CIB1

本期分享Nature综述系列之临床肿瘤学，详述了关于CDK4 和 CDK6抑制剂在乳腺癌治疗方向的治疗现状及挑战。细胞周期蛋白依赖性激酶 （CDK） 4/6 抑制联合内分泌治疗是晚期激素受体(HR)阳性、HER2 非扩增 （HR+HER2−）的乳腺癌。是乳腺癌中最常见的亚型(HR+、HER2-亚型)，占总数的70%。这些药物也可作为早期疾病高危患者的辅助治疗。在本综述中，描述了这些药物的临床中的一些挑战，1. 如何解决获得性耐药性？2. 确定哪些患者最有可能在治疗前从治疗中受益？3. 以及了解这些药物的最佳给药时机和顺序？要点CDK4/6 抑制剂抑制细胞周期，从而诱导细胞凋亡，并且发现与抗肿瘤免疫有关。三种CDK4/6抑制剂用于临床实践，并显示出高度一致的无进展生存结果，尽管其总体生存结果存在不一致。不同CDK4/6抑制剂的毒性特征各不相同，允许根据个体患者的需求定制一定的治疗方案。CDK4/6抑制剂类型的增加和使用使人们更好地了解获得性耐药的机制;正探索克服这些机制的潜在治疗组合。CDK4/6抑制剂疾病进展后的治疗选择仍然是一个活跃的研究领域，并可能受到潜在耐药机制的影响。1. CDK4 和 CDK6 抑制剂背景细胞周期的异常进展是癌症的一个既定标志，该周期的各个阶段已成为抗癌药物开发的有吸引力的靶标。在这方面，CDK4 和 CDK6 抑制剂的开发取得了重大成功，其中三种抑制剂（哌柏西利(palbociclib，辉瑞)，瑞博西尼(ribociclib，诺华) 和 阿贝西利(abemaciclib，礼来)），在过去 8 年中已广泛应用于临床。在转移性激素受体阳性 (HR+) 乳腺癌患者中使用这些药物可显着改善临床结果，2021年10月，abemaciclib 还获得 FDA 批准用于辅助治疗。然而，这些药物的增加和早期使用开始产生另一组问题，包括获得性耐药性的发展以及一旦患者使用其中一种药物出现疾病进展该怎么办。对 CDK4/6 抑制可能影响癌症生长的其他方式（特别是通过改变肿瘤免疫微环境）的理解正在不断扩大，并导致了将 CDK4/6 抑制剂与免疫调节抗癌药物相结合的临床前研究和临床试验。在CDK4/6抑制剂在乳腺癌患者中的使用迅速扩大的时候，我们旨在总结这些药物的既定作用机制，然后讨论它们最近描述的免疫学作用。我们总结了在HR+乳腺癌患者转移和辅助环境中测试CDK4/6抑制剂的III期试验的最新数据，包括总生存期（OS）数据，并讨论了药物之间结局差异的可能原因。我们还回顾了CDK4/6抑制剂在其他乳腺癌亚型患者中的应用，以及这些药物的耐药机制，以及临床前研究和早期临床试验中正在探索的各种新方法，以试图克服这一挑战。2. CDK4/6 和细胞周期由控制细胞分裂过程失调引起的异常细胞增殖是癌症的标志之一。阻止这种快速分裂是抗癌治疗药物的一个关键目标。细胞周期由严格调节的检查点和过程系统控制，这些检查点和过程必须以逐步方式通过才能使细胞成功分裂。CDK通过与伴侣细胞周期蛋白的相互作用而被激活，并规范特定的过渡是这一过程的关键部分。长期以来，人们对CDK作为抗癌药物的潜在靶点存在兴趣，尽管测试泛CDK抑制剂的早期试验数据通常是阴性的，主要是由于大量的毒性。这些不良事件被认为部分是由抑制 CDK1 介导的，因为观察到 Cdk1 敲除在小鼠模型中具有胚胎致死性。因此，识别依赖于单个CDK同工酶进行增殖的癌症，并增加抑制剂的选择性，一直是开发安全有效的CDK抑制剂的关键。激酶 CDK4 和 CDK6 在结构和功能上具有一些相似之处，并介导通过 G1 限制点的过渡，主要是通过细胞周期阻遏蛋白视网膜母细胞瘤 1 （RB1） 的磷酸化。依赖 CDK4/6 进行增殖的细胞通常在 G0 和 G1 早期具有低表达水平的 D 型细胞周期蛋白（细胞周期蛋白 D1-D3）。随着 D 型细胞周期蛋白水平的增加，生成的细胞周期蛋白 D-CDK4/6 复合物部分磷酸化 RB1（低磷酸化）以及 RB 口袋蛋白 p130 和 p107。在未磷酸化状态下，RB1 通过与 E2F 转录因子家族结合来抑制参与细胞周期进程的基因的转录。RB1 磷酸化降低了 RB1 对 E2F 的亲和力，并降低了 RB1 抑制 E2F 功能的程度，从而抑制细胞周期进程。与磷酸化 RB1 结合产生的部分激活的 E2F 蛋白启动 S 期转录程序，包括 E 型细胞周期蛋白的表达，其与 CDK2 和其他在 S 期中起重要作用的蛋白质形成复合物。形成一个正反馈回路，其中细胞周期蛋白 E-CDK2 进一步磷酸化 RB1，从而进一步抑制 E2F 介导的抑制信号并触发 S 相变 （图 1）。图1：CDK4/6抑制剂的作用机制。a，未磷酸化视网膜母细胞瘤1（RB1）通过与E2F转录因子结合抑制细胞周期相关基因的转录。随着细胞从 G0 进展到早期 G1，cyclin D 水平增加，细cyclin D 与细胞周期蛋白依赖性激酶 （CDK） 4/6 形成复合物。b，细胞周期蛋白 D-CDK4/6 复合物磷酸化 RB1，从而降低 RB1 对 E2F 介导的转录的抑制作用。部分激活的 E2F 激活 S 期转录程序，其中包括 CCNE1 的表达，CCNE1 与 CDK2 结合并部分激活，这导致 RB1 在 G1 期晚期进一步磷酸化。p27 抑制细胞周期蛋白 E/CDK2 的完全激活，蛋白体介导的 p27 降解是触发 S 期进入和 DNA 复制启动的开关。CDK 调节受两组抑制蛋白的影响，称为 INK 家族和 CDK 抑制剂 1-激酶抑制蛋白 （CIP/KIP） 家族。INK 家族由四种结构相关的蛋白质（p16、p15、p18 和 p19）组成，相对于其他 CDK 同工酶，对 CDK4 和 CDK6 具有高亲和力。p16 是特征最广泛的，而稳健的 p16 上调是 RB1 功能丧失的标志。p16 蛋白与 CDK4 和 CDK6 形成复合物，抑制cyclin D 的结合，从而阻止 RB1 磷酸化和细胞周期进程。CIP/KIP 蛋白组包括 p27、p21 和 p57 。p21 和 p27 普遍表达，而 p57 仅由组织子集表达。p27 与 CDK4/6-细胞周期蛋白 D 复合物结合，具有完全 CDK4/6 活性所需的三聚体复合物。在体外，p27 与 CDK4/6- cyclin D 的结合降低了临床 CDK4/6 抑制剂的效力，尽管这种相互作用是否会影响临床疗效仍不确定。相比之下，p27 抑制 CDK2，p27 的降解是触发 G1-S 相变的关键步骤（图 1）。CDK4/6 在控制细胞周期的 G1-S 周期转变中的主导作用高度依赖于细胞类型。单个 Cdk4 或 Cdk6 小鼠敲除是非致命的，反映了 CDK4 和 CDK6 之间的很大程度的功能补偿。然而，Cdk4 和 Cdk6 的双重敲除导致胚胎晚期严重、致命的贫血，尽管非血液细胞类型的增殖在很大程度上不受影响，CDK2 代偿了 CDK4/6。来自单个细胞追踪实验的数据表明，有丝分裂后子细胞中CDK2的表达水平决定了哪些细胞变得静止（低CDK2活性）以及哪些细胞直接通过细胞周期（高CDK2活性）。“新生”具有高水平 CDK2 活性的细胞可能不需要 CDK4/6 进行增殖，这一观察结果可能解释了 CDK4/6 抑制剂在源自此类细胞的肿瘤中缺乏活性的原因。3. CDK4/6 在乳腺癌中的应用在癌症中成功抑制 CDK4/6 信号依赖于完整的细胞周期蛋白 D-CDK4/6-RB1 轴，以及细胞类型对 CDK4/6 的特异性依赖性，以便通过 G1 限制点过渡。细胞周期蛋白 D1 通常在雌激素受体阳性 （ER+） 乳腺癌患者的样本中高水平表达。在大约 13% 的原发性乳腺癌中，这种过表达反映了编码细胞周期蛋白 D1 的 CCND1 的扩增。此外，CCND1 表达直接受内质网调控;然而，在没有 CCND1 扩增的情况下，细胞周期蛋白 D1 表达水平可能很高。来自几项研究的数据表明，细胞周期蛋白 D 还能够以不依赖激素的方式直接促进内质网激活，ER 信号传导和细胞周期蛋白 D1 之间的这些多重联系可能解释了 ER+ 乳腺癌细胞对 CDK4/6 细胞周期进程的选择性依赖。完整的 RB1 对于依赖 CDK4/6 信号传导也是必需的，RB1 失活仅发生在 1-2% 的原发性和未经治疗的转移性内质网乳腺癌中。RB1 缺失更常与luminal B 型生物学相关，并可能作为对 CDK4/6 抑制剂耐药的机制获得。4. CDK4/6抑制剂在肿瘤免疫中的作用除了在细胞周期调节中发挥作用外，CDK4/6抑制剂调节免疫肿瘤微环境的能力也越来越明显。CDK4/6抑制通过增加肿瘤细胞的抗原呈递能力来促进抗肿瘤免疫，增加T细胞活化抑制调节性 T 细胞(Treg)，并改变 T 细胞对记忆 T 细胞的平衡。来自各种临床前研究的数据表明，CDK4/6抑制剂具有提高免疫检查点抑制剂（ICI）疗效的潜力。在neoMONARCH研究中，对接受新辅助阿贝西利加阿那曲唑(abemaciclib plus anastrozole)的患者的活检样本和手术标本的分析中也观察到与炎症和抗肿瘤免疫相关的基因的上调。CDK4/6 抑制剂激活内源性逆转录病毒逆转录转座子被认为会导致肿瘤细胞抗原呈递增加。抑制这种逆转录转座子的 DNA 甲基转移酶 1 是一种 E2F 通路靶基因，受 CDK4/6 抑制下调。逆转录转座子激活导致细胞内双链RNA水平升高，从而触发抗病毒防御机制，并导致编码MHC和IFN信号传导的基因上调。在新辅助(neoadjuvant) NeoPalAna 试验中，从接受 palbociclib 的患者获得的活检样本中也观察到参与干扰素信号传导的基因上调。CDK4/6抑制剂也可能促进细胞毒性T细胞反应。在体外过表达 PD-1 的 Jurkat T 细胞中抑制 CDK4/6 激活 NFAT 蛋白家族，导致 IL-2 的产生以及小鼠模型中效应 T 细胞的增殖、归巢和激活。趋化因子 CXCL9 和 CXCL10 的表达，它们控制 T 细胞向肿瘤的运输，在暴露于 CDK4/6 抑制剂后增加，这可能解释了在这种情况下观察到的 T 细胞归巢增加的原因。CDK4/6 抑制似乎也将 T 细胞转向中枢记忆表型（抑制 Treg表型），这可能会使抗肿瘤免疫反应更持久。CDK6 在 Treg 细胞中表达较高与其他 T 细胞亚型相比，可能解释了这种细胞类型对 CDK4/6 抑制剂的敏感性增加。5. 比较临床批准的CDK4/6抑制剂所有三种主要的CDK4/6抑制剂均已在欧洲、美国和其他几个地区获批临床使用，以及在中国获批的dalpiciclib(达尔西利，恒瑞)，被设计为对 CDK4/6 具有相对选择性，但对其他 CDK 具有不同程度的抑制活性。Palbociclib 对 CDK4 和 CDK6 具有相似水平的亲和力，ribociclib 和 abemaciclib 都是更有效的 CDK4 抑制剂。与 CDK6 相比，Ribociclib 对 CDK4 的相对亲和力最高。Abemaciclib 与 ribociclib 和 palbociclib 的不同之处在于其抑制更广泛其他激酶（包括 CDK2）的能力，尽管程度低于 CDK4 或 CDK6。这些对 CDK4 和 CDK6 的不同亲和力可能解释了这三种药物毒性特征的一些差异。CDK4 是ER+乳腺癌细胞中的主要激酶，抑制 CDK4 被认为可以解释 CDK4/6 抑制剂在这种情况下的疗效，而 CDK6 是骨髓祖细胞中的主要激酶，抑制 CDK6 被认为会导致中性粒细胞减少。Abemaciclib 对 CDK2 的弱抑制可能是该药物差异活性的重要决定因素。例如，在一些体外模型中，palbociclib耐药细胞也对ribociclib耐药，但对abemaciclib仍然敏感。这种明显的耐药性缺乏可能是由同时的 CDK2 抑制引起的。然而，这一结果并未在所有模型中复制，并且仍然是一个活跃的研究领域。与其他 CDK4/6 抑制剂相比，abemaciclib 的中枢神经系统 （CNS） 渗透程度似乎也存在差异。在异种移植模型中，与palbociclib相比，abemaciclib能够穿过血脑屏障（BBB），渗透水平更高。这种增强的渗透可能反映了与 palbociclib 相比，abemaciclib 的外排减少，这是由于与 BBB 上存在的外排转运蛋白的不同相互作用。abemaciclib 的中枢神经系统渗透浓度足以使 CDK4/6 的临床相关抑制已在临床研究中得到证实。