SPI1

引言 在基因组中，转录因子(transcription factors, TFs)通过特定序列的结合位点来调控基因表达。然而，不同TFs在基因启动子(promoters)和增强子(enhancers)中的结合位点常常呈现出相似的组合，这些结合位点如何编码多种重叠的基因表达程序仍然是一个重要的研究课题。 每个细胞都以独特的方式解释相同的基因组，这一过程的核心是序列特异性TFs，它们通过解读基因组中的调控序列语法来组织调控程序。然而，这些调控程序是如何编码的仍然大多不明。许多调控元件包含相似的TFs序列模式，大多数TFs广泛结合于调控序列，基因调控结果却因而变化不大。这导致我们目前难以仅从DNA序列预测基因表达模式，并且对大多数人类基因转录的调控方式还不清楚。之前的研究表明，TF结合位点的间距、方向和拷贝数，以及TF结合位点的亲和力，均能影响转录输出。然而，关于TF结合位点如何构建基因调控程序的普遍规律仍然很少，这限制了合理解释基因组或理解调控序列中突变对基因调控或疾病表现的影响。 7月17日Nature的研究报道“Position-dependent function of human sequence-specific transcription factors”，通过研究人类序列特异性转录因子在不同转录起始位点(transcription start sites, TSSs)的功能，揭示了TFs对转录起始的影响是位置依赖的。通过分析TF结合位点相对于TSS的位置，研究人员发现了多个具有高度优选位置的序列模式。 该研究利用自然遗传变异、内源性TF蛋白水平的扰动以及大规模并行分析自然和合成的调控元件的方法，展示了TFs结合对转录起始的影响是位置依赖的。具体而言，研究人员发现在不同的TSSs附近，某些TFs的结合位点具有显著的定位偏好。例如，NRF1、NFY和Sp1等经典激活因子不仅能够激活也能够抑制转录起始，其功能取决于它们相对于TSS的精确位置。该研究还展示了这些TFs和它们的间距共同引导了转录起始的位置和频率。这些发现揭示了相似的TF结合位点组合如何根据其空间配置产生不同的基因调控结果，并说明了DNA序列多态性可能如何导致转录变异和疾病。 该研究发现在转录起始点周围，TF结合位点的偏好位置是这些因子功能的反映，体现了它们在调控转录起始中的多种机制作用。该研究揭示了如何通过结合位点的空间配置来解码基因组中的调控信息，这对于理解基因调控和非编码DNA突变如何导致疾病有重要意义。 在基因组中，转录因子（Transcription Factors, TFs）通过特定序列的结合位点调控基因表达。然而，不同TFs在基因启动子（Promoters）和增强子（Enhancers）中的结合位点常常呈现出相似的组合，这些结合位点如何编码多种重叠的基因表达程序仍然是一个重要的研究课题。为了揭示TFs结合对转录起始的影响是否是位置依赖的，该研究利用自然遗传变异、内源性TF蛋白水平的扰动以及大规模并行分析自然和合成的调控元件的方法进行实验。 研究团队设计了三种不同的DNA插入片段，用于TSS-MPRA（Massively Parallel Reporter Assay）分析。每种设计包含400-500个DNA插入片段，长度为155 bp，并与4或5个独立的11 bp条形码耦合，以优化其分子特性和多样性，从而每种设计生成2000个DNA插入片段 。 通过分析TF结合位点相对于TSS的位置，研究人员发现了多个具有高度优选位置的序列模式。例如，NRF1、NFY和Sp1等经典激活因子不仅能够激活也能够抑制转录起始，其功能取决于它们相对于TSS的精确位置 。 细胞培养与RNA提取：研究使用U2OS、HepG2、HEK293T和Vero E6细胞，在37°C和5% CO2的条件下培养，培养基为含10% FBS的DMEM。使用siRNA和mRNA进行转染，并在24小时后收集RNA样本 。 csRNA-seq分析：csRNA-seq（small capped RNAs, ~20–60 nucleotides）和总小RNA-seq输入测序读数使用HOMER工具进行修剪，并与相应的基因组（GRCh38/hg38, GRCm38/mm10）比对。