TAB1

近年来，DNA 编码库 (DEL) 发现平台已成为一种强大的苗头化合物识别技术。它已成为小分子药物发现以及 HTS 和数据挖掘等其他策略的主要并行工作流之一。对于许多在 DEL 领域工作的研究人员来说，通过 DEL 筛选发现的许多苗头和先导化合物以独特且前所未有的结合模式与靶蛋白结合。本篇综述，作者分析和讨论最近发表的针对重要临床分子靶点进行的 DEL 筛选。观察到的显着趋势，包括来自 DEL 筛选的抑制剂具有高度选择性和采用新颖的结合模式的明显趋势，与该领域的当前状况和未来考虑因素一起强调和讨论。1.DEL背景介绍筛选，即对分子集合进行测试以发现具有所需活性的化合物，仍然是小分子药物开发的基本发现方法。罗氏/基因泰克的一项研究发现，根据年份的不同，四分之一到二分之一的被发现的先导化合物系列是通过各种类型的筛选发现的。其余的大部分是通过基于知识或传统方法产生的，例如“专利破坏”。高通量筛选（HTS）是效率最高的筛选形式，在大多数年份中，占筛选衍生先导系列的大部分，而Focused筛选和Fragment筛选也有很好的代表性。DEL筛选在过去 5 年中成为潜在lead的来源。虚拟筛选方法（在出版物中标记为“从头”发现）仅占先导系列的相对较小部分（大多数年份为 0-10%）。最近对已发布的开发候选药物和筛选苗头(hit)的分析得出了类似的结论，尽管与上述分析相比，DEL 的代表性不足，这与典型的苗头到候选(hit-to-candidate)时间线并不不一致。筛选通常被描述为“探索”“化学空间”体现在手头的分子集合中。化学空间是巨大的，据估计，具有类似药物理化性质的化合物数量可能高达 10^60。由于蛋白质配体结合位点的形状和体积具有一定程度的保守性，药理学相关空间可能更小。但即便如此，潜在有用的化合物空间仍然巨大，无法使用当前的筛选方法进行有效采样。目前药物发现的 HTS 集合通常包含大约 1-300 万种化合物，比上面指出的潜在有用空间小得多。因此，必须仔细选择筛选平台中包含（和排除）哪些化合物。构建筛选集合的精确选择标准因组织而异。优先权和多样性等概念，与可开发性、溶解性、稳定性、合成可处理性和避免有害化合物相平衡，以达到组织所需的筛选平台。 由于化学空间广阔而我们探索它的手段有限，所有筛选收集都是人类深思熟虑的结果。DEL 筛选与其他方法不同，它受人类决策的影响较小。给定反应方案中可以包含的分子砌块(building blocks)的数量实际上没有限制，因为每个合成步骤的编码能力远远超过特定反应类别中商业上可用的分子砌块的数量。因此，库的规模和多样性取决于可用分子砌块的数量、反应性以及获取它们的预算。幸运的是，现代分子砌块集合的范围和多样性足以确保即使是简单的方案也可以产生多样化且有用的化合物。如果我们将可及化学空间定义为可以从市售试剂轻松组装的理论化合物的总体，那么 DEL 是让我们对可及空间进行有意义采样的唯一方法。由于组合合成的算法和大量可用的分子砌块，只需很少的合成操作就可以构建巨大数值大小的 DEL。为了了解 DEL 的规模，我们可以考虑 参考CAS 注册表。根据过去 100 年的文献和专利汇总，其 2.75 亿种化合物代表了化工企业的总体。除了类药(drug-like)有机化合物之外，它还包含配位化合物、金属、聚合物和其他在药物发现中不太感兴趣的物质。常规合成的 DEL 含有超过 2.75 亿种类药(drug-like)。因此，一次 DEL 可以筛查的化合物比现代化学史上制备和报道的化合物还要多。虽然数字大小经常被用作化学多样性的简写，但两者并不等同。有一些证据表明 DEL产率与文库大小无关。作者认为，库分子砌块的数量和多样性，而不是总体库大小，是单个 DEL 生成苗头化合物能力的关键决定因素。获得许多具有不同方案、核心和连接化学物质的此类 DEL 是总体成功率的重要因素，也是以下示例中体现的各种分子结构的关键。筛选如此超大型且结构无偏差的文库可能会产生什么后果？如果潜在的配体-蛋白质相互作用的范围有限，那么当前的 HTS 牌组可能会相当好地覆盖该范围。在这样一个世界中，配体解决蛋白质结合问题的方法有限，DEL 筛选预计会产生结合相互作用方面新颖性较低的命中结果。然而，直觉似乎表明，由于化学空间如此巨大，而我们挖掘它的能力又如此稀疏，配体-蛋白质相互作用中一定存在未开发的机会。那么，对化学空间进行更广泛的探索可以带来什么好处呢？第一个好处是能够成功发现其他苗头分子识别方法失败的靶标的配体。虽然存在 DEL 筛选案例，使得“无法成药的药物”成为可能，包括下面讨论的一个，但大多数都未发表，因此超出了本综述的观点。另一个结果：发现配体-蛋白质相互作用的新模式。如果我们真正探索化学空间中新颖且未探索的区域，那么应该能够观察蛋白质以新颖且未探索的方式做出反应。现在有大量 DEL 出版物包含结构数据，特别是晶体学数据，以便人们可以系统地探讨这一问题。在本综述中，作者检查了已发表的 DEL 筛选实验，并确定是否观察到新的配体-蛋白质相互作用。这种新颖性可以通过新的结合位点（包括变构）、已知位点的新结合模式或相互作用、不寻常的蛋白质构象或前所未有的抑制模式来例证。将检查选定的 DEL 出版物，并与之前报道的内容进行比较，评估其报道的配体-蛋白质相互作用的性质。主要包括以下4个方面:2.诱导蛋白产生新构象(c-MET, TAK1, PAD4)3. 新的蛋白-配体相互作用(BTK, RIP1, RIP2, Mer )4. 新的结合位点(PAR2, WIP1)5. 新的结合模式诱导二聚化(ATAD2)2.诱导蛋白产生新构象2.1 c-METc-MET（间充质（至）上皮转化因子）是一种受体酪氨酸激酶，参与调节多个关键细胞过程，包括生长、运动和存活。众所周知，这种激酶的失调在许多人类癌症中发挥着重要作用。已经公开了许多c-MET小分子抑制剂，并且一些已被批准用于治疗c-MET驱动的癌症。根据它们与 c-MET 的结合方式，这些抑制剂大致可分为两类：I 型或 II 型。已批准的 I 型抑制剂，包括克唑替尼、沃利替尼、卡马替尼和替波替尼，已知或预期可与 c-MET 的 ATP 结合位点结合，并通过 π 堆积到位于激酶 A 环（激活环）内的酪氨酸残基 (Y1230) 上来实现极高的选择性。II 型抑制剂，如卡博替尼（已批准）或福替尼（目前未批准），也与 ATP 位点结合，但另外延伸到活性位点更深处，取代了 A 环的保守“DFG”肽基序。虽然 I 型抑制剂被证明是有效的，但获得性耐药突变形式的 c-MET 的出现提出了重大挑战，目前需要能够抑制野生型和耐药突变体形式的激酶，同时保持高激酶组(kinome)选择性的抑制剂。为此，阿斯利康的研究人员与 X-Chem 的研究人员合作，筛选了一个 DNA 编码的化学库平台（即多个 DEL 的集合），该库由超过 1000 亿种针对野生型和耐药 D1228V 突变体筛选。对筛选结果进行分析后，选择外消旋化合物1进行脱 DNA 合成（图 1a），随后的 SPR 分析确认该化合物与 c-MET 结合。然后尝试进行结晶实验（重点关注 D1228V 突变体，1具有更高的亲和力），得到 2.01 Å 的晶体结构（图 1 b）。晶体结构分析显示化合物1与激酶的铰链区结合并延伸至后袋，表面上类似于 II 型抑制剂的结合模式。然而，αC 螺旋似乎采用了一种非常不寻常的构象，重新排序形成两个正交螺旋（如图 1b中的红色所示），而不是激酶 αC 螺旋通常看到的单螺旋（以灰色显示）如图 1 b)所示。然后分离活性对映体（如晶体结构所示）（产生化合物2）并进一步分析。在体外生化酶测定中进行测试时，发现2抑制野生型和 D1228V c-MET，IC 50值分别为 0.9 和 0.09 μM。有趣的是，针对一组约 140 个激酶的激酶选择性评估为2，表明该化合物对 c-MET 具有高度选择性，与晶体学观察到的不寻常结合模式一致。因此，这项工作强调了 DEL 筛选发现抑制剂的能力，这些抑制剂不仅具有新颖的结合模式，而且具有良好的药理学特性（例如高靶点选择性）。