这些药物之间的其他临床相关差异包括生物利用度和代谢的变化，因此由于消除半衰期较短（abemaciclib为18.3 h，palbociclib为29 h，ribociclib为32 h），因此abemaciclib需要每日两次给药。6. CDK4/6抑制剂在乳腺癌患者的应用6.1 转移性乳腺癌三种CDK4/6抑制剂：Palbociclib、ribociclib 和 abemaciclib。这三种抑制剂的中位无进展生存期（PFS）结果非常一致（表 1）。表1 CDK4/6抑制剂在转移性ER+HER2-患者中的部分研究1. 帕博西利(Palbociclib)PALOMA-1 的结果，一项随机II期研究，在一线治疗中测试了帕博西利联合来曲唑(palbociclib plus letrozole)，基于中位PFS的统计学显著改善，FDA于2015年加速批准了该组合。这一改善在随后的III期PALOMA-2研究中得到了证实（表 1）。在这两项研究中，所有患者之前都没有接受过转移性疾病的治疗，也不允许之前接受过任何化疗。III期PALOMA-3试验，证明氟维司群加帕博西利与氟维司群(fulvestrant plus palbociclib)加安慰剂相比具有优越性（表 1）。所有患者在既往内分泌治疗中均出现疾病进展，并允许接受最多一线化疗治疗晚期疾病。除了中位PFS显著改善外，氟维司群联合帕博西利组患者的后续化疗的中位时间更长（17.9个月 vs 8.8个月）。2. 阿贝西利布(abemaciclib)在一线治疗中，III期MONARCH-3试验的数据显示，与palbociclib联合来曲唑联合芳香化酶抑制剂（阿那曲唑或来曲唑，anastrozole or letrozole）联合阿贝西利所取得的结果相似（表 1）。几乎一半的患者（46.7%）既往接受过早期乳腺癌的内分泌治疗，其中27%的患者既往接受过芳香化酶抑制剂。在所有亚组中均观察到获益，包括先前接受过芳香化酶抑制剂的亚组。在III期MONARCH-2试验中，氟维司群联合阿贝西利(fulvestrant plus abemaciclib) 在一线内分泌治疗疾病进展或辅助内分泌治疗疾病复发的患者中进行了测试。在转移性情况下，只允许进行一种既往的内分泌治疗，并且不允许既往化疗。与接受安慰剂组相比，abemaciclib治疗组的PFS显著改善，客观缓解率（ORR）显著增加，为48.1%，而单用芳香化酶抑制剂组为21.3%（表 1）。在 II 期 MONARCH-1 研究中单药 Abemaciclib 在晚期 HR+HER2- 乳腺癌患者中进行了测试。试验人群接受了大量预处理（既往治疗的中位数三线），尽管所有受试者之前都没有接受过CDK4/6抑制剂。报告的ORR为19.7%，中位PFS为6个月。该ORR高于一项测试palbociclib单药的小型II期研究（ORR 6%）所见的ORR和一项测试 ribociclib 的 I 期研究 （ORR 5.6%）。这些患者也进行了重度预治疗，≥70%的患者在进入研究之前接受了两线或更多线治疗，另外30%的患者接受了四线或更多线治疗。这种增加的疗效可能反映了 abemaciclib 对 CDK2 的弱抑制，但 palbociclib 或 ribociclib 没有，尽管这仍然是一个未经证实的假设，因为 abemaciclib 还抑制一系列其他激酶。唯一获得 FDA 批准用作单一药物的 CDK4/6 抑制剂是 abemaciclib。该药物可作为晚期 HR+HER2− 乳腺癌患者的单药治疗，在内分泌治疗和化疗后发生进展后使用，尽管在美国以外仍未获得批准。该批准是基于MONARCH-1试验的数据。3. 瑞博西利(ribociclib)III期MONALEESA-2试验旨在研究 ribociclib 加来曲唑(letrozole)在一线治疗中的疗效。中位PFS数据与abemaciclib和palbociclib在相似队列中的结果一致（表 1）。在 III 期 MONALEESA-3 试验中，将ribociclib联合氟维司群(ribociclib plus letrozole)的疗效与氟维司群的疗效进行比较，结果显著改善了中位PFS（表 1）。大约一半的队列既往接受过晚期疾病的内分泌治疗，另一半在辅助内分泌治疗后疾病复发。与PALOMA-3试验（9.5个月）相比，MONALEESA-3试验（20.5个月）治疗组的中位PFS在数值上更高，这可能反映了MONALEESA-3试验中约一半的患者在一线接受研究治疗的事实。事实上，来自亚组分析的数据表明，在MONALEESA-3试验的治疗组中，接受二线治疗的患者的中位OS在数值上低于接受一线治疗的患者。Ribociclib 是 MONALEESA-7 试验中唯一在包括绝经前患者在内的队列中评估的 CDK4/6 抑制剂，尽管其他研究也纳入了此类患者（表 1）。所有受试者都接受了卵巢功能抑制，无论内分泌如何。晚期疾病患者不允许先前进行内分泌治疗，但允许最多进行一种先前的化疗。该人群的中位PFS和OS与绝经后患者的研究中一致。2018 年 7 月，FDA 批准的 ribociclib 联合芳香化酶抑制剂的适应症扩大到包括绝经前和围绝经期患者。由于心脏毒性风险增加，这种扩展不允许与他莫昔芬(tamoxifen)联合使用。普遍的共识是，CDK4/6抑制剂在接受卵巢抑制的绝经前患者中具有与绝经后患者相同的活性水平。6.2 毒性三种批准的CDK4/6抑制剂在毒性特征方面存在一些临床上重要的差异。在 I 期安全性评估中，中性粒细胞减少是 palbociclib 和 ribociclib 的主要剂量限制性毒性 （DLT），而 ribociclib 还导致其他 DLT，包括 QTc 间期延长。在MONALEESA-7试验中，接受他莫昔芬作为内分泌治疗的患者更常见（16% vs 7%）。相比之下，abemaciclib 的主要 DLT 是腹泻和疲劳。这些结果反映在III期数据中，其中palbociclib和ribociclib最常见的毒性是中性粒细胞减少（在PALOMA-2试验中，66.5%的患者为3-4级事件，而安慰剂组为1.4%，MONALEESA-2试验为60% vs 4%)。然而，据报道，两种药物的发热性中性粒细胞减少症发生率都非常低（palbociclib组为2.1%，ribociclib组为1.5%），这可能表明尽管循环水平较低，但仍有一部分中性粒细胞保持功能。这两种药物的其他常见毒性包括疲劳、恶心和脱发。与palbociclib相比，Ribociclib 似乎导致任何级别的恶心（53% vs 35% 的患者）和肝功能检查异常（20% vs 12%）的发生率更高。在MONALEESA-2试验中，10例接受ribociclib治疗的患者（3%）的QTc间期延长了>60 ms，而来曲唑(letrozole)组有1例患者（0.3%）。这些患者大多无症状，使用ribociclib剂量调整来管理事件;尽管如此，目前的指南建议所有开始使用 ribociclib 的患者都应在前两个周期接受心电图监测。QT间期延长药物的伴随处方也是禁忌的。与 palbociclib 和 ribociclib 相比，abemaciclib 具有更明显的毒性特征。在MONARCH-2和MONARCH-3试验中，高达90%接受abemaciclib的患者发生腹泻，并导致20%的剂量改变（遗漏，减少或停药）。Ribociclib 诱发的腹泻通常发生在治疗过程的早期，中位发病时间为 7 天。然而，在 MONARCH-3 试验的 abemaciclib 队列中，3-4 级中性粒细胞减少症的发生率（在 24% 的患者）低于其他CDK4/6抑制剂。另一个似乎是abemaciclib独有的不良反应是血清肌酐升高，这通常会持续治疗期间。这种效应似乎反映了尿肌酐排泄的减少，而肾功能没有任何可检测到的变化，肾功能在停用 abemaciclib 后恢复到以前的水平。abemaciclib 还注意到静脉血栓栓塞 （VTE） 的风险小而明显增加。在 MONARCH-3 试验中，20 例患者 （6.1%） 发生 VTE，而接受安慰剂的患者为 0.6%。在对 364 名接受 abemaciclib 的患者数据的真实世界分析中，7.4% 的患者发生了血栓事件。在MONARCH-E试验中，abemaciclib 与 tamoxifen联合使用可进一步增加VTE的风险（4.3% vs 与芳香化酶抑制剂联合使用时为1.8%）。对于更有可能接受他莫昔芬治疗的绝经前患者来说，这种风险增加是一个重要的考虑因素，应根据患者特定的血栓栓塞危险因素仔细权衡。上市后监测研究显示，与对照组相比，接受三种药物中任何一种的患者发生肺炎或间质性肺病的风险增加（1.6% vs 0.7%）。然而，这些事件发展的机制尚不清楚。这些毒性特征的差异为临床医生提供了定制药物选择的机会，以最好地满足个体患者的需求。如果一种药物存在毒性问题，通常认为改用替代 CDK4/6 抑制剂是合理的选择。6.3 OS 结果现已获得三种已获批的CDK4/6抑制剂的OS数据。与PFS数据相比，OS数据在各药物之间并不一致（表 1）。对于 ribociclib，长期随访显示，在 MONALEESA-3 试验中，与氟维司群(fulvestrant)联合使用后，OS 均有一致的统计学显着改善和来曲唑(letrozole)在MONALEESA-2。在MONALEESA-7试验中，绝经前患者也观察到类似程度的改善。对于abemaciclib，长期随访也显示，在MONARCH-2试验中，氟维司群联合使用均有统计学意义的改善，在MONARCH-3试验中，与来曲唑联合使用在数值上相似但尚未有统计学意义的改善。相比之下，在PALOMA-3试验中，palbociclib与氟维司群联合使用时，OS在数值上有所改善，但无统计学意义，但在PALOMA-1试验中没有显示来曲唑联合使用改善OS的明确证据或 PALOMA-2 试验。鉴于相似的PFS中位数据，这些结果有些令人惊讶，有许多可能的解释。对于测试含氟维司群组合的研究，研究设计的差异可能为OS结局的差异提供了最可能的解释。PALOMA-3试验的队列纳入了更大比例的预处理患者（>50%的患者既往接受过两线或更多线治疗，33%的患者接受过晚期化疗），这降低了氟维司群在对照组中的疗效，因此也限制了中位PFS的绝对改善程度（6.8个月）。MONARCH-2 试验的纳入标准允许患者既往接受过单线内分泌治疗，并导致 PFS 的中等绝对改善（8.5 个月），而 MONALEESA-3 试验主要招募接受辅助内分泌治疗的疾病复发患者，并证明中位 PFS 的绝对改善最大（12.2 个月）。OS结果与PFS的绝对改善相匹配，其中MONALEESA-3试验的中位OS获益最大，PALOMA-3试验的中位OS获益最低。氟维司群研究得出的一个潜在结论是，CDK4/6抑制剂应主要用于一线治疗，在这种治疗中，药物可提供最高水平的绝对获益，并最终转化为OS的最实质性改善。对于测试CDK4/6抑制剂加来曲唑的研究，存在两种不同的解释。首先，这些研究的设计没有足够的功效来检测OS的统计学显着改善，这种有限的功效增加了偶然发生任何发现的风险，即使对OS的真正影响是相同的。在 PALOMA-2 试验中，27% 的患者在疾病进展后交叉使用 CDK4/6 抑制剂，并且 palbociclib 组 13% 和安慰剂组 21% 的患者缺乏 OS 数据，这可能导致偏倚。这些试验的中位PFS结果高度一致，支持这一观点，认为这是palbociclib组中位OS缺乏改善的最可能解释。对来曲唑研究数据的第二种解释是，两种药物的疗效存在真正的差异，palbociclib的疗效不如ribociclib或abemaciclib，这反映在缺乏OS的显著改善上，这在PFS结果中没有得到体现。临床前数据表明，abemaciclib 和 ribociclib 都是比 CDK6 更有效的 CDK4 抑制剂，CDK6 抑制导致更大的骨髓相关不良事件，从而可能限制 palbociclib 的耐受性，为这一观点提供支持。6.4 目前使用 CDK4/6 抑制剂根据上述研究，CDK4/6抑制剂现在被推荐作为大多数晚期HR+HER2-患者的一线治疗乳腺癌。该建议排除在某些患者中使用 CDK4/6 抑制剂的例外情况包括早期器官衰竭和/或其他相关合并症，例如肝功能差。