验，如表2所示。 表2 已批准上市或正在进行/已完成2期和3期临床试验的代表性siRNA药物列表 siRNA属于dsRNA类分子。顾名思义，siRNA的长度很短，大约为18到25个核苷酸(nt)，每个链的3'端有无两个悬出的磷酸化碱基。siRNA治疗的机制利用了其自然能力，即通过Argonaute 2(Ago2)的催化域切割完全互补的mRNA的特定序列。设计成模仿Dicer切割的合成siRNA，称为"Dicer-ready" siRNA，可以被传递到感兴趣的细胞并直接被Ago2-RISC复合物识别和装载，使其作为药物特别有吸引力。通过设计所需效力和特异性的siRNA序列针对目标mRNA，可以沉默疾病引起的mRNA。 最新获批用于治疗ASCVD和HeFH的siRNA药物inclisiran(LEQVIO; Novartis)，是一种首创的N-乙酰半乳糖胺(GalNac)修饰的siRNA共轭物，显示出显著降低血浆胆固醇水平。动脉粥样硬化被描述为一种慢性动脉炎症性疾病，导致慢性斑块积聚阻塞血管，导致狭窄和组织缺氧，是ASCVD的主要原因。动脉粥样硬化的发病机制复杂; 然而，已知它与增加的低密度脂蛋白胆固醇(LDL-c)水平有关。Inclisiran针对前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/半胱氨酸蛋白酶9型(PCSK9)的mRNA; PCSK9是一种与LDL受体(LDLR)结合的丝氨酸蛋白酶，调节胆固醇和细胞质载脂蛋白B(ApoB)，发现它增加了血浆LDL浓度。通过抑制PCSK9的产生，降低的PCSK9 mRNA表达减少了LDLR的降解，并增加了LDL的摄取，以降低LDL-c的浓度。 2期和3期临床试验显示了inclisiran在ASCVD和HeFH患者中的有希望的结果。ORION-9试验(NCT标识符：NCT033907121)招募了482名HeFH患者; ORION-10试验(NCT标识符：NCT03399370)在1561名ASCVD患者中进行; ORION-11试验(NCT标识符：NCT03400800)招募了1617名ASCVD或其风险等价物患者。在这些3期试验中，患者在第1天、第90天、第270天和第450天接受了1.5毫升皮下注射，注射了284毫克的inclisiran(相当于300毫克的inclisiran钠)。 所有3期研究报告说已经达到了他们的主要疗效终点。上述三项随机临床试验(RCT)的汇总分析显示，与安慰剂组相比，每年两次剂量的LDL-c总体降低了51%，并将主要不良心血管事件率降低了24%。此外，发现inclisiran降低了总胆固醇、ApoB和非高密度脂蛋白胆固醇水平。因此，inclisiran通过每年两次剂量抑制肝脏PCSK9的产生，有效降低LDL-c水平，并维持这种效果。 除了inclisiran的疗效外，其安全性同样可接受。三项RCT的安全性概况与之前的研究一致，并且没有与异常肝功能、肌酸激酶水平和血小板计数相关。与安慰剂相比，注射部位不良事件在使用inclisiran时报告得更频繁。尽管inclisiran的表现显示出LDL-c和PSCK9水平的显著降低，但另一项三项研究的荟萃分析观察到，在心肌梗死风险方面，使用inclisiran的患者与安慰剂相比没有统计学上的显著差异。总体而言，inclisiran通过每年两次剂量抑制肝脏PCSK9的产生，显著降低LDL-c水平，同时展现出理想的安全性概况。inclisiran及其前驱siRNA药物的成功展示了siRNA导向的RNAi治疗的有希望的未来。这也是第一个用于治疗常见慢性病的小核酸药物。 4.  miRNA治疗 miRNA治疗作为一种治疗不同疾病的新型治疗剂，因其在发育中的作用而开始出现。如前所述，miRNA和siRNA都是能够通过转录后基因沉默靶向mRNA的小双链RNA分子。然而，它们的生物合成和作用机制不同。miRNA的生物合成始于核内，其基因转录受到严格调控，如图2所示。miRNA双链——由处理过的pri-miRNA产生的结果——与RISC结合形成miRISC，由成熟的miRNA引导进行目标识别。与siRNA不同，miRNA通过部分互补碱基配对与目标mRNA结合，抑制mRNA翻译而不是目标mRNA的裂解。 图2 miRNA生物生成和作用机制的示意图。前体miRNA（pre-miRNA）由位于细胞核中的初级miRNA（pri-miRNA）产生，它由末端环和不匹配组成。pre-miRNA进入细胞质，由Dicer酶切割末端环，生成miRNA双链。随后的过程与siRNA的生物生成相似，其中RISC与其RNA双链形成，并装载到Argonaute上进行链的选择。最后，成熟的miRNA准备就绪，可以与目标mRNA结合并促进其降解。 miRNA治疗的应用有两种方法：miRNA抑制和miRNA替代。miRNA抑制利用合成的单链RNA类似物，与目标miRNA的活性链互补，并作为miRNA拮抗剂(也称为anti-miRs或antagomiRs)抑制内源性miRNA，这在结构上类似于反义寡核苷酸。Anti-miRs最初由Krützfeldt等人描述，其中这些化学修饰的、胆固醇结合的、与目标miRNA互补的寡核苷酸的静脉注射降低了小鼠中miR-16、miR-122、miR-192和miR-194的水平。后一种方法采用合成miRNA(也称为miRNA模拟物)来模拟目标miRNA的功能，促使mRNA抑制。 miRNA模拟物可以像化学修饰的siRNA一样使用，具有与目标miRNA相同的导向链，它们被装载到RISC上以抑制下游内源性miRNA。由于其与典型miRNA的相似性，miRNA模拟物可能作为癌症管理的治疗剂，因为肿瘤抑制miRNA在癌症发展中的作用。然而，miRNA模拟剂的传递仍然存在挑战。 miRNA治疗的出现尚未转化为医疗干预的批准药物候选。迄今为止，有几种miRNA分子正在进行临床试验。然而，没有进入3期试验。目前，Regulus和Genzyme(Sanofi)开发的lademirsen(RG-012)正在进行2期试验的患者招募(NCT标识符：NCT02855268)。Lademirsen是一种anti-miR药物候选物，通过皮下给药来沉默Alport综合征患者的microRNA-21(miR-21)的功能。Alport综合征是一种X连锁遗传疾病，其特征是由胶原蛋白IV基因突变引起的慢性肾病。Gomez等人的临床前研究发现，化学修饰的anti-miR-21寡核苷酸与磷酸硫酯键和修饰的糖单元增强了对miR-21的亲和力，并改善了Alport神经病变小鼠模型的生存率。关于lademirsen的临床数据在本次审查时尚未发布。 除了lademirsen的临床开发外，MiRagen Therapeutics(现为Viridian Therapeutics)开发的remlarsen(MRG-201)已完成2期试验，用于治疗瘢痕疙瘩患者(NCT标识符：NCT03601052)。Remlarsen是一种microRNA-29(miR-29)模拟物，旨在治疗病理性纤维化。miR-29家族被发现在纤维化调节途径中发挥作用，其中miR-29的表达水平在纤维化疾病中较低。Remlarsen模拟miR-29以抑制纤维化的形成，如皮肤纤维化。Gallant-Behm等人的研究总结了在健康志愿者中皮下给药的remlarsen的1期临床数据，该药物候选物减少了切口皮肤伤口中的胶原蛋白表达和纤维母细胞增生的发展。此外，该候选物在1期研究中所有研究剂量中被认为是安全且耐受性良好的。1期结果表明，remlarsen可能是预防皮肤纤维化的有效的治疗；然而，尚未发布的2期临床结果在有瘢痕疙瘩病史的患者中可能具有更重大的临床意义。尽管miRNA药物有大量的临床前研究，但只有少数miRNA药物候选物进入临床开发，50%的miRNA药物在临床开发阶段经历了终止或暂停。在开发miRNA药物候选物时面临挑战，例如确定不同疾病特定的miRNA靶标及其精确传递，同时避免进入细胞时的降解。 RNAi基治疗，如siRNA和miRNA治疗，是一个不断发展的领域，对许多疾病具有巨大的治疗前景。RNAi药物面临一些挑战，如内体逃逸和传递到非肝脏和非肾脏组织。尽管目前只有四种siRNA治疗获得了监管批准，但预计不久的将来会有更多的siRNA治疗出现。RNAi治疗提供的广泛的临床应用和安全性概况加强了其潜力。 5.  反义寡核苷酸治疗 1978年，Zamecnik和Stephenson利用与Rous肉瘤病毒目标序列互补的13个核苷酸长的反义寡核苷酸（ASO），在体外展示了病毒复制的抑制，这为ASO作为治疗手段的潜力打开了大门。自这一发现以来，寡核苷酸药物的开发取得了显著进展。ASO是短的单链且高度修饰的核酸类似物，旨在针对特定序列的RNA进行降解。如图3所示，ASO有几种作用机制。目标RNA通常是核内的前体mRNA（pre-mRNA），ASO与多聚腺苷酸识别位点结合，利用核糖核酸酶（RNase）H阻止多聚腺苷酸化；ASO也可以结合到细胞质中mRNA的翻译起始位点，以抑制翻译。 图3 ASO作用机制的示意图。A. 细胞质中的ASO与目标RNA结合，导致RNase H切割，引发目标mRNA降解。B. 细胞质中的ASO也可以结合到mRNA上，阻止RNA结合蛋白复合体的结合，抑制目标mRNA的翻译。C. ASO可以进入细胞核，通过结合并阻断剪接位点或外显子/内含子序列来调节剪接，这些可以通过核糖核蛋白(RNP)复合体催化，以跳过或包含目标外显子。 ASO的化学修饰对其作为治疗药物的转化至关重要，这有助于提高稳定性、特异性并减少不良反应。