XIAP

摘要:凋亡是一种程序化和受控的细胞死亡形式，它占生物加工过程中细胞死亡的大多数。细胞死亡影响培养的寿命和产品质量；它是由生物反应器内细胞经历的多种压力引发的。了解导致凋亡的因素以及开发能够保护细胞的策略对于稳健的生物加工开发至关重要。本综述旨在：a) 从生物加工的角度探讨凋亡；b) 描述重要的凋亡机制，并将它们与生物反应器中遇到的最相关的压力联系起来；c) 讨论设计操作条件以避免细胞死亡；d) 聚焦于工业相关的细胞系；以及 e) 提出包括细胞工程和基于模型的生物加工优化在内的抗凋亡策略。此外，还强调了凋亡在从克隆筛选到生产规模的质量设计生物加工开发中的重要性。 1.引言 在快速增长和竞争激烈的生物制剂市场中，生物加工优化至关重要。一个优化的生物加工将涉及高产细胞培养和最小的凋亡压力。培养活性对于确定培养寿命至关重要，通常由活性截止点决定，超过该点产品质量将受到影响。存在三种主要的细胞死亡途径：坏死、自噬和凋亡。据报道，凋亡是所有工业相关细胞系中死亡的主要原因，在中华仓鼠卵巢（CHO）细胞中占细胞死亡的80%和TB/C3杂交瘤细胞培养中的90%。阐明凋亡及其构成机制对于提高培养寿命和产品滴度，同时保持高产品质量至关重要。本综述着重于与凋亡相关的生物加工开发挑战，通过：a) 介绍凋亡细胞死亡的主要机制；b) 检查各种生物加工变量和操作条件对凋亡压力的影响；c) 确定影响生物加工的压力；以及d) 讨论两种方法——细胞系工程和凋亡建模——作为传统基于实验的方法的替代，用于最佳操作设计（图1）。 图1. 凋亡的生物过程策略：a) 传统方法，基于实验优化培养条件，b) 细胞系工程方法，旨在产生抗凋亡细胞系，以及 c) 虚拟方法，将生物学机制整合到数学模型中，以实现基于模型的优化。 2.细胞死亡的生物学 2.1.凋亡的生物学 在凋亡中，内部和/或外部刺激引发一系列高度控制的反应，最终导致细胞死亡。参与凋亡的两组最重要的蛋白质，半胱天冬酶和Bcl-2（B细胞淋巴瘤2）家族蛋白，参与所有凋亡细胞死亡途径。半胱天冬酶是依赖半胱氨酸的内切蛋白酶，催化肽键的断裂。大多数半胱天冬酶以单体形式产生，活性很小或没有活性，通常称为前半胱天冬酶或酶原。激活后，它们同源二聚体形成生物活性蛋白。在小鼠或人类细胞中已报告有14种半胱天冬酶（编号1至14），对生物加工很重要。此外，还在小鼠或人类以外的哺乳动物细胞基因组中鉴定出四种其他半胱天冬酶（编号15至18），其中半胱天冬酶16是一个假基因（不翻译）。大多数半胱天冬酶可以根据其作用分为三组：a) 起始半胱天冬酶（半胱天冬酶8和9）；b) 执行者半胱天冬酶（半胱天冬酶3、6和7）；c) 参与炎症的半胱天冬酶（半胱天冬酶1、4、5、11和12L）。半胱天冬酶-2没有被分类，因为它与起始和执行者半胱天冬酶共享结构元素，是半胱天冬酶3和8的已知底物，也可以通过激活细胞色素C释放来触发凋亡体的形成。半胱天冬酶-2也可以被p53的下游靶标激活。半胱天冬酶-10的作用尚未完全阐明，它由半胱天冬酶-6激活，以及半胱天冬酶12S和14也仍未分类。半胱天冬酶级联反应一旦被触发，就会自我催化，如图2所示。 图2. 凋亡途径概述。已确定的五条主要途径包括：(1) 由外部刺激激活的外源性途径；(2) 由Bax通道促进的MOMP激活的内源性途径（Taylor等人，2008年）；(3) DNA损伤诱导的依赖caspase-2的途径；(4) 由Granzyme B诱导的途径，其中该分子作为caspase-3的诱导剂；以及 (5)由Granzyme A诱导的途径，其中不涉及任何caspases - Granzyme A诱导一种DNase，该酶诱导DNA片段化和细胞死亡。 