仅考虑唯一比对的读数（MAPQ≥10），并丢弃剪切或软剪切的比对读数，以确保准确的TSS位置 。 突变分析：通过TSS-MPRA评估TF结合位点突变对转录起始的影响，选择133个人类启动子和增强子进行突变。突变后的TF结合位点在其自然富集的位置上与转录抑制相关，而在其他位置上的突变则与转录起始增加相关 。 转录因子（TF）功能的依赖位置效应（Credit: Nature） 核苷酸频率偏差：在图a中，展示了在人类U2OS细胞的TSS附近的核苷酸频率偏差。这些数据揭示了在TSS区域内，核苷酸的分布存在显著的偏差。 TF结合位点富集：图b展示了许多TF结合位点在基因组范围内活跃TSS的特定位置上显著富集。NRF1、NFY和Sp1等TF在TSS上游显示出明显的富集，而在TSS下游则显著减少。 结合位点的富集或耗尽模式：图c展示了结合位点相对于TSS的位置分布，使用HOMER2工具识别出TF结合位点在TSS相对位置上的富集或耗尽情况，例如NRF1结合位点在TSS上游显著富集。 结合位点的功能分布：图d总结了463种已知人类TF结合位点在TSS相对位置上的富集或耗尽情况，展示了这些结合位点在不同位置的分布规律。 结合位点位置与转录活性的关系：图e和图f展示了NRF1结合位点相对于TSS的位置如何影响其转录活性。通过敲除NRF1，发现结合位点在TSS上游的TSS转录活性降低，而结合位点在TSS下游的TSS转录活性增加。 模型验证：图g通过过表达一个无转录活化域的NRF1突变体（dnNRF1），进一步验证了结合位点相对于TSS的位置如何影响转录活性。结果显示，当NRF1结合位点位于TSS上下游时，均会导致转录活性降低。 NRF1功能模型：图h展示了NRF1结合位点位置对TSS去抑制的模型，提出了NRF1在TSS上游结合位点可能通过空间阻碍机制抑制下游TSS的转录起始。 TF结合位点的定位偏好 研究发现，在转录起始点周围，TF结合位点的偏好位置是这些因子功能的反映，体现了它们在调控转录起始中的多种机制作用。例如，NRF1位点更倾向于位于TSS上游，而YY1位点则偏好位于TSS下游。 自然遗传变异揭示了位置依赖的功能和不同类别的转录因子（TFs）（Credit: Nature） 遗传变异对基因调控的影响：图a和b展示了基因组中的自然DNA多态性如何显著影响基因调控。在这两个示例中，SPRET小鼠株系中的遗传变异消除了NF-κB（p65）结合位点，这与下游转录起始的减少（图a）或解除转录起始的抑制（图b）相关。这些结果表明基因调控是位置依赖的，突变的结合位点相对于TSS的位置决定了其影响。 TF结合位点的功能依赖位置：图c显示了Sp1结合位点突变对转录起始的影响，结果表明这些结合位点对转录起始的影响是位置依赖的。变异使Sp1结合位点削弱，在其优选位置（上游TSS）时显著与转录减少相关，而在下游TSS位置时则显著与转录增加相关。 信号依赖的TF功能：图d展示了刺激NF-κB（p65）结合位点的突变在不同时间点的影响，表明这些结合位点的功能在受到KLA刺激后显著改变，进一步证实了TF功能的位置信号依赖性。 TF类别的分类：图e总结了TF结合位点的功能类别，分为纯激活因子（如PU.1），纯抑制因子（如ZEB2）和双功能因子（如Sp1）。这些分类表明TFs在调控转录起始中的功能依赖于其结合位点相对于TSS的位置。 全基因组分析：图f展示了全基因组范围内的TF结合位点突变影响，揭示了463种已知人类TF结合位点中有300种以上的结合位点在至少一个位置上与转录起始变化显著相关。TF结合位点的功能影响根据其相对于TSS的位置进行分类，表明这些TF在基因调控中的功能是高度位置依赖的。 合成DNA序列的实验验证 为了验证这些发现，研究团队设计了一种合成的150 bp DNA序列，并在整个序列中以2 bp为增量插入NRF1、NFY、YY1或Sp1的结合位点。TSS-MPRA捕捉到的结果显示，TF结合位点的插入常常导致新的TSSs出现，进一步支持了TF结合位点对RNA聚合酶II招募和定位的强烈影响。 自然增强子区域的验证 研究还在自然增强子区域进行了NRF1结合位点扫描，结果显示，NRF1结合位点的位置不仅影响转录起始的位置和频率，而且其他TF结合位点的存在也会对NRF1的功能产生影响。 