对于早期器官衰竭患者（通常是由于侵袭性疾病，有内脏危象风险，伴有症状性器官浸润和疾病快速进展），标准方法是使用化疗，然后进行维持性内分泌治疗和 CDK4/6 抑制剂，尽管 2023 年 3 月提交的 II 期 RIGHT Choice 试验的会议摘要提供了一些证据表明，ribociclib 联合内分泌治疗可能比化疗更有效设置。推荐的 CDK4/6 抑制剂伴随内分泌治疗是芳香化酶抑制剂，如果患者在辅助治疗期间或停止治疗后 12 个月内出现疾病进展，则使用氟维司群。患者的年龄和绝经状态不应影响决策。CDK4/6抑制剂的选择在一定程度上反映了医生的偏好，尽管三种获批药物之间的差异允许毒性特征与合并症进行某种匹配。Palbociclib 一直是许多医生的首选标准选择，这主要是由于该药物的早期批准，尽管在获得 OS 数据后已转向使用其他 CDK4/6 抑制剂。CDK4/6抑制剂的正确给药时机（一线治疗与后线治疗）在SONIA试验中得到解决。患者被随机分配接受一线Palbociclib加芳香化酶抑制剂，然后接受二线氟维司群与芳香化酶抑制剂作为一线治疗，然后接受二线Palbociclib加氟维司群治疗，第二次进展的时间没有差异（HR 0.87,95% CI 0.74–1.03;P = 0.10）。本研究不足以评估 OS 的差异。从表面上看，SONIA 试验挑战了将芳香化酶抑制剂加 CDK4/6 抑制剂作为一线治疗的标准临床范式，但需要注意的是，这项研究旨在显示 CDK4/6 抑制剂组合在一线治疗中的优越性，而不是非劣效性。自 SONIA 试验以来，氟维司群单药治疗已被超越，现在是仅次于芳香化酶抑制剂加 CDK4/6 抑制剂的次优二线治疗，因为其活性太低;此外，Palbociclib 也不再是许多医生首选的 CDK4/6 抑制剂。目前，在二线治疗中，有几种比氟维司群单药更有效的替代药物：在 ESR1 突变患者中，依拉司群elacestrant提供了一种更有效的替代药物， fulvestrant 加alpelisib联合治疗PIK3CA和/或AKT信号通路改变的患者也是如此，以及，经批准后，Capivasertib和依维莫司（everolimus）组合。SONIA试验可能开启了将芳香化酶抑制剂作为单药一线治疗的可能性，可能用于有合并症的老年患者，尽管这些数据不太可能广泛影响临床实践。6.5 辅助治疗绝大多数乳腺癌患者表现为早期疾病（I-III 期），可以以手术的形式提供潜在的根治性治疗，联合或不联合新辅助和/或辅助化疗和/或放疗。通常持续 5-10 年的内分泌治疗可降低复发率，但仍有大量患者出现疾病复发，局部或远处复发。几项大型试验评估了 CDK4/6 抑制剂在绝经前和绝经后妇女辅助治疗中延长无复发生存期的潜力。与涉及转移性疾病患者的试验的类似结果相比，在这种情况下，疗效似乎存在明显差异。1. 帕博西利(palbociclib)随机III期PALLAS试验，比较了 5,761 例 II-III 期 ER+HER2− 乳腺癌患者初次手术后 palbociclib 联合内分泌治疗与单独内分泌治疗 2 年。在这项研究中，选择为期 2 年的 palbociclib 疗程是基于许多因素，包括 palbociclib 的细胞抑制作用机制表明需要延长治疗，原发性乳腺癌治疗后延长使用内分泌治疗长达 10 年就证明了这一点，以及安全有效地监测患者不良事件的能力。根据标准护理方法，内分泌治疗持续 5-10 年。主要终点是侵袭性无病生存期（iDFS）。经过 4 年的随访监测，帕博西利组的 iDFS 为 84.2%，安慰剂组为 84.5%。帕博西利组的毒性发生率显著更高（3级和4级不良事件分别为67.5%和5.7%，安慰剂组为14.4%和0.8%），并且大多是血液学的，与涉及晚期疾病患者的试验经验一致（表 2）。表2 ER+HER2−乳腺癌患者辅助治疗CDK4/6抑制剂的研究一项较小的队列III期研究，即PENELOPE-B试验，还评估了帕博西利在辅助治疗中的疗效，尽管在新辅助化疗后有残留病灶的高危人群中。本研究招募了 1,250 名临床病理分期-ER 分级 （CPS-EG） 评分为 \（\ge \）3 或 \（\ge \）2 且淋巴结阳性的女性。受试者被随机分配接受 1 年的 palbociclib 联合标准内分泌治疗与标准内分泌治疗加安慰剂。中位随访时间为42.8个月后，两组间iDFS的主要终点没有统计学上的差异（表 2）。2 年时出现了 4.3% 的小幅绝对 OS 获益，随着进一步随访而消失。观察到的毒性发生率和类型，与PALLAS试验和palbociclib在转移性环境中观察到的相似。2. 阿贝西利布(abemaciclib)与 PALLAS 和 Penelope-B 试验相比，MONARCH-E 试验在 ER+HER2−患者的标准内分泌治疗中加入 abemaciclib 显示出实质性且具有统计学意义的临床益处高危早期乳腺癌。在这项随机试验中，参与者连续接受 abemaciclib 治疗 2 年，同时接受标准护理内分泌治疗或单独内分泌治疗。该队列包括 5,637 名高危疾病患者，定义为四个或更多肿瘤阳性淋巴结或一至三个阳性淋巴结，具有以下附加特征之一：肿瘤直径 >5 cm、低分化（≥3 级）肿瘤或 >20% 的肿瘤细胞上 Ki67 表达。abemaciclib联合内分泌治疗组2年iDFS为92.2%，内分泌治疗加安慰剂组为88.7%。中位随访时间为 42 个月的更新分析显示，abemaciclib 组的 4 年 iDFS 为 85.5%，而内分泌治疗组为 78.6%（表 2）。这一结果提供了明确的证据，表明在患者完成预先指定的 2 年疗程后，abemaciclib 继续提供临床益处，这种遗留效应在辅助内分泌治疗中也观察到。接受 abemaciclib 治疗的患者中死亡人数较少，但最终 OS 数据仍不成熟。两组的治疗停药率相似（abemaciclib组为18.2%，单纯内分泌治疗组为17.1%）。在abemaciclib组中，不良事件是停止治疗的最常见原因（35% vs 6%），而非致死性iDFS事件（50% vs 30%在abemaciclib组）是对照组中最常见的停药原因。许多患者（43.6%）需要减少abemaciclib剂量以控制不良反应，主要是腹泻。令人欣慰的是，这些剂量减少似乎并没有影响肿瘤学结果。有趣的是，超过一半的停止治疗的患者以前没有减少剂量。这些观察结果强调了适当的患者咨询的临床重要性，以鼓励早期报告不良反应，并积极管理毒性，例如使用洛哌丁胺（loperamide）腹泻，以及减少剂量以实现长期治疗依从性。MONARCH-E 试验的数据也表明，Ki67 具有预后价值（因为高 Ki67 指数评分与较差的预后相关），尽管 abemaciclib 在高和低 Ki67 指数评分的患者中获益的相对水平相同。2021 年 10 月，abemaciclib 获得 FDA 批准作为早期 HR+HER2− 患者的辅助治疗乳腺癌符合与晚期疾病相同的高危疾病标准。在 2023 年 3 月更新的批准公告中，取消了对 Ki67 指数 ≥20% 的要求。3. 瑞博西利(ribociclib)2023年6月报告了III期NATALEE试验的初步数据。共有 5,101 例 ≥IIA HR+HER2- 乳腺癌患者被纳入组，并以 1：1 的比例随机分配到 ribociclib 或安慰剂加内分泌治疗组。该队列的风险略低于 MONARCH-E 试验。NATALEE还包括少数男性患者（0.4%）。Ribociclib 以每天 400 mg 的剂量给药（低于转移性疾病患者每天 600 mg 的标准剂量），以提高辅助治疗的耐受性。在最新的临界值，19%的患者因不良事件而停用了ribociclib。在这项试验中，ribociclib 被给予长达 3 年，将治疗持续时间延长到其他研究所见的程度之外，以试图最大限度地提高疗效。毒性与在转移性条件中测试ribociclib的研究中发现的毒性一致。NATALEE试验达到了改善iDFS的主要终点，ribociclib的3年iDFS为90.4%，而ribociclib的绝对获益为87.1%，绝对获益为3.3%（表2）。6.6 解释不同的佐剂结果药物之间活性的差异为研究之间结局的差异提供了最合理的解释。Abemaciclib 单药治疗在接受过大量预处理的内分泌治疗难治性疾病患者中的反应率高于 palbociclib 或 ribociclib，尽管在早期治疗中，当药物与内分泌治疗联合使用时，这种疗效差异不再明显。辅助治疗的早期疾病复发可能反映了高度增殖性癌症亚群的存在，被认为对内分泌治疗不敏感或最低敏感，来自该组的数据可能更接近于转移性环境的数据。虽然未经证实，但抑制更广泛激酶（尤其是CDK2）的能力可能解释了abemaciclib在此类癌症中单药活性的增加。目前，由于 NATALEE 试验的随访有限，因此不建议比较 MONARCH-E 和 NATALEE 试验的结果，以便对 abemaciclib 和 ribociclib 进行比较。6.7 新辅助治疗新辅助内分泌治疗历来仅用于少数患者;尽管如此，对 CDK4/6 抑制剂在早期乳腺癌中的活性的兴趣促使启动了几项试验，研究 CDK4/6 抑制剂联合内分泌治疗在新辅助治疗中的表现。到目前为止，所有的新辅助研究都是II期随机试验，可分为比较CDK4/6抑制剂加内分泌治疗与化疗的研究，如NeoPAL和CORALLEEN试验，以及仅以内分泌治疗为对照组的试验，例如 PALLET, FELINE, MONALEESA-1试验。选择的终点各不相同，但包括反应的生物标志物和被认为与 Ki-67 指数评分和病理完全缓解 （pCR） 率变化等结果相关的生物标志物。在比较CDK4/6抑制剂联合内分泌治疗与化疗的两项研究中，使用相同的50基因表达谱分析法选择了高危患者。在这两项研究中，所有患者在基线时的基因组风险评分均为中等或高。NeoPAL试验（palbociclib联合内分泌治疗与三个周期的5-氟尿嘧啶-表柔比星-环磷酰胺，然后三个周期的多西他赛）未能达到其主要终点，即20%的患者，残余癌症负担评分为0-1。值得注意的是，在这项试验中，对照组的结果也很差，只有 15% 的患者的残余癌症负担评分为 0-1，这可能反映了 HR＋ 乳腺癌对化疗的内在耐药性。在CORALLEEN试验中，患有HR＋luminal　B型的绝经后妇女被随机分配至ribociclib联合内分泌治疗或化疗组。主要终点是复发风险评分从基线到手术的变化。两组之间复发风险评分变化的患者数量大致相似，尽管ribociclib联合内分泌治疗显然具有一定的活性，但其效果并不优于化疗。比较CDK4/6抑制剂联合内分泌治疗与内分泌治疗的研究通常仅显示联合使用具有更高的抗增殖作用，尽管在pCR方面没有显着差异。目前正在等待本节讨论的所有研究中对无事件生存期进行长期随访。在新辅助治疗中实施 CDK4/6 抑制剂的主要障碍之一是缺乏准确的生物标志物，无法识别最有可能从添加 CDK4/6 抑制剂中获益的患者，因为许多患者仅接受内分泌治疗即可获得极好的结局。在单臂II期DxCARTES试验中，对新辅助 CDK4/6 抑制剂加内分泌治疗和分子降期的反应似乎与基线肿瘤生物学无关，需要进一步研究以确定有效的生物标志物。7. 其他乳腺癌亚型CDK4/6抑制剂在HR乳腺癌患者中活性的积极数据引起了人们对在其他肿瘤类型中测试这些药物的兴趣。作为一个异质性群体，三阴性乳腺癌 （TNBC） 被认为对 CDK4/6 抑制剂耐药，部分原因是基底样 TNBC 中细胞周期蛋白 E1 表达异常以及RB1更频繁的改变。然而，TNBCs的基因表达模式亚分类，揭示了一种表达雄激素受体 （AR） 的管腔雄激素受体 （LAR，luminal androgen receptor） 亚型。反映LAR亚型的细胞系和小鼠异种移植小鼠模型已被证明对palbociclib有反应。目前正在进行一项 I 期试验，测试该药物与抗 PD-1 抗体 avelumab 联合治疗 AR TNBC 患者 （NCT04360941）。HER2＋ 乳腺癌通常也属于管腔亚型 luminal subtype，小鼠模型携带已知对 CDK4/6 抑制剂敏感的 Erbb2 驱动的肿瘤。临床前证据表明，CDK4/6抑制剂可能会抵消对HER2靶向治疗的耐药性，但尚待临床确认。