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了解小分子配体如何与其靶标结合对于药物发现非常关键，进而可以通过基于结构的设计实现更有效的优化，更好地理解分子药理学的机制。本文列出了工业界用于确定或预测配体结合位点的常用的10种方法，包括：  X射线晶体学 低温电子显微镜（cryo-EM）  竞争分析 核磁共振（NMR）  共价标记  光亲和标记 突变分析和定点诱变 氢/氘交换 (HDX) 和化学或蛋白水解稳定性分析  非变性质谱法  计算建模方法 首先是提供最高可信度预测、精度和分辨率的技术（例如 X 射线晶体学），然后是经济快速的替代方案（图 1，按分辨率排序）。 图 1. 本文涵盖的方法概述，箭头上的相对位置指示结合位点确定或预测的置信度/精度/分辨率水平。 1. X射线晶体学 X 射线晶体学是一种历史悠久的生物物理方法，可提供有关结合位点结构和配体结合姿势的详细信息。它被广泛认为是研究蛋白质配体结构的“金标准”方法。 主要优点：容纳高达数百kDa的蛋白质；可提供支持设计的 < 3 Å 分辨率 主要缺点：样品制备困难，尤其是完整膜蛋白；静态结构与动态解状态不同 X射线晶体学的基本原理是，有序蛋白质晶体中的原子会在特定方向上衍射X射线，产生衍射图案，从中可以得出电子密度图。然后将原子级结构建模为电子密度图。 X 射线晶体学可以适应一定范围的结构尺寸，并且通常可以实现 < 3 Å 分辨率，这是实现基于结构的设计的粗略阈值。还可以使用 X 射线晶体学捕获低亲和力配体或片段的结合事件，这对于支持基于片段的药物发现中的命中确认和后续工作很有价值。此外，数十年的技术改进已经使这种方法变得成熟，可以在几分钟内解析出新的蛋白质配体结构，从而能够跟上药物化学设计和合成周期。 另一方面，从 X 射线晶体学获得的结果并不总是可信或不能提供完整的信息。假阳性伪影可能涉及配体稳定在两个蛋白质拷贝的（可能）非生理相关界面处。在晶体浸泡过程中可能会出现假阴性伪影，其中结合位点被人为地封闭在预形成的蛋白质晶体中。最后，相对静态的蛋白质晶体可能无法揭示配体结合时发生的构象变化的全部程度。 利托那韦(Ritonavir)，X射线晶体学引导药物设计最早的成功范例之一。 X射线晶体学过程中的一个主要障碍仍然是产生有序的晶体，这对于跨膜或本质上无序的蛋白质和多蛋白复合物来说尤其困难。此外，由于 X 射线强度的必要增加，极小的晶体会遭受辐射损伤。克服这一问题的一种方法是采用带有 X 射线自由电子激光器的串行飞秒晶体学(SFX)。   一些创造性的解决方案使得利用配体膜蛋白进行 X 射线晶体学分析成为可能。例如， Sosei Heptares 采用基于分子进化的技术来生成具有增强的 SBDD 稳定性和结晶性的 GPCR 变体。Kyowa Kirin 的科学家发现的另一个解决方法是使用抗体 Fab 区域来稳定配体结合的 GPCR，这使他们能够确定高达 3 Å 分辨率的结构。 X 射线晶体学、 NMR 和冷冻电镜一起构成了研究蛋白质-配体相互作用的三种最流行、最可靠的生物物理技术（图 2）。 图 2. 每年发布的 PDB 结构数量图（ PDB数据库），说明了 X 射线晶体学、NMR 和冷冻电镜技术对发现新颖结构和结合位点的影响。 X射线晶体学的持续局限性，例如膜蛋白的溶解度普遍较差、蛋白质的灵活性以及翻译后修饰蛋白质的化学异质性，促使科学家们探索其他方法。其中尤其包括冷冻电镜，因为其通常可实现的分辨率已接近 X 射线晶体学的分辨率。事实上，目前用于确定完整膜蛋白和大型多结构域蛋白及复合物结构的首选方法是冷冻电镜。然而，X 射线晶体学仍然是对较小蛋白质或大蛋白质的较小结构域进行精确结构表征的非常有价值的方法。如前所述，其在解决蛋白质-配体复合物结构方面的快速通量是另一个关键优势。 2. 低温电子显微镜 (cryo-EM) 冷冻电镜是一种补充 X 射线晶体学和核磁共振的生物物理方法。这项技术可能是生物物理方法三合一中最新的技术，直到20 世纪 90 年代末才出现。 主要优点：能够处理大型、柔性或跨膜生物靶标；可提供支持设计的 < 3 Å 分辨率 主要缺点：仅限于大蛋白质和蛋白质复合物（120 kDa以下很难，50 kDa以下目前认为不可能）；采用多种构象状态的柔性蛋白质无法通过单个颗粒进行评估（例如，IgSF 蛋白质）；需要严格优化样品制备 冷冻电镜是 X 射线晶体学和核磁共振的补充，因为它可用于解析其他方法不易处理的结构，例如大型多亚基蛋白质。与 NMR 一样，通常不需要结晶，从而避免了 X 射线晶体学中最具挑战性的步骤。结晶对于最近开发和流行的MicroED技术是必要的，该技术可以解析微米或纳米尺寸晶体的配体蛋白质结构。 在冷冻电镜中，电子束射向配体结合蛋白的冷冻溶液网格。对获得的随机取向的蛋白质-配体复合物的放大图像进行分类以生成 2D 模型，然后将其重建为 3D 模型。改进图像处理、样品处理和探测器技术等关键因素预计将提高冷冻电镜的通量和结构质量。