通常，ASO在两个修饰的2'糖的两个侧翼区域之间具有磷酸硫（PS）键，形成骨架。PS部分保护寡核苷酸不受外切酶的降解并提高稳定性。这种设计呈现了一个中心PS寡核苷酸间隙，赋予了“gapmer”的名称，当RNA-DNA双链形成时，可以激活RNase H1对目标RNA进行切割。此外，磷酸二胺吗啉寡核苷酸（PMOs）的修饰也在ASO中广泛使用，其中六元的吗啉环取代了五元的核糖呋喃糖，骨架通过磷酸二胺连接。这种修饰也稳定了PMO对抗核酸酶的能力，但最小化了对互补目标RNA亲和力的降低。此外，另一种ASO的设计是RNase H独立或仅占用途径，其设计为空间上的障碍，以空间上抑制或防止目标RNA的翻译或剪接。一些ASO药物已经获得了FDA和EMA的批准，如表3所示。迄今为止，已有九种基于ASO的药物获得批准，用于商业用途，所有这些药物都治疗罕见疾病。然而，目前正在开发的ASO显示出ASO平台的应用正在向治疗其他常见病迈进。 表3 已批准上市或正在进行/已完成3期临床试验的代表性反义寡核苷酸药物列表 最近获批的基于ASO的药物casimersen获得了美国FDA的加速批准，用于治疗杜氏肌营养不良症（DMD）。DMD是一种X连锁隐性退行性神经肌肉疾病，由DMD基因中的移码或无义突变引起，该基因编码肌营养不良蛋白，这些突变抑制了功能性肌营养不良蛋白的产生。Casimersen利用基于PMO的策略，引起DMD基因中第45个外显子的跳跃，以绕过移码突变，允许内部截断但部分功能性肌营养不良蛋白的产生。在其1/2期研究中，PMO药物候选物在DMD患者中耐受性良好，适合进行第45个外显子跳跃。3期ESSENCE试验（NCT标识符：NCT02500381）的中期结果显示，所有可评估的接受casimersen的患者都显示出第45个外显子跳跃的增加；然而，由于其样本量小和正在进行的3期ESSENCE试验，很难确定casimersen改善运动功能的能力。开发ASO基药物以治疗神经肌肉疾病的剩余挑战是ASO在肌肉组织中的分布和摄取不足。除了罕见疾病，心血管疾病也是ASO的目标领域。与siRNA治疗类似，ASO药物候选物也在开发中，用于治疗心血管疾病。Pelacarsen是一种首创的GalNAc结合PS ASO，它针对载脂蛋白(a)（apo(a)）的mRNA，使用RNase H1依赖性切割。脂蛋白(a)（Lp(a)）是一种含有ApoB和apo(a)的LDL样脂蛋白，通过二硫键连接，已发现与心血管疾病风险增加有关。在其2期研究（NCT标识符：NCT03070782）中，对286名已建立心血管疾病和增加Lp(a)水平的患者，Tsimikas等人观察到通过皮下给药pelacarsen后，Lp(a)水平剂量依赖性降低了35至80%，并具有良好的安全性概况。鉴于pelacarsen在2期研究中取得了有希望的结果，心血管疾病的ASO药物候选物正在进行3期临床试验（NCT标识符：NCT04023552）。反义技术的进步推动了ASO的发展，证明了基于ASO的药物是一种多功能且安全的治疗方法。大量治疗更常见疾病的ASO候选物正处于晚期临床开发阶段，这将在不久的将来产生有意义的结果。ASO需要克服一些现有的挑战，以扩大其临床应用，例如有效靶向传递到其他组织并减少在其他器官的非靶向积累。随着新型传递平台的发展，ASO治疗更常见疾病的前景是乐观的。 6.  小激活RNA治疗 小双链RNA家族还包括小激活RNA（saRNA），首次由Li等人和Janowski等人报道。研究人员发现，这些21个核苷酸长的双链RNA靶向特定基因启动子，诱导了基因转录激活，并被命名为RNA激活（RNAa）。这两项研究描述了由小双链RNA介导的基因表达诱导的自然现象。Li等人描述了设计的21个核苷酸长的双链RNA与E-钙粘蛋白、p21和VEGF（血管内皮生长因子）基因的启动子区域互补，以序列特异性方式诱导基因表达，并依赖于Ago2，类似于RNAi。Janowski等人展示了通过互补双链RNA靶向其启动子区域诱导孕激素受体表达。此外，RNAa已被证明在多种哺乳动物细胞中保守。RNAi和RNAa在分子机制上存在相似之处，如图4所示。在RNAa中，saRNA被装载到Ago2蛋白中，形成RNA诱导的转录激活（RITA）复合物。RITA复合物由saRNA/Ago2复合物、RNA解旋酶A和与RNA聚合酶相关的蛋白CTR9组成，与RNA Pol II相互作用，触发转录启动和有效的延伸。RNAa在其分子动力学、基因组靶向能力和激活核内目标基因转录延伸方面具有独特性。 图4 saRNA作用机制的示意图。引入的saRNA被装载到Ago2蛋白中，随后Ago2切割链选择形成saRNA/Ago2复合物，并被转运到细胞核。活性的RITA复合物目标并结合到基因组目标位点的启动子区域，并与RHA和CTR9结合，通过RNA聚合酶II（RNAP II）介导的转录活性。 RNAa的发现以及saRNA的作用为选择性基因激活研究提供了新的见解。此外，saRNA本身作为上调基因表达的新型治疗方式，在具有抑制性转录或翻译活性的疾病中提供了新的可能性。开发saRNA作为治疗药物有几个优点，包括低免疫原性和位点特异性基因转录激活；然而，其缺点，如对RNase降解敏感性和非靶向效应，也是关键的挑战。目前，几个saRNA药物候选物正在开发中，如表4所示。尽管大多数候选物仍处于临床前阶段，但MiNA Therapeutics开发的MTL-CEBPA已经进入2期，与蛋白激酶抑制剂索拉非尼联合治疗乙型或丙型肝炎感染的晚期肝细胞癌（HCC）患者（NCT标识符：NCT04710641）。 表4 临床开发中的代表性小激活RNA治疗候选药物列表 MTL-CEBPA是一种首创的saRNA寡核苷酸，具有2′-O-Me修饰，由SMARTICLES脂质体纳米粒子封装，并通过静脉注射给药，治疗HCC患者。转录因子C/EBP-a是一种亮氨酸拉链蛋白，通过与髓系基因的启动子区域结合，启动并激活髓系基因表达，已知与肝细胞调节相关。在小鼠肿瘤模型中，研究人员发现髓系来源的抑制细胞中C/EBP-a的下调；C/EBP-a的上调抑制了肝癌小鼠模型中的肿瘤生长。MTL-CEBPA旨在通过诱导CEBPA基因的转录来上调C/EBP-a。在与肝硬化、非酒精性脂肪性肝炎或肝转移相关的HCC患者中进行的MTL-CEBPA首次人体1期研究结果显示，saRNA药物候选物的安全性概况可接受，建议的初始剂量为130 mg m−2，并通过其药效学分析显示了目标参与。然而，其疗效概况有限：在24名可评估MTL-CEBPA单药疗效的患者中，只有1名患者观察到客观的肿瘤反应和部分反应。在7名患者中使用酪氨酸激酶抑制剂（索拉非尼、lenvatinib或regorafenib）治疗，观察到3名完全反应，2名病情稳定，1名部分反应。1期研究得出结论，MTL-CEBPA对HCC的预处理有助于为酪氨酸激酶抑制剂，如索拉非尼的治疗效应创造更易接受的肿瘤微环境。 除了2期的MTL-CEBPA加索拉非尼外，MiNA Therapeutics还在开发MTL-CEBPA与PD1检查点抑制剂pembrolizumab联合治疗晚期实体瘤患者，已进入1期（NCT标识符：NCT04105335）。 尽管MTL-CEBPA的1期临床结果有希望，但这种新型寡核苷酸治疗方式仍存在不确定性和挑战。在目标序列识别方面仍缺乏明确的机制理解；当涉及额外的DNA元素时，目标基因组的可访问性也不清楚。 7.  环状RNA治疗 除了前述的RNA治疗方法外，另一种新兴的RNA治疗因其显著的研究进展而受到关注。环状RNA（circRNA）是一类具有环状结构的非编码RNA，它们没有末端结构，例如5'帽和3'聚(A)尾部，主要存在于真核细胞中。1976年，Sanger等人首次在类病毒中发现circRNA，现在通过RNA测序发现circRNA在众多物种中高度保守。由于circRNA的环状特性，它们的稳定性可能优于线性RNA，因为它们能够抵抗各种RNA外切酶的降解。此外，Wesselhoeft等人证明了外源性circRNA的蛋白表达比未修饰和修饰的线性RNA持续时间更长。因此，鉴于它们的稳定性和在真核细胞中表达时无需修饰，circRNA为医学应用提供了有希望的应用前景。 与大多数线性RNA不同，circRNA的生物生成涉及外显子的反向剪接，通过共价键将下游的“尾部”（3'）连接到上游的“头部”（5'）。这种共价键的形成使circRNA具有自然能力，能够抵抗主要的RNA降解途径。鉴于circRNA的异常稳定性，其调控和周转在管理其丰度方面非常重要。最近，更多的研究阐明了circRNA的周转机制，其中特定的circRNA，如CDR1as，可以通过完全互补的miRNA结合，然后通过Ago2介导的切割来降解；响应病毒感染的RNase L也可以降解circRNA；高度结构化的circRNA可以通过结构介导的RNA降解来调节。也就是说，需要额外的研究来确定circRNA的分子途径。 与其他RNA治疗方法一样，circRNA作为调节基因表达或携带模块化效应的潜在治疗方法而出现。合成的circRNA已被成功地证明在真核细胞中具有强大且稳定的翻译。Wesselhoeft等人设计了自剪接的前体RNA，使用间隔序列优化了圆环化效率，并能够圆环化长达5 kb的各种长度的RNA。经过工程化的高效液相色谱（HPLC）纯化的circRNA发现，与对照组相比，其翻译效率高达97%。此外，这种纯化的circRNA可以逃避细胞RNA传感器，如Toll样受体和RIG-I，同时提供比未纯化的circRNA更稳定的蛋白表达。此外，circRNA也可以与LNP配制而成，以实现在小鼠和恒河猴中有效的体内传递和翻译。