HER2靶向治疗曲妥珠单抗和帕妥珠单抗联合帕博西利正在新辅助治疗（NA-PHER试验）中进行研究，迄今为止的可用数据表明Ki67指数有统计学意义的下降（基线几何平均值为31.9，手术时为12.1;P = 0.013）以及有希望的pCR率（27%）。这种组合似乎是可以耐受的，并且可以为 HER2 乳腺癌患者提供无化疗的选择，因为 ORR 与 NeoSphere 试验中的化疗相似。在转移性条件中，目前正在研究CDK4/6抑制剂联合HER2靶向治疗和内分泌治疗的三项临床试验。III 期 PATINA 试验 （NCT02947685） 旨在确定在诱导化疗后使用曲妥珠单抗或帕妥珠单抗加内分泌治疗进行帕博西利维持治疗的效果。招募现已完成，研究预计将于 2026 年完成。II 期 PATRICIA 试验 （NCT02448420） 正在评估在接受过大量预处理的 HER2 乳腺癌患者群体（既往接受过两种或两种以上治疗，包括曲妥珠单抗）中使用 palbociclib 联合或不联合来曲唑。对队列 A 和 B（包括管腔内源性亚型患者）数据的早期分析表明，接受三联治疗的患者的 PFS 更长。这项研究现已结束招募。在MONARCH-HER试验将患有晚期HR+、HER2+疾病的女性随机分配至abemaciclib加氟维司群和曲妥珠单抗组（A组）、abemaciclib加曲妥珠单抗组（B组）或标准化疗组加曲妥珠单抗组（C组）。这些患者接受了大量预处理，包括曲妥珠单抗（96%）。该研究达到了A组和C组PFS差异的主要终点（8.3个月 vs 5.7个月）。中位OS虽然在数值上更长，A组为31.1个月，而C组为20.7个月，但未能达到统计学意义（HR 0.75,95%CI 0.47-1.21;P = 0.24），可能反映出缺乏统计功效。该队列的随访目前正在进行中，这种组合可以为晚期 HER2 疾病患者提供无化疗的选择。CDK4/6 抑制剂加 ICI化疗联合抗PD-L1抗体阿替利珠单抗(Atezolizumab)或抗PD-1抗体帕博利珠单抗(Pembrolizumab)。现已被批准作为 PD-L1+ 转移性 TNBC 患者的标准治疗，尽管这些药物在 HR+ 癌症患者中的作用目前尚不清楚。大多数HR+癌症被认为是“免疫冷肿瘤”，肿瘤浸润淋巴细胞水平低，因此它们对ICI不敏感。鉴于 CDK4/6 抑制剂的免疫调节作用，将它们与 ICI 联合使用可能有可能在先前耐药人群中释放后者的持久抗肿瘤作用。一项测试帕博利珠单抗联合 abemaciclib 的 Ib 期研究显示，在未选择 PD-L1 状态的患者中，其临床获益率与 CDK4/6 抑制剂单药治疗相当。患者被分为初治队列（队列 1）和既往治疗队列（队列 2）。队列 1 和队列 2 中分别有 69.2% 和 60.7% 的患者发生 ≥3 级治疗中出现的不良事件，包括 2 例与不良事件相关的死亡。在另一项涉及转移性疾病患者的早期研究中，据报道，在帕博西利加用帕博西单抗后，完全缓解率高达 31%，中位 PFS 和 OS 持续时间分别为 25.2 个月和 36.9 个月。这些研究的最终结果将有助于指导未来的试验计划。来自 PACE 试验的数据，其中接受 CDK4/6 抑制剂加内分泌治疗的患者的疾病进展是纳入标准，于 2022 年 12 月报告，这可能是迄今为止该领域最令人鼓舞的结果。本研究评估了 palbociclib 在疾病进展后的延续以及 avelumab 的添加。尽管与单纯内分泌治疗相比，继续使用palbociclib的中位PFS没有变化（4.6个月 vs 4.8个月），但三联组（palbociclib、阿维尤单抗(Avelumab) 和氟维司群）的中位PFS几乎翻了一番，达到8.1个月。8. 生物标志物分析(Biomarker)随着治疗范式变得越来越复杂，人们开始对最有可能从 CDK4/6 抑制剂中获得最大益处的患者以及肿瘤可能对治疗产生内在耐药性的患者进行前瞻性识别。这种方法将使昂贵的治疗只能用于那些可能获得有意义的益处，并避免那些不太可能改善生存结果的患者的毒性。8.1 遗传变异和内在耐药性(Intrinsic)CDK4/6抑制剂在有和没有常见遗传改变（如PIK3CA和TP53突变以及CCND1扩增）的肿瘤患者中均有持续的益处。存在罕见的ER+肿瘤突变亚群，例如携带 RB1 突变或编码其他信号通路成分的基因的亚群，这些亚群可能对 CDK4/6 抑制剂具有内在耐药性。在临床前模型中，用于灭活 RB1 突变或缺失的纯合肿瘤对治疗具有耐药性（图 2）在对MONALEESA试验队列样本的分析中，在循环肿瘤DNA（ctDNA）中检测到这些改变的患者从ribociclib中获得的益处明显低于野生型RB1患者（中位PFS为3.8个月 vs 18.9个月）。尽管如此，在未经治疗的 HR+ 乳腺癌患者中，预先存在的失活 RB1 突变或缺失很少见（<4% 的患者）。此外，单拷贝RB1缺失，保留野生型等位基因，不太可能导致对治疗的耐药性，尽管这种改变可能会通过丢失剩余的野生型等位基因来增加获得性耐药的可能性。BRCA2 位点位于 13 号染色体上的 RB1 附近。种系 BRCA2 突变患者的肿瘤通常以野生型 BRCA2 等位基因以及邻近的 RB1 等位基因缺失为特征。有研究表明，具有种系 BRCA2 突变的患者的 PFS 持续时间较短反映了这种共缺失，这使得剩余的野生型 RB1 等位基因容易受到治疗突变的影响。图2：CDK4/6抑制的耐药机制。已经建立了几种对细胞周期蛋白依赖性激酶 （CDK） 4/6 信号传导的耐药机制，包括：RB1 的失活突变和/或缺失;AURKA的扩增; Cyclin D-CDK4/6 抑制蛋白视网膜母细胞瘤 1 （RB1） 磷酸化的改变，包括激活编码受体酪氨酸激酶 （RTK） 的基因突变，例如 FGFR1 和 HER2 过表达，其中一些影响可能使用特定的 RTK 是可逆的;FAT1、ARID1A 或 PTEN 突变和/或缺失，导致 CDK6 过表达;CCNE1 过表达导致高水平的细胞周期蛋白 E 和 CDK2 的旁路激活;或 ESR1 突变，尽管 CDK4/6 受到抑制，但雌激素受体 （ER） 仍能促进细胞增殖。FAT1 是一种与 Hippo 信号通路相互作用的肿瘤抑制基因，在 HR+ 乳腺癌中很少失活。然而，失活突变的存在与对 CDK4/6 抑制剂的不良反应有关。FAT1 突变导致继发于 CDK6 表达增加，继发于编码 Hippo 信号通路成分的基因下调。由于FAT1突变的罕见性，识别真正失活的FAT1突变具有挑战性，从而限制了将该证据纳入临床实践。8.2 基因表达特征无论亚型如何，管腔Luminal A 型或 B 型乳腺癌患者始终受益于 CDK4/6 抑制剂，但富集 HER2 人群的结果可能差异更大，回顾性探索性生物标志物分析显示，在该亚组中，ribociclib 有益，但 palbociclib 无效。这一观察结果是否是回顾性分析的偶然发现尚不清楚;尽管如此，在正在进行的 III 期 HARMONIA 试验 （NCT05207709） 中，富含 HER2 的 ER+ 疾病患者被随机分配接受 palbociclib 或 ribociclib 联合内分泌治疗，该试验应提供一些额外的清晰度。前面提到的对 III 期 MONALEESA 试验数据的回顾性分析, 表明只有具有基底样亚型(basal-like)的患者没有从ribociclib中获益。这种亚型的肿瘤具有更高水平的Cyclin E1 表达和基因表达模式，更符合 TNBC 表型。罕见的内质网基底样亚型患者可能无法从 CDK4/6 抑制剂中获益，但没有足够的证据支持在此基础上停止治疗。两个相关的基因表达特征与对 CDK4/6 抑制剂的部分耐药性有关：高水平的 CCNE1 表达和高水平的 E2F 激活的特征。一项对PALOMA-3试验患者组织样本的分析显示，CCNE1 mRNA水平高与palbociclib疗效较差相关（中位PFS为7.6个月 vs 14.1个月）。细胞周期蛋白 E 过表达可通过激活 CDK2 诱导耐药性，从而实现旁路信号传导。在临床前研究中，过表达Cyclin E的细胞对CHK1抑制剂特别敏感、 WEE1 抑制和 PKMYT1 抑制。对新辅助试验（NeoPalAna 和 neoMONARCH）样本的生物标志物分析表明，与 IFN 信号传导相关的基因表达特征与对 CDK4/6 抑制剂的耐药性之间存在关联。尽管如此，所有这些发现的临床适用性尚不确定，因为在具有与耐药性相关的基因表达特征的患者中观察到一些活性，尽管水平较低。CDK4/6抑制剂在辅助治疗中获益的生物标志物仍然难以捉摸。到目前为止，尚未报告来自 MONARCH-E 或 NATALEE 试验队列的生物标志物分析;然而，2023 年 3 月公布的 PENELOPE-B 和 PALLAS 试验数据表明，一种复合生物标志物，其中包含内在亚型、孕酮受体状态和 ERBB2（编码 HER2）表达，可在手术标本中进行评估，从而能够识别可能从帕博西利辅助治疗中获得最大益处的患者亚组。9. 获得性耐药的机制尽管CDK4/6抑制剂是高效的治疗方法，但大多数患者最终都会产生耐药性。许多分子改变与对这些药物的耐药性有关。RB1 缺失是一种既定的耐药机制，已在细胞系和患者来源的异种移植模型中得到证实。在临床实践中，多达 10% 的 CDK4/6 抑制剂疾病进展患者获得两个 RB1 拷贝的改变或缺失，但在单独接受内分泌治疗的患者中看不到这种改变。RB1 改变可在 ctDNA 中检测到。鉴于现在接受 CDK4/6 抑制剂的患者数量，RB1 缺陷肿瘤患者的数量将会增加;因此，为这一不断增长的子集确定临床有效的治疗策略将变得越来越重要。RB1 丢失后，细胞周期的进展以 CDK4/6 非依赖性方式驱动。Aurora 激酶 A （AURKA） 是一种在细胞分裂中起重要作用的激酶，与对 CDK4/6 抑制剂的内在性和获得性耐药性有关和内分泌治疗。有趣的是，在临床前模型中，当RB1缺失时，AURKA的抑制似乎是合成致死的，这种效果正在这种临床环境中进行探索。在临床前模型中，RB1 缺失似乎预示着对纺锤体组装检查点苏氨酸酪氨酸激酶的靶向抑制的反应。某些 palbociclib 耐药细胞系在长期暴露于 CDK4/6 抑制剂后获得 CDK6 扩增，CDK6 表达促进耐药性。也可以出现高水平的 CDK6 表达，至少部分是在此类细胞中 microRNA 表达变化介导的 TGFβ 信号传导抑制之后。敲除 CDK6 可恢复对 CDK4/6 抑制剂的敏感性。在临床前模型中，CDK6 表达也因 PTEN 和 ARID1A 的缺失而增加。这些模型中PTEN的损失可以通过AKT抑制剂和CDK4/6抑制剂的组合来克服。2022 年 12 月报告的 CAPiTello-291 试验数据证实了 AKT 抑制剂 capivasertib 在编码 AKT 信号通路成分（包括 PTEN）基因突变的患者中的临床活性)。生长因子信号通路异常（如 FGFR1 过表达）是另一种被充分描述的内分泌治疗耐药机制，并且这种改变也被证明在临床前降低了对CDK4/6抑制剂的敏感性，以及对 MONARCH-3 试验的临床样本的评估。这种耐药机制被认为是由 ER 和 MAPK 激活下游信号通路的改变介导的，并且可以使用 FGFR 抑制剂逆转耐药表型。事实上，在FGFR1过表达的患者来源的异种移植模型中，在加入FGFR酪氨酸激酶抑制剂厄达替尼，比帕博西利联合或不联合内分泌治疗更有效地抑制肿瘤生长。在从CDK4/6抑制剂耐药肿瘤患者队列中获得的样本中也发现了FGFR信号通路下游元件的突变，为未来的治疗提供了潜在的靶点。致癌转录因子 c-MYC 在 CDK4/6 抑制剂耐药细胞系中上调。在 MONARCH-3 试验中，5% 的 abemaciclib 疾病进展患者发现了 MYC 的获得性突变，及nextMONARCH 试验中 9%。因此，MYC上调可能是获得性耐药的另一种生物标志物。CDK4/6抑制剂与内分泌治疗同时给药; 因此，患者可能会对这种治疗组合的内分泌成分产生耐药性。ESR1 突变是此类药物耐药性最广泛的机制，尽管在给予内分泌治疗之前很少检测到，可见于对内分泌治疗产生耐药性的肿瘤。对 PALOMA-3 试验样本的分析表明，在存在多个 ESR1 突变，特别是 ESR1Y537S突变在耐药人群中发现。2022 年发表的 EMERALD 试验数据表明，在存在或不存在这种突变的情况下，对后续治疗的反应可能有所不同。