Bcl-2家族蛋白（图2）在凋亡调节中起着重要作用，具有促进和抑制凋亡的活性，可以分为三个亚组。抗凋亡组包括Bcl-2、Bcl-xL（B细胞淋巴瘤超大）、Bcl-W（Bcl-2样蛋白2）、Mcl-1（诱导髓样白血病细胞分化蛋白）、Bcl2A1（Bcl-2相关蛋白A1）和Bcl-B（与Boo蛋白氨基酸序列相似的Bcl-2样蛋白）。这些蛋白有四个Bcl-2同源结构域（BH1、BH2、BH3和BH4）。除了Bcl2A1，所有其他成员都有跨膜结构域，通常与细胞、核或线粒体膜相关联。第二组由Bax（Bcl-2相关蛋白X）、Bak（Bcl-2同源拮抗剂杀手）和Bok（Bcl-2相关卵巢杀手）组成，缺乏BH4结构域。最后，第三组只有BH3结构域，由Bik（Bcl-2相互作用杀手）、Hrk（Harakiri）、Bim（Bcl-2样蛋白11）、Bad（Bcl-2相关死亡促进因子）、Bid（BH3相互作用域死亡激动剂）、PUMA（p53上调凋亡调节因子）、NOXA（Phorbol-12-肉豆蔻酸-13-乙酸酯诱导蛋白1）和Bmf（Bcl-2修饰因子）组成。BH4缺乏和仅有BH3结构域的蛋白在过表达时是促凋亡的。 已确定五种主要的凋亡途径，其中提出了多种途径。外源途径（通常称为类型I）由细胞外部刺激触发。死亡配体（如FasL或肿瘤坏死因子α，TNFα）与细胞膜上的受体结合，触发半胱天冬酶-8的激活，从而启动凋亡（图2）。内源途径（通常称为类型II或线粒体途径）由内部刺激（代谢或缺氧压力）激活，也可以由内质网应激触发。凋亡类型II触发的内部刺激促进半胱天冬酶和Bcl-2家族的促凋亡成员的激活（图2），通过Bax通道导致线粒体外膜通透性（MOMP）增加。Bax激活SMAC（线粒体来源的第二种半胱天冬酶激活剂），抑制XIAP（X连锁凋亡抑制蛋白）的抗凋亡活性。反过来，MOMP导致细胞色素C的释放，这诱导了凋亡体的形成，由七个半胱天冬酶-9单元组成的复合体。半胱天冬酶-9将触发一个执行者半胱天冬酶（3或7），确保过程的连续性。Bcl-2家族的抗凋亡成员（例如Bcl-2、Bcl-xL、Mcl-1）能够通过抑制其促凋亡对应物的活性来抑制凋亡。在这个过程中，外源途径的激活也可以通过半胱天冬酶-8激活Bid发生。相反，外源途径作为内源途径的下游效应可能在p53激活CD95时发生。第三种途径依赖于半胱天冬酶-2的存在，它可以在持续DNA损伤时被肿瘤抑制基因p53激活。凋亡也可以通过Granzyme B直接激活半胱天冬酶-3触发。最后，由Granzyme A促进的DNA片段化也可以导致凋亡。对CHO细胞的蛋白质组学研究表明，内源途径是培养中最重要的凋亡驱动因素。它可以直接与生物反应器的操作条件联系起来，使其在生物加工中很重要，因为它可以被营养物质缺乏、过量蛋白质生产、温度或pH变化和高渗透压等触发。 凋亡的调节是通过蛋白质-蛋白质相互作用实现的，可能涉及第三个蛋白质作为介导。没有介导的蛋白质-蛋白质相互作用的例子包括Bax蛋白的BH3结构域产生四聚体，在线粒体膜上形成通道，或Bcl-2抑制Bax通道形成。相比之下，Bcl-2或Bcl-xL与半胱天冬酶-8之间的相互作用需要BAP31（Bcl-2相关蛋白31）的介导。内源途径导致由线粒体膜上的Bax通道或钙离子引起的线粒体外膜通透性（MOMP）。MOMP反过来会导致许多促凋亡分子的释放，如细胞色素C。如图2所示，半胱天冬酶-3在凋亡中起着重要作用，可以由起始半胱天冬酶8和9或Granzyme-B激活。