冷冻电镜目前正在经历一场“分辨率革命”，可以解析低于 3Å 分辨率的结构，并且更容易识别小分子-蛋白质相互作用。Astex Pharmaceuticals等一些公司已对该技术进行了大量投资，以支持其药物发现计划。 冷冻电镜可用于识别大型蛋白质复合物上的结合位点，例如构象灵活的 336-kDa GDH酶或 20S 蛋白酶体。Genentech 的科学家报告了他们使用冷冻电镜来研究新型 TRPA1 离子通道抑制剂的结合位点和作用机制，其中一种 ( GDC-6599 ) 已进入 II 期研究。冷冻电镜用于解析与同源四聚复合体跨膜受体（> 500 kDa）的一种化合物的结构，该结构为药物设计提供了关键见解。对非活性构象中的冷冻电镜配体-受体复合物与先前解析的活性构象的比较表明，配体充当“分子楔(molecular wedge)”。结合时，配体可防止附近的接头伸直，而这是受体呈现其活性构象所必需的。来自同一项目的结构不同的化合物 GDC-0334，冷冻电镜也被用来了解其作用机制。 冷冻电镜研究支持 Genentech 发现了一流的 TRPA1 离子通道抑制剂 GDC-6599，该药物目前正在进行 II 期临床试验。 小且灵活的蛋白质仍然对冷冻电镜提出挑战。此类蛋白质可能需要通过与其他分子（如抗体或纳米抗体）结合或成为较大蛋白质复合物的一部分来稳定。随着技术的成熟，适合解析冷冻电镜结构的蛋白质大小的下限已稳步降低。目前小于 70-80 kDa 的蛋白质更适合 X 射线晶体学。 冷冻电镜的其他的局限性包括构建模型所需的时间较长，以及在电镜密度中精准地定位小分子的挑战。在 X 射线晶体学中，结构一部分模型构建的逐步改进提高了整个电子密度的质量，因此配体和未建模片段的电子密度不断提高。不幸的是，冷冻电镜却并非如此。显然，这项技术还有很大的改进空间。 3. 配体竞争分析 竞争测定是根据测试配体和已知配体之间观察到的竞争类型推断配体结合位点的方法。 主要优点：在某些情况下，可能需要对现有常规检测进行最小程度的调整；可以使用水溶液中靶点；可以使用细胞裂解物中的内源蛋白；如果竞争配体在功能上相关，则可以确认结合模式在功能上的相关性 主要缺点：不能直接提供结合位点的结构信息；不揭示配体结合模式；已知配体需要具有已建立的结合位点并且可能需要进行标记；结果的解释可能不准确 两个配体之间的竞争（其中一个配体具有已知的结合位点）可以让实验者推断结合是否发生在共享位点或独特结合位点。然而，如果两个配体竞争结合，则不一定保证相同位点结合，因为竞争性配体不一定结合在相同位置。结合到不同位点的配体经常会引起蛋白质构象变化，从而影响远程位点的配体结合（例如，变构竞争性抑制）。 使用此方法测试有多种方案。具有已知结合位点的配体可以被“标记”，例如通过荧光标记或放射性标记，以实现读出。未标记的配体也可与亲和选择质谱、 NMR或SPR一起使用。核磁共振已成为研究含氟“间谍(spy)”分子与在同一位点结合的其他配体的竞争的简单方法。SPR 尤其常用于工业中的竞争实验。 对于酶靶标，动力学测定可以提供丰富的信息。如果酶抑制剂被证明与底物具有竞争性，则它可以靶向活性位点。一种传统方法是 Lineweaver-Burk 作图分析，其中绘制抑制剂浓度的倒数与反应速率的倒数的关系图。或者，分析可以利用Dixon作图，其中抑制剂浓度与反应速率的倒数作图。该技术用于表征竞争性和反竞争性抗菌 FabI 抑制剂(10.1021/jm300489v)。 葛兰素史克 (GSK) 报告发现了第一个 ATP 竞争性驱动蛋白纺锤体蛋白 (KSP，Kinesin Spindle Protein) 抑制剂(10.1021/jm070435y)。在其发表之前，仅报道了 KSP 的变构抑制剂，并且已知这些抑制剂容易受到耐药突变的影响。研究人员推断，靶向别构结合位点可以解决这一耐药性问题并赋予新的药理学作用。他们的新化合物的抑制模式通过 Lineweaver-Burk 图分析确定，并且表明示例性化合物与 ATP 具有竞争性，但与微管不具有竞争性。这与之前的变构抑制剂不同，后者与 ATP 不竞争，与微管也不竞争。 4. 核磁共振 (NMR) NMR 是一种生物物理方法，可补充 X 射线晶体学和冷冻电镜。从 20 世纪 80 年代末开始，NMR 解析的结构一直保存在 PDB 数据库中，现在该技术通常用于研究蛋白质-配体相互作用。 主要优点：可使用水溶液中的靶点；可以计算相互作用和动力学测量的 KD；可同时监测多种化合物；适合无序蛋白质或具有无序区域的蛋白质 主要缺点：某些实验需要同位素蛋白标记和/或蛋白大小 < 30 kDa 配体和蛋白质观察核磁共振实验产生有关蛋白质-配体相互作用的原子级信息。这些实验系列的一个共同特征是自由态和束缚态之间可观察的 NMR 参数（例如化学位移）的扰动。在观察 配体的NMR，包括STD、WaterLOGSY、transferred NOESY 或R2KD等实验可以提供有关配体结合模式的信息，并在某些情况下（但并非总是如此）能够计算 KD。