患者在接受 CDK4/6 抑制剂加内分泌治疗后出现进展，并随机分配至氟维司群加芳香化酶抑制剂组与口服选择性ER降解剂elacestrant（SERD，selective ER degrader）组。在接受elacestrant治疗的携带ESR1突变的肿瘤患者中，中位PFS显著增加（从2.1个月到8.6个月），这种效应在既往使用CDK4/6抑制剂治疗持续时间较长的患者中更为明显。基于这些数据，FDA 于 2023 年 1 月批准 elacestrant 用于 ESR1 突变的晚期乳腺癌患者，这些患者在接受过一种或多种内分泌治疗后疾病进展。ERBB2 中的激活突变也与内分泌治疗和 CDK4/6 抑制剂的耐药性有关，而且，至少根据临床前证据，可以通过添加HER2酪氨酸激酶抑制剂奈拉替尼来克服耐药性。II期SUMMIT研究提供了一些临床证据，表明奈拉替尼(neratinib)在这种情况下的疗效。患者可能会积累多个亚克隆，因此具有几种不同的改变，这些改变共同导致了耐药表型。使用精确方法确定耐药机制，可能在以放射学可检测的疾病复发形式出现临床耐药性之前进行ctDNA追踪，可能有助于减少耐药克隆的增殖并实现早期治疗，从而延缓疾病进展的发生。在 PADA1 研究中，监测接受 palbociclib 联合芳香化酶抑制剂的患者在 ctDNA 中的 ESR1 突变状态，并在检测到突变的情况下随机分配至继续使用芳香化酶抑制剂与氟维司群联合继续使用 palbociclib。初步结果表明，在这一阶段转换治疗有益（中位PFS为5.7个月 vs 11.9个月;HR 0.61,95% CI 0.43–0.86;P = 0.004）; 最终结果正在等待中。10. CDK4/6抑制后的治疗单药内分泌治疗（如氟维司群）对使用 CDK4/6 抑制剂治疗疾病进展的患者效果较差。在CAPitello-291试验中，既往接受过CDK4/6抑制剂治疗的患者中，氟维司群单药治疗的中位PFS为2.6个月，而未接受过CDK4/6抑制剂治疗的患者中位PFS为7.2个月。结合内分泌治疗和 PI3K-AKT-mTOR 通路抑制剂的方案越来越被视为使用 CDK4/6 抑制剂后疾病进展后的标准治疗方法。两项研究在此背景下测试了PI3K抑制剂alpelisib：SOLAR-1试验 和较小的 BYLieve 试验。在 SOLAR-1 试验中，对内分泌治疗的耐药性是主要的纳入标准，只有 6% 的受试者之前接受过 CDK4/6 抑制剂。这个小亚组从alpelisib中获得的益处与其他队列相似。BYLieve试验还证明了alpelisib在既往接受过CDK4/6抑制剂治疗的患者中的临床活性。靶向该信号通路的其他下游元件是一个有吸引力的前景。在 CAPitello-291 试验中，AKT抑制剂capivasertib在CDK4/6抑制剂预处理和初治队列中具有相似水平的获益。如前所述，依拉司群是另一种药物，与内分泌治疗相比，对使用 CDK4/6 抑制剂疾病进展的患者疗效更高。在获得 FDA 批准后，该药物很可能成为 CDK4/6 抑制剂进展后的 ESR1 突变癌症患者的标准治疗。在过去几年中发表的试验已经调查了在疾病进展之后继续使用 CDK4/6 抑制剂的潜力。在 II 期 MAINTAIN 试验中，内分泌治疗加 CDK4/6 抑制剂后疾病进展的患者被随机分配接受exemestane或氟维司群联合或不联合 ribociclib。大多数患者既往接受过氟维司群（83%）加帕博西利（84%）治疗。在氟维司群或exemestane联合使用ribociclib的中位PFS为5.3个月，而单独使用内分泌治疗组为2.8个月（HR 0.56,95%CI 0.37–0.83;P = 0.004）。同样，在 II 期 PACE 试验中，CDK4/6 抑制剂治疗疾病进展期的HR+HER2−乳腺癌在进展后被随机分配接受氟维司群联合或不联合帕博西利。大多数患者（90.9%）既往接受过palbociclib治疗，中位PFS无显著差异（palbociclib联合内分泌治疗组为4.6个月，内分泌治疗组为4.8个月）。与PACE试验中继续使用相同的CDK4/6抑制剂相比，大多数MAINTAIN试验队列中接受的CDK4/6抑制剂类型的变化可能解释了这些不同的结果。在参加 PALMIRA 试验的患者中，尽管该药物较早出现疾病进展，但也有意继续使用 palbociclib。患者被随机分配继续帕博西利加二线内分泌治疗或单独二线内分泌治疗。中位PFS差异无统计学意义（4.2个月 vs 3.6个月;HR 0.8,95% CI 0.66-1.1;P = 0.206）。对于abemaciclib，一项小型观察性研究的数据表明，以前接受过palbociclib的患者有一些活性。在现已结束招募的 III 期 postMONARCH 试验 （NCT05169567） 中，符合条件的患者必须在一线内分泌治疗加 CDK4/6 抑制剂或辅助治疗后出现疾病进展，并被随机分配到 abemaciclib 加氟维司群与单独使用氟维司群。该试验将为在二线环境中继续使用 CDK4/6 抑制剂的疗效提供进一步证据。有趣的是，这项研究还包括在辅助治疗中接受 CDK4/6 抑制剂后疾病进展的患者，鉴于 2023 年 3 月辅助治疗 abemaciclib 获得批准，这正成为一个越来越重要的问题。需要这些研究和进一步研究的全部结果来确定在疾病进展后继续使用 CDK4/6 抑制剂治疗是否能提供任何益处，以及治疗顺序是否重要。11. 使用ctDNA指导治疗与肿瘤组织活检样本的分析相比，液体活检提供了一种侵入性较小的方法来评估某些基因组改变的存在与否，并且可能比传统成像更灵敏地监测疾病复发。在CDK4/6抑制剂的背景下，该技术未来可能会出现两种潜在用途。在开始使用 CDK4/6 抑制剂后不久，对治疗有反应的患者通常 ctDNA 水平降低，而无反应的患者 ctDNA 水平相对于基线没有变化。ctDNA水平的这些早期动态改变可用于识别可能需要额外治疗的患者。在这方面，目前正在招募患者的 II 期 FAIM 试验 （NCT04920708） 正在随机分配在 CDK4/6 抑制 2 周后 ctDNA 水平相对于基线没有降低的患者接受 AKT 抑制剂 ipatasertib 联合正在进行的治疗与仅进行治疗。在对治疗有初步反应后，液体活检可用于监测耐药突变的出现，然后再通过影像学检查发现疾病进展。PADA1试验在帕博西利加芳香化酶抑制剂的一线治疗期间，使用液体活检样本检测 ESR1 突变的出现，在放射学进展前检测 ESR1 突变时，将患者随机分配到氟维司群组与芳香化酶抑制剂组，PFS 有显着改善。III 期 SERENA6 试验 （NCT04964934） 正在招募患者，并将监测接受一线 CDK4/6 抑制剂的患者液体活检中的 ESR1 突变，患者从芳香化酶抑制剂转为下一代口服 SERD camizestrant 加 CDK4/6 抑制剂在检测到 ESR1 后继续使用 CDK4/6 抑制剂疾病进展前的突变。未来，这些方法可能会改变我们在临床上使用CDK4/6抑制剂的方式，并有可能比目前更精确地个性化治疗。目前正在一项大型队列 II 期试验 （NCT04985266） 中评估使用 ctDNA 监测接受辅助治疗的 HR 疾病患者的早期分子复发。12. 未来方向正在研究许多新方法，以试图提高CDK4/6抑制剂的疗效。与这些药物相关的至少一些血液学毒性是骨髓中 CDK6 抑制的结果。因此，CDK6抑制可能导致毒性，但没有额外的疗效。CDK4的选择性抑制剂，CDK6抑制作用显著降低，目前正处于早期临床试验阶段，早期结果显示对HR乳腺癌患者有一定疗效，与氟维司群联合使用的安全性数据令人鼓舞。CDK家族成员ATP结合位点的相似性对真正选择性抑制剂的开发提出了挑战。尽管如此，CDK2 被认为是旁路信号传导的关键介质，可对 CDK4/6 抑制剂产生耐药性，因此是新型抗癌疗法的一个有吸引力的靶点。在临床前模型中抑制CDK2增强了CDK4/6抑制剂的抗肿瘤活性。因此，如果有足够的耐受性，联合 CDK2/4/6 抑制有可能提供更好的疗效。CDK2/4/6抑制剂PF-3600的初步结果为既往接受过CDK4/6抑制剂治疗的患者提供了临床活性的一些证据，其主要毒性包括骨髓抑制。或者，选择性 CDK2 抑制剂在先前暴露于 CDK4/6 抑制剂的细胞中显示出活性，以及含有 CDK2 激活改变（如 CCNE1 扩增）的临床前模型。由于替代 CDK 具有补偿 CDK2 抑制的潜力，因此选择对 CDK2 具有特定依赖性的癌症患者可能是成功临床开发所必需的。将 CDK4/6 抑制剂与其他靶向疗法（如 PI3K 抑制剂）联合使用是一种极具吸引力的可能性。临床前数据表明这两种治疗方式之间存在协同作用，尽管需要进一步研究来确定预测反应的生物标志物，因为这些组合并非在所有模型中都成功。此外，一项测试alpelisib联合ribociclib 和 fulvestrant的Ib期试验由于存在重大毒性而不得不停止入组。尽管如此，一项测试palbociclib联合PI3K抑制剂inavolisib的研究结果仍在等待中（NCT04191499）。最后，液体活检的更广泛使用可能会在未来几年内极大地改变患者监测和治疗方案（包括 CDK4/6 抑制剂）的调整方法。13. 结论CDK4/6抑制剂的实施极大地改变了HR+乳腺癌患者的治疗方式，在早期和转移性环境中都显著改善了生存结局。一旦正在进行的临床试验结果公布，这些药物在其他乳腺癌亚型中的使用以及与其他靶向治疗和免疫治疗的联合使用，这些药物的使用可能会进一步扩大。未来的优先事项将包括优化基于CDK4/6抑制剂的治疗组合和序列，以及开发可以克服治疗耐药性的新方法。14. 参考文献Morrison, L., Loibl, S. & Turner, N.C. The CDK4/6 inhibitor revolution — a game-changing era for breast cancer treatment. Nat Rev Clin Oncol (2023). 声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！长按关注本公众号   粉丝群/投稿/授权/广告等请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓

摘要表达嵌合抗原受体特异性靶向CD19或B细胞成熟受体(BCMA)的基因修饰的T细胞疗法被批准用于治疗某些B细胞恶性肿瘤。然而，将这些成功案例转向治疗实体瘤患者遇到了各种挑战：包括由于CAR - T细胞介导的细胞毒性对表达目标抗原的非恶性组织的严重的临床靶向非肿瘤效应相关毒性的临床风险。事实上，在CAR-T治疗实体瘤患者的临床试验中已经观察到了靶向非肿瘤效应相关毒性（OTOT），强调了制定这种效应发生的预测、缓解和预防战略的重要性。在这篇综述里，我们总结了目前CAR-T细胞治疗实体瘤出现OTOT的临床证据，并讨论了临床前小鼠模型在预测临床OTOT方面的应用。我们描述了用于提高CAR-T治疗实体瘤特异性的一些当前策略，特别是对目标结合物的亲和力，逻辑电路和合成生物学。而且，我们强调了可用于减轻细胞输注后临床OTOT的控制策略，如调节或消除CAR - T细胞活性、CAR表达的外源控制和CAR - T细胞的局部给药等。介绍嵌合抗原受体(CAR) T细胞已成为一种有效的癌症治疗方式。这种方法依赖于基因工程患者来源或供体来源的T细胞来表达一种合成CAR，这种CAR可以以主要组织相容性复合体(MHC)独立的方式识别肿瘤细胞表面分子。CAR的设计不断发展，以提高灵敏度、特异性和疗效以及工程T细胞的持久性。CAR-T细胞的抗原识别是通过融合到跨膜和细胞内信号域的特异性单克隆抗体衍生单链可变片段(scFv)介导的。CD3ζ是T细胞活化所需的结构域，而共刺激结构域，如CD28和/或4-1BB，与CAR - T细胞增殖、分化和持续相关。到目前为止，FDA批准的所有六种CAR - T细胞产品都针对CD19或BCMA，并利用第二代CAR设计（如图1）。尤其是B细胞恶性肿瘤和多发性骨髓瘤对CAR - T细胞有反应，主要是由于丰富的系源性抗原表达如CD19和BCMA。抗CD19和抗BCMA的CAR-T细胞可以消耗内源性表达靶分子的非恶性B细胞和浆细胞，导致低γ球蛋白血症。这种毒性通常是可以忍受的，并且可以通过静脉注射免疫球蛋白来纠正。