图 1.(a)通过针对野生型和D1228V c-MET 的  耐药突变体筛选 DNA 编码文库，发现了 c-MET抑制剂1和2的化学结构。(b) 与化合物1结合的 D1228V c-MET 的晶体结构，突出显示在该复合物中观察到的高度不寻常的 αC 螺旋构象（红色，PDB:8ANS）。为了进行比较，灰色显示了由沃利替尼结合的 c-MET 晶体结构中的 αC 螺旋（PDB:6SDE），显示了该螺旋的典型构象。2.2 TAK1TGF-β 激活激酶 1 (TAK1)，也称为 MAP3K7 和 MEKK7，是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，参与调节先天性和适应性免疫反应、神经褶皱形态发生、血管发育和肿瘤发生。TAK1可以被TGF-β激活，并促进多种促炎细胞因子（例如 TNF-α、TLR 配体、LPS 和 IL-1）的下游信号传导。TAK1 与 TAK1 结合蛋白 1 (TAB1) 形成稳定的复合物，并触发 TAK1 激酶活性。(TAK1 抑制剂的治疗潜力已被研究用于治疗胰腺癌、卵巢癌,和乳腺癌以及炎症性疾病。已报道了几种 TAK1 抑制剂，包括天然产物 5Z-7-oxozeaenol，这是一种不可逆共价抑制剂，可与 TAK1 活性位点半胱氨酸残基结合。该化合物表现出细胞活性；然而，它缺乏选择性，因为它结合许多其他具有类似活性位点半胱氨酸的激酶。最近的研究描述了 I 型和 II 型激酶抑制剂，例如takinib。这些是从各种筛选实验中鉴定出来的，并且通过基于结构的药物设计（SBDD）来帮助优化它们的效力。尽管付出了巨大的努力，但仍未实现激酶选择性和细胞效力的正确组合。为了从头发现新型 TAK1 抑制剂，发起了 DEL 筛选。将目标 TAK1-TAB1 融合蛋白作为文库池，对 21 个不同的 DNA 编码化学文库进行 DEL 筛选。追求平行筛选条件，包括不同的靶标浓度和 5Z-7-oxozeaenol 的存在。DEL 筛选产生了大量丰富的配体，数据分析和分析揭示了可操作的可能配体以进行后续跟踪。优先合成的没有编码标签的化合物之一是3（图 2a），它源自具有两个多样性化学循环的 376 万种化合物的库。图 2.(a) TAK1 DEL hit 3及其类似物的结构。在 10 μM ATP 存在下使用 TAK1-TAB1 融合蛋白进行生化 Lantha screen 测定。(b) 在撰写本综述时蛋白质数据库中可用的所有 TAK1 晶体结构的叠加（总共 22 个结构）。DEL 命中的晶体结构（PDB:7NTH和7NTI ) 的颜色为绿色。所有其他 TAK1 晶体结构均描绘为 白色 丝带，具有先前报道的 I 型 TAK1 抑制剂 (PDB:4L53 以白色显示为代表性的非 DEL 衍生抑制剂。从 DEL 衍生的抑制剂到铰链区（hinge region,残基 Ala107）的氢键显示为黑色破折号。化合物3的生化检测 IC 50值为 1.3 μM，根据其 DEL 选择性曲线被假定为 I 型结合物，并作为后续构效关系 (SAR) 探索的起点。据推测，酰胺羰基和吡咯氨基与TAK1的铰链区相互作用，而吡咯烷环在后袋中产生疏水相互作用。N-甲基酰胺的DNA接头区域预计最有可能暴露在溶剂中。将吡咯核心修饰为咪唑部分产生了其密切类似物4（图 2a）。随后，获得了与 TAK1 结合的化合物4的 X 射线晶体结构，这为产生化合物5（图 2a）的系列 SBDD 铺平了道路，其TAK1 生化检测 IC 50为 2 nM（在测定检测限） 。4和5均以I 型方式与 TAK1 的铰链结合，通过其咪唑 NH 和酰胺羰基作为供体-受体对与 Ala107 的主链相互作用（图 2b，绿色）。化合物4和5均诱导铰链区的独特构象，其中 Ala107 相对于之前的 TAK1 翻转结构。这种翻转的构象将铰链主干从其他结构中观察到的位置移开（图 2b，白色与绿色卡通），作者推测这种差异可能导致4和5对 TAK1 相对于其他激酶的高选择性。总之，在 DEL 筛选中发现的一系列 I 型 TAK1 抑制剂揭示了铰链区独特的结合模式，与其他已知的 TAK1 抑制剂相比，这可能有助于这些 DEL 衍生化合物具有优异的激酶组选择性。2.3 PAD4PAD4（肽基精氨酸脱亚胺酶 4）是五个PAD家族蛋白质（PAD1-4 和 PAD6）的成员之一，这些蛋白质通过带正电残基的钙依赖性脱亚胺作用对肽基精氨酸残基进行翻译后修饰，得到中性瓜氨酸残基。虽然该蛋白家族广泛分布于全身并参与许多重要的生理和病理过程，但 PAD4 在骨髓、淋巴组织和血液中表达最高，并在 NETosis (中性粒细胞胞外陷阱)中发挥关键作用。底物类似物的早期研究确定卤代脒6和7是 PAD4 的不可逆抑制剂（图 3a），其活性一般，且对其他肽基精氨酸脱亚胺酶的选择性较差。2015 年，葛兰素史克 (GSK) 报道了一种新型结构的选择性 PAD4 抑制剂，对缺钙蛋白仍具有活性。在存在和不存在钙的情况下针对 PAD4 筛选 GSK DNA 编码文库集合，结果发现了8（IC 50：3.2 μM，图 3 a）。图 3.(a) PAD4 抑制剂的化学结构，包括 DEL 衍生化合物8和9。(b) 与9结合的 PAD4 的晶体结构（PDB: 4×8G）。抑制剂和蛋白质之间的关键极性相互作用显示为 黑色破折号。残基 633–645 为红色。该区域有助于9与 PAD4 的结合，在 apo-晶体结构中是无序的。苯并咪唑环系统上的取代和氮杂吲哚核心的引入导致类似物的活性得到改善（9，IC 50：0.2 μM，图 3 a）。对9与人 PAD4的晶体结构分析突出了许多关键相互作用，这些相互作用解释了观察到的 SAR 并有助于进一步完善该分子（图 3 b）。此外，X射线结构显示，小分子的结合诱导了蛋白质区域的先前未见的构象。在没有钙的情况下，残基 633-645 是无序的；然而，9被认为稳定了蛋白质的这个区域，这些残基形成了 β-发夹构象（图 3b中的红色），允许两个亲脂残基（Phe634 和 Val643）与配体相互作用。这被认为是这些化合物相对于 PAD 家族其他成员的选择性的根源，因为 Phe634 不存在于 PAD1-3 和 PAD6 中。3. 新型蛋白质-配体相互作用3.1 BTKBTK 是一种细胞质非受体激酶，在 B 细胞受体 (BCR) 信号通路中发挥关键作用，从而在 B 细胞以及其他造血细胞的分化中发挥重要作用。众所周知，BTK 的上调会导致多种血液癌症的发生，包括慢性淋巴细胞白血病 (CLL)、小淋巴细胞淋巴瘤 (SLL) 和肥大细胞淋巴瘤 (MCL) 等。因此，BTK 作为癌症药物靶点受到了相当大的关注，迄今为止已有五种小分子抑制剂被批准用于治疗各种血癌。尽管这些批准的药物被证明非常成功，但人们仍然希望发现更多安全性更高的 BTK 抑制剂，既可以作为癌症治疗药物，也可以用于治疗肿瘤学以外的疾病，例如自身免疫性疾病和炎症性疾病。为此，Cuozzo 等使用多重平行选择条件对 BTK 筛选了一个由超过 1.1 亿种化合物组成的 DNA 编码化学库。这导致了化合物10的鉴定，该化合物脱 DNA合成后进一步表征（图 4a）。10在探针置换测定中显示出令人印象深刻的（特别是对于未优化的初级苗头分子来说）IC50 =0.55 nM，并且在使用相关细胞系进行细胞测定时进一步显示出优越的活性（低nMIC 50）和安全边际。BTK 与10复合物的共晶结构，表明该抑制剂与激酶的 ATP 结合位点结合，与铰链区 M477 的主链 NH 以及 D539 的侧链形成氢键以及 P 环 F413 的主链 NH（图 4b）。特别值得注意的是，四氢-β-咔啉部分被认为占据了由 P 环重排形成的子口袋(subpocket)，之前尚未发现有抑制剂占据该子口袋（图 4c，蓝色椭圆形） ）。作者随后假设，这种以前未观察到的结合模式可能是10对 BTK 的高结合亲和力的基础。