在观察蛋白质 NMR 中，通过构建 HSQC 等实验生成的化学位移图，可以得出结合位点的粗略图片。检测蛋白质 NMR 的缺点包括在蛋白质大小 > 10 kDa 的情况下需要特殊标记（例如13 C、 15 N）蛋白质，以及由于标记和共振分配问题而对蛋白质大小的实际限制为 30 kDa。 由于 NMR 对弱的毫摩尔级KD结合配体具有敏感性，因此适合片段筛选，并支持多种临床阶段和已批准药物的发现。也许最著名的例子来自 Abbott 的科学家，他们开发了一种基于 NMR 的构效关系分析的新技术，该技术有助于他们发现BCL-2 抑制剂 Venetoclax (10.1126/science.274.5292.1531)。 NMR SAR构效关系是一种观察蛋白质的 NMR 方法，首先找到一个有希望的结合片段，然后在第一个片段达到饱和浓度的情况下筛选其他片段。以这种方式，可以发现第二位点结合物，其可以连接到第一片段以产生更高亲和力的双齿化合物。NMR SAR 的开发是基于片段的药物设计技术的开发和采用的一个重要事件，并且仍然是药物发现科学家的一个鼓舞人心的故事。 5. 共价标记 共价标记包括各种化学生物学方法，这些方法在与生物靶标孵育后检测反应性探针的结合。通常，MS 检测和肽图谱用于确定哪些残基被共价探针或感兴趣的共价配体共价修饰。共价探针和感兴趣的配体之间的竞争实验可以验证结合位点。 主要优点：灵活性，可以设计蛋白质或探针来实现该方法；可以使用水溶液；可以使用来自细胞和细胞裂解物的内源蛋白 主要缺点：没有揭示配体结合模式；只提供不完整的结合位点图片；仅适用于可以发生共价修饰的结合位点（例如，存在 Cys、Lys、Ser 等） 在该技术中，反应性探针分子与生物靶标一起孵育，然后通常通过质谱和肽图谱来鉴定标记的氨基酸。然后需要生成配体在该位点的结合模式的工作模型。 Sunesis Pharmaceuticals 的研究人员此前详细介绍了他们的“束缚方法(tethering method)”，其中针对含有天然或引入的半胱氨酸的目标蛋白质筛选半胱氨酸反应性小分子库。孵育和反应后，质谱分析揭示了反应性半胱氨酸的位置，甚至是潜在的可配位口袋的位置。 KRAS G12C抑制剂的首先是通过共价探针实验发现的。加州大学旧金山分校的研究人员率先报道了针对 KRAS G12C中半胱氨酸 12 的共价抑制剂如何将该酶捕获在非活性、GDP 结合状态。Amgen 和 Carmot 的科学家筛选了包含 3,300 个成员的亲电子化合物库与 GDP 结合的 KRAS G12C，以找到与该残基发生反应的共价抑制剂。这些化合物在多种测定中进行了评估，包括测量酶功能失活的生化测定，以及确认G12C 处共价加合物形成的基于质谱的测定。X 射线晶体学显示，他们新发现的抑制剂可进入附近的隐秘口袋，这与之前报道的抑制剂不同。利用这一特性来获得效力并改善药物特性。通过这种方式，快速找到了针对所需结合位点的化学起点，从而为 sotorasib 的发现铺平了道路。 安进 (Amgen) 的 KRASG12C 抑制剂 sotorasib（右）的发现涉及以共价标记为中心的筛选，及命中分子（左）。 6. 光亲和标记 光亲和标记是一种化学生物学方法，可在与生物靶标孵育并随后照射后检测光反应探针的结合。标记的蛋白质残基通常通过 MS 检测和肽图谱来确定。 主要优点：可用于结合位点缺乏亲核残基的蛋白质；可以使用水溶液；可以使用来自细胞和细胞裂解物的内源蛋白 主要缺点：没有揭示配体结合模式；只提供不完整的结合位点图片；可能需要付出大量努力才能找到合适的探头；一些光活化波长可能破坏蛋白质 在该技术中，将带有光激活基团的已证实活性的配体与生物靶标一起孵育，并进行照射以诱导探针激活并与附近的蛋白质残基发生反应。然后将标记的蛋白质提交以通过质谱和肽图谱鉴定光标记的蛋白质残基。 该方法应用的一个例子来自卫材对天然产物pladienolide的靶点识别和结合位点定位。他们的新型光亲和探针将剪接复合物 SF3b 识别为靶标，同时将结合位点缩小到亚基 SF3B3 和 SF3B1 之间的区域。H3 Biomedicine 后来的冷冻电镜研究揭示了由亚基 SF3B1 和 PHF5A 组成的口袋中存在 pladienolide 的结合位点，其中 SF3B3 位于光亲和部分结合的位置附近。 卫材使用光亲和探针来确定感兴趣的靶标和天然产物pladienolide的结合位置。 光亲和标记方法已应用于阐明小型弱结合配体的结合位点，例如HSAF 中的异丙酚(propofol)、 Munc13-1 中的乙醇、以及最近ANXA2 中的 PY-60 。 麻醉剂异丙酚（左）及其相应的光亲和探针 AziPm（右）。这说明了光亲和探针设计中的一个重要考虑因素，即光反应部分的正确放置，以避免光活化后的分子内反应。 安进科学家报告称，利用光亲和标记实验找到了一系列新型有丝分裂驱动蛋白 KIF18a 抑制剂的结合位点。