一旦激活，它会反激活上游半胱天冬酶以确保过程的连续性。半胱天冬酶-3也是CAD（半胱天冬酶激活的DNase）的激活剂，它在增殖细胞中与其抑制剂形成复合体。当半胱天冬酶-3过表达时，该复合体会被切割，CAD降解染色体DNA，当聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）被半胱天冬酶-3（或7）抑制时也会发生这种情况。在晚期凋亡期间，半胱天冬酶-3作为细胞骨架重组和解聚诱导剂，导致凋亡小体的形成。尽管半胱天冬酶-3被认为是凋亡中必不可少的，但已经表明不表达半胱天冬酶-3的人类MCF-7乳腺癌细胞仍然可以经历凋亡。实际上，已经鉴定出一种由Granzyme A介导的半胱天冬酶独立途径，其中Granzyme A诱导DNA片段化导致细胞死亡。 在凋亡过程中，细胞的几种结构特征会发生变化：许多细胞骨架成分被降解导致膜泡形成；核层被破坏导致核膜塌陷、DNA片段化和染色质浓缩；形成含有完整细胞器的凋亡小体，随后被巨噬细胞降解；线粒体膨胀和伸长。尽管这些特征中的一些可以通过光学显微镜观察到，但这种技术不如流式细胞仪准确，流式细胞仪通常更受青睐用于凋亡监测。流式细胞仪已被用于分析DNA、RNA、线粒体膜电位和细胞膜完整性，两种染料的组合，荧光素-Annexin V和7-氨基放线菌素D（7AAD），已用于区分活细胞、早期凋亡、晚期凋亡和死亡细胞。在某些条件下，凋亡可以逆转，如在多种细胞系中去除凋亡刺激后报道的那样。还有人提出DNA损伤诱导p53（一种肿瘤抑制基因），反过来同时诱导DNA修复、细胞周期停滞和凋亡停滞。此外，即使在由促凋亡蛋白诱导DNA损伤后，晚期凋亡也可能是可逆的。Anastasis（希腊语意为“复活”）被提议为细胞“复活”过程的名称。建议的逆转机制需要一组几种蛋白质，逆转凋亡后观察到一些遗传变化，包括染色体畸变和数量。 2.2.其他形式的细胞死亡 尽管凋亡是哺乳动物细胞培养中主要的细胞死亡形式，其他机制，特别是在细胞培养后期，也可能有所贡献。这些包括自噬和坏死性凋亡，下面简要描述（图3）。自噬是一种将细胞质物质运送到溶酶体进行降解的细胞死亡形式。尽管自噬被认为是一种细胞存活机制，但最近的研究表明自噬可以促进细胞死亡。在自噬过程中，隔离膜形成，通常位于线粒体/内质网接触区域。Beclin-1和液泡蛋白分选34（VPS34）促进隔离膜的成核；几个细胞器可能被招募到这种生长膜的内侧，包括线粒体、高尔基体和内质网。蛋白质轻链3（LC3）通过一组自噬相关蛋白（ATG）附着在隔离膜上。LC3将促进识别自噬体，然后与溶酶体融合以破坏细胞成分。这种细胞死亡形式最初由Hwang和Lee在葡萄糖和谷氨酰胺缺乏时在CHO细胞培养中观察到。自噬可能通过ATG5激活半胱天冬酶-8触发外源途径的凋亡。有趣的是，抗凋亡蛋白Bcl-2也是Beclin-1的抑制剂。虽然这种相互作用阻止了自噬，但它并不抑制Bcl-2的抗凋亡作用。BH3-only蛋白抑制Bcl-2/Beclin-1相互作用，从而促进自噬。一个例外是BIM，它将Beclin-1错误定位到动力蛋白轻链1（DLC1），阻止自噬。自噬也可能在凋亡的终末阶段通过Beclin-1切割被半胱天冬酶-3抑制，如图3A所述。另一种越来越受关注的细胞死亡形式是坏死性凋亡。当死亡受体被配体激活时，受体相互作用的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1（RIPK1）被激活。这种蛋白反过来激活RIPK3，触发坏死性凋亡。