在绝大多数患者注射CAR-T细胞后，其他毒性，如细胞因子释放综合征和免疫效应细胞相关神经毒性综合征，主要与急性细胞因子的产生相关，是可控的。CAR - T细胞在血液病治疗恶性肿瘤中的成功为研究实体瘤这一问题提供了动力。CAR-T细胞治疗实体肿瘤患者发展的一个相当大的障碍是，大多数候选靶抗原通常在非恶性组织上共表达，由于靶向非肿瘤效应相关毒性(OTOT)，产生了很大的发病风险。在临床前和临床研究中，使用CAR - T细胞靶向恶性和非恶性组织共有的抗原，已经报道了不同严重程度的OTOT。在这篇综述里，我们研究了OTOT在CA-T靶向实体肿瘤的T细胞疗法的发展，总结了OTOT在临床前和临床研究的证据，并讨论临床中CAR – T中可能有助于克服的OTOT的进展。OTOT的机制和风险OTOT源于CAR-T细胞介导的识别和表达靶抗原的非恶性组织的裂解，可能引起严重不良反应。在识别靶抗原后，CAR- T细胞激活导致CAR和靶细胞之间形成免疫突触，触发效应功能（图2）。穿孔素和颗粒酶的释放被认为是CAR-T细胞介导的细胞毒性主要的机制。然而，其他的机制，如上调T细胞表面分子诱导靶细胞凋亡(如FAS配体)或分泌细胞因子，包括IFN和/或TNFγ，也可能导致组织破坏（图2）。生成对于实体肿瘤患者安全有效的CAR-T细胞，靶抗原的选择是至关重要的。最佳抗原候选物，称为新抗原，应该只在恶性细胞上表达，而不是在非恶性细胞上表达。这种抗原可能产生于肿瘤特异性的非同义突变、插入或缺失，这些突变会改变细胞表面蛋白质的氨基酸序列，癌胎抗原的异常表达，或肿瘤特异性翻译后修饰。然而，细胞表面新抗原是罕见的，特别是在低突变负荷的肿瘤中。EGFRvIII存在于24-67%的胶质母细胞瘤中，是少数已发现的例子之一。而且，大多数CAR-T细胞疗法治疗实体瘤的靶点是是肿瘤相关抗原(TAAs)，在非恶性组织中也表达(图3)。肿瘤相关抗原包括EGFR, HER2, CAIX, B7-H3,间皮素和GD2。CAR-T相关的OTOT的证据临床表现OTOT是在一项转移肾细胞癌病人接受抗CAIX第一代CAR - T细胞治疗的临床试验中观察到的现象（补充表2）。3例患者均显示2-4级肝毒性，肝活检均显示离散性胆管炎伴胆管上皮上CAIX的表达。同样的，在晚期CEACAM5-阳性实体瘤的患者进行抗CEACAM5 CAR - T细胞的I期临床试验中，产生了严重不良反应事件(呼吸急促、肺浸润或呼吸窘迫);其中有一个病人需要重症监护。总体上不利的疗效和安全性导致了该试验的终止。考虑到CEACAM5是在肠道中表达，但肺毒性出乎意料。研究人员发现了在8例患者中5例非恶性肺切除标本(63%)出现了中等到强的CEACAM5表达。这一发现得到了发表在其他杂志上的蛋白质组学数据的支持，在I型和II型肺泡细胞中显示低水平的CEACAM5表达 (图3)，提示OTOT可能诱发观察到的不良临床表现。图1 CAR结构。标准第二代嵌合抗原受体(CAR)与单克隆衍生的单链可变片段(scFv)抗体通过跨膜结构域(TM)连接到一个共刺激信号结构域(例如，来自CD28或4-1BB)和细胞内的CD3ζ信号域。CD28允许快速扩增，但耐久性较差，4-1BB促进持续的效应功能和持久性。ITAM，免疫受体酪氨酸激活基序；VH,重链可变域；VL，轻链可变域。图2 CAR-T细胞溶解机制和旁分泌作用。通过嵌合抗原受体（CAR）T细胞识别肿瘤相关抗原(TAA)，免疫突触形成，随后CAR-T细胞活化。同时，释放含有穿孔素和颗粒酶的细胞毒性颗粒，颗粒酶通过穿孔素通道进入靶细胞，通过破坏线粒体和激活半胱天冬酶触发细胞内生性凋亡。此外，CAR - T细胞上调FAS配体，与靶细胞上的FAS受体结合，触发凋亡和caspase介导的靶向细胞死亡的外源性途径。而且，CAR - T细胞释放IFNγ和TNF，激活免疫细胞，如巨噬细胞。CAR - T细胞可能识别非恶性细胞上的TAAs，导致健康组织的不希望的溶解。下一代CAR - T细胞还可以配备额外的效应功能(如IL-12分泌)将免疫反应扩展到包括内源性T细胞。OTOT，靶标，非肿瘤毒性。靶向HER2的CAR-T细胞已经在晚期实体瘤患者的治疗中进行了几种测试。在一份报告中，一位患有转移性结肠癌的39岁患者，单次输注高剂量(1010)抗HER2 CAR-T细胞导致急性呼吸窘迫，输液后5天死亡（附加表2）。同样地，在一项针对晚期胆道或胰腺癌患者的抗HER2 CAR-T细胞I期研究中，观察到轻度皮肤瘙痒和1例严重的上消化道出血。总之，临床数据表明，低剂量的抗HER2 CAR-T细胞具有中等毒性，有临床反应的证据。CAR-T细胞剂量、scFv特性、CAR设计、肿瘤位置和不同临床试验中的其他变量排除了关于接受抗HER2 CAR-T细胞治疗的患者的OTOT的明确结论，这表明需要更多的数据来验证HER2作为CAR-T细胞靶点。尽管EGFR广泛靶表达(图3)，用EGFR定向CAR-T细胞的OTOT是可控的。在输注抗EGFR CAR-T细胞后，报告了轻度或中度皮肤OTOT，包括纹状地衣样皮肤皮疹，部分表皮丧失和基底空泡变性细胞。在一项抗EGFR CAR-T细胞治疗患有晚期胆道癌I期研究中，潜在OTOT表现为口腔黏膜炎、口腔溃疡、胃肠道出血、脱屑和瘙痒(均为1-2级)。6-13%的转移性胰腺癌患者在接受抗EGFR CAR-T细胞的I期试验治疗中观察到更严重的粘膜和皮肤不良事件(一些3-4级)。研究人员在一名患者中使用甲基强的松龙控制了这些不良事件的发生。在另一项I期试验中，一名晚期胃接受抗CLDN18.2治疗。2名使用CAR-T细胞的患者出现3级粘膜毒性，另外5个出现较轻的这种毒性(1级和2级)。由于分化的胃粘膜细胞中CLDN18.2的高水平表达，作者将其定性为OTOT。尽管如此，该队列37例患者的安全性被认为是可接受的，无剂量限制性毒性报告出现。总的来说，这些I期临床数据证明了接受CAR-T细胞治疗的实体肿瘤患者发生严重OTOT的可能性。强调了TAAs在非恶性组织中的表达的重要性，以便准确地将CAR-T细胞相关的不良事件归因于OTOT。这些数据表明，OTOT可能受到无数因素的影响，包括输注细胞的数量，肿瘤和非恶性组织上的抗原表达密度、CAR设计和给药方式。图3非恶性组织的TAAs公开获得的选定实体瘤的蛋白表达密度。使用免疫组织化学建立表达评分，并基于染色强度，染色的比例（<25%, 25–75% 和>75%）和亚细胞定位。TAA，肿瘤相关抗原，*B4GALNT1被分析替代GD2的表达(B4GALNT1)参与GD2的生物合成)。数据截至2022年10月。两份报告表明CAR-T细胞也可能引起血液系统恶性肿瘤患者意想不到的OTOT。单细胞RNA测序分析的结果表明，在患者中观察到某些神经毒性，包括B细胞恶性肿瘤患者罕见的致命性脑水肿病例接受抗CD19 CAR-T细胞治疗，与大脑中CD19阳性周细胞的OTOT有关。此外，多发性骨髓瘤患者输注抗BCMA CAR-T细胞三个月后，OTOT对基底神经节表达BCMA的神经元和星形胶质细胞的抑制作用被认为是出现进行性运动障碍和帕金森病的原因。OTOT的临床前可预测性CAR-T细胞的OTOT风险已经在临床前模型进行了研究。对小鼠器官进行组织学分析，以检查CAR-T细胞浸润，肿瘤和正常组织坏死的程度，以及肿瘤周围和远离肿瘤的炎症部位的TAA表达水平。免疫组织化学可以验证可能的肿瘤外TAA表达和CAR-T细胞浸润，从而为OTOT提供明确的证据。例如，在小鼠模型中输注抗B7 - H4 CAR-T细胞后(输注后45-48天) 迟发性OTOT的检测是可行的。免疫组化染色非恶性小鼠组织显示广泛的B7-H4表达，与人B7-H4蛋白在非恶性组织中的分布相当。而且，荧光素酶标记的CAR-T细胞在小鼠中也可用于监测CAR-T细胞的转运和活化，从而提高了对CAR-T细胞迁移和肿瘤外相互作用的认识。尽管使用小鼠模型来研究OTOT，但在非恶性小鼠和人类组织中靶抗原表达的差异使预测临床OTOT变得谨慎（附加表1和表2）。例如，在8例神经母细胞瘤异种移植小鼠中，有5例报道了致死性中枢神经系统(CNS)毒性是使用基于scFv的14G2a抗GD2 CAR的高亲和变体，这也解释了OTOT对小鼠大脑GD2表达区域的作用。其他人对OTOT在这些毒性中的作用存在争议，因为他们甚至在高亲和力CAR中也没有观察到这种作用。这些临床前研究结果也与具有原始14G2a scFv CAR结构的抗GD2 CAR-T细胞的临床毒性特征相冲突。并且，在小鼠模型中，在接受抗CLDN18.2 CAR-T细胞治疗的患者中未观察到胃肠道OTOT，这很可能是由于几个因素，包括CLDN18.2在非恶性小鼠组织中的表达有限，以及CLDN18.2阴性胃干细胞的快速组织再生。此外，由于人和小鼠CLDN18.2同源物的抗原结构、靶表达行式或不同的组织微环境和/或解剖壁龛的差异，小鼠的OTOT可能不会转化为临床环境中的OTOT。使用不同的方法可以增强小鼠模型的预测性。包括使用人类同源基因取代小鼠基因的基因工程，或将细胞系移植到小鼠体内以模拟非恶性组织中肿瘤外TAA的表达的例子。尽管如此，这些方法很少使用，并且仍然可能无法准确反映TAAs在非恶性人体组织中的复杂表达模式。正在考虑使用现代器官芯片技术旨在模拟完全人性化模型中组织内的体内微结构和生理过程。这些模型不能完全模拟人类组织抗原表达的复杂性，尽管它们可能有助于解决更传统模型的缺陷。缓解OTOT的工程策略临床CAR-T细胞试验中观察到的毒性鼓励了旨在提高安全性同时保持抗肿瘤功效的技术的发展。利用合成生物学，新的方法正在被开发出来，以便更好地限制CAR-T细胞对肿瘤的有效细胞毒性活性，从而避免OTOT。CAR域微调通过修改CAR的scFv进行亲和调优已经成为一种有趣的方法来获得对肿瘤具有足够的亲和力细胞识别，同时保留TAA表达有限的非恶性细胞，这可以通过对现有的scFv进行诱变或筛选scFv库来确定具有不同亲和力的替代结合物来实现。高亲和力CAR-T细胞可能对低密度抗原表达的肿瘤细胞具有更好的反应性，但也可能导致识别存在于肿瘤外组织的靶抗原（图3）。对靶抗原具有非常高亲和力的ScFvs可能会由于激活诱导的细胞死亡而限制CAR-T细胞增殖的潜力。相反，低亲和力CAR-T细胞可能缺乏抗肿瘤活性，因为它们无法充分识别和/或裂解TAA表达水平较低的肿瘤细胞。并且，在血液系统恶性肿瘤患者中已经观察到了低亲和力的scFv增加了低抗原密度肿瘤细胞逃避CAR-T细胞识别的风险。在人类HER2异位表达的小鼠模型中，研究了scFv亲和力对OTOT的影响。研究人员发现，相比靶向相同抗原的低亲和力CAR-T细胞，高亲和力的抗HER2 CAR-T细胞导致更多肝损伤，这归因于肝脏对低亲和力CAR-T细胞的清除速度更快。此外，研究人员在小鼠胶质母细胞瘤异种移植模型中测试抗EGFR-细胞，结果显示OTOT强烈依赖于CAR亲和力。相较于输注低亲和力的CAR-T细胞存活率100%，给小鼠注射了高亲和力的抗EGFR CAR-T细胞后，毒性增加，53天存活率57%。事实上，在体外和体内小鼠异种移植模型中，具有可变scFv亲和力的抗HER2和抗EGFR CAR构建物在没有OTOT的情况下都具有强大的抗肿瘤反应。除了scFv的亲和调节外，对铰链和跨膜结构域(H/T)的修饰以及基于酪氨酸的免疫受体激活基元(ITAMs)的数量可以改变CAR的抗原密度阈值(图1)。比如，具有CD8-H/T的4- 1BB-CD3ζ CAR-T细胞与那些具有CD28-H/T的CAR-T相比，具有更高的抗原密度阈值,形成不太稳定的免疫突触。并且，减少CD3ζ结构域中ITAM的数量可以降低CAR - T细胞对具有有限抗原密度的细胞的细胞毒性，同时保持对高抗原密度目标的细胞毒性。CD3ζ中一个或多个ITAM的功能缺失突变也可用于校准激活和分化程序，突变ITAM的位置可以决定CAR-T细胞的功能、分化和抗肿瘤活性。逻辑门控CAR-T细胞布尔逻辑门控方法，其中涉及数学操作符“IF/THEN”、“AND”、“OR”和“NOT”可用于控制CAR-T细胞的激活，其中一些方法是可以使用的增加细胞杀伤的特异性，减少潜在的OTOT（图4）。使用AND -逻辑电路解耦CAR-T细胞激活信号。不同的CAR-T细胞激活信号(图5a)可以通过所谓的AND逻辑电路解耦，以避免在某些情况下的OTOT。双与逻辑CAR-T细胞表达两种不同的合成受体(一种含有CD3ζ，另一种含有CD28或4-1BB信号域)，每一种都以分裂的方式靶向不同的TAA（图4a和图5b）。