他们的结合位点测定不仅用于理性设计和指导 SAR分析，还假设了一个工作模型，说明抑制剂如何将 KIF18a 捕获在微管上并阻止其滑动。辉瑞公司的研究人员使用源自γ-分泌酶调节剂的光亲和探针来识别和区分活性γ-分泌酶复合物内的结合位点。 在 ACS-EFMC 2023 会议上，Jnana Therapeutics 重点介绍了他们的RAPID 平台，用于在表达内源靶标的活细胞中进行命中识别（ WO2021076680 ），该平台基于化合物库的光反应探针竞争。该平台的优点之一是可以立即推断出命中分子的结合位点。 普林斯顿大学和默克公司的研究人员最近开发了一种创造性的方法来增强单个标记实验产生的信号。与传统的标记实验不同，目标配体不与所研究的蛋白质共价结合。相反，配体与铱光催化剂结合，催化附近的二氮丙啶试剂转化为卡宾，与结合位点附近的残基发生反应。该方法的催化性质导致多个标记事件，使结合位点周围的区域充满共价标签。该技术的分辨率相对粗糙，各种测试案例显示标记残基通常在已知结合位点的约 20 Å 范围内。 7. 突变分析和定点诱变 在传染病和肿瘤学中，赋予药物抗性的突变通常会暴露感兴趣的靶标和结合位点。定点诱变是一种生化方法，可以通过突变残基来推断结合位点并评估对配体结合的影响。 主要优点：是与生物物理方法互补的方法；可以使用水溶液 主要缺点：不提供结合位点的完整图谱；不揭示配体结合模式；突变对蛋白质可能有意外影响 如果结合位点中的残基发生突变，预计会显著改变配体结合亲和力。如果发生这种情况，配体可以对接到假设的结合位点以生成工作模型。 通常，可能与配体相互作用的残基突变为丙氨酸（称为丙氨酸扫描）。然而，当丙氨酸突变不能重现活性蛋白或破坏其二级/三级结构时，就会出现问题。由于这些原因，通常会合理选择突变以试图保留结构（例如，半胱氨酸变为丝氨酸，谷氨酸变为谷氨酰胺）。另一个潜在的解决方案是将假设的结合位点残基从人类蛋白质中发现的残基转换为其他物种中的残基。武田 (Takeda)研究 CENP-E 抑制剂的研究人员演示了该解决方案。在分析化合物以测试其结合位点假设之前，他们的突变蛋白保持了与野生型相似的催化活性。 武田CENP-E抑制剂 8. 氢/氘交换 (HDX) 和化学/水解稳定性分析 氢/氘交换(HDX) 是一种生化方法，可测量暴露于氘化环境后蛋白质靶标骨架酰胺中氢 ( 1 H) 与氘 ( 2 H) 的交换。理论上，与靶标蛋白质结合的配体应该影响结合位点的这种交换，从而产生可观察到的质量差异变化。有几种基于类似原理的相关方法，即特异性结合的配体应增加靶标的稳定性或在暴露于某些试剂时保护感兴趣的结合位点。这些其他方法采用变性剂和活性物质（例如， SPROX 、羟基自由基印迹、卡宾印迹）或蛋白水解酶（例如， DARTS 、 LiP-MS ）。 主要优点：可以提供结合位点以外的构象变化的附加信息；可以使用水溶液；可以使用来自细胞和细胞裂解物的内源蛋白 主要缺点：不能揭示配体结合模式；有时不太适合阐明结合位点；对于特定的蛋白质类型可能具有挑战性（例如，高度糖基化） HDX 的基础是，当暴露于氘化环境（即 D2O）时，目标蛋白的骨架酰胺可以将氢交换为氘，并且可以停止此交换过程以允许 MS 检测和肽图谱 (NMR)，以显示发生氘化的地方。结合配体周围的区域通常显示出酰胺主链质子交换速率相对于较远区域的差异。尽管该方法不受蛋白质大小的限制并且可以使用天然状态蛋白质进行，但它只能提供结合位点的氨基酸水平分辨率。 虽然 HDX 最常用于大分子的表位作图，但越来越多的例子将其应用于小分子结合位点识别。在HDX-MS 2022会议上，默克科学家描述了他们使用 HDX 来揭示临床研究的 NLRP3 抑制剂 MCC950 在蛋白质 Walker A 基序中的结合位点。这一发现与基于药物亲和力响应靶稳定性 (DARTS)测定的文献报告提出的 Walker B 基序中的结合位点不一致。默克通过X 射线晶体学（PDB：7ALV ）和冷冻电镜结构（PDB：7PZC ）得到证实(10.1038/s41589-019-0277-7)。 NLRP3 中 MCC950 结合位点首先通过 HDX 确定，随后通过 X 射线晶体学和冷冻电镜证实。 研究人员使用HDX 定位 AMPK 上的激活剂结合位点。后来的 X 射线晶体学研究证实了这一发现，并显示配体与一个新的变构位点结合(10.1016/j.str.2013.08.023)。这一系列方法的一个主要挑战是它们无法区分化合物结合的直接影响与长程变构变化引起的扰动。因此，受保护的蛋白质区域不能自动假定为结合位点。 9. 天然质谱分析 天然质谱是一种生物物理方法，可以通过在气相中保留非共价蛋白质-配体复合物来揭示蛋白质上的配体结合位点，同时使蛋白质主链容易断裂。结合位点通过产物离子的分析揭示（例如，保留结合配体的肽片段）。 