疾病相关变异的分析 通过分析疾病相关的变异位点，研究发现这些变异位点通常位于TF结合位点附近，且这些变异会显著影响TSS选择，从而改变基因表达水平和基因调控程序。例如，GWAS鉴定的变异位点rs11122174位于一个NRF1结合位点内，显示出与邻近TSS位置相关的位点依赖性变化。 基因组中的TF定位效应 在全基因组范围内，TF结合位点的定位与其功能存在显著相关性。例如，活化因子如Sp1、NRF1和NFY在其结合位点位于TSS上游时促进转录起始，而当这些位点位于TSS下游时则抑制转录起始 。 多重TF结合位点的协同作用 通过分析多个TF结合位点的间距和相对位置，研究发现这些TF的协同作用能够显著影响转录起始的位置和频率。这些发现揭示了TF结合位点的空间配置在基因表达调控中的关键作用 。 该研究揭示了TF结合位点的空间配置如何解码基因组中的调控信息。这些发现对于理解基因调控和非编码DNA突变如何导致疾病具有重要意义。通过进一步的研究和实验验证，未来有望在精准医疗和基因治疗领域取得重要突破。例如，利用TF结合位点的定位偏好，可以设计更有效的基因调控工具，用于治疗因基因表达失调引起的疾病。 总之，该研究通过系统的实验设计和数据分析，揭示了转录因子结合位点的空间配置在基因表达调控中的关键作用，为理解复杂的基因调控网络提供了新的视角。未来的研究可以进一步探索其他TFs的定位偏好及其在不同生物学过程中的功能，从而推动基因组学和生物信息学的发展。 参考文献 Duttke SH, Guzman C, Chang M, Delos Santos NP, McDonald BR, Xie J, Carlin AF, Heinz S, Benner C. Position-dependent function of human sequence-specific transcription factors. Nature. 2024 Jul 17. doi: 10.1038/s41586-024-07662-z. Epub ahead of print. PMID: 39020164. https://www-nature-com.libproxy1.nus.edu.sg/articles/s41586-024-07662-z 责编|探索君 排版|探索君 转载请注明来源于【生物探索】 End 往期精选 围观 一文读透细胞死亡(Cell Death) | 24年Cell重磅综述（长文收藏版） 热文 Cell | 是什么决定了细胞的大小？ 热文 Nature | 2024年值得关注的七项技术 热文 Nature | 自身免疫性疾病能被治愈吗？科学家们终于看到了希望 热文 CRISPR技术进化史 | 24年Cell 综述

T细胞发育受到多种因素的影响，包括胸腺内环境信号的长时间迭代，以及由这些信号诱导的转录因子动态表达。 7个转录因子 1. TCF1 HMG（The high mobility group）盒转录因子TCF1（由Tcf7编码）是早期胸腺祖细胞 (Early Thymic Progenitor，ETP)中Notch信号传导的直接靶基因。 当胸腺祖细胞从胸腺微环境中识别Notch配体时，ICN（ intracellular domain of Notch）被转移到细胞核，并与RBPJ直接结合到Tcf7位点的上游区域（-31.5kb），作为激活Tcf7表达的机制的一部分。 TCF1作为一种先驱样因子，从T细胞发育的最早阶段开始，建立T细胞谱系特异性染色质景观的各个方面。 Immunity 48, 243–257 e10 (2018). 在比较从HSPC到CD4 + SP T细胞和CD8 + SP T细胞的T细胞发育过程中染色质可及性，发现TCF1结合基序在ETP中比胸腺前祖细胞更“开放”的基因组区域富集，特别是在后期T发育中保持开放的位点。 2. GATA3 GATA3属于锌指转录因子的GATA家族，具有两个高度保守的IV型锌指，每个锌指后面都有一个保守的基本区域。 GATA3 表达在 HSC 的一个亚群，在胸腺和外周的 T 细胞发育过程中具有重要作用。