最近，Qu等人展示了一种针对SARS-CoV-2的circRNA疫苗，编码了三聚体RBD的刺突蛋白，为动物提供了足够的保护。此外，他们还展示了使用合成circRNA表达SARS-CoV-2中和抗体和hACE2诱饵来中和假病毒颗粒。 最后，工程化circRNA的另一个应用是RNA编辑，其中循环ADAR招募RNA被用来招募本地ADAR1或ADAR2酶，将特定的腺苷碱基改变为肌苷，以执行精确的内源性RNA编辑。除了工程化circRNA外，circRNA治疗的另一种方法是利用基于circRNA的适体，其中一种名为Tornado（twister优化的RNA，用于持久过表达）的表达系统执行RNA圆环化，并产生能够结合蛋白的RNA适体。尽管在circRNA的研究和应用方面取得了显著进展，但大多数候选物目前仍处于发现阶段或临床前开发阶段。截至本文撰写之日，尚无circRNA治疗候选物进入临床试验。circRNA提供了几种有希望的医学和研究应用，从治疗药物和蛋白替代疗法到预防性疫苗。还应注意，circRNA的另一种潜在治疗方法是使用其他方法（如CRISPR-Cas9或siRNA）调节本native circRNA，以及使用本native circRNA进行生物标记或海绵治疗各种疾病，包括癌症、心血管疾病和神经系统疾病。最后，开发合成circRNA作为治疗剂仍存在许多挑战，例如控制circRNA的表达水平以避免由于其异常稳定性而持续过度表达，大规模生产高纯度的人工circRNA，以及circRNA的靶向传递。因此，进一步的研究伴随着临床研究可能解决和克服这些挑战。尽管如此，从线性RNA治疗方法（如基于mRNA的治疗方法）中获得的理解可以转化为基于circRNA的治疗方法，并为开发circRNA作为治疗剂提供宝贵的见解。 8.  基于信使RNA的治疗 与前面描述的RNA不同，信使RNA（mRNA）是一种生命的关键分子，是一种与DNA反义链互补的单链RNA。顾名思义，mRNA是细胞核中编码蛋白质的DNA翻译和细胞质中蛋白质生产之间的信使。鉴于mRNA在作为分子生物学中心法则中介的蛋白质生产中的关键作用，为这一类新药开发了几种治疗策略，包括基于mRNA的疫苗和mRNA替代疗法。Wolff等人首次描述了在动物中成功引入体外转录（IVT）mRNA。在过去十年中，该领域取得了显著进展，使mRNA治疗成为治疗传染病和癌症等疾病的有希望的模式。 基于mRNA的治疗方法具有许多优势，例如相对较低的插入突变风险，以及在功能性方面无需进入细胞核。此外，mRNA的短暂性质为在需要时更临时地表达蛋白质提供了好处。通过将化学修饰的mRNA引入细胞的细胞质中，可以表达遗传疾病中减少或抑制的蛋白质，以类似于天然蛋白质的方式。此外，这种mRNA也可以用作预防性疫苗，在这种情况下，mRNA可以编码特定的外来抗原，以引发针对传染病的保护性免疫；或者作为治疗性疫苗，以启动免疫系统刺激细胞介导的反应，以靶向肿瘤。 8.1.  mRNA疫苗 疫苗接种预防疾病，是防止传染病传播最有效的公共卫生干预措施之一。疫苗的广泛使用导致了许多传染病的完全根除，并减少了全世界脊髓灰质炎、麻疹和其他疾病的发病率。在过去的几个世纪里，疫苗学随着传统疫苗方法的出现而发展，如减毒活疫苗和灭活疫苗，为一系列疾病提供了持久的保护。尽管传统疫苗方法取得了进展，但在疫苗开发中仍存在挑战，以满足当前的医疗需求，如新出现的传染病病原体具有更好的能力来逃避适应性免疫反应或需求细胞免疫反应。此外，面对新出现的病毒，有必要采用能够快速开发和大规模生产并具有理想特性以广泛分发的疫苗方法。 还需要针对非传染病的疫苗，传统疫苗方法可能不适用。因此，开发更具适应性和效力的疫苗平台至关重要。最近在mRNA疫苗方面的进展，如mRNA序列工程、大规模生产开发和有效的传递方法，进一步加速了该疫苗平台的开发。 9.  预防性疫苗 如前所述，mRNA疫苗可用于预防性或治疗性目的。mRNA设计、制造和传递方法的最新进展使mRNA疫苗成为传统方法的有吸引力的替代品。对于预防性目的，合成的mRNA编码抗原被传递到细胞质中，一旦表达，就能在不穿越核膜屏障的情况下引发免疫反应，如图5所示。有两种主要类型的体外转录（IVT）mRNA，它们都模仿内源mRNA结构：非复制型mRNA和自增强型mRNA。前者结构包括5'帽、5'非翻译区（UTR）、编码抗原的开放阅读框、3'UTR和聚A尾部；自增强型mRNA还包含病毒复制机制，如复制酶基因，以表达依赖RNA的RNA聚合酶，这允许细胞内RNA扩增和充足的抗原表达。 图5 mRNA疫苗作用机制的示意图。mRNA疫苗包含脂质纳米颗粒(LNP)包裹的mRNA序列（绿色），通过肌肉注射进行注射。封装的mRNA编码感兴趣的抗原（蓝色），被肌肉细胞摄取并在细胞的细胞质中表达。内源性产生的抗原被分泌并运送到局部淋巴结，这刺激了细胞介导的免疫和体液免疫，如分化的B细胞分泌抗体（紫色）。mRNA疫苗方法通过主动免疫提供保护，而不包含实际病毒或细菌的部分。 从DNA模板转录的mRNA携带遗传信息，指导细胞内蛋白、膜蛋白和细胞外蛋白的翻译和生产。同样，mRNA疫苗的核心原则是传递编码信息，如抗原蛋白，以在细胞内翻译。从而有效激活细胞免疫和体液免疫，如图6所示。 图6 mRNA疫苗在抗原呈递细胞(APCs)中诱发免疫的示意图。APCs通过内吞作用摄取mRNA疫苗后，mRNA在核糖体中被翻译成抗原肽，并刺激细胞免疫反应。蛋白酶体复合物将抗原肽处理成更小的肽表位，这些表位可以通过主要组织相容性复合体(MHC)I类或II类呈现在细胞表面，具体取决于APC的类型。MHC I类呈现的表位被CD8+细胞毒性T细胞识别，以激活并杀死感染细胞。MHC II类呈现的表位被CD4+辅助T细胞识别，这些细胞促进B细胞的激活和中和抗体的产生，并通过吞噬细胞启动体液免疫反应。 除了与内源mRNA的相似性外，mRNA疫苗还能表达复杂的抗原，没有包装限制。利用基因序列信息的无细胞制造过程允许快速、可扩展的生产，以迅速应对任何新出现的传染病。经过多年的mRNA治疗研究和投资，解决了其药理学方面的许多挑战，如稳定性和效力。 随着2020年1月严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）大流行的爆发及其完整基因组的发布，对SARS-CoV-2的有效疫苗的开发竞赛开始了。结果，针对SARS-CoV-2开发了多种疫苗，包括几种基于RNA的疫苗，如表5所示。Moderna开发的Spikevax和Pfizer及BioNTech开发的Comirnaty迅速获得了FDA的紧急使用授权（EUA）和EMA的条件性市场授权（CMA）。目前，只有Comirnaty获得了FDA的批准。这些mRNA疫苗展示了它们高效力和理想的安全性概况，以前所未有的速度被开发和施用。此外，这些疫苗的开发验证了基于mRNA的平台，并激发了对mRNA治疗应用的巨大吸引力。 表5 针对COVID-19的基于RNA的疫苗在临床试验中或已批准的列表 2019冠状病毒病（COVID-19）是由SARS-CoV-2病毒引起的一种高度传染性的病毒感染性疾病，已导致全球健康危机，对世界造成了灾难性影响。为了应对全球大流行，辉瑞和BioNTech开发的Comirnaty（BNT162b2或Tozinameran）是首个获得FDA批准的用于预防性指示的mRNA疫苗。Comirnaty疫苗是一种修饰的核苷酸mRNA，编码SARS-CoV-2的刺突（S）蛋白，并由脂质纳米颗粒包裹，允许S抗原的表达。SARS-CoV-2 S蛋白是一种I型融合糖蛋白，是病毒的主要表面蛋白和中和抗体的主要靶标。S蛋白对病毒及其感染至关重要，因为它能够显著的结构重排，将病毒和宿主细胞的细胞膜融合，将其病毒基因组传递到目标宿主细胞进行感染。Comirnaty编码了SARS-CoV-2的前融合稳定和膜锚定的全长S蛋白，这保留了中和敏感表位，有效激发对S抗原的免疫反应 Comirnaty在临床试验中展现了高疫苗效力和良好的安全性。在其2/3期试验中，共有37,706名16岁以上的参与者接受了两次剂量为30微克的接种，两次接种间隔21天。在接种第一剂后，他们观察到对COVID-19有52%的疫苗效力，表明对疾病发作有初步保护作用；在接种第二剂后7天，对COVID-19的疫苗效力达到91%。总体而言，在这项2/3期试验中，所有参与者观察到95%的疫苗效力。此外，该研究还确认了其有利的安全性概况，其中反应原性事件，如疲劳、全身反应和淋巴结病，在出现几天内自行解决。在BNT162b2的早期1/2期研究中，评估了成年参与者的免疫原性，同样的剂量方案和时间表在参与者中引发了强劲的血清SARS-CoV-2中和滴度，在第二剂后7天，并在第二剂后一个月持续存在。最后，利用以色列大规模疫苗接种活动收集的数据进行的一项研究发现，接种两剂BNT162b2的3,159,136名参与者的结果显示与随机试验一致：预防有症状COVID-19的有效性为94%；预防住院的有效性为87%；预防严重COVID-19发作的有效性为92%。因此，mRNA疫苗BNT162b2证明了mRNA预防性疫苗作为一个有效的平台，以保护免受传染病的侵害，同时在反应原性和免疫原性之间显示出有利的平衡。 作为RNA病毒，SARS-CoV-2容易发生基因突变，使其进化，允许与野生型菌株相比具有不同属性的突变变种出现。对BNT162b2疫苗针对各种变种进行了多项初步研究，特别是对全球流行的高传染性B.1.617.2（Delta）和B.1.1.529（Omicron）变种。