总体而言，这项工作代表了 DEL 筛选的一个很好的例子，该筛选产生了针对经过验证的重要药物靶标的新型高活性小分子抑制剂，并具有独特的结合模式。图 4.针对BTK的DEL筛选。(a) BTK 抑制剂10。(b)BTK结合的10 的晶体结构（PDB: 5U9D）。(c)10时与当时所有 BTK-配体复合物的结构比对，其中10显示为蓝色棒状，所有其他化合物显示为灰线。10的四氢-β-咔啉部分的蓝色圈出。3.2 RIP1激酶RIP1 激酶或 RIPK1，最近才发现作为炎症、细胞凋亡和坏死性凋亡的重要调节因子。由于其在这些过程中的作用，RIPK1目前被认为是治疗一系列急性和慢性炎症性疾病的有前途的药物靶点。第一个 RIPK1 小分子抑制剂是所谓的“necrostatins”， 2013 年报道了这些化合物与 RIPK1 的晶体结构。这些晶体结构表明necrostatins（和类似物）与激酶活性位点深处的亲脂性口袋结合。然而，这些化合物对 RIPK1 的活性相对较弱（IC 50值在亚 μM/高 nM 范围内），这促使 GSK 的研究人员通过生化筛选一组针对 RIPK1 的激酶小分子，试图发现这种酶有更好特性的抑制剂。发现一系列 II 型激酶抑制剂，尽管这些抑制剂显示出显着提高的活性（与necrostatins相比），但被认为作为进一步优化的先导化合物不是最理想的（主要是由于这些化合物的分子量相对较高）。为了进一步尝试发现具有优化临床应用潜力的 RIPK1 抑制剂，GSK的研究人员随后筛选了一个 DNA 编码的化学库，其中包含约 77 亿种针对 RIPK1 的化合物。对筛选结果进行分析后，一系列苯并氧氮杂酮被认为是有希望的苗头分子。在基于 FP 测定中，脱 DNA合成和对命中化合物11的评估（图 5a ），提供了支持 IC 50=10 nM ，对11抑制 RIPK1 酶活性的能力的评估产生了优越的 IC50（特别是对于 1.6 nM 的主要苗头分子。图 5. (a) 11的化学结构，是通过筛选针对 RIPK1 的 DNA 编码化学库组而发现的。(b)各种RIPK1抑制剂的结合模式比较。RIPK1与11（PDB: 5HX6，绿色碳）结合，II 型 RIPK1 抑制剂（PDB:4NEU，蓝色碳），以及与 necrostatin 类似物结合（PDB:4ITH，红色碳）。黑色虚线表示从11到残基D156的主链NH的氢键。然后确定了11与 RIPK1 复合物的晶体结构，揭示了与先前公开的 RIPK1 抑制剂明显不同的结合模式（图 5b）。发现11的苯基与类似的necrostatin（和类似物）基团结合到相同的亲脂性后袋上，然而，发现苯并氧氮杂酮部分向激酶的铰链区（腺嘌呤环所在的区域）延伸。其天然底物 ATP 预计会结合），但与之前公开的 II 型化合物不同，未发现与铰链区域形成接触。因此，这种结合模式将11归类为“ATP 竞争性 III 型”抑制剂，当时这对于 RIPK1 抑制剂来说是独一无二的。对11 种激酶组对超过 450 种激酶的选择性的评估表明，该化合物对 RIPK1 具有精确的选择性，即使不是完全选择性的。此外，其理化和 DMPK 特性也被确定为有利的，这标志着11是一个有希望的候选者，可以进一步优化为潜在的临床候选者。事实上， 11的进一步优化类似物已进入临床试验，强调了 DEL 筛选能够产生关键药物靶点的临床候选药物的能力，而之前的替代性命中发现尝试并未成功（即未能成功发现具有合适特性的抑制剂）。3.3 RIP2激酶RIP2 激酶或 RIPK2是一种细胞内激酶，已被确定为模式识别受体 NOD1 和 NOD2（包含核苷酸结合寡聚化结构域的蛋白 1 和 2）的关键信号传导伴侣。ATP 驱动的 RIPK2 自身磷酸化激活下游信号转导。针对 NOD/RIP2 通路的 RIPK2 抑制剂已被证明可以抑制下游细胞因子的产生；因此，RIPK2抑制代表了治疗炎症性疾病的一种有吸引力的治疗策略。通过筛选 GSK 已知的系列激酶抑制剂，已鉴定出2类RIPK2抑制剂，包括 I型和 II型抑制剂。(虽然这些抑制剂，例如12（SB-203580，一种p38 MAPK抑制剂，见图6a），erlotinib和gefitinib（EGFR 激酶抑制剂）可有效抑制 RIPK2 并阻断 NOD2 驱动的细胞因子产生，这些药物具有广泛的激酶活性，使其不适合作为选择性 RIPK2 抑制剂用于治疗炎症的药物用途。图 6.(a) RIPK2 抑制剂的结构，13是通过 DEL 筛选发现的。(b) RIPK2-12 (SB-203580, PDB: 5AR4) 和 RIPK2-13 (PDB: 5AR5) 复合物的重叠结构，突出显示13在P环( S25) 之间的 ATP 结合位点中独特的双齿相互作用和铰链区域（M98）。抑制剂13是一种新型苯并咪唑结构（图 6a），是通过针对 RIPK2 筛选 GSK DEL 集合而发现的。RIPK2-13复合物的 X 射线结构显示13是 I 型激酶抑制剂，尽管以非典型方式结合 RIPK2（图 6b）。13拥有一个不寻常的甲基醚铰链结合基序，接受来自 Met98 的主链 NH 的氢键，而苯并咪唑 N3 与 Ser25 的侧链羟基（位于激酶 P环内）形成关键的氢键相互作用。13的这种结合模式被认为对于激酶抑制剂来说是非常不寻常的（可能是因为在整个激酶组的 P 环内这个位置丝氨酸的作用较少），研究人员表示这种不寻常的结合模式可能有助于与其他 RIPK2 抑制剂相比，13的激酶选择性高，这是该领域的一项显着成就。3.4 MerMer 和 Axl 属于受体酪氨酸激酶 TAM 家族。它们都与免疫反应的功能有关，并且 Mer 和 Axl 抑制的组合作为增强当前免疫疗法的有吸引力的机制而引起了人们的兴趣。Mer 由肿瘤相关巨噬细胞表达，Mer 的激活促进从 M1 型巨噬细胞极化至原肿瘤 M2 型巨噬细胞，从而通过胞吞作用导致凋亡细胞清除。通过 Mer 抑制逆转这种巨噬细胞极化过程应该能够恢复免疫介导的肿瘤抑制。虽然 Axl 活性本身不是致癌驱动因素，但它在免疫调节中发挥着复杂的作用，可以抑制细胞因子释放、Toll 样受体信号传导以及抗原呈递树突状细胞激活 T 细胞。因此，预计肿瘤微环境中 Axl 的抑制也有利于增强免疫反应。虽然小分子 TAM 激酶抑制剂已进展到临床，在 TAM 家族和更广泛的激酶组中的不同程度的选择性表明，仍然明确需要高度选择性的双 Mer/Axl 激酶抑制剂来评估其在癌症免疫治疗中的使用。因此，阿斯利康实施了全面的领先一代的开发策略，包括虚拟筛选、FBLG、数据挖掘(data mining)、HTS 和 DEL 筛选。虽然数据挖掘和HTS在发现有效的 Mer 激酶抑制剂方面取得了成效，但这些努力并未识别出具有足够选择性和可开发性的化合物来。DEL 筛选与其他苗头分子筛选实验并行运行，利用 20 个选择条件对超过 900 亿分子的库进行筛选。该方法旨在探测有和无 ATP 的多个 Mer 构建体，并根据几种脱靶蛋白质结果分析。该数据集与全面的下游筛选级联相结合，实现了有效的分类过程，以重点关注具有所需的双Mer 和 Axl 抑制选择性特征的苗头分子，并且针对主要反靶标 Flt3 的选择性裕度超过 50 倍（图 7a )。在解析与 Mer 结合的命中的 X 射线晶体结构后，可以看到明显的结合模式的多样性（图 7b）。图 7.(a) 通过 DEL 筛选发现的 3 Mer 激酶抑制剂的化学结构。(b) 所有三个苗头分子的晶体结构叠，显示Mer与14（红色碳，PDB:7AW3）、15（绿碳，PDB:7AW2）和16（蓝碳，PDB: 7AW4 ）复合物中的不同结合模式）。虽然以14为例的氮杂吲哚系列在 TAM 家族激酶中显示出合适的活性，但在针对更广泛的激酶组进行筛选时发现它有些混杂，考虑到 I 型结合模式，这并不意外（图 7b，洋红色碳） ）。15被发现采用I1/2型激酶抑制剂的结合模式特征（图7b，绿色碳）。在铰链区与 Met674 形成氢键相互作用，而分子的其余部分向 αC 螺旋延伸，同时保持 DFG-in 构象。