然而，GATA3在多种其他组织中也很重要，从发育中的颌骨到乳腺，肾脏和交感神经元。 在生理条件下，前胸腺祖细胞中Gata3水平非常低，在迁移到胸腺时被Notch信号上调。由于Gata3调控元件的复杂性，Notch信号诱导Gata3转录上调的分子机制尚不完全清楚。 Gata3表达在第1阶段逐渐增加，然后分别在从第1阶段到第2阶段和从第2阶段到第3阶段的过渡处调节早期T细胞发育的几个检查点，包括T细胞谱系定向和β选择。 GATA3在指定所有T细胞的前体，之后很长一段时间内在一系列不同的T细胞发育选择中具有不同的作用，并且它还支持其他淋巴细胞的命运，特别是第2组先天淋巴细胞（ILC2s）的命运。 在αβTCR+胸腺细胞中，GATA3促进CD4+命运超过CD8+命运，随后促进辅助性T细胞2（TH2）细胞命运超过TH1细胞或TH17细胞命运。 GATA3与1期前T细胞的基因组位点结合与后期T细胞发育阶段的基因组位点大不相同，GATA3的这种背景依赖性与TCF1形成鲜明对比。 3. E蛋白 Notch诱导的因子HES1，TCF1和GATA3在胸腺前体中已经存在的其他转录因子的丰富背景下起作用。其中最重要的是E蛋白。 E 蛋白属于转录因子的 I 类碱性螺旋-环-螺旋 （bHLH） 家族，在HSC、淋巴引发的多能祖细胞 （LMPP）、B 细胞和 T 细胞的生成中起着重要作用。 E蛋白，尤其是E2A，在细胞进入胸腺之前已经在淋巴功能前体中高度表达。有强有力的分子证据表明，它们有助于T细胞发育的1期和后期事件。然而，它们最突出的作用是在2期激活确定的T细胞谱系基因。 Front. Immunol 2022 E蛋白促进T细胞从DN1阶段到DN3阶段的定向和分化。αβT细胞中的Pre-TCR和TCR信号通路导致Id3的短暂上调和E蛋白的抑制。在γδ T细胞的发育过程中，γδ TCR信号的梯度通过调节Id3的表达和E蛋白的活性来决定不同γδ亚群的结果。当E蛋白的功能被抑制时NKs、ilc2和ILC前体（ILCPs）可能出现在DN阶段。 4+5. Ikaros和Runx因子 Ikaros家族和Runx家族转录因子在进入胸腺之前就已经高表达。与锌指阻遏剂GFI1和MYB，对早期T细胞发育极为重要（尽管它们从1期到2期的表达水平变化相对较小）。 它们是双功能的，既抑制又激活靶基因。 Ikaros家族因子作为肿瘤抑制因子，并强制执行发育检查点功能，激活或者抑制调节基因波（从一个发育阶段到下一个发育阶段），更像开关，而非渐进的。 在Runx家族因子中，RUNX1在DN pro-T细胞中表达非常高，并且已发现对1期和2期特异性因子的活性具有关键作用。 Ikaros和Runx家族的个体成员有不同的表达模式。 6. BCL11B 高度T细胞谱系特异性因子BCL11B不会立即被TCF1和GATA3激活，在DN2a晚期（1期到2期的过渡）首次表达，它对于T细胞谱系定向，所有αβ T细胞发育以及成功通过β选择变得至关重要。 Front. Immunol. 2021 在人类患者中，BCL11B蛋白（N441K，参与DNA结合）的第二锌指中的杂合错义突变，导致严重的T细胞免疫缺陷以及神经系统缺陷。由此产生的突变BCL11B蛋白具有显性的负活性，并以某种方式阻断了有效的BCL11B和DNA结合。 靶向突变表明，BCL11B 的DNA 结合和 N 末端抑制结构域对 T 细胞定向分化至关重要。在 CD4+ 与 CD8+ 谱系选择期间，C末端锌指在 T 细胞发育的后期阶段很关键。 7. PU.1 至少两种机制减缓了细胞对T细胞调节因子TCF1，GATA3和Notch信号传导的初始反应。 一种机制涉及细胞进入胸腺时的起始表观遗传状态，其中由于组蛋白上的抑制标记，DNA甲基化，染色质的压缩，和/或核内定位，关键T细胞特异性基因周围的大量基因组区域变的不可及。Bcl11b也会受影响， 另一种限制机制是最初在T细胞前体中运行的稳健的替代基因调控网络的活性，涉及1期转录因子，如PU.1。 PU.1是一个ETS家族的转录因子，在造血过程中发挥着广泛的作用。它是髓系、树突状细胞和B细胞的直接调节因子，是众所周知的终末红细胞分化拮抗剂，也在胸腺内T细胞发育的早期阶段表达。