理论上，这种双重控制降低了OTOT的风险，因为这两种TAA都需要在非恶性组织上表达才能使CAR-T细胞完全激活，而仅连接一种受体会导致信号传导减弱。在小鼠中，靶向CEA和间皮素的AND逻辑门控CAR-T细胞对双TAA阳性细胞显示出特异性的细胞毒性，而不识别单TAA阳性细胞。另一项研究表明，使用这种方法更有效地杀死双TAA阳性细胞。他们还发现，仅含有CD3ζ的CAR的参与可能导致泄漏。在这种情况下，逻辑电路仅被一个信号激活，导致单TAA阳性细胞裂解和OTOT风险增加。其他肿瘤相关的特征可以通过AND逻辑靶向，而不是第二个细胞表面抗原。例如，肿瘤抗原PSCA和免疫抑制因子TGF-β和IL-4是胰腺癌肿瘤微环境(TME)所独有的，已经被利用到一个AND逻辑系统中。研究人员产生了抗PSCA的CAR-T细胞，共表达了两种转基因细胞因子受体，能够将TGFβ和IL-4的免疫抑制作用转化为免疫刺激信号。这种方法增强了CAR-T细胞的效力和安全性，并在小鼠模型中显示出选择性抗肿瘤作用。这种策略降低了OTOT的概率，但含有CD3ζ的CAR仍然有可能泄漏。总体而言，AND-逻辑电路对多个TAA的依赖性增加了抗原逃逸的风险。TME的感知有助于IF/ THEN逻辑门控。IF/ THEN -逻辑门控提供了另一种限制CAR-T细胞杀伤TME的策略降低了泄漏的风险(图4b)。在酸性环境中对PH敏感的CAR-T细胞最佳识别TAAs提供了一个基于IF/ THEN -logic靶向的例子。这种方法利用了Warburg效应，其实这种效应在许多肿瘤中普遍存在，指的是糖酵解加速和乳酸生成增加，导致肿瘤内酸性环境。一种具有PH限制结合域的靶向HER2的CAR在酸性TME中优先检测HER2，在小鼠模型中导致CAR-T细胞扩增和高抗原密度HER2阳性肿瘤细胞的消退。缺氧感知也可以限制CAR的表达和TME的活性(图4b)。在一项概念验证研究中，HIF1α的缺氧感应亚域被融合到多链抗CD19 CAR的细胞内c端。在常氧条件下，HIF1α亚结构域和CAR被降解。然而，在TME的缺氧条件下，HIF1α不会发生降解，从而使局部CAR表达成为可能。类似的方法已应用于泛抗ERBB CAR防止小鼠致命毒性(补充表1)。T细胞仅在严格缺氧(0.1%氧气)下选择性表达CARs，导致卵巢腺癌小鼠异种移植模型中的肿瘤得到控制，无全身毒性。图4 规避OTOT的布尔逻辑门控原理。A，通过与两个靶向不同的肿瘤相关抗原(TAAs)的靶细胞结合，AND -逻辑嵌合抗原受体(CAR) T细胞被激活。B，基于IF/THEN肿瘤微环境的逻辑门控CAR - T细胞只有在某些肿瘤微环境特异性特征存在时才能被激活。例子包括ph限制的TAAs结合，car的缺氧依赖性表达或抗原结合位点的蛋白酶依赖性释出。C，非逻辑CAR - T细胞共同表达针对不同抗原的刺激性CAR - T和抑制性CAR - T。当靶细胞表达与非恶性组织相关的选择配体时，抑制性CAR抑制T细胞活化。D，在基于IF/THEN TAA的逻辑电路中，CAR-T细胞只有在遇到靶细胞上的两种不同的TAA时才会被激活。组成表达的合成Notch受体对一个TAA识别，随后诱导靶向另一个TAA的CAR的表达。scFv，单链可变片段；TM，跨膜结构域。另一种方法是使用蛋白酶敏感连接体将掩蔽肽附着在抗EGFR CAR的抗原结合位点上（图4b）。CAR的抗原结合位点只有通过蛋白酶裂解掩蔽肽才能被释放。这种方法将CAR的功能限制在TME, TME具有高浓度的局部膜型丝氨酸蛋白酶1 (MT-SP1)，尿激酶型纤溶酶原激活剂(uPA)和溶酶体酶豆科蛋白。这种蛋白酶依赖的CAR提供的抗肿瘤活性水平以一种更具选择性的方式与未被掩盖的CAR相当。这些方法的一个重要警告是，某些非恶性组织可能共享TME的目标特征，导致TME感应CAR - T细胞在远离肿瘤的解剖位置被激活。例如，肾髓质和肠粘膜在生理条件下是缺氧的。因此，低氧诱导T细胞治疗的靶抗原选择或PH诱导的CAR表达和/或功能应该集中在在非恶性缺氧和/或酸性组织中不表达的TAAs上。SynNotch电路使用IF/ THEN逻辑门控促进多种抗原传感。使用合成Notch (SynNotch)电路的IF/ THEN逻辑门控CAR-T细胞依赖于多抗原感应，克服了亲和力和选择性之间的权衡（图4d）。通过将CAR-T细胞效应功能限制在多个肿瘤靶点上，这种方法可以使用更具侵袭性、更高亲和力的CAR，否则这些CAR有可能导致OTOT。SynNotch CAR-T细胞通过CAR转基因表达的两个步骤被激活，只有在SynNotch受体识别所谓的启动抗原后才被诱导（图5c）。在描述SynNotch CAR-T细胞的最初报告中，CAR的表达和T细胞的激活依赖于对两种不同的TAAs的识别。其他研究小组也研究了SynNotch电路，并在没有OTOT迹象的情况下证明了其有效的体外抗肿瘤活性。SynNotch CAR-T细胞通路在表达ALPPL2的实体瘤临床前模型中显示出增强的特异性。值得注意的是，通过阻止CAR介导的强直信号传导，在该模型中实现了优越的肿瘤控制。在被赋予串联CAR的SynNotch CAR-T细胞中，同一组在表达EGFR VIII的胶质母细胞瘤的异种移植模型中显示出精确的肿瘤靶向性(补充表1)，没有OTOT的证据。CAR-T细胞设计结合了亲和力调节的SynNotch电路，包括低亲和力的抗HER2 SynNotch受体和高亲和力的抗HER2 CAR。该系统允许SynNotch CAR-T细胞基于S型曲线识别靶标抗原密度阈值，其中CAR-T细胞在低水平HER2表达时无活性，但一旦HER2密度超过特定阈值，细胞毒性就会大幅增加。这些协同作用受到高抗原密度，使抗肿瘤活性强大，从而降低OTOT的风险。SynNotch电路的多功能性，包括使用多个SnNotch受体的选择，为设计更特异性和毒性更低的CAR-T细胞提供了可能。然而，宿主对SynNotch蛋白的免疫反应的可能性以及转基因的复杂性和大小为该技术的临床应用带来了挑战。为了克服后者，研究人员重新设计了潜在的SynNotch结构，并建立了“合成膜内蛋白水解受体”(SNIPR)系统，该系统更紧凑，并且与人类转录因子兼容。该方法在一项涉及表达ALPPL2 - HER2的卵巢癌异种移植模型的原理性临床前研究中得到了成功的测试。与AND逻辑相反，由于CD3ζ信号的独立细胞毒性作用，IF/THEN门与泄漏风险无关。然而，引发的SynNotch CAR-T细胞从肿瘤中迁移到表达CAR抗原的共定位的非恶性组织中仍然是一个潜在的风险。图5 在CAR-T细胞中测试的逻辑门控策略的例子。a，传统的第二代嵌合抗原受体(CAR) T细胞在单一结构中结合了最佳CAR - T细胞功能所需的两种信号。b，双逻辑CAR - T细胞通过结合不同肿瘤相关抗原(TAAs)的两个独立受体完成信号传导和共刺激。c，合成Notch (SynNotch) CAR - T细胞组成性地表达一个SynNotch受体。抗原结合该受体导致暴露Notch调控区和跨膜结构域的蛋白质切割位点，允许通过酶ADAM和γ-分泌酶进行顺序切割。这释放出一种栓系的细胞内转录因子，促进CAR的表达。该表达的CAR可以识别自身的同源抗原和触发细胞毒性反应。D，分裂，通用和可编程(SUPRA) CAR - T细胞表达亮氨酸拉链作为细胞外结合域。亮氨酸拉链可以结合携带单链可变片段(scFv)的亮氨酸适配分子。这种可溶性适配器scfv赋予CAR - T细胞对特定靶标的抗原识别能力。由于适配器- scFv偶联物被独立地施用于CAR - T细胞，因此注入不同的scFv可以在体内切换CAR靶标。可溶性拉链- scFv可以竞争性地结合适配器- scfv，阻止CAR - T细胞信号传导。该系统也可以使用与逻辑分割架构进行设计，如b所示。E，AND-logic亲和度控制的CAR - T细胞含有低亲和性scFv，依赖于亲和度来识别TAA。CAR - T细胞的激活依赖于抗原识别和两种低亲和力CAR在可溶性二聚体存在下的二聚体化。F，Co-LOCKR系统利用cage和关键中间蛋白识别并结合靶细胞。笼和关键分子携带一个TAA结合域，而只有笼携带一个包含隐藏的Bim结构域(结合位点)的锁存器。一旦笼子和钥匙结合了它们的同源抗原，锁存器就会被释放，暴露出Bim结构域，并允许CAR - T细胞识别。通过CD28或4-1BB进行共刺激。TF，转录因子；TM，跨膜结构域；VH，重链可变区；VL，轻链可变区。AND逻辑门控的通用CAR设计旨在进行外源控制。合成生物学使更复杂的逻辑系统的工程，包括输注可调控制CAR - T细胞的活性后。例如，一个分裂的、通用的和可编程的(称为SUPRA) CAR电路可以被修改以结合不同的逻辑门控策略。功能齐全的SUPRA-CAR包含两个元素:(1)连接到细胞外亮氨酸拉链的CAR的跨膜和内结构域，(2)连接到亮氨酸适配器的可溶性scFv(适配器- scFv)。SUPRA CAR-T细胞只有在适配器- scFv结合TAA并且适配器通过拉链附着在CAR上时才会被激活。为了避免OTOT, SUPRA电路可以进一步编程为包含与逻辑门(图5d)。在这种情况下，设计了两个SUPRA CAR，使CD3ζ信号和共刺激由两个独立的受体传递，以实现抗肿瘤活性。此外，实施结合不同TAA的适配器- scFv允许在体内切换CAR靶标。此外，为了防止CAR-T细胞信号传导，可以给予一种可溶性的拉链- scFv，它竞争性地结合适配器- scFv和阻止其抗原识别和CAR-T细胞活化。另一种设计使用了CAR-T细胞贪婪的概念，其中免疫反应依赖于多种低亲和力CAR-抗原的相互作用。在这种所谓的亲和控制CAR (Avid CAR)系统中，只有当两个低亲和CAR独立识别靶抗原并在特定的小分子二聚体存在下变成二聚体时，才能实现激活。这种设计可以进行修改，将CAR与针对不同TAA的scFv结合起来，从而扭转这一局面将系统转换为与亲和度相关的与逻辑电路(图5e)。已经报告了对该系统的各种扩展，包括AND逻辑利用VEGF作为二聚体。尽管在非恶性组织中也发现了VEGF，但它是肿瘤血管生成的关键介质，因此可以在TME内激活CAR-T细胞。使用SUPRA和AvidCAR设计和逻辑门控CAR-T细胞的能力提供了一种降低OTOT风险的方法，同时也提供了外源性控制的元素。SUPRA CAR-T细胞的可切换特性还可以通过给药靶向替代TAA的适配器- scFv来降低抗原逃逸的风险，而无需在体外重新设计CAR-T细胞。考虑到对多个TAA的依赖会增加抗原逃逸的风险，这对于使用AND逻辑电路的构建可能特别有用。此外，建立一个允许外源控制CAR-T细胞活性的系统是一项重要的安全措施，可以在出现任何毒性时对其作出反应非逻辑门控可以阻止CAR-T细胞激活。AND -逻辑和IF/THEN -逻辑电路调节刺激CAR的活动，一旦识别抗原，将会触发细胞毒性反应。相比之下，非逻辑门控则含有一种能诱导细胞毒性的刺激性CAR反应和一种抑制性CAR (iCAR)，它触发一种有效的抑制信号，将非恶性细胞上表达的标记物解释为防止杀伤的信号(图4c)。非逻辑电路的第一个例子是在小鼠异种移植模型中测试的PSMA靶向iCAR，其中PSMA用作非恶性组织的代理抗原，CD19作为靶抗原。iCAR T细胞成功抑制了共表达CD19的PAMA阳性NALM6细胞的消除，但不影响对PSMA阴性对应细胞的反应。相似的概念性验证方法在其他研究中也进行了使用，使用抗CD93 CAR和抗CD19 iCAR结构在体外成功的避免了OTOT。iCARs也被用于靶向杂合性缺失(LOH)以降低OTOT。当不可逆的基因改变仅影响一条染色体时，就会发生LOH，导致非恶性细胞易患癌症。HLA分子中的LOH是多种肿瘤发生免疫逃避的机制之一，并已被几个研究小组利用作为肿瘤特异性标志物(补充表1)。用抑制性受体靶向HLA分子会在遇到非突变细胞时阻碍CAR - T细胞信号传导，同时对LOH影响的细胞产生细胞毒性。另一种基于下游抑制T细胞功能的非逻辑方法提供了一种替代iCARs的方法。在这个系统中，synNotch受体被设计用来识别主要存在于非恶性组织中的抗原，然后激活被截断的促凋亡因子BH3相互作用结构域死亡的表达激动剂(tBID)，诱导CAR-T细胞凋亡。正如作者所指出的，找到肿瘤外细胞凋亡和肿瘤内扩张之间的平衡对于这种方法的临床成功至关重要。自适应逻辑门控与中间蛋白允许外源控制。