这只是据报道采用这种 Mer 结合模式的第二种抑制剂。从 DEL 筛选中鉴定出的第3种化学型以化合物16为例。它源自包含两组氨基酸构建模块的 3 循环文库。在 Km和高（高于 K m ）ATP 浓度下的生化 Mer 测定中观察到缺乏与 ATP 竞争。该化合物与 αC 螺旋附近的变构袋结合，促进 αC 螺旋向外构象，与 ATP 袋中的铰链区没有相互作用（图7b，蓝色碳）。这代表了 Mer 激酶抑制剂的一种新的结合模式。化合物16与 αC 螺旋上的催化 Lys619 和保守的 Glu637 发生极性接触。三氟甲基苯基团占据 DFG-Phe 的口袋，激活环处于 DFG-out 构象。与 I 型抑制剂相比，这种 III 型结合模式赋予 Mer 和 Axl 双重效力，并对多种激酶具有出色的选择性。总之，DEL 筛选提供了多种结构上不同的苗头分子，这些苗头分子具有跨正构结合位点的不同结合模式，涵盖了更常见的 I 型、记录较少的 I1/2 型，以及独特的 III 型 Mer 激酶抑制剂。与现有的 Mer 激酶抑制剂相比，I1/2 型和 III 型都具有大大改善的选择性，咪唑并吡啶系列已开发为有效的体内探针化合物，并纳入免疫肿瘤学功效模型。3.5 ATXATX，也称为 ENPP2（外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶家族成员 2），可将溶血磷脂酰胆碱 (LPC) 转化为生物活性磷脂衍生物溶血磷脂酸 (LPA) 和胆碱。LPA 作为细胞外信号分子，通过激活 LPA 受体发挥其生物活性。ATX/LPA 轴由于涉及多种疾病领域，例如癌症、疼痛，纤维化，和炎症。在特发性肺纤维化 (IPF) 患者的肺部观察到 ATX 水平升高，一种死亡率高且无治愈方法的疾病。此外，ATX 抑制剂有望成为抑制肿瘤进展的一种有吸引力的治疗策略。学术和工业组织已报告了几类 ATX 抑制剂。ATX 抑制剂可分为脂质样结构，其特征是具有酸性极性头部的线性亲脂尾部（例如 PF8380、BI-2545）、吲哚/吲唑衍生的 ATX 抑制剂和其他化学型包括 GLPG1690 ( 17 ),一项 3 期临床候选药物，最近由于获益-风险问题而被终止。在对 2.25 亿成员的编码化学库进行 DEL 筛选中发现了一类新的 ATX 抑制剂。选择活动产生了丰富的成果，并且出现了几类结构独特、高度富集的化学型作为假定的结合分子。无编码 DNA 标签的富集样本的合成产生了高效的 ATX 抑制剂。苗头系列的 SAR 探索以选择输出为指导，进一步优化导致先导化合物18（图 8a）具有适合动物模型测试的 ADME 特性。图 8. (a) ATX及抑制剂的结构：18是 DEL 筛选发现的。(b)与 ATX 结合的18的晶体结构（蓝碳，PDB:6W35），覆盖17（GLPG1690，黄碳，PDB:5MHP）和 PF-8083（红色碳，PDB :5L0K）。以 1.98 Å 的分辨率获得了18与人 ATX的共晶结构（图 8 b），这揭示了该先导化合物的独特结合模式。与之前报道的结构如 PF-8380 或 BI-2545 不同，其中苯并恶唑烷酮的位置和苯并三唑部分完美地叠加并与 Zn 结合口袋中的催化锌离子之一接合，18延伸穿过结合位点以占据自分泌运动蛋白的疏水口袋和疏水通道。与GLPG1690类似，18不与Zn结合口袋中的锌离子结合。有趣的是，18在疏水口袋和疏水通道中的轨迹与 GLPG1690 的结合元件不同（图 8b）。2-氟-5-三氟甲基苯基取代基占据疏水袋，而乙内酰脲基团羰基氢键连接至 Tyr83 的侧链。吲唑基团指向溶剂并与 Ser82 形成氢键，并与 Phe250 形成边对面 π-π 相互作用。正如所报道的，从丰富的 DEL 筛选结果中获得的 SAR 观察加速了从苗头到先导分子的开发，并且先导化合物18 (X165) 很容易被优化为候选质量的化合物。3.6 BRD4BRD4，含溴结构域蛋白 4，是溴结构域和 c 末端结构域外 (BET) 蛋白家族的成员。该家族由 BRD2、BRD3、BRD4 和 BRDT 组成，所有这些都与组蛋白尾部和其他蛋白质上的乙酰化赖氨酸残基结合。乙酰化赖氨酸作为表观遗传标记，一旦与 BET 家族蛋白结合，就会导致 RNA 聚合酶和其他转录相关蛋白募集到这些位点，从而调节转录起始和延伸。BRD4 作为肿瘤学靶点，因为它通常是血液肿瘤中癌基因（包括 Myc）表达所必需的。Bromodomains(溴结构域)是这些蛋白质中与乙酰化赖氨酸相互作用的结构元件。BRD4 包含两个溴结构域，溴结构域 1 和溴结构域 2。这两个溴结构域高度同源，结构彼此非常相似（图 9a），并且与其他 BET 家族成员中的溴结构域非常相似。BRD4 抑制剂的许多早期报告并未探讨所报告的抑制剂与溴结构域 1、溴结构域 2 或两者结合的程度。图 9.(a) BRD4 溴结构域 1 和溴结构域 2 的重叠显示两个结构域之间的高度序列和结构相似性。BRD4 溴结构域1（PDB:2OSS）为蓝色，BRD4 溴结构域2（PDB: 2OUO）为绿色。(b) 目前公开的所有 50 个 BRD4 溴结构域 2 复合物结构的叠加，其中使用亲和力介导的选择从 DNA 编码的化学库中发现的唯一化合物以蓝色显示。DNA 编码的化学文库独特地用甲氧基取代了原本保守的水分子。(c) 使用 DNA 编码化学发现的 BRD4 抑制溴结构域 2 的选择性高于对溴结构域 1 的选择性。(d) BRD4 溴结构域 2 与覆盖有 apo 蛋白（绿色）的 DEL 苗头分子 19 （蓝色）复合。在过去的十年中，文献中出现了一些关于 BRD4 溴结构域 2 选择性抑制剂的报道，尤其是因为泛 BET 溴结构域抑制剂已在一系列临床和临床前进行了研究，并显示出不理想的治疗裕度。据报道，选择性抑制剂越来越多其中最具选择性的显示出约5000倍的选择性比。其中 50 种化合物的重叠结合姿势如图 9b所示。大多数这些化合物有许多共同点，包括在乙酰基赖氨酸结合袋内结合以及与 His437、Asn433 和 Pro430 相互作用，保留四个高度保守的氢结合水分子。目前有一篇关于使用 DNA 编码化学文库来发现 BRD4 溴结构域 2 抑制剂的报告。发现初始 DEL 苗头分子的筛选旨在富集在同时结合溴结构域 1 与  溴结构域 2 的化合物。同时筛选了两个构建，其中每个溴结构域中的关键酪氨酸是突变为丙氨酸以使其失活。溴结构域 2 选择性化合物针对野生型构建体，和溴结构域 1 被突变的构建加以富集。得到一个 DEL 苗头分子 ( 19 )如图所示图 9c以及该苗头分子的优化版本 GSK040 ( 20 )，经确定其对 BRD4 溴结构域2 的选择性比 BRD4 溴结构域1 的选择性高 5000。这是迄今为止报道的选择性最强的化合物。DEL苗头分子是用 BRD4 溴结构域2 结晶的，该结构如图 9d所示，与 apo 结构重叠。甲氧基苯环充当乙酰基赖氨酸模拟物，与 Asn433 形成氢键。His437 和 Val439 与苯环之一之间发生其他相互作用。也许最值得注意的是，甲氧基延伸并取代了在该溴结构域的大多数结构中观察到的高度保守的水分子之一。这种独特的结构特征如图 9b所示，其中所有 50 个公开可用的BRD4 溴结构域 2 复合物结构已在结构上对齐（以灰色显示），其中 DEL 苗头分子19以蓝色显示。从该覆盖图可以明显看出，甲氧基独特地占据了与其中一个水分子结合的位点。同样区分这种结构，该 DEL 苗头化合物的任何部分都没有投射到 His437 和 Asn433 之间的裂缝中，而大多数其他选择性化合物被认为是在该区域内获得其选择性的。在与最初合成该化合物的两个结构单元相对应的位点以及连接子附着点上对该化合物进行了进一步优化，作者发现 GSK040 ( 20 ) 与 BRD4 溴结构域 2 的亲和力显着增加，且具有IC50值为 5 nM，选择性比 BRD4 bromodomain 1 高 5000 倍。