Tang等人通过匹配的测试阴性病例对照研究评估了BNT162b2针对Delta变种的实际效果，并得出结论，疫苗有效性降低至51.9%，防止有症状或无症状COVID-19。此外，Nemet等人的另一项初步实验室研究发现，两剂BNT162b2针对Delta和Omicron的中和效力显著降低，对这些变种的保护效力降低。需要注意的是，这些是初步结果，需要进一步研究以检查BNT162b2对特定变种的全面影响。也就是说，这些结果表明需要针对新出现的变种调整疫苗，这对于RNA基础的疫苗方法是可能的，因为它可以快速和可扩展地生产。除了COVID-19 mRNA疫苗外，还开发了针对其他传染病的mRNA疫苗，如呼吸道合胞病毒（RSV）、HIV-1、流感和寨卡病毒，这些疫苗已显示出有希望的临床前和临床结果。BNT162b2和mRNA-1273的批准和紧急授权为mRNA疫苗方法的安全性和效力提供了充分的证据，这加速了这种疫苗技术的发展，并为转变现代疫苗策略提供了乐观的前景。 10.  治疗性疫苗 除了mRNA预防性疫苗外，基于mRNA的疫苗还应用于癌症免疫疗法。mRNA癌症疫苗编码癌症抗原，如肿瘤相关自身抗原（TAA）或肿瘤特异性抗原（TSA），以诱导针对肿瘤的特异性T细胞反应，从而实现肿瘤排斥。基于mRNA的方法在癌症免疫疗法中具有优势，因为它具有抗原传递和表达能力，以及通过mRNA设计激活先天免疫的佐剂功能。基于mRNA的癌症疫苗有两种方法：mRNA树突状细胞（DC）疫苗和mRNA直接癌症疫苗。 基于mRNA的DC疫苗涉及将TAA加载到DCs中，因为DCs具有呈递TAA并启动针对肿瘤的强大效应反应的能力。DCs的体外操作需要从患者的血液中分离出的造血前体细胞，并将转染的细胞重新输注到患者体内，这提供了一种个性化的治疗策略，因为DCs是患者衍生的。然而，这个过程也可能是昂贵和劳动密集型的，同时增加了一层复杂性。顾名思义，后一种方法涉及直接注射编码肿瘤抗原的mRNA，可以被局部细胞摄取以进行抗原呈递。目前，有几个癌症疫苗候选物正在进行临床开发，如表6所示。 表6 目前正在进行或已完成2期或3期临床试验的代表性基于RNA的癌症疫苗列表 在Kyte等人（NCT标识符：NCT01278940）的1/2期研究中，用自体肿瘤mRNA转染的黑色素瘤DC疫苗单独或与佐剂白介素-2（IL-2）一起使用，报告说在31名晚期黑色素瘤患者中有16名患者的肿瘤特异性T细胞免疫反应与生存期改善相关，并且安全性可接受。在另一项2期研究（NCT标识符：NCT03480152）中，一种编码20种不同新抗原的mRNA直接癌症疫苗，由自体癌症表达，并与LNP配制而成，被用于四名转移性胃肠道癌症患者。这种疫苗候选物被发现是安全的，并且诱导了针对预测新表位的突变特异性T细胞反应，使用肿瘤浸润性淋巴细胞；然而，由于患者数量有限，其临床疗效尚待确定。鉴于IVT mRNA技术的安全性、稳健性和相对较低的成本，使用mRNA疫苗的癌症免疫疗法的个性化是可能的，伴随着有希望的临床前数据和正在进行的临床试验。 除了预防性和治疗性mRNA疫苗外，LNP-mRNA技术最近在小鼠模型中用于短暂的抗纤维化嵌合抗原受体（CAR）T治疗。Rurik等人证明，含有修饰核苷的mRNA编码针对成纤维细胞激活蛋白（FAP）的CARs，与CD5靶向LNPs配制而成，也称为靶向抗体/LNP-mRNA载体，可以定向传递到CD5细胞以表达功能性CAR T细胞。FAP是在活跃的组织重塑和急性心肌梗死后损伤中表达的细胞表面糖蛋白。鉴于FAP在心脏成纤维细胞中的强烈表达，它是激活的心脏成纤维细胞的可行靶标和标记。在他们的一系列概念验证实验中，Rurik等人成功证明了封装在靶向LNPs中的修饰mRNA能够传递到特定细胞类型，在体内产生功能性工程化T细胞。此外，这种传递产生了短暂有效的抗纤维化CAR T细胞，表现出肌动蛋白吞噬作用。在高血压小鼠心脏损伤和纤维化模型中，58%的CD3+ T细胞是FAPCAR+，表明在CD5/LNP-FAPCAR注射的小鼠中成功转导了FAPCAR mRNA。最后，用CD5/LNP-FAPCAR治疗的小鼠显示出改善的心脏功能和减少的间质纤维化。通过针对特定细胞类型的LNPs，修饰mRNA治疗可能会扩大其应用范围，创造出一种可扩展且相对便宜的通用治疗的可能性，具有工程化免疫功能的能力。 10.1.  mRNA作为蛋白质替代疗法 体外转录（IVT）mRNA的另一个直接应用是蛋白质替代疗法，其中IVT mRNA编码所需的蛋白质，并在目标细胞中表达以实现治疗目的。因此，以蛋白质表达不足或异常蛋白质产生为特征的疾病，如遗传性疾病，可能从蛋白质替代疗法中受益。基于mRNA的蛋白质替代疗法的优势在于其能够表达几乎所有的蛋白质，包括分泌蛋白、细胞内蛋白和跨膜蛋白。蛋白质替代疗法的临床试验主要集中在遗传性代谢性疾病上，如表7所示。 表7 临床开发中的代表性基于mRNA的蛋白质替代疗法列表 在蛋白质替代疗法的临床研究中，由于其特征是必需酶的缺乏，导致酶的缺乏导致过量的代谢产物，从而产生临床表现，因此遗传性代谢性疾病是研究的重点。上述候选药物的临床数据尚未公布。因此，需要进一步证据来证明蛋白质替代疗法的安全性和有效性。除了代谢性疾病外，蛋白质替代治疗方法也被应用于血液疾病，如血友病A和B。Ramaswamy等人使用LNP配方的mRNA编码人凝血因子IX（hFIX）治疗血友病B的FIX缺陷小鼠模型，证明了他们的传递平台LUNAR在小鼠模型中的安全性和有效性；以及传递到肝脏的FIX蛋白的治疗产生。对于这种模式，仍然存在挑战，如传递方法。目前，mRNA蛋白质替代疗法的传递方法主要针对肝脏、肺和心脏。因此，需要进一步开发传递策略以传递到其他器官。 除了传递编码缺失或异常蛋白质的mRNA外，还开发了与单导向RNA（sgRNA）和编码CRISPR相关蛋白9（Cas9）的mRNA配伍的疗法。Cas9是一种相关的内切核酸酶，能够进行双链DNA断裂，并通过与导向RNA结合形成核糖核蛋白复合物。通过传递与目标基因互补的特定sgRNA以及Cas9 mRNA，可以通过Cas9对目标基因进行切割以实现基因沉默，从而实现体内基因编辑。多个药物候选物正在使用基于RNA的CRISPR-Cas9基因编辑策略进行临床开发，以治疗遗传性疾病。Intellia Therapeutics开发的NTLA-2001是一种基于CRISPR-Cas9的体内基因编辑疗法，目前正在1期临床试验（NCT标识符：NCT04601051）中用于治疗转甲状腺素（ATTR）淀粉样变性——一种罕见的、进行性的疾病，其特征是异常的转甲状腺素（TTR）蛋白的错误折叠积累。候选药物NTLA-2001由与目标TTR基因互补的sgRNA和Cas9蛋白的修饰mRNA序列配制而成，通过LNP传递到肝脏。临床前研究和首次人体中期临床数据分析显示，在动物模型和遗传性ATTR患者中血清TTR浓度降低，证明了TTR的持久靶向敲除。这些研究为体内基于RNA的CRISPR-Cas9基因编辑作为有希望的治疗策略提供了临床证据和概念验证。 在过去几年中，mRNA疫苗领域取得了关键进展，证实了基于mRNA的治疗的可行性。制造方法和传递材料的进步加速了mRNA治疗的发展。尽管基于mRNA的治疗的临床数据令人鼓舞，但仍需要针对特定细胞类型靶向的传递材料的挑战，以及需要进一步深入理解mRNA治疗的机制，以最小化不良事件并提高效力。 11.  结论和未来展望 RNA治疗学是一个迅速发展的领域，正在经历快速扩张。目前已有超过十五种基于RNA的治疗方法获得监管批准，更多的研究进入后期临床开发阶段。这个强大且多功能的平台能够解决当前治疗方法无法满足的许多医疗需求。由于RNA治疗的基本挑战，如传递、稳定性和免疫原性已得到解决，RNA药物的开发正在迅速增长。仍然有改进和优化的空间，如特定细胞类型的传递、提高内体逃逸和增强效力。 然而，RNA活性和传递平台的持续发现和增加的机制理解为RNA治疗的前景提供了乐观的展望。GalNAc-siRNAs和mRNA疫苗的最新成功，以及CRISPR的潜力，预示着RNA治疗学新时代的到来。

近期Signal Transduction and Targeted Therapy杂志（IF=40.5）上发表了一篇重量级AAV基因治疗综述文章（通讯作者为美国马萨诸塞大学Chan医学院的高光坪教授），深入探讨了AAV基因治疗的最新突破与未来趋势。这篇文章不仅汇聚了行业内的权威观点，更揭示了关键技术的最新动态，为学术界和产业界的创新提供了全新启发。上篇我们了解到基因治疗的背景和AAV生物学基本概念，接下来咱们继续深入剖析基因治疗递送载体AAV-载体开发。 rAAV的衣壳序列和基因组（包括启动子、外源基因、增强子和ITRs等），都在被深入研究。本篇将介绍rAAV的衣壳和基因组开发策略，以提高AAV的感染效率、组织特异性和治疗基因的表达效率。 AAV衣壳设计 衣壳设计是为不同临床应用开发定制rAAV的主要策略。它主要包括三种方法：鉴定自然存在的AAV变体、理性设计和定向进化（图1）。最近，AI辅助进化已成为rAAV衣壳设计的新工具。 图1 开发新型AAV变体的策略。a 可以从人类和小鼠等非人灵长类动物（NHP）组织中通过多轮PCR和高通量测序分离出自然存在的AAV变体。b 利用AAV生物学的知识进行合理设计，修改AAV衣壳中的相关氨基酸，以增强转导能力或逃避免疫监视。c 定向进化是一种工程方法，用于开发具有特定组织/细胞特异性的新型AAV变体，包括随机或特定的肽段插入、衣壳重组、易错PCR和饱和突变。d 通过计算机模拟方法利用已知的衣壳序列重建AAV衣壳氨基酸序列。通过对大量AAV变体转导样本数据集的学习，预测AAV基因组中特定序列与包装能力和组织靶向性之间的关系。 