由这些（RIPK1和RIPK3）和其他蛋白质形成的复合体称为坏死体，已知它能抑制糖原分解和谷氨酰胺分解，最终减少能量代谢。细胞内ATP总体减少导致坏死性凋亡死亡。这条途径不仅与半胱天冬酶无关，而且还受到半胱天冬酶的抑制；半胱天冬酶-8抑制RIPK1和RIPK3的相互作用，从而防止坏死性凋亡，如图3B所述。 图3. 其他细胞死亡机制。细胞培养中发生的其他形式的细胞死亡包括自噬（A）和坏死（B）。 总之，细胞死亡，特别是凋亡，在生物加工中具有显著影响，影响细胞活性、生产力和产品质量。上游工艺开发应考虑凋亡监测和尽可能避免凋亡的策略开发，而不是试图逆转它。这需要深入了解跨尺度的相关促凋亡压力以及如何最小化这些压力。这是下一节的范围。 3.生物加工开发过程中的凋亡压力 3.1.不同尺度上的凋亡 上游工艺开发的第一步是选择一个合适的克隆，通常基于生长和生产力。虽然克隆选择发生在微升级别，但在生物加工开发过程中，规模将逐渐增加到立方米级别的生物反应器。在这些步骤中，凋亡压力的性质不同，它们对生长和生产力的影响也不同。为了实现最佳操作条件，重要的是准确识别相关压力及其原因，理解细胞响应机制，并在生物加工开发的各个阶段消除/逆转凋亡（图4）。在摇瓶或微孔板尺度上，由于不进行搅拌，运输是由于扩散和轨道混合，凋亡压力主要由克隆选择中使用的有毒试剂所主导。两种广泛使用的试剂是无谷氨酰胺培养基用于谷氨酰胺合成酶（GS）基础选择和甲氨蝶呤（MTX），如果使用二氢叶酸（DHFR）系统。MTX也是一种已知的凋亡诱导剂，能刺激PUMA。当生长速率和生产力成为克隆选择的关键标准时，确保pH值、温度、营养物质耗竭和渗透压不抑制生长或触发凋亡变得至关重要。即使在小规模上，扩散足以确保均匀环境，由于计划维护/取样任务在孵化器外进行，除非采用自动化系统，否则可能会发生压力温度波动。随着规模的增加，扩散不再能够维持有效的物质运输，宏观环境变得越来越不均匀，需要混合系统，这是剪切应力的来源。与规模放大相关的另一个问题是提供足够的氧气。在大型生物反应器中，这通常是通过从底部通气来实现的，这可能会产生额外的剪切应力。相比之下，大规模的温度控制不是一个主要问题。由于生物加工开发包括不同的操作模式，必须注意考虑与规模相关的效应。为了最小化放大问题，从克隆选择阶段就使用微型搅拌罐系统。 图4. 不同尺度的凋亡应激。上游生物过程开发识别重要的流程和生物反应器参数以及各个生物过程尺度上的相关凋亡应激和途径。 3.2.生物反应器中的凋亡压力 本节讨论与生物反应器相关的压力，如缺氧、剪切、营养物质缺乏、温度、pH值、渗透压和蛋白质错误折叠，将与每种特定压力相关的细胞生物学联系到产品质量、生物加工变量和操作条件。重要的是要提到，不同压力的影响可能因使用的培养系统而异。灌注系统，例如，允许营养物质的供应和副产品的去除，减少代谢压力。然而，由于实现了更高的细胞密度，培养粘度的相应增加导致pH值、渗透压和剪切应力的增加，这些在分批培养中观察到的。 3.2.1.缺氧压力 氧气在哺乳动物细胞代谢中至关重要，是需氧能量代谢中的最终电子受体。在缺乏氧气的情况下，采用厌氧代谢进行能量生产，导致有毒代谢产物的产生，最终导致细胞周期停滞和凋亡。因此，能量消耗减少，分泌生存因子，如低氧诱导因子（HIFs），在调节细胞对缺氧的反应中起着关键作用。HIFs是具有α（O2-labile）和β（稳定）亚基的异二聚体蛋白。在正常氧水平下，α亚基通过脯氨酰羟化酶（PHDs）在两个保守的脯氨酸残基上羟化，标记HIFα进行蛋白酶体破坏。在缺氧条件下，PHDs活性降低，HIFα不被抑制，诱导缺氧反应基因。