主要优点：可使用水溶液；可以使用细胞裂解物中的内源蛋白；样品消耗量低（即每次实验使用皮摩尔蛋白质）；允许计算蛋白质-配体亲和力和化学计量 主要缺点：已知配体在气相时会迁移通过蛋白质；通常观察到非特异性配体-蛋白质相互作用；变性条件和裂解效率之间的平衡；不能揭示配体结合模式；提供了不完整结合位点 通过使用“更温和”的电离技术（通常是 ESI），可以通过天然质谱法检测配体结合位点，与典型的质谱实验相比，该技术包括更温和的电压、温度和 pH 值的组合。温和的条件允许感兴趣的蛋白质以或多或少的天然构象生存，即使在气相中也是如此——尽管情况是否属实存在争议。由于真空中疏水相互作用的减弱和静电相互作用的加强，预计蛋白质的一些变性和配体结合的变化会在气相中发生。 研究报告称，使用 ESI-MS 和 ECD 将 α-突触核蛋白上精胺的结合位点缩小到 C 末端区域。他们提出的结合区域与同一系统的核磁共振研究确定的结合区域一致(10.1021/ja063197p)。 使用该技术确定奥沙利铂在泛素上的结合位点残基。选择泛素是因为它可以作为模型蛋白质，并且该方法在检测可能的结合位点方面的成功可能有助于金属药物-蛋白质复合物的未来研究。作者指出，天然 MS 是一个合适的选择，因为酶消化可能会破坏所研究的金属药物-蛋白质相互作用(10.1007/s00216-011-5523-0)。 天然质谱分析可以定位一线癌症化疗药物奥沙利铂在泛素上的结合位点。 10. 计算建模方法 各种计算方法使用根据已知结合位点特征进行训练的软件程序来预测新配体的结合位点。 主要优点：方便；快速见效；进入门槛低；成本相对较低 主要缺点：提供了必须通过实验验证的预测；可能不太适合某些靶标类别；高误报率 该技术的门槛较低，可以快速检测所提供的感兴趣靶标模型上的预测结合位点。计算方法的一个好处是结果中可以包括结合位点配体性的评估（即所有预测位点之间的排名或分数），甚至配体药效团特征的视觉映射。在工业药物发现项目中，通常使用这些结合位点预测来指导 SAR 研究或虚拟屏幕。 这种方法的一个例证来自武田 (Takeda) 的 CENP-E 抑制剂的早期示例。与变构位点结合的新型抑制剂的工作模型后来通过定点诱变研究得到证实。 声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！ 长按关注本公众号  粉丝群/投稿/授权/广告等 请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓

前言 关于Pan-RAS及其专利，此前写过太多的文章了。现有上临床的分子大致可分为两大类，一类为以RMC-6236为代表的Pan-RAS分子胶，其能够同时抑制KRAS, HRAS及NRAS；另一类则为Pan-KRAS变构抑制剂，其相对于HRAS及NRAS，对KRAS有选择性。此前重点关注了Pan-RAS分子胶的专利撞车【专利大撞车：药明与Revolution到底谁cover了谁的专利？Erasca危矣？】 ，那么Pan-KRAS赛道是否也同样有专利撞车？ 如今Pan-KRAS的专利已经多到数以百计，若要整体分析的话定是一个非常庞大的工程，本文重点关注了已上临床的pan-KRAS之间，特别是国内Biotech与MNC之间，是否有专利问题。 检索结果显示，Pan-KRAS赛道已有管线上临床的玩家除了BI、Pfizer等MNC外，也有诸多国内Biotech的身影，如加科思、璎黎、百济神州。 临床阶段的Pan-KRAS抑制剂 分析各家专利，果如所料，Pfizer开发的PF-07934040极有可能撞车这家Biotech的专利，熟悉的剧情，不同的味道，以下慢慢道来。 Pfizer的PF-07934040专利分析 12月5日，中国国家药监局药品审评中心（CDE）官网公示，Pfizer的1类新药PF-07934040片临床试验申请获得受理。公开资料显示，这是Pfizer在研的一款口服Pan-KRAS抑制剂，正在开展国际多中心的1期临床。本次是该产品首次在中国申报IND。 截图来源：CDE官网 根据ClinicalTrials官网，辉瑞正在开展一项1期临床研究，评估PF-07934040作为单一药物或与其他靶向药物联合用于KRAS基因突变晚期实体肿瘤患者的最佳剂量、疗效和安全性，研究拟纳入非小细胞肺癌、结直肠癌、胰腺导管腺癌等患者，拟在国际范围内入组330名受试者，其首次提交注册时间为2024-05-29。 截止目前，PF-07934040的结构尚未公开，但Pfizer已公开4篇相关PCT专利： PF-07934040到底在哪篇专利里？结构如何？以下逐一分析： 1. WO2024009191A1 Pfizer的首篇专利，共34个实施例，代表性化合物结构如下： 专利中公开了SPR 结合活性测试结果（Table 3）、CTG抑制Panc08.13 (KRAS G12D细胞系)、H358(KRAS G12C细胞系)及SW620(KRAS G12V细胞系)的实验结果（Table 4），以及Ex.33的前药Ex.34相对于原药在雌性NGS小鼠中的PK结果（Table 1-A）。 