01 鉴定自然存在的AAV变体 在早期阶段，人体组织是发现新AAV的关键来源。从1965年到2004年，有限数量的AAV主要从人类临床样本中分离出来，随后被转化为载体并进行了测试。AAV9最初是从人类肝脏组织中发现的，但由于其能够穿越血脑屏障（BBB），且对大脑有强烈的嗜性，因此成为中枢神经系统（CNS）转导的常用载体。AAV7和AAV8是从恒河猴的心脏和淋巴结中分离出来的，对骨骼肌和肝脏有出色的嗜性。 研究表明，40-80%的人对已知的野生型AAV血清型有抗体，这强调了发现更多血清型AAV的必要性。研究人员已经在人类和非人灵长类动物之外的物种中筛选AAV血清型，以找到新的衣壳，避免人类AAV预存抗体的中和效应，但这些AAV在人类中的转导可能有限。因此，发现人类来源的AAV变体，并筛选转导效率高，具有特定组织嗜性的候选者已经成为一种常见的方法。AAVv66，一种通过长读长测序从人类样本中分离出来的AAV2变体，具有比AAV2更高的产量和CNS转导效率。这些发现表明，鉴定自然存在的AAV变体可以为改善组织特异性转导提供有价值的工具。虽然只有少数团队还在鉴定和评估自然衣壳变体作为基因治疗的潜在载体，但源自野生型AAV血清型的rAAV仍然是当前临床研究中的主要选择。 02 理性设计 理性设计方法涉及对rAAV衣壳的特定位点进行结构修改，需要对rAAV的结构和生物学有一定的理解，常用的三种关键方法包括：遗传突变、插入功能结构域以改善组织亲和力，以及化学修饰。有研究探索了特定氨基酸残基对rAAV转导效率的贡献，发现rAAV2衣壳表面的酪氨酸残基的磷酸化会导致它们在入核前被降解，而将这些残基修改为苯丙氨酸（Y444F/Y500F/Y730F）可以增加rAAV2在中枢神经系统中的基因递送效率。虽然rAAV2不能通过玻璃体内注射转导光感受器，但含有特定残基替换（Y272F/Y444F/Y500F/Y730F/T491V）的变体实现了高达25%的光感受器细胞感染。此外，改变表面暴露的残基可能实现组织去靶向，从而提高安全性。例如，在黑猩猩组织样本中发现了H527Y和R533S的替换，如果将这种替换引入至rAAV9衣壳，在新生小鼠和一种致命性儿科白质营养不良症小鼠模型中，当AAV的导入方式为静脉注射时，rAAV9在外周组织的感染更少。 另一种理性设计方法是将功能结构域引入rAAV衣壳的特定位点。一项研究通过插入人类黄体生成素受体（LH-R）的15个氨基酸结合域，成功地在卵巢癌细胞中实现了与HSPG无关的通过LH-R的转导。另一项研究通过在rAAV9衣壳中插入细胞穿透肽，成功鉴定出两种变体，它们能够在系统给药后穿越血脑屏障（BBB），并改善了中枢神经系统的感染。宿主免疫反应是rAAV能够诱导有效和长期转基因表达的主要障碍。结构研究表明，rAAV衣壳上的中和抗体（NAbs）识别位点可能是保守的。根据冷冻电子显微镜（cryo-EM）图像显示的rAAV1衣壳与三种小鼠单克隆抗体复合物的结构信息，工程化的rAAV变体能够逃避小鼠、非人灵长类动物和人类血清中的NAbs。将rAAV衣壳与生物素-聚乙二醇（PEG）和N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）结合可能有助于逃避NAbs，尽管这可能会改变rAAV的组织嗜性，降低感染效率。一项研究使用域交换技术从rAAV2和rAAV8生成了27个嵌合体衣壳，并证明了rAAV8的肝脏嗜性与第四环域相关。此外，在AAVrh10的可变区域VIII中插入精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）整合素结合基序，可提高心脏特异性感染效率并减少肝脏分布。 不改变rAAV衣壳氨基酸组成的化学修饰是衣壳工程的一个有前景的方法。对表面氨基酸的微小修改可以改变受体结合亲和力，从而影响感染和嗜性。一项研究使用带有亲电性琥珀酰亚胺丙酸功能团的聚乙二醇-N-羟基琥珀酰亚胺（PEG-NHS）与rAAV2衣壳上的赖氨酸残基交联，以逃避中和抗体（NAbs）。研究发现糖化的rAAV2与肝素和单克隆抗体A20的结合减少，导致其在肌肉中的转基因表达显著提高。一项研究将抗骨骼肌特异性蛋白CACNG1的抗体共价结合到rAAV9衣壳的可变区域，导致工程化的衣壳能够在小鼠肌管中特异性表达转基因，与未结合抗体的rAAV9相比，肝脏靶向性降低。同样，另一项研究工程化了一个rAAV9和rAAVrh74的混合衣壳，可以特异性结合在骨骼肌表达丰度较高的受体整合素αVβ（AVB6）。一个由此产生的变体，LICA1，在人类肌管和小鼠杜氏肌营养不良症（DMD）模型的骨骼肌中显示出更强的感染性。此外，还可以通过遗传密码扩展技术来实现对rAAV衣壳的化学修饰。遗传密码扩展技术允许研究者在蛋白质中特定位置引入非天然氨基酸（ncAAs），从而赋予蛋白质新的或改变其原有的功能。最近的一项研究使用了这种方法，通过工程化的正交原核tRNA/tRNA合成酶（正交意味着这些tRNA和tRNA合成酶对不会与宿主细胞中已有的tRNA和tRNA合成酶发生相互作用，从而避免了非目标氨基酸的掺入）插入单个ncAAs来工程化一类新的rAAV，称为Nε-AAVs。这些突变的Nε-AAVs成功地与功能分子结合。体内研究表明，在异种移植动物模型的目标细胞中，与Nε-AAVs结合的功能分子导致了高度特异性的摄取。另一项研究还表明，在AAV5衣壳的D374位置整合一个ncAA可以增强其在小鼠肺部的特异性感染。尽管取得了这些进展，但理性设计方法仍受到我们对rAAV结构和生物学不完全理解的限制。 03 定向进化 定向进化通过模仿自然进化的过程，人为设计的实验条件分离具有优势属性的衣壳变体，如更高的rAAV产量和感染效率、免疫逃逸或特定的细胞/组织嗜性。一种定向进化策略涉及诱导随机、无偏倚的突变，并对衣壳施加病毒适应性的选择压力。有研究通过使用易错PCR然后通过交错延伸以生成VP1-3的Cap突变体库，筛选对肝素亲和力发生改变且能实现免疫逃逸的变体。此外，基于DNA重组的方法，通过组合来自不同亲本AAV血清型的衣壳氨基酸序列，也被用来生成多样且广泛的随机嵌合体库。用这种技术构建的大量AAV变体在体外和体内都显示出广泛的细胞嗜性。饱和突变不同抗原印记也被用来工程化AAV8衍生的衣壳以逃避Nabs，改善肝脏嗜性。 在AAV衣壳上表面筛选随机肽段是定向进化的另一种方法。例如，基于Cre重组的AAV靶向进化（CREATE）系统（图2）将短肽段插入到rAAV9衣壳上以改变其属性，已有研究用该方法成功获得了AAV-PHP.B。AAV-PHP.B在C57BL/6小鼠模型中表现出了优异的穿透血脑屏障（BBB）的能力，因此被广泛用于小鼠的中枢神经系统（CNS）研究。然而，后续的研究表明，AAV PHP.B的这种特性并没有在其它品系的小鼠和非人灵长类动物（NHPs）中得到相同的效果，这表明AAV PHP.B衣壳与宿主因素之间存在复杂的相互作用，而这些因素在不同物种之间可能存在差异。 图2  基于Cre从感染的靶细胞中恢复AAV衣壳序列。a  CREATE选择过程示意图。用PCR引入多样性（多色光谱垂直带）到一个衣壳基因片段（黄色），该片段被克隆到携带剩余衣壳基因（灰色）的rAAV基因组中，并用于生成病毒变体库，之后该库被注入Cre转基因动物体内，最后用PCR从Cre+细胞中选择性恢复衣壳序列。b  rAAV-Cap-in-cis-lox rAAV基因组。Cre颠倒了被lox71和lox66位点包围的聚腺苷酸（pA）序列。PCR引物（半箭头）被用来选择性扩增Cre重组序列。c  从两个Cre+或Cre-小鼠中恢复的衣壳库序列的Cre重组依赖性（顶部）和独立性（底部）扩增的PCR产物。d 示意图显示了Rep-AAP AAV辅助质粒内的AAV基因以及由cap基因编码的蛋白质。在cap基因中插入的终止密码子消除了VP1、VP2和VP3衣壳蛋白的表达。e 与用标准的AAV2/9 Rep-Cap辅助质粒+ rAAV-UBC-mCherry（中间）或AAV2/9 Rep-AAP + rAAV·UBC-mCherry质粒（底部）生产的病毒相比，使用分离的AAV2/9 Rep-AAP + rAAV-Cap-in-cis-lox质粒也能生成有DNase抗性的AAV载体基因组（vg）（顶部）（AAV基因组的DNase抗性是AAV在生产、纯化、储存和给药过程中过程中具有较高的稳定性的指标）。f 将7-mer衣壳库克隆到rAAV-∆Cap-in-cis载体中。g  AAV9表面模型显示了7-mer插入在氨基酸（aa）588和589（洋红色）之间的位置。黄色表示用PCR生成的库片段编码的位点（aa 450-592）。 随后，Voyager Therapeutics公司开发了一种名为TRACER（Tropism Redirection of AAV by Cell-type-specific Expression of RNA，通过细胞类型特异性表达RNA重新定向AAV的嗜性）的新型rAAV进化平台（图3）。这个平台的核心是基于RNA进行筛选，能快速发现穿透血脑屏障（BBB）并增强CNS嗜性的AAV衣壳。这一过程不需要转基因动物，因此可以用于多种物种，包括非人灵长类动物（NHPs）。一项在小鼠中的研究基于在rAAV9衣壳上展示的肽库，鉴定了十个优势变体，这些变体在系统给药后，大脑的转导效率比亲本rAAV9高了多达400倍。最近一个研究报道，VCAP-102，一种基于TRACER开发的rAAV9变体，在非人灵长类动物的不同大脑区域显示出比rAAV9高20-90倍的感染效率。对VCAP-102的迭代进化产生了新的衣壳变体，其BBB穿透性进一步提高了6-7倍。