事实上，PHDs已被提议作为负责HIF对氧浓度反应的氧气传感器。对缺氧诱导的凋亡的反应可以根据线粒体感知的氧水平重新编程，导致产生活性氧（ROS），降低PHDs。确保氧气不是限制因素在生物反应器设计和放大中至关重要。氧传递系数（kL）和气泡表面积（a）的乘积，通常表示为kLa，用作衡量通气效率的指标。kLa与混合引起的能量耗散率成正比；确保高kLa和低剪切应力环境可能具有挑战性，特别是在哺乳动物细胞培养中实现的越来越高的细胞密度。关于氧气对哺乳动物细胞培养影响的文献综述见表1。 在摇瓶和控制生物反应器中的CHO细胞研究表明，与摇瓶培养不同，生物反应器培养没有经历缺氧，缺氧导致蛋白质表达减少。在50L生物反应器中也获得了类似的结果，其中溶解氧从60%降低到15%的空气饱和度导致寿命减少和蛋白质运输，从而影响生产力和滴度。尽管通过补充金属离子可以维持活力和生产水平，但这种策略对产品质量的影响没有报告。这将特别有趣，因为已经证明金属离子在糖基化中起着重要作用。尽管在CHO细胞生物学中起着重要作用，但缺氧本身不会导致死亡，除非氧分压降低到零或其他因素参与。即使当氧分压降低到2x10-4巴，细胞生长停止，也可能不会观察到细胞死亡。然而，当缺氧与pH值6-6.5结合时，会观察到时间和pH依赖的细胞毒性效应。在这些条件下，由于pH（独立于氧水平）导致的葡萄糖消耗和乳酸产生减少，并且在两种压力结合下ATP水平降低了85%，而单独任一压力对能量产生没有影响。在GS-NS0培养中观察到类似的效应，在缺氧12小时后，细胞周期在G2期（9小时）停止，随后是G1和S期的停止，并且mAb生产停止。报道了降低能量密集型过程（如DNA合成）和激活能量产生和氧气输送过程。这些研究表明，缺氧压力效应的某些方面在细胞系间是保守的。在产品质量方面，血清自由培养的CC9C10杂交瘤细胞中观察到缺氧的负面影响，其中观察到IgG1糖基化的不足。作者推测，糖基化不足可能是由于UDP-Gal核苷糖供体的可用性降低。还观察到增加的抗氧化酶活性，为活性氧提供了证据。总之，缺氧诱导的生长停滞似乎是细胞系独立的，对于低于1%的缺氧水平。需要更多的研究来完全阐明缺氧对产品质量的影响，这也将有助于在工艺开发过程中的质量设计。 3.2.2.剪切应力 剪切应力是由搅拌器和挡板产生的，它们被用来在生物反应器内实现均匀性，或者通过通气产生，这可能会产生剪切应力，直接导致细胞破裂，因为气泡在上升到气液界面时破裂。与通气相关的剪切应力随着气泡直径的减小而增加。使用表面活性剂，如Poloxamer F68，显著降低了细胞与气泡之间的表面张力，减少了剪切对培养活性的影响。然而，重要的是要确保消泡剂不影响细胞生长和产品质量，并且它们可以在下游处理中有效去除。剪切应力影响的其他培养参数包括单克隆抗体（mAb）生产、葡萄糖消耗和乳酸产生，这些参数以不受规模影响的方式受到影响。关于生物反应器内部剪切应力的流体动力学来源的详细概述，包括湍流、边界层和碰撞效应，见其他地方。一般来说，在大多数培养时间内，生物反应器内部经历的剪切应力水平低于诱导凋亡所需的水平。此外，抵抗力和可容忍的压力水平取决于细胞系、几何形状和操作条件。表2总结了剪切应力在工业相关细胞系中的影响。 CHO细胞可以耐受比Sp2/0细胞更高的剪切应力水平，然后才会观察到对生长或生产力的负面影响。随着工艺的放大，混合系统的设计必须确保细胞不会长时间暴露在高水平的压力下，据估计（在搅拌器周围经历的）仅发生在生物反应器体积的约5%或在良好混合反应器中的5%时间内。反应器的不均匀性和长时间暴露在高剪切下会以剂量和时间依赖性的方式影响细胞培养。