由上述结果可知，虽然Ex.23及32具有最优的SPR结合活性，但是其抑制KRAS G12V SW620细胞系的活性显著低于Ex.33。Ex.33同样表现出最低的抑制KRAS G12D Panc08.13细胞系的活性。 从PK实验可以看出，Ex.33的暴露量较低，但其前药Ex.34显著提高了系统暴露量。因此，Ex.33及Ex.34很可能便是该篇专利中的重点化合物。 但令人感到诧异的是：Pfizer在其请求保护的权利要求范围内，居然仅请求保护了前药Ex.34，在具体化合物中也不见Ex.33的踪影，这种操作略显诡异。 为此，对Ex.33（CAS:2920695-77-6）进行了检索，居然有7篇专利中公开了同一个化合物: 不得不说Pan-KRAS确实是专利撞车的重灾区。撞车常见，7车连环撞显然不多见。 当然这些不是本文的重点，加科思专利是否cover另外四家的专利，则是另一个故事了。 还是回到分析Pfizer的专利上来。 分析这7篇专利的马库什式也能够发现，这些专利均具有几乎一致的通式。这其实并不奇怪，Pan-KRAS的设计与成药性优化几乎延续了KRAS G12D抑制剂的思路，而这类结构骨架便是源自Astrazeneca在2018年的G12C专利WO2018206539A1，以及Genenntech在2022年公开的KRAS G12D专利WO2022173678A1（公开日2022-08-18）。Pfizer专利中Ex.33的萘环（暂且称之为R1）与蝴蝶醇（R2）两个官能团显然是延续了MRTX1133的结构，那Ex.33的成药性差其实也显而易见了。众所周知的便是MRTX1133的成药性数据惨不忍睹。而后续的口服KRAS G12D的优化思路大多聚焦于R1、R2这两个基团，且大差不差，Genentech算是首个高分答案。不得不说，在如此多参考经验的背景下，Pfizer的首个Pan-KRAS抑制剂专利交出这样一份答卷，不得不让人怀疑其研发能力。 话说回来，分析Pfizer的优先权文件便能够发现，Pfizer该专利的2022.10.11的优先权中也仅存在Ex.33。而Ex.34及其与Ex.33的成药性对比数据直至其2023.5.18的优先权文本中才出现。从时间线上便能很明显的知晓这一答案：正是在加科思专利WO2023046135A1于2023.03.30公开后，Pfizer的专利预警人员及时发现了这一信息，抢救性地针对Ex.33设计了其前药化合物Ex.34作为专利的创新点。 但若是说Ex.34便是PF-07934040多少有些牵强，毕竟一个前药专利很难支撑其产品。因此Pfizer后续的三篇专利也是在Ex.33的基础上进行改造，以期得到成药性优化且无专利风险的化合物。 2. WO2024209339A1 专利中共62个实施例，主要改造方向是在Ex.33(191’)的基础上，萘环替换成了（脂肪环取代）吲唑，以及蝴蝶醇上引入取代烯基。 需要注意的是，本专利最初的优先权（2023-04-05；2023-06-12）也是在WO2024009191A1基础上做的补救（萘环替换为吲唑，Ex.34/35对应公开文本中的Ex.1/2），但活性不理想。新的优先权（2023-09-22）选择推翻重来，引入了烯基取代蝴蝶醇作为创新点（权利要求提到脂肪环吲唑，但缺乏实施例），共27个实施例。优先权（2023-11-14）正式引入脂肪环吲唑创新点，补充了实施例28-33。后续两个优先权（2024-02-06；2024-03-21）进一步优化这两个创新点，将实施例分别补充至46与62。 专利中高活性代表性化合物结构如下: Pfizer在专利中展现了这类化合物对KRAS GDP与GTP状态均具有高亲和力（且对KRAS GTP亲和力更高），表明这类化合物为KRAS ON/OFF抑制剂。此外还展现了这类化合物多多组KRAS突变细胞系的优异抗增殖活性。但缺乏其成药性相关的任何表述。 当然专利权利要求中也给出了本专利的一些优选实施例： 3. WO2024213979A1 本专利仅有22个化合物，专利主要创新点在主要改造方向是在Ex.33(191’)的基础上，萘环替换成了苯并环己烷，以及蝴蝶醇上引入取代烯基。 长话短说，与上一篇专利类似，本专利四篇优先权（2023-04-10；2023-05-26；2023-10-05；2024-02-15）分别将实施例补充至Ex.1、Ex.3、Ex.21、Ex.22。 专利中代表性化合物结构如下。专利中活性评价维度与第二篇一致，仅有对KRAS GDP/GTP亲和力与抗增殖评价，无成药性评价。 专利中也给出了一些优选实施例如Ex.1-3、Ex.22。 4. WO2024218686A1 本专利特殊之处在于其37个实施例中，前33个实施例其实与首篇专利WO2024009191A1完全一致，新增了34-37这四个化合物。与其他专利多个优先权不同的是，从本专利仅有的2023.04.20的优先权文件与申请文本几乎完全一致（仅权利要求有一点差异）这一点可以发现，本专利其实也是基于发现加科思WO2023046135A1专利的基础上，非常快速做出的补救措施。 