它的表达使T细胞前体最初、短暂地进入髓系和树突状细胞的发育，因此代表了T细胞谱系定向的拮抗或延迟的来源。 Front. Immunol. 2019 PU.1和Notch共同决定了T和髓系系的命运。胸腺内的Notch信号通常限制PU.1效应,支持早期前T细胞发育，同时阻断PU.1的替代命运。Notch信号本身并不抑制PU.1表达；然而，其他由Notch信号通路诱导的转录因子最终在DN2b阶段沉默了Spi1的表达。 小部分表达高水平PU.1的细胞在DN2b向髓样状态转移，可以在表型上与保留在T细胞状态内的细胞区分。 参考资料 Johnson JL et al. Lineage-Determining Transcription Factor TCF-1 Initiates the Epigenetic Identity of T Cells. Immunity 48, 243–257 e10 (2018). Hosokawa H & Rothenberg EV Cytokines, Transcription Factors, and the Initiation of T-Cell Development. Cold Spring Harb. Perspect. Biol 10(2018). Yui MA & Rothenberg EV Developmental gene networks: a triathlon on the course to T cell identity. Nat. Rev. Immunol 14, 529–45 (2014). Rothenberg EV Programming for T-lymphocyte fates: modularity and mechanisms. Genes Dev 33, 1117–1135 (2019) Cumano A et al. New Molecular Insights into Immune Cell Development. Annu. Rev. Immunol 37, 497–519 (2019). Pankow A and Sun X-H (2022) The divergence between T cell and innate lymphoid cell fates controlled by E and Id proteins. Front. Immunol. 13:960444. doi: 10.3389/fimmu.2022.960444 Sidwell T and Rothenberg EV (2021) Epigenetic Dynamics in the Function of T-Lineage Regulatory Factor Bcl11b. Front. Immunol. 12:669498. doi: 10.3389/fimmu.2021.669498 Rothenberg EV, Hosokawa H and Ungerbäck J (2019) Mechanisms of Action of Hematopoietic Transcription Factor PU.1 in Initiation of T-Cell Development. Front. Immunol. 10:228. doi: 10.3389/fimmu.2019.00228

引言转分化代表了直接的谱系转换；然而，对这一过程的描述不足阻碍了其潜在的应用。2024年3月19日，山东大学刘峰团队（张一帆及康志鑫为论文的共同第一作者）在Developmental Cell  在线发表题为“Single-cell omics identifies inflammatory signaling as a trans-differentiation trigger in mouse embryos”的研究论文，该研究利用单细胞组学鉴定炎症信号作为小鼠胚胎的转分化触发器。为了探索转分化的潜在普遍原理，该研究在小鼠胚胎中进行了内皮到造血转化(EHT)、内皮到间充质转化和上皮到间充质转化的单细胞转录组分析。