在HDP1杂交瘤中，暴露于60 Pa（600 dyne/cm2）45分钟后观察到活性下降50%，而在20 Pa（200 dyne/cm2）下观察到类似的减少需要2小时。类似地，CRL-8018杂交瘤在暴露于50 dyne/cm2下10分钟后活性下降50%，在30分钟后下降80%。挡板是剪切应力的另一个来源，因为它们通过增加能量耗散率5倍。尽管从理论上讲，挡板可以被消除，但它们在防止涡流形成方面至关重要，涡流是剪切相关细胞死亡的主要原因。挡板的数量和位置体现了防止涡流和产生剪切应力之间的权衡。在设计混合系统时，应保持低能量耗散率；能量耗散率约为2-3x105 W/m3（>700 rpm）会在CHO细胞中诱导凋亡，而能量耗散率为1x108-1x109 W/m3会导致CHO细胞破裂。这些值在存在气相的情况下可能会改变，这将促进涡流、气泡夹带和气泡破裂，从而增强剪切应力，因此必须降低搅拌速率。事实上，当消除2L生物反应器中的气相空间时，CHO细胞在600 rpm下搅拌没有经历显著损伤，这与Mollet等人的估计一致。有趣的是，这些结果与高速搅拌下搅拌器设计和分布器位置无关，而在搅拌速率较慢时，分布器的位置起着更重要的作用。 已经假设细胞抵抗剪切应力的能力随着特定细胞系的培养历史而变化，而在T型瓶或低搅拌spinner flasks（低水平流体应力）中培养的杂交瘤比在高搅拌下培养的杂交瘤对剪切更敏感。然而，野生型和Bcl-2缺陷CHO细胞对剪切的抵抗力被发现与它们之前在T型瓶或悬浮培养中的培养无关。这一观察归因于细胞暴露于剪切时Bcl-2表达的丧失。还报告了基因表达损失，其中在5L生物反应器中培养的CHO细胞显示出较低的F-肌动蛋白表达水平，导致细胞骨架较弱。相反，Perani等人观察到Bcl-2确实在三个几何不同的系统中培养的NS1衍生的小鼠杂交瘤中提供了凋亡保护。这些不同的发现表明，剪切应力抵抗力是细胞系特定的。 3.2.3.营养物质/代谢物压力 限制生长的营养物质是细胞系和克隆特定的；确定它们对于设计合适的培养基和补充培养基进行分批和连续培养至关重要。几项研究已经检查了营养物质和代谢物对细胞生理学的影响，如表3所总结的。生长限制性营养物质的耗尽导致生长停滞，最终导致凋亡，这也由有毒代谢物的存在引起。葡萄糖作为重要的碳源，在调节凋亡方面至关重要，但其重要性可能更多的是调节性的而不是营养性的，这已通过使用GS-NS0细胞的研究建议，其中葡萄糖调节并延长了静止期，以及调节DNA修复和转录。此外，葡萄糖可以通过快速提供ATP来防止或延迟凋亡。除了主要的碳源（通常是哺乳动物细胞的葡萄糖），氨基酸非常重要，不仅作为蛋白质生产的构建块，还作为三羧酸（TCA）循环中间体的前体。 了解细胞系和克隆特定的氨基酸代谢使能够确定培养过程中必需营养物质的代谢转变，应避免这些转变，因为它们可能会影响生长、生产力和产品质量，导致制定适应所用细胞系/克隆特定需求的培养基和喂养策略。如果代谢发生变化，纠正措施可能不会产生预期的效果。在氨基酸中，谷氨酰胺已被证明与CHO培养中的乳酸代谢转变相关，从而也影响培养pH。包括任何代谢转变信息的详细代谢分析对于理解这些观察至关重要。 除了糖或氨基酸之外的其他必需营养物质包括蛋白质，如胰岛素和转铁蛋白，其撤除导致CHO细胞凋亡，以及磷，添加到高细胞密度NS0培养中成功防止活性损失，增加mAb滴度和抑制凋亡。另一组必需分子是脂质。当营养物质耗尽时，某些细胞系能够通过合成三酰甘油和形成脂滴来维持活性。