同样，基于TRACER开发的VCAP-100衍生物在非人灵长类动物中显示出比其亲本AAV5高六倍的大脑感染效率，而在的肝脏感染效率则降低了300倍，预示着更低的肝毒性。 图3 TRACER策略。（A）野生型AAV（顶部）和TRACER文库载体（底部）结构示意图。ITR，反向末端重复序列。Pro，启动子。虚线表示AAV内含子（顶部）或合成的CMV globin内含子（底部），实线代表次要（细线）和主要（粗线）衣壳转录本。底部显示了用于恢复2.8-kb衣壳文库扩增子的引物。（B）在TRACER平台中将CAG、SYN和GFAP启动子串联（左边）或单一启动子（右边）的活性。转基因被包装在AAV9衣壳中，并在HEK293T细胞或小鼠原脑细胞中进行测试（1E+5 vg/细胞，n = 3）。感染后48小时通过实时RT-PCR定量RNA。（C）肽展示文库的构建。在包含SYN或GFAP启动子的载体中，将由AQ、DG或DGT残基引导的随机序列引入至AAV9 VP1的特定位置。（D）体内选择过程示意图。（1）DNA文库用于生产病毒库，（2）将病毒文库通过静脉注射（i.v.）感染小鼠（1E+12 vg/只），（3）注射后28天从整个大脑中恢复大量RNA，（4）通过RT-PCR扩增编码肽库的衣壳片段，通过下一代测序（NGS）进行分析，然后克隆到TRACER载体中进行另一轮选择。（E）在注射SYN和GFAP启动子文库后28天，从三只小鼠中获得的RT-PCR产物示例（顶部和中间，分别）。底部：RT阴性对照。 DELIVER（Directed evolution of AAV capsids leveraging in vivo expression of transgene RNA, 定向进化AAV衣壳，利用体内表达的转基因RNA）策略是另一种开创性的方法（图4），该方法通过在体内筛选AAV衣壳变体，以实现对特定组织的高效递送。已经有研究者采用这种策略鉴定出一类含有RGD基序的衣壳，这些衣壳在小鼠和非人灵长类动物中通过静脉注射后，能够以更高的效率和选择性感染肌肉组织。进一步分析表明，目标细胞中表达的与RGD结合的整合素异二聚体与含有RGD基序的病毒变体有很强的相互作用。研究人员最近生成了一个嵌入RGD的7个氨基酸肽库，插入衣壳的可变区域VIII，并鉴定出一些新的AAV衣壳变体，其骨骼肌转导效率比基准衣壳增强了20多倍。 图4 DELIVER鉴定出一类含有RGD基序的肌肉趋向性AAV衣壳变体。（A）使用DELIVER生产病毒文库和选择衣壳变体的示意图。（B）使用含有ITR的质粒产生的rAAV滴度比较，这些质粒在CMV、CK8或MHCK7启动子的控制下表达AAV9衣壳编码序列。（C和D）在8周龄C57BL/6J小鼠的骨骼肌（C）和心脏（D）中，由CMV、CK8或MHCK7启动子控制表达的AAV9衣壳库mRNA的体内表达。病毒库感染方式为系统性注射，剂量为1E+12 vg/只小鼠。（E）图表显示在不同小鼠骨骼肌中，由MHCK7启动子表达的衣壳变体在DNA和mRNA水平上相对于病毒文库的富集情况。（F）在8周龄C57BL/6J小鼠肌肉中注射1E+12 vg病毒库后，经过第二轮基于转录本的选择，高度表达的衣壳变体中7个氨基酸的插入序列。每组中颜色相同的变体由同义密码子编码。变体的排序是基于每个变体在股四头肌、胫骨前肌、腓肠肌、肱三头肌、腹肌、膈肌和心脏中的mRNA表达量之和。 定向进化是一个强大的工具，用于生成和识别具有特定属性的变体，虽然这些属性并不总是能够在灵长类动物中跨物种转化，如AAV-PHP.B在小鼠中显示出比AAV9更强的CNS感染，但在狨猴中则没有，这表明在衣壳工程中进行跨物种进化的必要性。然而，一项在多个物种中的顺序进化rAAV衣壳库的研究确定了rAAV.cc47作为一种强大的跨物种变体，与rAAV9相比，在非人灵长类动物的大脑和心脏中具有增强的感染能力。AAV2.7m8是一种AAV2变体，通过10个氨基酸的插入，在小鼠中通过玻璃体内注射能够强烈转导外层视网膜层，如光感受器和视网膜色素上皮（RPE）细胞。使用ADVM-022（AAV.7m8-aflibercept）治疗糖尿病性黄斑水肿（DME）的II期临床试验（NCT04418427），接受高剂量【6.0 × 10^11病毒基因组（vgs）/眼】后16-36周内多名患者出现严重不良反应，包括难以治疗的眼内压降低，因此该临床试验暂停，这显示了工程化衣壳在该领域的转化挑战。 04 AI辅助设计 计算机辅助的rAAV工程是一种前沿的方法，它利用计算工具来辅助rAAV的设计和优化。各种研究已经从rAAV的进化谱系中探索了其多样的属性，并使用预测的祖先基因组重建来创造新的衣壳变体。有两项类似的研究通过合理设计或采用定向进化来计算建立祖先衣壳库。这两项研究都生成了具有更好的热稳定性的衣壳变体，热稳定性是血清型特征的一个指标，是显示临床应用潜力的生物学属性。在这些变体中，Anc80L65是一个有前途的载体，可用于内耳或眼睛相关疾病的基因治疗。 机器学习在生物医学研究中得到了广泛使用，包括医学图像分析、遗传学和药物发现。一项开创性的研究应用机器学习来理解rAAV2衣壳，从衣壳的适应度视角描述了单密码子替换，并使用机器学习来设计精确的多突变变体，这些变体基于它们对目标组织的影响。此外，深度学习已被用来多样化rAAV2衣壳变体，准确预测它们的活力。这种方法揭示了在衣壳之外工程化rAAV基因组的新可能性，这在未来的rAAV发展中具有创新应用潜力。 rAAV基因组设计 rAAV基因组由ITRs和转基因表达盒组成，后者包括感兴趣的基因和调控元件。rAAV基因组的设计策略包括修改ITRs或内含子，插入组织特异性启动子进行转录调控和/或使用可诱导表达系统，密码子优化，减少转基因cDNA的CpG基序，以及通过微小RNA（miRNA）介导的转录后调控重靶向等。这些元件各有其功能，它们各自和共同作用决定了转基因表达、细胞类型特异性、rAAV转导的安全性和持久性。 01 rAAV ITRs的设计 传统的rAAV携带单链载体基因组。其转导效率和速率取决于mRNA转录发生前载体DNA的第二链合成，这是限速步骤。为了提高转导效率，可采用突变其中一个ITR，生成具有双链载体基因组的自互补AAV（scAAV）的策略。scAAV可绕过dsDNA合成的限速步骤，更快、更高效地转导目标细胞。然而，使用scAAV有明显的局限性：较小的包装能力（scAAV为2.5 kb，而ssAAV为4.7 kb）以及由于转基因产物快速积累而导致的免疫反应风险的增加。 ITRs可以被改变，通过选择性地从两个相邻的ITRs中移除D序列，可以选择性地限制包装载体基因组的正链或负链。ITRs还包含CpG基序，可被toll 样受体（TLR）-9识别并诱发炎症反应。完全从ITRs中移除CpG并不会对治疗动物中载体基因组的拷贝数或转基因表达产生不利影响，然而，这会导致rAAV滴度的降低，并且尚不清楚是否能减少对rAAV的炎症反应。总的来说，ITRs可能是异质的，原因是ITRs天然容易发生突变，具有回文结构、高GC含量和二级结构。优化ITRs中的GC含量可能是一种潜在的改善rAAV属性的设计策略。 02 优化启动子 选择和优化转基因表达盒中的启动子可以满足特定的需求，如组织特异性和表达水平。常用的巨细胞病毒（CMV）或鸡β-肌动蛋白（CBA）启动子可提供强大且广泛的基因表达，而组织特异性启动子如CK8或MHCK7则在肌肉中提供组织特异性的基因表达。组织特异性转基因表达对于实现低剂量下足够的转导效率和最小化脱靶效应至关重要。一项研究采用了携带内源性人类存活运动神经元1（SMN1）启动子的scAA9载体，以在神经元中特异性驱动SMN1的表达。这种方法显示了更好的安全性，显著降低了肝脏毒性，并在患有脊髓性肌肉萎缩症（SMA）的SMNdelta7小鼠中增强了治疗效果。这一结果超越了使用CMV/CBA启动子被FDA批准的治疗方法Zolgensma的性能，从而强调了组织特异性启动子的优势。其它的调控元件，如添加上游增强子可以提高表达活性和特异性。许多增强子已被设计用于临床基因治疗载体中，目的是增加转基因表达，减少病毒剂量。另一项研究报告称，小鼠甲基-CpG结合蛋白-2启动子的一个片段在神经元中特异性地实现了强大的长期表达。 基于机器学习的多组学数据可以用于设计组织特异性启动子，使转基因活性在靶组织和非靶组织之间实现超过1000倍的动态增加。 03 转基因表达调控 转录调控：可以上调或下调感兴趣基因或蛋白的表达，以优化和微调所需的效果。四环素诱导系统是一种广泛使用的策略，用以实现特定水平的表达，虽然由于潜在的免疫原性问题，它不太可能被应用于人类。有研究开发了一种使用免疫抑制药物雷帕霉素来激活的反应性转录因子的系统，该系统最初由两个不同的rAAV递送，随后被优化成只需要一个rAAV就足够了。目前该系统已被用于对雷帕霉素处理的可诱导剂量-反应表达，以长期表达所需的转基因。重要的是，在没有给予雷帕霉素的情况下，转基因表达只有最小限度，表明这可能是一个特异且安全的调控系统。 转录后调控：一种策略是使用核糖开关（riboswitches），这是一类非编码RNA元件，主要存在于细菌mRNA的5'非编码区（5'UTR），但在真核生物mRNA的3'UTR及初始转录产物的内含子区段也有发现。核糖开关通常由两部分组成：适配体（aptamer）域和表达平台（expression platform）域。适配体域负责结合特定的小分子代谢物，即配体（ligand），而表达平台域则负责基因表达的调控。当特定分子（配体）结合适配体域时，会引起表达平台域的局部构象发生变化，从而打开或关闭下游基因的表达。