应用熵、细胞型特征转录因子表达和关键过渡信号三个评分指标来显示支持过渡状态命运可塑性的共同特征。跨模型比较确定了炎症特征的过渡状态和白细胞介素-33在促进命运转换中的共同触发作用。多模式分析(整合转录组学和染色质可及性分析)证明了造血规范的炎症调节。此外，多模态组学和命运定位分析表明，内皮特异性Spi1作为炎症效应因子，控制着适当的染色质可及性和转录程序，以保护EHT。总的来说，该研究使用单细胞组学来识别关键的过渡状态/信号以及炎症信号在发育应激诱导的命运转换中的常见触发作用。Waddington的表观遗传景观一直被认为是描述细胞从全能性状态到终末分化状态的一个隐喻该景观具有三个基本要素，即细胞类型/状态、分化路径和基因调控网络(GRN)后来，细胞重编程的成就补充了Wadding的景观。细胞重编程对再生医学至关重要。从一个成熟谱系到另一个成熟谱系的转分化是细胞重编程的主要途径通过操纵确定的因素成功的转分化表明，稳定的细胞状态在Waddington的表观遗传景观可以克服障碍，直接改变他们的命运。虽然获得具有明确功能的终末细胞是成功的转分化的标志，但对过渡状态、动态过渡路径和复杂GRN的全面理解仍然是转分化领域的重大挑战。在脊椎动物的最终造血干细胞和祖细胞(HSPC)生成过程中，内皮到造血转化(EHT)是一个被充分研究的转分化范式。在小鼠中，主动脉-性腺-中肾(AGM)中的扁平动脉内皮细胞(AECs)首先特化为具有内皮-造血双重电位的造血内皮细胞(HECs)然后，HECs萌发形成主动脉内造血集群(IAHCs)，其中包含造血祖细胞(HPCs)和造血干细胞(HSCs)的未成熟前体(1型[T1]和2型[T2]前造血干细胞)。此外，内皮-间充质转化(EndoMT)和上皮-间充质转化(EMT)也是两种典型的转分化模式，在组织发育、再生和肿瘤发生中起着至关重要的作用。与EHT类似，EndoMT和EMT也有一系列的过渡状态。尽管现有的研究为转分化提供了丰富的组学和实验数据资源，但要获得指导其广泛应用的通用原理仍然是一个巨大的挑战。模式图（Credit: Developmental Cell）体内细胞命运的转变通常由输入刺激介导，如发育线索或损伤诱导的应激炎症信号在感染或炎症期间负责防御病原体和维持机体稳态，也调节着自然或应激条件下的命运转变。在最终的HSPC出现时，toll样受体4下游的炎症信号或被干扰素、肿瘤坏死因子α和白细胞介素激活，指示EHT。内皮功能障碍时，炎症反应诱导EndoMT，进一步导致血管系统缺陷当在小鼠成纤维细胞中强制转录因子(TF) Etv2过表达以实现内皮细胞重编程时，在重编程成纤维细胞中存在激活的炎症信号通路。此外，逆转录病毒介导的多能重编程或成纤维细胞到内皮细胞(EC)的转分化导致先天免疫反应和炎症信号的激活，这有助于有效的细胞命运重编程。这些研究促使人们重新审视炎症信号在细胞命运转变中的特定作用。该研究进行了单细胞组学分析和功能分析，以揭示小鼠胚胎中EHT、EndoMT和EMT的潜在共同分子特征和机制。研究发现由炎症信号和下游效应TF介导的发育应激负责天然转分化。激活免疫/炎症信号的富集是EHT、EndoMT和EMT过渡状态的共同特征;同时，已知的EndoMT/ EMT调节剂促炎白细胞介素-33 (IL-33)通过其受体抑制致瘤性2 (ST2)触发EHT。该研究基于目前可用的单细胞转录组数据集和实验验证，提供了一个框架来表征反式分化的过渡状态和信号触发因素。将该框架应用于疾病相关数据集还可以帮助解码疾病进展过程中的关键转变，例如正常细胞向肿瘤细胞的转化。原文链接https://doi-org.libproxy1.nus.edu.sg/10.1016/j.devcel.2024.02.010责编|探索君排版|探索君文章来源|“iNature”End往期精选围观一文读透细胞死亡(Cell Death) | 24年Cell重磅综述（长文收藏版）热文Nature | 破除传统：为何我们需要重新思考肿瘤的命名方式热文Nature | 2024年值得关注的七项技术热文Nature | 自身免疫性疾病能被治愈吗？科学家们终于看到了希望热文CRISPR技术进化史 | 24年Cell综述