专利中也给出了优选实施例，最优选便是Ex.34，活性优于Ex.33。 5. PF-07934040到底长啥样 PF-07934040的IND时间为2024.5.29。此前讨论过，小分子PCC to IND的时间大概是9-12个月。按最快时间9个月计算，Pfizer的PCC确定时间大致在2023.8.29之前（当然考虑到MNC的CMC效率，这个时间还可以延后）。结合四篇专利优先权（如此内卷的情况下，PCC优先权自然是越早递交越安全），结合活性数据便能大致推测出PCC可能即是下列化合物之一：Ex.34(191’)；Ex.2(339’)；Ex.29(339’); Ex.39(339’); Ex.1(979’)；Ex.34(686’)： 通过优先权文件可知，4篇专利均存在与Ex.33(191’)的对比数据，故这些活性数据可以直接对比。通过对比活性数据优劣，答案便很明显了：Ex.34(686’)，很可能便是PF-07934040，但并不能完全排除是其他化合物的可能性。 Pfizer专利的授权前景存疑 Pfizer的Ex.34(191’)前药或许依赖其显著提高系统暴露量的效果能获得专利授权，但比较奇怪的一点是，Pfizer其他的可能的PF-07934040在专利申请文件仅仅提供了抑制细胞的活性数据，而这些数据与Ex.33(191’)几乎相当，在WO2023046135A1已经启示了修饰方向的前提下，这些相当的活性能否被认为是预料不到的技术效果或许要打上一个问号，这些数据使得Pfizer的专利授权产生非常大的不确定性，或许需要看其与审查员的博弈了。 那么，在Pfizer的这一系列的补救措施下，其专利FTO是否真的安全了呢？ 叹息之墙，PF-07934040的FTO风险：或被加科思全覆盖 正如之前文章中分析的那样，Pan-KRAS赛道的最初一批玩家并不存在fastfollow，而是因为思维撞车，最终殊途同归的走到了同一条路，均属于原研首创。而加科思则是最初那批玩家中的佼佼者。 截止目前，加科思一共公开了10篇相关专利。要分析其临床管线JAB-23E73。那肯定得另起一篇。这里重点讲一下最相关的专利WO2023046135A1。 如上文中提到的，这类四元并环Pan-KRAS抑制剂骨架首次出现便是在WO2023046135A1。该案的权利要求极其丰富，几乎囊括了此前KRAS G12C/G12D中的经典改造案例（对取代萘环与蝴蝶醇的改造与替换）： 首先是R4，囊括了取代苯环、取代吡啶、取代萘环、取代吲唑等KRAS G12X抑制剂常见的取代基。同时加科思对这块的范围定义极广：包含BC并环，以及DE联环。其中：B环选自6元芳环、5-6元杂芳环；C环选自3-10元脂肪环、3-10元脂肪杂环。从这里也可以看到，Pfizer专利中无论是取代吲唑、环己烷并吲唑，还是苯并环己烷，其实均在这一保护范围内。 再看看蝴蝶醇部分，不仅列举了一些常见的烯基/卤代烯基取代的蝴蝶醇，其R12取代基也采用了一环套一环的形式。 上述推测的PF-07934040所有可能的结构：Ex.34(191’)；Ex.2(339’)；Ex.29(339’); Ex.39(339’); Ex.1(979’)；Ex.34(686’) 全部在加科思专利范围内。 甚至在加科思135’专利的p22，Pfizer的Ex.34(686’)赫然在列。 另外还有一个有意思的地方，那就是WO2023046135A1甚至Claim关键中间体： 上述推测的PF-07934040所有可能的结构：Ex.34(191’)；Ex.2(339’)；Ex.29(339’); Ex.39(339’); Ex.1(979’)；Ex.34(686’)（无论是在芳香区还是在溶剂区的修饰）几乎都难逃不利用该关键中间体。 这个时候，估计Pfizer内心肯定很想说一句： 至于加科思能否拿到大的授权范围，就需要看双方的博弈了，特别是作为全球最大的美国医药市场，加科思能否在美国拿到大的授权范围尤为重要。依据笔者的认识，美国的原研专利的审查较为宽松，会授予更大的保护范围。毕竟烯基蝴蝶醇的砌块化学早已成熟，基团替换没有合成难度。同理，取代吲唑也是如此。加科思拿到这部分的授权，问题应该不大。 更别提美国专利审查中还会出现二次概括狙击竞争对手的情况，艾伯维的BTK便是一个经典案例【研发随笔|百济神州这把悬了？艾伯维来阴的。】。相信加科思的IPR自然不会放过这个机会，重拳出击，狙击Pfizer的专利。 总结：大卫战胜了歌利亚？ Pan-KRAS赛道，这回可能是国内Biotech打败了MNC？当然，要说大卫打败了歌利亚还为时尚早，毕竟事情还未盖棺定论，尚需等待加科思如何出招，Pfizer怎样去应对。但正如之前的一点碎碎念【研发随笔|由百济神州引起的事关中国医药知识产权的碎碎念】： 也许，本案便会是这一标志性的一刻。后续会如何发展，还请大家拭目以待吧。 声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！ 长按关注本公众号  粉丝群/投稿/授权/广告等 请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓

狂犬病作为一种致死率几乎100%的疾病，预防性狂犬疫苗的接种是一种有效的方式，可以在病毒入侵之前建立起免疫防线。 2024年10月南开大学和山西大学等单位在《Nature Communications》上发表题为“Self-assembling nanoparticle engineered from the ferritinophagy complex as a rabies virus vaccine candidate”的文章，报道通过非共价方式偶联狂犬病病毒糖蛋白III (GDIII) 的Fagy标签，构建了一个自组装的狂犬病病毒疫苗候选者。Biacore作为分子互作检测技术的“金标准”，在该疫苗研究的多个环节提供了坚实的数据，下面我们就详细来看看Biacore在不同阶段的具体表现。 肽和铁蛋白之间的结合亲和力 人类铁蛋白重链 (Ferritin Heavy Chain) 的基因编码蛋白FTH1被用作纳米颗粒疫苗的载体，病毒抗原通过非共价键与FTH1融合，研究中首先评估了GDIII与Peptide WT，Peptide 10和Fagy标签融合后，与FTH1的亲和力。结果显示，与GDIII-Peptide WT和FTH1之间的结合亲和力 (1.913E-07M) 相比，GDIII-Fagy标签和FTH1之间的结合亲和力 (2.900E-08M) 增加了约七倍（图1）。 图1：SPR检测GDIII-Peptide融合蛋白与铁蛋白FTH1的亲和力 评估不同狂犬病亚单位疫苗 的抗原效力 抗原中和表位的有效呈现对疫苗的疗效至关重要。研究人员表达并纯化了三种GDIII特异性中和抗体：Docaravimab和Rafivirumab（目前正在进行临床研究），以及RVC20（已证明具有中和活性）。并且制备了三种可供选择的狂犬病亚单位疫苗，进行平行的免疫原性评估。其中包括GDIII蛋白的单体形式 (GDIII) 、GDIII与人类抗体Fc结构域连接的融合蛋白 (GDIII-Fc) 以及全长G单体蛋白 (G) 。 Biacore测定了这三种抗体分别与不同亚单位疫苗的亲和力和动力学，结果证明，GDIII-Ferritin纳米粒子疫苗有效地突出了抗原中和表位，预期的结合曲线表明抗原表位被屏蔽的风险极小（图2）。 图2：SPR检测三种GDIII表位特异性中和抗体与不同亚单位疫苗的亲和力 该文章将病毒抗原与多肽标签融合，并利用Fagy标记将抗原固定到FTH1纳米颗粒表面，可以提升抗原呈递效率、增强抗原的免疫原性、增加纳米颗粒疫苗的稳定性、提高制备和储存的便利性。这些优点使得这种方法成为开发新型纳米颗粒疫苗的有效策略。 总 结 Biacore在整个研究工作中提供了两方面的核心数据，也展示了技术上的优势：  1  SPR的高分辨率能够准确呈现GDIII三种不同的多肽融合蛋白与FTH1之间亲和力的差异，发现Fagy标签是一种非常有效的偶联方法，可以显著提高抗原与铁蛋白的结合亲和力，从而增强纳米疫苗的免疫原性。  2  在抗体与不同亚单位疫苗的动力学测试中，亲和力达到了10-11次方，这样高的亲和力对基线的稳定性以及仪器的灵敏度都提出了更高的要求，Biacore的亲和力检测范围广，即使是pM级别的亲和力也能轻松检测。通过这一数据发现GDIII-Ferritin纳米疫苗与中和抗体的结合亲和力更高，表明GDIII-Ferritin纳米疫苗能够有效地展示GDIII的中和表位，并产生更强的中和抗体反应。 Biacore作为唯一被中国、美国、日本三国药典收录的分子互作检测技术，以其卓越的性能的和精准的数据质量，在疫苗抗原性检测，结构设计开发、免疫原性鉴定，佐剂选择与免疫评价等领域发挥着越来越重要的作用。相信未来Biacore一定会在疫苗研发的各个领域崭露头角，助力疫苗研发，保证疫苗的安全性和有效性。 扫码即刻下载资料 《Biacore 1系列，非标记相互作用分析系统》 Biacore，for a better life 参考文献 Fu D, Wang W, Zhang Y, Zhang F, Yang P, Yang C, Tian Y, Yao R, Jian J, Sun Z, Zhang N, Ni Z, Rao Z, Zhao L, Guo Y. Self-assembling nanoparticle engineered from the ferritinophagy complex as a rabies virus vaccine candidate. Nat Commun. 2024 Oct 4;15(1):8601. doi: 10.1038/s41467-024-52908-z. PMID: 39366932; PMCID: PMC11452399.