核糖开关广泛存在于细菌中，它们在细菌的硫代谢、辅酶合成、氨基酸合成等基础代谢中发挥着非常重要的调控作用。迄今为止，已有20余类感应不同分子的核糖开关在细菌中被确认。目前核糖开关正被用来系统工程化哺乳动物基因表达调节器aptazymes，以改善其调控范围。使用核糖开关的优点包括与FDA批准的药物兼容、RNA的小尺寸，以及几乎没有免疫原性。重要的是，核糖开关序列非常短，这与rAAVs有限的包装能力相结合时尤为重要，使其成为调控rAAV基因治疗的强大系统。 非编码RNA是转基因调控中的多功能工具。将带有可切割的聚A信号（PAS）的RNA aptamers整合到转基因的5'-非翻译区（UTR）中，在没有小分子的情况下，PAS切割导致mRNA降解，从而沉默转基因表达；添加小分子时， mRNA的完整性得以维持，转基因可表达，可以将这种工具与可变剪接相结合，以更精确地控制基因表达。 一些调控系统需要外源性添加或共表达某些元件才能起作用。为了缓解这个问题，研究者们一直在追求使用药物诱导剪接作为基因表达调控的机制。这种方法涉及递送一个包含过早终止密码子的基因，以防止蛋白质的翻译。添加小分子剪接诱导剂有助于将一个特别设计的外显子包含到成熟转录本中，并排除终止密码子，从而使得感兴趣蛋白质的翻译成为可能。启动子的强度和诱导分子的剂量可精确激活目标基因的表达水平。然而，当前技术依赖于固有蛋白质周转机制来降低目标蛋白质的水平。 翻译后调控：调节感兴趣蛋白质半衰期的策略之一是使用蛋白质降解系统（degron），该系统允许对蛋白质的移除和恢复进行可逆和快速响应。一些研究已在体外建立degron系统，但在尝试将其转化为体内系统时发现存在较高的毒性。然而，通过优化已经生成了一些有前景的可应用于体内的系统，如在感兴趣蛋白质上结合一个SMASh (small-molecule–assisted shutoff) 标签，然后引入一种已经获批用于人类的小分子药物，以防止SMASh标签的分离，从而导致蛋白质的降解。结合可诱导表达系统、替代剪接策略和蛋白质降解方法，有可能实现对目标蛋白表达水平的精细控制。 04 优化转基因（转录后水平） 在表达盒优化中一个常见的方法是密码子优化，即使用计算机算法识别转基因中罕见或次优的密码子，并用更受偏好的密码子替换它们。研究已经证明，在小鼠模型中，对FVIII和人类囊性纤维化跨膜传导调节因子（CFTR）进行密码子优化后，其表达水平显著提高。此外，对Canavan病的致病基因，一种天冬氨酸酰酶（ASPA）的密码子进行优化，显著恢复了ASPA蛋白的表达，并在小鼠模型中挽救了致命的疾病表型。虽然密码子优化是提高rAAV递送的转基因表达的有效策略，但这种效果可能因特定的转基因和宿主生物而异。密码子优化方法可能会引入意外的免疫原性和毒性，以及损害其它特性，如嗜性。事实上，一项研究发现密码子优化在基于rAAV8的FIX Padua基因治疗中引入了大量CpG基序，这可能引发先天免疫反应。一项研究开发了一种新的基于循环神经网络的工具，该工具使用来自小鼠心肌细胞、神经元和肝细胞的数据，为特定细胞类型优化密码子使用，这种方法提高了蛋白表达水平并减少了CpG二核苷酸，为提高组织特异性基因治疗效率提供了希望。 05 修改其他顺式调控元件 在表达盒中修改其它顺式调控元件可以调节基因表达和特异性。例如，土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件（WPRE）是一个约600 bp的RNA元件，通常添加在转基因下游。WPRE可以通过增加与转基因无关的mRNA转录量来提高体外和体内的转基因表达。有研究谨慎地报告了WPRE在小鼠中递送的慢病毒载体中潜在的致癌活性。然而，通过从原始WPRE中移除致癌序列，可以降低此类风险。 在转基因表达盒中包含内含子也可以改善动物中的基因表达。有研究表明内含子在体内可以将转基因表达提高40-100倍。然而，内含子对基因表达的影响可能是复杂的，取决于多种因素，如内含子的大小和位置以及特定的目标细胞。选择合适的polyA信号对于优化转基因表达和稳定性很重要【例如，β-球蛋白、SV40或牛生长激素（BGH）】。一项比较研究发现，修改后的SV40晚期polyA（135 bp）的较短版本在小鼠大脑中的转基因表达与BGH polyA（223 bp）相当。此外，包含Kozak序列可以进一步增强转基因表达。 确保仅限在目标组织中表达目的基因对于避免有毒性的过表达和免疫毒性至关重要。rAAV设计采用了细胞特异性启动子作为目标表达的主要策略，并进一步开发了微调策略，例如在3′-UTR中添加miRNA结合位点以抑制目标基因在表达互补miRNA的细胞中的表达。如在rAAV9中添加miR-122结合位点可以实现在中枢神经系统表达的同时减少靶向肝脏、心脏和骨骼肌。当rAAV携带外源转基因，或对患者体内发生无义突变的基因拷贝进行替代时，转基因产物可能被抗原呈递细胞（APCs）视为非自身抗原，然后APCs处理转基因产物，通过主要组织相容性复合体（MHC）进行提呈，启动免疫清除。减轻转基因免疫的一种策略是在rAAV的表达盒中结合APC特异性miRNA结合位点，如miR-142和miR-652，以抑制转基因在APCs的表达。结果显示，在小鼠中转基因特异性免疫反应减少，目标细胞中转基因表达持续。这种策略已在非人灵长类动物中转化，通过rAAV递送后，针对人类免疫缺陷病毒的NAbs得到了广泛持久的表达，突出了这种策略在临床转化中的潜力。 06 扩展rAAV包装能力 rAAV应用中的另一个重大挑战是递送超过其4.7 kb包装能力的转基因，如Leber先天性黑蒙症10型的中心体蛋白（CEP290）（约7.5 kb），或基于CRISPR的工具，如胞嘧啶碱基编辑器或先导编辑器2（超过5 kb）。为了克服这一障碍，可将大基因片段分成两部分，每部分都封装在rAAV衣壳中。这些分段的转基因被共同引入同一细胞，从而重组成全长基因和蛋白。这种重构可以在遗传信息流的不同阶段发生。在DNA水平上，可以通过rAAV ITRs、部分转基因序列或在两个rAAV基因组中都存在的优化的重组元件来促进载体间DNA重组。重叠序列可以在转录后通过特别设计的剪接信号被切除，产生成熟的全长mRNA，随后被翻译成所需的蛋白。在RNA水平上，通过每个转录本中存在的剪接供体和受体介导的两个单独载体的转录本之间的跨剪接，生成全长转录本和蛋白。在蛋白水平上，可以通过分裂型内含肽（分裂型内含肽是能够切除自身并连接附近蛋白片段的天然多肽）实现蛋白重构。 参考资料： 1.     https://doi-org.libproxy1.nus.edu.sg/10.1038/nbt.3440 2.     https://doi-org.libproxy1.nus.edu.sg/10.1016/j.omtm.2020.12.006. 3.     https://doi-org.libproxy1.nus.edu.sg/10.1016/j.cell.2021.08.028 4.     https://doi-org.libproxy1.nus.edu.sg/10.1038/s41392-024-01780-w 关于派真生物

引言 微小RNA(microRNA, miRNA)作为一种重要的基因表达调控分子，自其发现以来便引起了科学界的广泛关注，并在2024年获得了诺贝尔生理学或医学奖。这一奖项的颁发无疑是对miRNA在生物学领域所做贡献的高度肯定。然而，尽管miRNA的发现和功能研究已取得显著进展，将其转化为有效的临床治疗手段仍面临着巨大挑战。（10月9日 Nature “MicroRNAs won the Nobel — will they ever be useful as medicines?”） miRNA的发现与生物学功能 miRNA的发现始于1993年，当时在模式生物线虫(Caenorhabditis elegans)中首次鉴定出miRNA作为基因表达的调控因子。Reinhart等人在1993年的研究中发现了lin-4，这是第一个被鉴定的miRNA，其通过抑制线虫发育过程中lin-14基因的表达来调控其发育过程。此后，科学家们在人体基因组中也鉴定出了数百种miRNA，例如miR-21、miR-34和miR-122，这些miRNA在多种生物过程中发挥关键作用。例如，miR-21与癌症的发生和发展密切相关，其在多种肿瘤中呈现上调并与肿瘤的侵袭和转移有关；miR-122主要在肝脏中表达，调控肝脏脂质代谢并在丙型肝炎病毒(HCV)感染中发挥重要作用。然而，尽管miRNA在生物学中的重要性不断显现，至今仍未有基于miRNA的药物获得美国食品药品监督管理局(US Food and Drug Administration, FDA)的批准，使得这一领域的发展陷入了某种瓶颈。 miRNA的生物学功能在多个系统和细胞过程中得到了深入研究。例如，miR-15和miR-16在调控细胞凋亡过程中扮演着重要角色，它们的下调与多种癌症类型的抗凋亡特性相关。此外，miR-155在免疫细胞的分化和活化过程中发挥关键作用，其异常表达与多种免疫性疾病和癌症的发生密切相关。这些发现为我们理解miRNA在生物系统中的复杂作用机制提供了重要线索。 miRNA的基因表达调控机制 miRNA作为一种非编码RNA(non-coding RNA)，其长度通常为约22个核苷酸，能够通过与靶mRNA的3'非翻译区(3' untranslated region, 3' UTR)结合，从而抑制基因的翻译或促进mRNA的降解。这种调控机制使得miRNA在细胞分化、增殖、凋亡等多种生物过程中发挥重要作用。