3.7 InhA结核病每年感染数百万人，并导致 2021 年超过 140 万人死亡。在 Covid-19 大流行之前，它是全球范围内传染病死亡的主要原因。人们越来越多地观察到，结核病的病原体结核分枝杆菌(Mtb) 对常用的治疗结核病的一线疗法利福平和异烟肼具有耐药性。烯酰基-ACP 还原酶(InhA) 是异烟肼的主要靶标，通过烯酰基中间体催化酰基载体蛋白 (ACP) 的 NADH 依赖性还原，烯酰基中间体形成脂肪酸生物合成途径的一部分，对于蜡质外膜分枝菌酸的形成至关重要山地车。异烟肼是一种需要 KatG 激活的前药，与辅因子 NADH 形成共价加合物 ( 21 )。异烟肼-NADH 加合物通过与 NADH 竞争而充当 InhA 的皮摩尔抑制剂。许多多重耐药结核菌株表现出对异烟肼的耐药性，这与至少五个与异烟肼前药转化相关的基因突变有关，其中大多数突变与 KatG 基因及其上游启动子的缺陷有关。因此，人们认为 InhA 的直接抑制剂将为异烟肼耐药菌株提供结核病药物，而不会与异烟肼产生交叉耐药性。鉴定直接 InhA 抑制剂的一些早期为三氯生类似物 ( 22 )，一种常见的外用抗菌剂，针对 ACP-烯酰还原酶 (ER) 在脂肪酸合成中的重要作用。三氯生是一种过渡态模拟物，以皮摩尔亲和力与酶的 NAD+ 结合形式结合。虽然通过延伸到 InhA 的亲脂区域来成功地制造对 InhA 具有更高亲和力的三氯生类似物，但这些分子保留了三氯生的有限物理特性，因此没有得到进展。2010年代初，GSK的研究人员鉴定出了甲基噻唑系列的InhA抑制剂（23， 图10a）具有有效的酶抑制 (InhA IC 50 = 0.003 μM) 转化为细胞效力 (Mtb MIC = 0.19 μM)。与三氯生类似，该化合物结合在催化位点的 NADH 烟酰胺环上方，并与三氯生类似物一样占据疏水袋（图 10b）。2014 年发表的一项使用包含 1610 万种化合物的 DEL 的筛选确定了另外一系列 InhA 抑制剂 ( 24 )。虽然与之前的抑制剂相比，该系列与 InhA 形成了不同的相互作用，但它占据了类似于化合物23的结合位点区域（图 10b）。图 10. (a) 选定的 InhA 抑制剂：21（异烟肼-NAD 加合物）、22（三氯生）、23（甲基噻唑系列）、24（来自 GSK DEL 平台的 InhA 抑制剂）、25（吡啶-哌啶 DEL 系列）、和26（吡咯烷DEL系列）。(b) 各种 InhA 抑制剂复合物晶体结构的叠加。InhA 显示为灰色丝带，NADH 显示为带有洋红色碳的棒。InhA 结合位点的不同结合区域用彩色椭圆表示：绿色（催化位点）、蓝色（疏水性口袋）、橙色（亲水性位点）和红色（腺嘌呤相邻位点）。化合物被描绘为棒：23（PDB: 4bqp，黄色碳）、24（PDB: 4cod，橙红碳）、25（PDB: 5g0v，青色碳）和26（PDB:5g0w，橙色碳）。23和 Met98 主链之间的氢键显示为黄色虚线。之后，阿斯利康和 X-Chem 的研究人员使用该酶的 apo、NAD+ 结合和 NADH 结合形式对 660 亿个编码化合物进行了 DEL 筛选，并确定了多个化学系列。X 射线晶体学显示其中几个系列与先前确定的 InhA 催化、疏水和亲水位点结合；然而，两个系列，25和26，（图 10a）延伸到一个区域（邻近辅因子的核糖和腺嘌呤），之前没有发现任何InhA抑制剂占据该区域（图 10b，红色圆圈） ）。尽管人们对 InhA 抑制剂抱有很大希望，但有效的 InhA 抑制剂仍然难以捉摸。这可能是由于抑制剂需要模仿制造分枝菌酸（结核分枝杆菌的保护性蜡层）所需的长链脂肪酸而具有疏水性。也可能 InhA 并不像曾经想象的那么重要，并且异烟肼加合物会抑制 Mtb 内与其功效相关的其他靶标。不管怎样，这两项 DEL 研究表明如何通过与靶标进行额外的极性相互作用来使用 InhA 的其他区域并改善物理特性。4. 新颖的结合位点4.1 PAR2PAR2，蛋白酶激活受体 2，是 G 蛋白偶联受体 (GPCR) 家族的一员，当其 N 末端的蛋白水解裂解暴露出束缚的肽配体时，该受体会被不可逆地激活，然后该配体结合并激活跨膜受体领域。该 GPCR 家族与多种疾病有关，包括癌症和炎症，使其成为重大药物研究工作的焦点。PAR1 的选择性拮抗剂（vorapaxar）已上市用于预防血栓形成，但事实证明发现其他 PAR 亚型的拮抗剂更具挑战性。开发 PAR2 拮抗剂的早期努力主要集中在已知激动剂肽序列的修饰上。这项工作产生了许多肽和肽模拟物，例如 K-14585（27，图 11a）具有良好的亲和力，但 ADME 性能较差。几个研究小组报告了具有改进特性的非肽拮抗剂，但仅表现出中等活性。然而，随着一系列新型拮抗剂的鉴定取得了突破，这些拮抗剂被证明可以与跨膜区域中以前未知的变构袋结合。来自阿斯利康、Heptares 和 X-Chem 的研究小组通过跨膜区域的多个点突变创建热稳定形式蛋白，成功地对这种跨膜蛋白进行了 DNA 编码筛选。图 11. (a) 肽模拟物 K-14585 ( 27 ) 和源自初始 DEL 命中28的变构 PAR2 拮抗剂 AZ3451 ( 29 ) 的化学结构。(b) PAR2-29 复合物的晶体结构（ PDB: 5NDZ）。图29被描绘为具有蓝色碳的球体，其中正位结合剂AZ8838以洋红色显示，取自PDB:5NDD。该筛选采用了蛋白质的两种变体，其中一种在捕获到树脂上之前暴露于溶液中的编码文库，而另一种在引入文库之前预先捕获到树脂上。在使用预捕获蛋白质的条件分析中鉴定出一组有趣的结构相关的苯并咪唑。通过分析 DNA 接头偏好获得了有关结合相互作用的更多信息。苗头分子来自同时使用芳基和烷基 DNA 连接体的文库，数据表明优先选择芳基连接体。当化合物28 (IC50 = 0.090 μM) 显示良好的拮抗剂活性而甲基酰胺无活性 (IC50 > 15 μM)时。通过探索苯环上的取代来改进这一点，得到了改进的变构拮抗剂 AZ3451（29，IC50 = 0.023 μM）。有趣的是，苯并咪唑家族化合物的概况推测它们与已知的拮抗剂具有竞争性，但是当获得29与 PAR2 复合物的晶体结构时（图 11b），发现它在跨膜内占据了一个新的结合袋-不与正构位点或其他已知的变构袋重叠的区域。与已知拮抗剂的竞争被认为源自 GPCR 与结合位点之间的变构通讯。总之，这项工作提供了 DEL 筛选能力的另一个例子，能够以前所未有的结合模式找到重要药物靶标的新颖、高活性苗头分子。4.2 WIP1Wip1，由 PPM1D（镁依赖性蛋白磷酸酶 1δ）编码）是一种具有致癌活性的丝氨酸/苏氨酸磷酸酶。Wip1 充当 DNA 损伤反应途径中关键蛋白（例如 p53、p38 MAP 激酶和 ATM）的负调节因子。与 Wip1 作为癌基因的功能一致，PPM1D 的扩增和过度表达已在多种人类癌症类型中得到证实，包括乳腺癌和卵巢癌。在人类原发性癌症中也发现了功能获得性 Wip1 突变。这支持了这样的假设：抑制 Wip1 将是抑制肿瘤生长和进化的一种有吸引力的机制。虽然丝氨酸/苏氨酸磷酸酶是有吸引力的治疗靶点，但它们往往具有高度保守的催化结构域，这使得选择性、竞争性抑制剂的开发具有挑战性。早期的 Wip1 抑制剂由 Yamaguchi 等人从 Wip1 的天然的底物序列衍生而来。这些环状磷酸肽旨在通过模仿 p38 MAP 激酶的 pTX pY 序列中的磷酸化苏氨酸来靶向催化位点。UNG2 被证明是 Wip1 的特异性底物，并且在对该分子进行进一步改进后，实现了Wip1 的Ki为 110 nM 的活性。可以证明比 PPM1A 具有一定的选择性，但这与 PPM1D 的抑制效果降低 30 倍相平衡。由于这些抑制剂负电荷高，细胞通透性差，因此其使用受到限制。GSK 报告了通过生化和生物物理筛选鉴定出的一系列小分子 Wip1 磷酸酶抑制剂，证明了平行筛选方法的综合协同作用。