还开发了一种可以执行与逻辑和非逻辑门控的多抗原传感系统，称为Co-LOCKR(图5 f)。在这种方法中，CAR-T细胞不直接与靶抗原结合，而是与促进CAR-T细胞与靶细胞结合的两种可溶性中间蛋白(称为“cage”和“key”)结合(图5f)。TAA结合的笼包含一个带有Bim结构域的锁存器，只有当共定位的关键蛋白与相应的抗原结合时才会显示出该结构域。随后，一种抗Bim的CAR - T细胞可以识别笼中的Bim结构域并触发CAR-T细胞的细胞毒性。此外，使用可以结合非恶性组织上表达的特定抗原的诱饵蛋白可以阻止CAR-T细胞结合Bim结构域并避免CAR-T细胞活化。这种非逻辑电路有望增加特异性并降低OTOT的风险。限制体内OTOT的其他策略CAR-T细胞的其他修饰正在开发中，以避免或减少输注后OTOT的严重程度。一些策略已经在临床上进行了测试，尽管大多数策略仅限于临床前模型。输注后CAR-T细胞控制临床批准药物对照。使用皮质类固醇进行全身免疫抑制是目前处理大多数免疫治疗相关毒性的首选策略。然而,使用皮质类固醇可能会对CAR-T细胞的抗肿瘤作用和持久性产生负面影响。酪氨酸激酶抑制剂达沙替尼可以实现CAR-T细胞的可逆(或暂时)控制，它可以作为CAR-T细胞信号传导的立即关闭开关，而不影响细胞活力(图6a)。尽管尚未在临床测试，但达沙替尼可能提供一种有效的方法来控制急性CAR-T细胞毒性，特别是考虑到它能进入血脑屏障，从而控制神经毒性。然而，考虑到在达沙替尼停药后CAR-T细胞的活力和活性仍能维持，该药物可能不是长期治疗OTOT的理想药物。自杀式开关控制。自杀开关和其他旨在体内消除和/或灭活CAR-T细胞的策略是治疗潜在危及生命的不良事件的重要安全措施。已经测试了包括使用基于诱导型Caspase 9的自杀结构(iCaspase 9)的各种方法。这种结构可以通过给药小分子AP1903激活，在暴露后几分钟内诱导CAR - T细胞凋亡(图6b)。2021年发表的一项临床研究数据表明，iCaspase 9可用于安全改善接受抗CD19 CAR-T细胞治疗的患者的临床严重神经毒性。 图6 CAR - T细胞中的控制开关。a，达沙替尼对酪氨酸激酶LCK的可逆抑制可阻止CD3ζ内免疫受体酪氨酸激活基序(ITAMs)的磷酸化，从而中断嵌合抗原受体(CAR) T细胞效应功能的必要信号。b，AP1903给药并与FKBP12-F36V结合导致二聚化并激活了一个基于诱导caspase 9的自杀构建体(iCaspase 9)，触发了CAR - T细胞的凋亡。c，CAR转基因也可以编码选择标记物RQR8，该标记物可以用利妥昔单抗靶向触发补体依赖性细胞毒性(CDC)和/或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)，从而耗尽CAR-T细胞。d，一个蛋白酶靶点、一个蛋白酶和一个degron被融合到CAR的胞内C端。蛋白酶可以将自身和CAR的降解物分离，防止CAR降解并维持其在细胞表面的表达。然而，用asunaprevir抑制蛋白酶会阻止裂解，导致降解物的保留，从而降解整个CAR结构。e，在mRNA剪接过程中，外显子的包含或排除可以使用所谓的剪接修饰剂药物来改变。通过将CAR的起始密码子(ATG)插入到对剪接修饰子有反应的位点，可以控制CAR的翻译和表达。在这种药物存在的情况下，CAR的起始密码子仍然是mRNA的一部分。这允许mRNA的翻译，并允许CAR的组装和表达。在没有药物的情况下，起始密码子被移除，CAR翻译不会启动。LTR，长末端重复；scFV，单链抗体；TM，跨膜结构域；VH，重链可变区域；VL，轻链可变区域图7 CAR T细胞活性的区域限制。a，嵌合抗原受体(CAR)转基因可以置于热休克蛋白(HSP)的调节控制下，这样聚焦超声就可以产生局部的瞬时温度升高。这会激活HSP，从而可逆性上调CAR的转录和表达。b，利用三组分光诱导的核转位和二聚化(LINTAD)系统可以实现蓝光诱导的CAR转录。除了CAR转基因后，T细胞表达LexA-CIB1-biLINuS (LCB)构建体。 bilinus响应元件在局部应用时被激活蓝光照射，导致核定位序列(NLS)和LCB结构进入细胞核内的易位。LexA(作为LCB的一部分)可与CAR转基因中设计的LexA结合序列(BS)结合。然后，LCB的CIB1成分可以招募一个共表达的CRY2-VPR融合结构，该结构可以靶向最小启动子并触发CAR的表达。c，局部脑室内给予CAR T细胞作为一种全身静脉输注的替代疗法，CNS，中枢神经系统CAR-T细胞也可以被改造成表达一种额外的细胞表面分子，然后用单克隆抗体靶向。这允许CAR-T细胞通过补体依赖性和/或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性清除。利妥昔单抗识别来自CD34和CD20衍生的多肽序列(称为RQR8)，以此为目的进行开发(图6c)。在小鼠脾细胞移植模型中，给予利妥昔单抗7天后，外周血样本中未检测到CAR转导的共表达RQR8的脾细胞。同样，使用西妥昔单抗可以靶向抗CD19 CAR-T细胞共同表达EGFR的截断版本(EGFRt)，从而消除CAR-T细胞和逆转B细胞发育不全。尽管这种方法具有潜力，但有几个因素可能会影响抗体介导的CAR-T细胞消除的效率。有限的单克隆抗体运输到中枢神经系统可能会阻碍CAR-T细胞在这个位置的消除。此外，在非恶性细胞上识别抗体靶点可能会引起额外的毒性。并且，单克隆抗体诱导的选择压力可能导致缺乏足够抗体靶向细胞表面标记物的CAR-T细胞群体扩大，从而逃避控制。最后，这种形式的T细胞消除动力学可能不够快，无法消除对重要器官的急性损伤。通过调节CAR表达和细胞毒性进行控制。在完全根除肿瘤之前使用自杀开关不可逆地消除CAR-T细胞可能会限制临床疗效。另一种选择可能是设计可逆的开关，允许暂时控制CAR-T细胞的激活并保持抗肿瘤功能。到目前为止，已经提出了几种设计，其中许多依赖于小分子或抗体的管理，以及其他方法。在关闭系统中，使用蛋白酶抑制剂阿苏纳韦来控制CAR表面表达。为了达到这个效果，一个蛋白酶靶点，一个蛋白酶和一个Degron被融合到CAR的C端。在没有阿苏纳韦的情况下，蛋白酶从CAR结构中分离出降解物，从而维持CAR表面的表达。阿苏纳韦给药后，蛋白酶被抑制，降解不能被切割，导致CAR降解(图6d)。类似地，已经开发了一种将CAR与配体诱导的降解结构域结合的系统。这种方法可以在配体的作用下使CAR的蛋白酶体降解，从而实现体内CAR表达的可调控制。在一种开关方法中，研究人员在CAR结构的跨膜结构域和信号结构域之间引入了蛋白酶裂解位点。此外，他们将一种以反式表达的膜结合NS3蛋白酶整合到CAR中。给予蛋白酶抑制剂依巴司韦抑制了CAR信号域的组成性切割，使CAR在小鼠模型中发挥功能。停止给药逆转了高剂量依巴司韦的CAR-T细胞相关OTOT，这表明药物剂量可以调节CAR-T细胞活性，在保持可接受的安全性的同时实现肿瘤控制。另一种允许远程控制CAR-T细胞的方法是先前讨论的AvidCAR（图5e）。建议在AvidCARs和其他开关系统中的二聚体包括AP20187，来那度胺和雷帕霉素。关于使用药物诱导剪接来调节治疗性蛋白表达的系统的数据也有报道，并且可能被改编为CAR-T细胞的开关（图6e）。实体肿瘤患者中CAR-T细胞结合药物诱导的安全开关是否会成功可能取决于药物耐受性和药物运输到CAR-T细胞活性部位。通过声音或光线控制CAR的表达。超声检查可用于控制CARs的转录和随后的表达。超声敏感的Piezo1离子通道被证明可以触发信号级联，导致体外抗CD19 CAR分子的转录上调。2021年8月，研究人员发表了一种方法，将抗PSMA或抗CD19 CAR的表达置于热休克蛋白的调控下（图7a）。该方法通过施加聚焦超声约5分钟，将肿瘤内的温度提高到43°C左右，实现了CAR在体内的表达控制。这诱导了肿瘤受限的细胞毒性反应，同时限制了肿瘤外的细胞毒性。类似于开关系统的光反应性CAR - T细胞可用于诱导局部CAR表达。引入光诱导核易位和二聚化(LINTAD)系统在体外和小鼠体内被证明可以控制CAR-T细胞介导的肿瘤细胞杀伤（图7b）。在其他地方，一种光响应通用CAR-T细胞已经开发出来，它依赖于对紫外线敏感的小分子CMNB(5-羧基甲氧基-2-硝基苄基)来识别TAA。体外肿瘤细胞的结合和杀伤依赖于紫外光的存在。使用声控或光控CAR-T细胞在空间和时间上诱导CAR-T表达可能会阻止CAR-T细胞的全身性激活，从而降低OTOT的可能性。CAR-T细胞的局部管理CAR-T细胞传统上是系统给药的，这给CAR-T细胞向肿瘤部位的充分运输和向非恶性组织的最小运输提出了挑战。在可能的情况下，区域或地方管理可以帮助克服这些挑战。例如，针对中枢神经系统肿瘤的CAR-T细胞脑室内和鞘内给药已经显示出有希望的临床前和早期临床结果。在三名胶质母细胞瘤患者中，有两名患者颅内递送抗IL – 13R α2 CAR-T细胞导致了短暂的抗肿瘤反应。尽管在IL – 13R α2高表达的患者中观察到3级神经毒性肿瘤细胞，但是不良事件是可控的。类似地，在一项I期试验中，抗HER2 CAR被直接注入复发性和/或难治性中枢神经系统肿瘤儿童患者的肿瘤腔或脑室系统（图7c）。本试验的初步数据提示，重复局部给药的耐受性良好，并导致局部免疫应答。2022年3月，研究者描述了在弥漫性内源性脑桥胶质瘤(一种高致死性儿童中枢神经系统肿瘤)患者中，抗GD2 CAR T细胞在脑室内成功给药的情况，4例患者中3例有临床和影像学改善，尽管GD2在正常脑组织中表达，但未观察到OTOT。在3例恶性胸膜间皮瘤(MPM)患者中也进行了将抗FAP CAR T细胞局部递送至胸膜腔的研究。本试验证明了在器官局限的肿瘤(如MPM)中局部给药的可行性。同样，27例恶性胸膜疾病患者通过胸腔内输注抗间皮素CAR T细胞。尽管39%患者在超过100天的外周血样本中检测到CAR T细胞，但未有OTOT的报告。抗B7 - H3 CAR T细胞已在几种肿瘤类型中，重点是递送途径，进行了研究。当局部给予抗B7 - H3 CAR T细胞时，在非典型畸胎样/横纹肌样的小鼠异种移植模型中产生了更有效的抗肿瘤反应。然而，使用免疫正常小鼠模型进行的一项研究的数据提示，无论给药途径如何，B7-H3 CAR T细胞均安全有效。正在进行的抗B7-H3 CAR-T细胞的早期临床试验，涉及脑肿瘤(NCT04185038)和其他实体瘤(NCT04483778，NCT04897321)可能使我们进一步了解给药途径对抗肿瘤活性和OTOT的影响。虽然CAR T细胞局部给药可将细胞毒性限制在特定组织腔室，但这些细胞仍有可能进入体循环。结论CAR-T细胞疗法的附加修饰可增强其针对实体瘤的效力正在开发中，并且正在稳步发展走向临床检测。大量TAA的发现为CAR-T用于治疗实体瘤患者奠定了基础，尽管它们在非恶性组织中的表达可能预示着增加OTOT发生的风险。正如数项CAR-T细胞临床试验的数据所观察到的，此类风险的评估策略并不完善，其中OTOT与临床前数据不一致。一个重要的研究领域是完善动物模型和/或改进体外系统，以更准确地预测这些毒性。深入研究集中于开发更具体的CAR系统，包括允许外源性控制T细胞功能或生存的CAR系统。调整scFvs的亲和力和改变CAR架构可能降低OTOT的风险。临床前模型已经探索了各种基于蛋白质的逻辑电路策略，旨在进一步限制CAR-T细胞对肿瘤部位的活化和杀伤。控制CAR-T细胞介导的OTOT的其他尝试包括设计用于外源性控制CAR-T细胞活性或及时清除CAR-T细胞的工程方法。局部应用CAR-T细胞在肿瘤环境中集中抗肿瘤活性可能避免OTOT，并且已经在早期阶段进行了临床研究测试。解决实体瘤新型CAR-T细胞研发过程中OTOT的风险是指导临床成功开发安全有效的治疗策略的必要条件。来源：Flugel, C. L., Majzner, R. G., Krenciute, G., Dotti, G., Riddell, S. R., Wagner, D. L., & Abou-el-Enein, M. (2023). Overcoming on-target, off-tumour toxicity of CAR T cell therapy for solid tumours. Nature Reviews Clinical Oncology, 20(1), 49-62.END