然而，正是由于miRNA在基因表达调控中的广泛作用，其作为药物的开发也面临着诸多挑战。 miRNA的调控机制不仅仅局限于基因的翻译抑制，它们还可能通过与其他非编码RNA相互作用，形成复杂的基因调控网络。例如，研究发现，miRNA与长链非编码RNA(long non-coding RNA, lncRNA)之间的相互作用在调控基因表达方面具有重要意义，这种复杂的网络调控使得miRNA的作用更加多样化，并且也为开发基于miRNA的治疗手段提供了新的挑战和机遇。 miRNA药物开发的挑战 miRNA药物开发的主要挑战之一在于其递送系统和安全性问题。在最初的miR-34临床试验中，研究人员发现难以有效将miRNA递送至靶组织，同时面临如何避免不良免疫反应的难题。miRNA分子本身易被体内的核酸酶降解，因此需要特殊的递送系统，如脂质纳米颗粒(lipid nanoparticles, LNPs)或聚合物载体(polymer carriers)来保护miRNA并将其递送至靶细胞。研究表明，在使用LNPs递送miR-34的试验中，药物在小鼠体内的半衰期延长了约3倍，这显著提高了其在肿瘤部位的积累。 miR-34作为一种具有抑癌潜力的miRNA，在小鼠肺癌模型中的研究显示，早期给予类似于miR-34的分子能够有效抑制肿瘤生长。然而，在人体临床试验中，由于递送方法不当，研究人员不得不使用高剂量的miRNA进入血液系统，这引发了强烈的免疫反应，导致4名受试者死亡，试验被迫终止。这一事件对miRNA药物开发造成了严重打击，也促使研究人员重新审视如何更安全地递送和使用miRNA。此外，miRNA药物还可能引发非特异性基因调控，导致不可预见的副作用，这些问题在早期的临床试验中尤为突出。因此，miRNA药物的开发不得不暂时搁置。 此外，miRNA的多基因调控特性也是开发过程中的一大挑战。miRNA通常能够靶向多个mRNA，这种多靶标的特性虽然赋予了miRNA在调控复杂疾病过程中的优势，但同时也增加了在人体中引发非特异性作用的风险。因此，在开发miRNA药物时，必须进行深入的基础研究，以明确每种miRNA在特定病理状态下的作用靶标，从而最大程度地降低不良副作用的发生。 miRNA药物开发的新进展 随着递送技术的不断改进，特别是改良的LNPs和靶向配体技术的应用，科研人员在最近的研究中已经取得了一些重要突破，使得miRNA药物的安全性和有效性显著提升。例如，通过化学修饰使miRNA分子更加稳定，或者利用特异性靶向配体将miRNA递送至特定细胞或组织，能够有效解决之前的递送难题。在最近的一项研究中，改进后的LNPs成功将miR-34递送至小鼠的胰腺肿瘤部位，并显著抑制了肿瘤生长，与未改进的递送系统相比，其有效性提高了约50%。这些技术的进步使得miRNA药物的开发重新燃起了希望。 近年来，合成生物学和纳米技术的发展为miRNA药物的递送提供了更多选择。例如，一种新型的递送系统结合了合成的纳米凝胶(nanogel)与靶向配体，使得miRNA在体内的递送效率显著提升。这种系统能够在不同的pH条件下实现药物的可控释放，从而在特定的肿瘤环境中最大化其疗效。此外，利用外泌体(exosome)作为天然的递送载体也逐渐成为一种新的研究方向。外泌体具有良好的生物相容性和靶向性，可以有效递送miRNA至目标组织，这为开发低毒性、高特异性的miRNA药物提供了新的可能性。 miRNA在疾病治疗中的应用前景 随着RNA药物技术的不断进步，科学家们已经逐渐掌握了如何通过改良miRNA分子的包装和修饰来降低其毒性，并提高其靶向性。例如，制药公司Novo Nordisk近期斥资收购了一家致力于miRNA抑制剂开发的公司，这表明了对miRNA药物未来潜力的强烈信心。研究人员已经开发出多种改进miRNA药物递送的方法，例如通过化学修饰使miRNA分子更加稳定，或者利用特异性靶向配体(targeting ligands)将miRNA递送至特定细胞或组织。这些技术的进步，使得miRNA药物的开发重新焕发了活力。 此外，其他基于RNA干扰(RNA interference, RNAi)的药物已经被批准，并证明了其通过减少特定基因表达来治疗疾病的有效性，为miRNA药物的成功提供了重要的参考。RNAi药物与miRNA药物在机制上有相似之处，都是通过与mRNA结合来调控基因的表达。然而，miRNA是内源性分子，通常能够同时调控多个基因，这一特点使得miRNA药物具有更广泛的应用潜力，但也意味着其在安全性和特异性方面需要更为严格的评估。 未来，miRNA在心血管疾病、代谢性疾病以及神经退行性疾病中的应用前景也备受关注。例如，miR-21在心脏纤维化过程中起关键作用，通过抑制miR-21的表达，可以有效减轻心脏纤维化，改善心脏功能。同样地，miR-33在脂质代谢中具有重要作用，其抑制剂被认为可以用于治疗高脂血症和动脉粥样硬化。此外，miR-29的下调与阿尔茨海默病(Alzheimer's disease)的病理进展有关，通过恢复miR-29的表达，有望减缓神经退行性变的进展。这些研究为miRNA在疾病治疗中的应用提供了更多可能性。 miRNA在临床试验中的应用实例 目前，科研人员正致力于开发多种基于miRNA的治疗手段，例如用于治疗癫痫、肥胖和癌症的miRNA疗法。在对miRNA的研究中，科学家们发现某些miRNA在特定疾病中的表达异常，因此通过恢复或抑制这些miRNA的功能，有望达到治疗疾病的效果。例如，miR-122是一种在肝脏中特异表达的miRNA，其在丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)感染中的作用备受关注。研究人员发现，通过抑制miR-122的表达，可以有效阻止HCV在肝细胞中的复制，从而达到抗病毒的效果。这一发现促使Santaris制药公司开展了相关的临床试验，尽管由于竞争对手开发出更为有效的传统治疗手段，该项目最终被放弃，但这依然是miRNA药物开发道路上的一个重要里程碑。 另一项令人振奋的进展是制药公司Cardior Pharmaceuticals正在进行的一项针对心力衰竭(heart failure)的miRNA抑制剂的II期临床试验。该药物通过抑制与心脏功能异常相关的miRNA，从而改善心脏功能。2024年3月，制药公司Novo Nordisk宣布以高达10亿欧元的价格收购Cardior，这一举措表明了对miRNA药物未来前景的强烈信心。 此外，miRNA在癌症治疗中的应用也正在逐渐深入。例如，miR-155在多种癌症中均表现为上调，其与肿瘤的炎症反应和免疫逃逸有关。通过抑制miR-155的表达，研究人员希望能够增强肿瘤对免疫治疗的响应。在一项针对黑色素瘤的小鼠实验中，抑制miR-155显著提高了免疫检查点抑制剂的疗效，为miRNA与免疫疗法的结合应用提供了新思路。 miRNA在癌症治疗中的潜力 除了在心血管疾病中的应用，miRNA在癌症治疗中的潜力也备受关注。例如，miR-34在多种癌症中均表现出抑癌作用，其能够同时调控多个与细胞增殖和凋亡相关的基因。因此，科学家们希望通过重新开展miR-34的临床试验，利用改进后的递送技术来避免之前的失败，特别是在一些难以治疗的癌症如胰腺癌中，miR-34有望成为一种有效的治疗手段。 此外，miR-21也是癌症治疗中的一个重要靶点，其在多种肿瘤中均表现为上调，并与肿瘤的侵袭、转移以及耐药性有关。通过抑制miR-21的功能，研究人员希望能够抑制肿瘤的恶性进展，并提高传统化疗药物的敏感性。在最近的一项研究中，miR-21抑制剂与化疗药物联合使用，显著提高了小鼠乳腺癌模型中的肿瘤抑制效果，这为未来miRNA在肿瘤联合治疗中的应用提供了新的方向。 总的来说，尽管miRNA药物的研究和开发依然面临诸多挑战，但科学家们并未放弃。在现有技术的支持下，miRNA有望在未来对治疗包括癫痫、肥胖以及癌症等多种疾病方面取得突破性进展。随着递送技术的不断改进和对miRNA功能理解的深入，miRNA作为一种全新的治疗手段，将在医学领域迎来新的发展契机。可以预见，miRNA药物将在不久的将来成为治疗多种复杂疾病的重要工具，为人类健康带来福音。 参考文献 Ledford H. MicroRNAs won the Nobel - will they ever be useful as medicines?. Nature. Published online October 9, 2024. doi:10.1038/d41586-024-03303-7 Reinhart, B. J. et al. Nature 403, 901–906 (2000). Pasquinelli, A. E. et al. Nature 408, 86–89 (2000). Johnson, S. M. et al. Cell 120, 635–647 (2005). Trang, P. et al. Mol. Ther. 19, 1116–1122 (2011). Janssen, H. L. A. et al. New Engl. J. Med. 368, 1685–1694 (2013). 责编|探索君 排版|探索君 转载请注明来源于【生物探索】 End 往期精选 围观 一文读透细胞死亡(Cell Death) | 24年Cell重磅综述（长文收藏版） 热文 Cell | 是什么决定了细胞的大小？ 热文 Nature | 2024年值得关注的七项技术 热文 Nature | 自身免疫性疾病能被治愈吗？科学家们终于看到了希望 热文 CRISPR技术进化史 | 24年Cell 综述