对全长 Wip1 进行的 DNA 编码文库筛选，鉴定出一种有效的 Wip1 抑制剂，IC50值为13 nM（30，图 12）。同时，进行了生化高通量筛选，使用截短的 Wip1 测量人工底物的水解，并鉴定出与 DEL 命中具有重叠特征的化合物，IC50为 361 nM。这些独立发现的苗头分子被合并成包含类氨基酸核心区域的系列，该系列被指定为加帽氨基酸（CAA）系列。发现对 Wip1 的30抑制与二磷酸荧光素 (FDP) 不具有竞争性，这表明 CAA 化合物在催化活性位点之外结合。令人高兴的是，这种变构特征似乎转化为对两个密切相关的 PP2C 家族成员 PPM1A 和截短的 PPM1K（磷酸酶结构域）的优异选择性。对一组 21 种磷酸酶也没有观察到抑制作用 (IC50 > 30 μM)。化合物30的细胞渗透性和药代动力学可以通过适度的结构变化进行适当调整，从而开发出 GSK2830371 ( 31 )，这是第一个报道的口服活性 Wip1 磷酸酶变构抑制剂。这种命中发现方法已经证明了亲和力筛选识别新变构位点结合物的能力，其中正构位点的选择性预计会阻碍药物开发，而先导优化的命中例证了 DEL 空间提供高度精细的机会的机会并在第一时间就获得了强有力的打击。图 12.变构 Wip1 抑制剂 ( 30 ) 的化学结构和用于产生 GSK2830371 ( 31 )的转化虽然目前还没有Wip1蛋白成功结晶的报道，但随后人们努力通过其他方式阐明GSK2830371的结合机制。使用计算模型和功能诱变的综合研究与生化和生物物理测定的结果相结合。这些结果表明，31通过与铰链区的相互作用，这是 PPM1D 所特有的，导致摆动区运动并将其锁定为单一的非活性构象。虽然31诱导这种构象变化的机制尚不清楚，但我们可以推测，这可能是由于配体与蛋白质的多个位点结合并充当“分子胶水”而引起的。5. 诱导二聚化的新型结合模式5.1 ATAD2ATAD2（ATP 酶家族，含 AAA 结构域的蛋白 2）也称为 ANCCA（AAA 核共调节器癌症相关蛋白）是一种表观遗传读取器，与组蛋白上的乙酰化赖氨酸结合，从而影响转录。由于与 c-Myc 共扩增，ATAD2 在许多癌症中过度表达，是转录因子的共激活剂，包括 ERα，E2F,是结直肠，胸部和肺部，子宫内膜和卵巢部位癌症预后不良的标志。基因敲除研究表明 ATAD2 可能是一个可行的肿瘤学靶点。ATAD2 由左手四螺旋束组成，与 ZA 和 BC 环一起决定了溴结构域内的乙酰化赖氨酸结合位点。ATAD2 溴结构域在适当的序列背景下与乙酰化赖氨酸相互作用，例如已被证明可以拉低乙酰化 H3 和 H4 肽，这种相互作用可能会被结合位点内的突变破坏，并且还被用于开发 TR-FRET 测定。ATAD2 具有三个不同的结构域。酸性 N 末端区域与染色质提供紧密但非特异性的结合。AAA ATPase 结构域驱动核小体驱逐。溴结构域 (BD) 与组蛋白上的乙酰化赖氨酸结合，充当表观遗传读取器。自 2014 年以来已报道了一系列 ATAD2 抑制剂IC 50值低至个位数 nM。本质上，发现方法完全是生物物理的；NMR、X 射线晶体学或亲和介导的选择，然后使用源自四乙酰化组蛋白 H4 (BET) 的探针进行 TR-FRET，或直接进行 TR-FRET。因此，可以通过这些方法中的任何一种来发现与调节肽结合的任何位点结合的化合物。然而，除了利用 DNA 编码化学文库的方法外，所有报道的化合物都占据了溴结构域内的一组重叠位点。对这些化合物进行的每一项 X 射线晶体学研究都表明它们与一组基本一致的氨基酸相互作用，主要包括Asn1064，或者更深入地进入口袋并取代结合的水分子。唯一的例外是使用 DNA 编码化学库和亲和介导的选择发现的化合物。该化合物通过完全不同的作用机制引发其抑制作用，因为它诱导 ATAD2 溴结构域二聚化，并因此阻止与乙酰化组蛋白的相互作用，无论是在体外还是与细胞中的染色质。目前尚不清楚为什么利用 DNA 编码化学库的方法为化合物提供了如此独特的作用模式，但这可能与本研究中筛选的化合物数量非常大有关。拜耳和 X-Chem 合作使用一系列 DNA 编码化学库和亲和介导的选择来发现 ATAD2 抑制剂。总共筛选了 650 亿种化合物，其中的苗头分子来自 1.1 亿的子库。苗头分子 ( 32 ) IC50为个位数 μM，而以33 (BAY-850)为代表的后续优化化合物，通过均相时间分辨 FRET 显示低至 22 nM 的值（图 13）。通过热位移测定 (TSA)、微量热泳动 (MST)、AlphaScreen 和 BROMOscan TM 证实了靶点接合，FRAP 测定证明了 MCF7 细胞中全长 ATAD2 从染色质中的置换。BROMOscan 测定表明相对于其他含溴结构域的蛋白质具有高度选择性，并且分子筛色谱表明该化合物能够诱导单体 ATAD2 的二聚化。这种人工二聚化形式的 ATAD2 可防止与体外乙酰化组蛋白，以及细胞中染色质的相互作用。在亲和力介导的筛选中针对 GST 标签的 ATAD2 溴结构域构建体富集的命中化合物，以及在这种情况下 GST 介导的靶标二聚化也可能在发现可诱导单体ATAD2本身二聚化的化合物方面发挥了作用。图 13. BAY-850 ( 33 ) 是一种异构体选择性 ATAD2 化学探针，根据通过 DEL 筛选发现的初始命中 ( 32 ) 进行优化。6. 讨论和结论上述示例证明了 DEL 筛选输出的丰富多样性，无论是在分子结构方面，还是在结合模式、选择性和蛋白质构象方面。很难将上面提到的每个例子分为不同的类别。然而，我们可以观察到广泛的趋势，这些趋势说明了 DEL 筛选发现的分子相互作用的新颖性。其中一种趋势是蛋白质采用以前未观察到的构象，如 c-MET 和 TAK1 示例中所示。观察到的另一个趋势是 DEL 配体通过新的相互作用与蛋白质相互作用。在 BTK 示例中，该化合物与疏水性亚袋（通过色氨酸部分）结合，这在之前的配体复合物中未观察到。在同一选择实验中发现具有不同结合模式的多个配体的能力是 DEL 筛选的标志。 Mer/Axl 案例中，在一次实验中，发现了三种完全不同的激酶抑制结合模式：I 型、“I1/2”型和 III 型。新的相互作用并不局限于激酶。在 BRD4 的情况下，一个水分子被取代，该水分子在许多其他已知的 BRD4 抑制剂复合物中是保守的。此外，值得注意的是该化合物不与 H437 和 N433 之间的裂缝相互作用，而该裂缝被大多数其他 BRD4 抑制剂占据。除了寻找与已知结合口袋相互作用的新方法之外，有时 DEL 筛选还会揭示完全未知的口袋的出现。GPCR PAR2 就是这样的一个例子。就 WIP1 而言，虽然配体-蛋白质复合物无法结晶，但各种生物物理实验表明该化合物是一种变构结合剂，可以稳定非活性蛋白质构象。它通过与其他相关磷酸酶中 Wip1 独有的结构域结合，并可能通过同时与多个结构域相互作用，充当分子内“胶水”来实现这一目标。在 ATAD2 病例中观察到完全不同的抑制机制。在这里，诱导的二聚化导致了抑制。据我们所知，这种作用机制在溴结构域中是前所未有的。毫不奇怪，正如 BROMOScan 数据所示，这种独特的机制带来了高选择性。高选择性似乎与这些新颖的模式相关，因为上面讨论的几乎每个案例都表明了化合物的高选择性。虽然大多数引用的参考文献中都缺乏选择实验的详细方案，但值得注意的是，并非在所有情况下都引用了脱靶的反选择。尽管引用了 TAK、BTK、c-MET、BRD4、PAR2 和 InhA 的竞争性和/或突变体选择，但只有 Mer/Axl 报告详细讨论了其反筛选策略。总之，我们认为这些观察结果对小分子筛选的未来来说是个好兆头。随着更多构建模块的出现以及更多 DEL 的合成，我们将继续扩大可利用的化学空间。这种扩展将进一步增加选择实验导致前所未有的结合相互作用和新药理学的可能性。随着该行业应对更新、更困难的靶标，对化学空间的公正探索将成为一个有价值的工具。参考文献:https://pubs-acs-org.libproxy1.nus.edu.sg/doi/10.1021/acs.jmedchem.3c01861声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！长按关注本公众号   粉丝群/投稿/授权/广告等请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓

研究人员证实了GFAT1通过促进GFAT1-TTLL5-TAB1复合物的形成，产生对TAB1的谷氨酰胺化修饰，进而激活p38 MAPK。 代谢重编程是肿瘤细胞区别于正常组织细胞的重要特征。在此过程中，显著上调的代谢酶发挥了关键作用[1]。此外，代谢酶也可通过参与信号传导，蛋白的转录后修饰等非酶依赖性的作用方式，协助肿瘤应对生存压力。 氨基己糖通路（HBP）是糖代谢的重要分支之一，它作为细胞内“能量传感器”，整合了葡萄糖代谢、谷氨酰胺分解、脂肪酸代谢和核苷酸代谢。在多种类型的癌症中，都存在HBP增强[2-3]。 谷氨酰胺-果糖-6-磷酸酰胺转移酶1（GFAT1）是HBP通路中最重要的限速酶，在多种肿瘤细胞中表达升高，并于与患者的不良预后相关[4-5]。有研究表明：在葡萄糖缺乏的情况下，GFAT1明显上调并激活HBP通路，进而维持肿瘤细胞的存活[6-7]。然而，GFAT1能否通过非酶依赖的作用参与肿瘤细胞生物过程目前尚不明确。 近日，由广州医科大学呼吸疾病国家重点实验室的陈涛、梁文华及钟南山领衔的团队，与上海交通大学医学院附属仁济医院蒋玉辉团队合作，在《细胞发现》期刊发表了有关营养压力下GFAT1促进肺腺癌细胞细胞存活的机制研究的重要成果[8]。 该研究团队证实了GFAT1对肺腺癌细胞存活的关键调控作用还发现GFAT1的作用并不依赖于其代谢调控功能，而是作为细胞内信号传导分子，促进TTLL5-GFAT1-TAB1复合物的形成，进而激活P38 MAPK信号通路，促进肺腺癌细胞的存活。 这项研究成果证实了在营养压力条件下，氨基己糖通路关键代谢酶GFAT1通过非代谢调控功能促进了肺癌细胞存活，为靶向GFAT1这一代谢靶点治疗肺癌提供了理论证据。 论文首页截图 接下来，我们就一起来来看看这个研究是如何展开的。 研究人员首先对癌症基因组图谱（TCGA）和基因型-组织表达程序（GTEx）数据库开展了基因表达谱互动分析（GEPIA），结果发现GFAT1在肺腺癌中表达明显上调。 为了探究GFAT1在肺腺癌发生中的作用，研究人员首先在肺腺癌细胞中敲除GFAT1，随后在营养压力下检测癌细胞的存活率，发现敲除GFAT1，癌细胞的存活率明显下降，同时也几乎完全抑制了p38 MAPK的激活。 随后，研究人员又过表达MKK6E，以激活p38 MAPK，结果发现明显逆转了敲除GFAT1的作用。 以上研究结果提示，GFAT1的作用可能依赖于P38 MAPK的激活。 为了探究营养压力下GFAT1的作用是否归因于其代谢活性，研究人员在稳定敲除的GFAT1肺腺癌细胞中，回补氨基葡萄糖来上调糖基化水平，结果发现肿瘤细胞生长并未恢复。 然而，在敲除GFAT1并过表达酶活性缺失的GFAT1（rGFAT1-H577A）的细胞中，回补谷氨酸后可以明显促进p38 MAPK的激活及肿瘤生长。 以上结果提示，营养压力下GFAT1通过介导谷氨酸的产生，对于P38 MAPK的激活及肿瘤的存活至关重要。 之前有大量研究表明，TAB1和p38α MAPK的结合可以导致p38 MAPK的激活[9]。研究人员通过质谱及蛋白免疫共沉淀（IP）实验发现，GFAT1与p38 MAPK信号的关键调控蛋白TAB1存在结合。后续的实验结果表明，p38 MAPK和JNK之间的协同作用促进了TAB1上Ser438的磷酸化。 随后，通过敲低及IP实验，研究人员证实了TAB1 S438的磷酸化是GFAT1-TAB1相互作用的必要条件，是营养压力下p38 MAPK持续激活的关键。 在探索过程中，研究人员还发现一个有趣的现象：GFAT1-TAB1与TAB1-p38 MAPK的相互作用存在相关。究其背后原因，研究人员发现在营养压力下，GFAT1与TAB1的结合导致了TAB1-p38α的结合，进而激活了p38 MAPK，维持了细胞生存。 接下来，研究人员对GFAT1对TAB1产生的修饰作用进行探索。结合之前GFAT1介导产生的谷氨酸所发挥的关键作用及质谱及IP结果，研究人员通过大量实验证实，在营养压力下，GFAT1与TTLL5的结合增加，从而对TAB1上Glu 212进行谷氨酰胺化修饰。这一构象改变促进了TAB1与p38α MAPK的结合，从而激活了p38 MAPK。 为了探究GFAT1-TTLL5对TAB1的谷氨酰胺化作用是否依赖于GFAT1介导产生的谷氨酸，研究人员通过回补谷氨酸实验发现，谷氨酸明显地促进TAB1谷氨酸化和TAB1-p38α MAPK复合物的形成，进一步实验证实，在营养压力下，GFAT1通过产生谷氨酰胺从而促进GFAT1-TTLL5-TAB1复合物的形成，介导TAB1谷氨酸化。 我们都知道，在营养压力下，肿瘤细胞可以通过上调自噬从而维持细胞存活，而p38 MAPK的激活对于细胞自噬至关重要。 为了探究GFAT1-TAB1-p38轴是否影响了细胞自噬，研究人员检测了细胞凋亡和自噬水平，发现GFAT1酶活丢失抑制了葡萄糖缺乏导致的肿瘤细胞自噬，而这一作用可被外源性回补谷氨酸所逆转。此外，TAB1 Ser438的突变几乎完全抑制了自噬，且无法被外源性补充谷氨酸所逆转。 与此同时，在GFAT1酶活丢失及TAB1磷酸化位点的突变的细胞中，过表达MMK6E激活p38 MAPK后，可明显促进肿瘤细胞存活和自噬水平的上调。十分有趣的是，在营养压力下，TAB1 Ser438的突变可以促进细胞凋亡，这一现象也可被过表达MMK6E以激活p38 MAPK所逆转。 以上结果说明，在营养压力下，GFAT1-TTLL5-TAB1复合物介导的p38 MAPK激活，通过调控细胞凋亡及自噬影响了肺腺癌细胞的存活。 为了在体内验证GFAT1-TAB1-p38轴对肺腺癌发展的作用，研究人员向裸鼠内分别注射WT rTAB1、rTAB1-S438A（磷酸化位点突变）或rTAB1-E212A（谷氨酰胺化位点突变）的肺腺癌细胞，对肿瘤生长及p38的激活进行评估。 结果他们发现，TAB1的磷酸化和谷氨酸化对于p38激活和肿瘤生长所必须的。这提示GFAT1-TAB1-p38轴的激活促进了肺腺癌肿瘤的形成。 除此之外，研究人员还在肺癌患者术后标本中观察到了p38激活和TAB1 S438磷酸化水平之间存在正相关。对患者生存期进行评估发现，GFAT1表达升高及TAB1 S438磷酸化水平升高，提示肺癌患者较差的预后。 总的来说，研究人员证实了GFAT1通过促进GFAT1-TTLL5-TAB1复合物的形成，产生对TAB1的谷氨酰胺化修饰，进而激活p38 MAPK。

胶质母细胞瘤（GBM）是一种侵袭性极强的癌症。 胶质母细胞瘤（GBM）是一种侵袭性极强的癌症。 过往研究表明，表皮生长因子受体（EGFR）扩增是GBM中一个重要的致癌驱动因素[1-2]。然而，多项靶向EGFR的临床试验均未能取得良好疗效，表明EGFR扩增在GBM中的功能作用或有不同[3-4]。 据统计，约57.4%的原发性GBM伴随野生型EGFR（EGFRwt）基因的扩增，并且这与共同扩增的GBM特异性突变EGFRvIII（2-7号外显子缺失）相关[5-6]。有研究表明，EGFRvIII能协同触发配体诱导的或构成型激活的EGFR信号传导（在没有EGFR配体的情况下，由GBM中EGFR的表达导致自发二聚体化导致的信号传导[7]）。 还有研究发现，构成型和配体诱导的EGFR激活触发了不同的信号通路[8-9]。目前，EGFR配体对于GBM发生发展的生物学功能，以及在GBM治疗中的临床实践意义是不清楚的。因此，构成型和配体诱导的EGFR激活在GBM中的作用和功能值得探索。 近日，来自德克萨斯大学西南医学中心的Amyn A. Habib教授团队，在《自然·细胞生物学》期刊上发表研究成果[10]。 他们发现，构成型激活EGFR通过激活TAB1-TAK1-NF-κB-EMP1通路促进GBM细胞侵袭。然而，配体诱导的EGFR激活通过上调桥接整合子3（BIN3），进而抑制DOCK7-RhoGTPase信号通路，导致GBM细胞增殖和侵袭能力下降。 简单来说，在EGFR扩增的GBM中，EGFR配体激活EGFR并抑制肿瘤细胞侵袭，将EGFR的作用从致癌基因转变为抑癌基因！郭高博士为论文的第一作者。 论文首页截图 让我们一起看看这项研究具体是如何开展的。 为了探索配体诱导的和构成型激活的EGFR及其介导的信号通路在GBM中的生物学作用。研究者在妙佑医疗国际患者来源的异种移植细胞系（PDX）和原代GBM神经球培养细胞中，检测了表皮生长因子（EGF）对GBM细胞侵袭的影响。 结果表明，添加EGF（EGFR配体）抑制了表达EGFRwt或EGFRvIII+EGFRwt的多个GBM细胞系的侵袭。使用siRNA敲降EGFR后，抵消了EGF对侵袭的抑制作用，表明GBM的侵袭作用是通过EGFR特异性介导的。 研究者也发现，将EGFR表达水平低的GBM细胞暴露于EGF会促进侵袭。然而，当EGFR在这些细胞系中过表达时，添加EGF又会抑制侵袭。 同时，使用不同剂量的siRNA敲降EGFR，随着EGFR表达水平的降低，EGF从抑制到促进侵袭逐渐过渡，这表明EGFR的表达水平，决定了配体诱导的EGFR信号传导的结果是促进还是抑制侵袭。 同时，研究者将GBM细胞注射到小鼠的大脑中，并通过体内活体显微镜实验证实，EGF抑制了GBM细胞的侵袭，并且EGF在高水平或低水平表达EGFR的多个细胞系中诱导细胞增殖。 然而，当siRNA敲降Src胶原同系物衔接蛋白（Shc）时，EGF诱导的增殖被抑制。Shc敲降抑制了响应EGF的丝裂原活化蛋白激酶1（ERK）激活，表明配体诱导的EGFR激活通过经典的Shc-ERK途径诱导增殖。 接下来，研究者进一步探索了EGFR抑制GBM细胞侵袭的下游信号机制。 RNA微阵列分析、WB和qPCR结果表明，BIN3是在添加EGF时上调程度最高的基因。重要的是，siRNA敲降BIN3阻断了EGF抑制GBM细胞侵袭的能力，同时过表达BIN3抑制细胞侵袭。 接下来，研究者利用质谱鉴定了与BIN3相互作用的蛋白，并找到了胞质分裂7（DOCK7）分子。 免疫共沉淀实验表明，EGF诱导了DOCK7和BIN3之间的相互作用，siRNA敲降DOCK7导致细胞侵袭性和RhoGTPase活性降低。 在DOCK7敲降的细胞中，添加EGF并没有进一步抑制侵袭或降低RhoGTPase活性，表明DOCK7位于BIN3的下游。同时，siRNA敲降BIN3抵消了EGF引起的RhoGTPase活性下调。 研究者也发现EGF诱导了GBM细胞中DOCK7-Y1118的酪氨酸磷酸化。DOCK7-Y1118F突变导致突变体不能与BIN3结合。结果表明，DOCK7的酪氨酸磷酸化以及EGFR上调BIN3对于DOCK7-BIN3相互作用同样重要。 随后，在无胸腺小鼠的颅内注射TGFα（EGFR配体）稳定表达的GBM12细胞或GBM9神经球细胞，结果表明，TGFα增加提高了小鼠存活率以及抑制了肿瘤侵袭能力。同时，在表达TGFα的肿瘤中，细胞增殖能力增强，但肿瘤体积明显减小。外源性输注EGF也会导致同样的结果。 以上结果表明，配体诱导的EGFR激活通过上调BIN3，进而抑制DOCK7-RhoGTPase信号通路，导致GBM细胞增殖，侵袭能力下降。 紧接着，研究者探索了构成型EGFR信号通路在GBM细胞中的作用及背后机制。 研究者发现，上皮膜蛋白1（EMP1）是一个通过构成型EGFR信号上调的基因，siRNA敲降EMP1抑制了GBM中EGFR表达引起的细胞侵袭。 质谱分析表明，TAB1与TAK1可能参与了EGFR的构成型信号传导。并且，TAB1能够激活NF-κB[11]。siRNA敲降TAB1导致构成型EGFR介导的侵袭、TAK1的激活和NF-κB亚基p65磷酸化的丢失。siRNA敲降TAB1或TAK1也阻断了EGFR诱导的EMP1的上调，表明TAB1-TAK1-NF-κB-EMP1信号轴驱动了构成型EGFR诱导的细胞侵袭。 此外，研究者发现，在构成型激活的EGFR中观察到低水平的EGFR酪氨酸磷酸化，这有利于激活NF-κB-EMP1途径，促进细胞侵袭。而在配体诱导的EGFR中检测到高水平的EGFR酪氨酸磷酸化，这有助于激活EGR1-BIN3信号通路，抑制侵袭。 接下来，研究者发现Jak1和Jak3抑制剂Tofacitinib，在多个GBM细胞系中高度上调BIN3的水平，以及抑制细胞侵袭。Tofacitinib也能上调肝素结合的EGF水平（HB-EGF：EGFR配体），并诱导EGFR的高度激活。 同时，Tofacitinib阻断了STAT1和STAT3的磷酸化，而STAT3敲降模拟了Tofacitinib的作用，引起HB-EGF分泌增加、EGFR活化以及侵袭抑制。此外，西妥昔单抗能够完全抑制Tofacitinib诱导的EGFR活化、BIN3上调和侵袭抑制。 研究者又探索了Tofacitinib对于小鼠颅内GBM肿瘤的影响，肿瘤细胞为GBM12TGFα的小鼠（高水平的EGFR配体），从Tofacitinib治疗中没有额外受益。然而，肿瘤细胞为GBM12V的小鼠（低水平的EGFR配体）在Tofacitinib治疗后，肿瘤侵袭能力下降，小鼠生存率显著增加。 此外，Tofacitinib也增加了小鼠肿瘤的增殖能力。稳定敲降HB-EGF的GBM39细胞对Tofacitinib治疗更敏感。这些结果表明，Tofacitinib可能对EGFR配体水平较低的EGFR扩增的GBM肿瘤更有效。 在体内和体外实验中均证实了EGFR配体具有激活并逆转EGFR为抑癌基因的能力，为了在数据库中检测EGFR配体的表达情况，研究者进行了进一步的生信分析。 癌症基因组图谱（TCGA）数据显示，7个EGFR配体在GBM中有不同的表达，其中HB-EGF、TGFα和EGF是GBM中最丰富的配体，EGFR配体在非EGFR扩增的GBM中具有非常强的致癌作用（P=0.0009）。然而，在EGFR扩增的GBM中，EGFR配体具有显著的抑癌作用（P=0.0355）。 由于EGFR配体在GBM发生发展中表现出的双重作用，研究者进一步探索了EGFR配体及相关蛋白与GBM患者预后之间的关系。 结果表明，当GBM患者肿瘤内EGFR配体水平较低时，肿瘤细胞内EGFR的激活方式主要为构成型信号传导，而这部分患者的预后也较差。此外，相比于EGFR磷酸化水平较低的患者，EGFR磷酸化水平较高的患者，预后更好（P=0.0254）。并且，在36个GBM样本中，随着BIN3蛋白水平的升高，患者预后逐渐改善。 同时，为了了解EGFR及配体在肿瘤内是否存在区域表达的差异，研究者开展了酶联免疫吸附试验（ELISA）。 结果表明，在36个切除的GBM样本中，EGFR的表达在肿瘤区域之间没有显著差异，然而，HB-EGF在肿瘤中心部分的表达水平却更高，它也是这36个样本中最丰富的EGFR配体。更进一步的是，已有研究发现Sp1能促进HB-EGF的转录，Sp1的过表达上调了HB-EGF的表达水平[12]。同时，Sp1与HB-EGF共同定位于肿瘤组织相同的区域，这表明转录因子可能参与调节了EGFR配体的区域表达。 总的来说，这项研究表明在EGFR扩增的GBM中，EGFR配体激活EGFR并抑制肿瘤细胞侵袭，将EGFR的作用从致癌基因转变为抑癌基因，而这依赖于配体诱导的EGFR激活，上调BIN3并抑制DOCK7-RhoGTPase信号通路来实现。 这意味着，基于EGFR和EGFR配体水平的患者分层，可能有助于预测能从靶向EGFR中获益的患者亚群。 参考文献 [1] Hatanpaa KJ, Burma S, Zhao D, Habib AA. 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