目前对这种现象的了解不足，但已经表明在完全营养物质耗尽的情况下，CHO细胞能够通过β-氧化脂肪酸生存，这需要脂滴生物生成。 随着细胞的生长和营养物质的代谢，它们产生副产品，这些副产品变得有毒并导致凋亡。两个重要的有毒代谢物是乳酸和氨，分别是葡萄糖代谢和谷氨酰胺/天冬酰胺代谢的副产品。当葡萄糖从更高效的TCA循环转向更快的发酵途径时，会形成乳酸。如果氧气不可用，就不能进行氧化磷酸化，细胞将通过替代途径代谢葡萄糖，例如乳酸发酵，产生乳酸。乳酸产生速率取决于克隆，受培养基配方的强烈影响。乳酸积累最终可能导致代谢转向乳酸消耗，尽管如此，仍然会导致生长停止和活力下降。此外，当乳酸脱氢酶A（LdhA）和丙酮酸脱氢酶激酶（PDK）1、2和3同时低表达时，CHO细胞中mAb产量增加，当丙酮酸脱氢酶复合体（PDC）被化学抑制时也是如此。乳酸对哺乳动物细胞培养的影响已与乳酸积累导致的氧化磷酸化速率下降相关。尽管在几项研究中被识别，但并非所有CHO克隆都观察到乳酸代谢转变。即使在同一项研究中，这也是细胞系和克隆特异性属性。有趣的是，从培养基中摄取谷氨酰胺的细胞中可能发生的乳酸代谢转变与谷氨酰胺的存在相关，这表明谷氨酰胺分解可能促进乳酸产生。然而，由于乳酸存在时线粒体氧化途径活性降低，代谢并未恢复正常。乳酸消耗另一个重要作用是再生糖酵解所需的NAD+辅因子。表达丙酮酸羧化酶的CHO细胞的分批培养表明，尽管观察到乳酸代谢转变，但培养寿命仅延长了1天（从10天延长到11天），尽管达到了更高的细胞密度。值得一提的是，这一现象可能受温度影响。在33°C培养的HFN 7.1杂交瘤中，即使谷氨酰胺完全消耗，乳酸生产仍在继续导致细胞死亡。然而，当相同细胞在37°C培养时，谷氨酰胺耗尽时乳酸生产停止。作者团队的未发表结果显示，在无谷氨酰胺、化学定义的培养基中分批培养的GS-NS0细胞产生的乳酸很少（<4mM），这可以归因于这些细胞在无谷氨酰胺的培养基中生长，并且只会产生它们所需的谷氨酰胺量（来自谷氨酸）。然而，另一种在分批培养中消耗乳酸的GS-NS0细胞系直到谷氨酰胺（最初不出现）达到0.4mM才开始消耗乳酸。只要保持谷氨酰胺浓度低，乳酸浓度就保持稳定，当谷氨酰胺浓度仅增加时就会产生乳酸。对于可以将乳酸和谷氨酰胺代谢联系起来的细胞系，培养基设计的一个重要限制是确保将谷氨酰胺浓度保持在最低以避免乳酸产生。控制谷氨酰胺水平也很重要，以避免产生氨。氨是谷氨酰胺代谢的副产品，与乳酸相反，它将培养pH值转变为碱性值。氨在2.5mM、6mM和高达29mM的浓度下分别对杂交瘤、HEK 293和CHO细胞培养产生负面影响。此外，氨的产生可能是细胞系和克隆特异性的。使用GS-NS0细胞进行的工作报告了不同水平的氨，从低于1mM到接近6mM。 3.2.4.温度 哺乳动物细胞生长、蛋白质生产和生化反应由酶催化，其活性受温度影响。生物加工规模与哺乳动物细胞生物加工开发中的温度控制相互关联。在小规模，直到台式生物反应器，温度控制是在受控环境中实现的，例如在孵化器中，而随着规模的增加，需要冷却和/或加热系统来控制温度并避免温度曲线的显著偏差。关于温度对哺乳动物细胞培养影响的分子机制有大量文献。具体来说，与热休克诱导的凋亡相关的转录独立的p53、钙失调和Bax具有调节作用。热休克蛋白70（HSP70）通过几种可能的机制参与保护免受温度诱导的凋亡。 在CHO细胞中，HSP70很重要，因为它延迟了半胱天冬酶-3的表达。鉴定了200多种具有温度依赖性表达谱的蛋白质，其中118种上调，与生长、凋亡和糖蛋白质量控制直接相关的23种蛋白质与温度降低直接相关。几项研究表明，高于最佳温度（37°C）的培养温度会触发凋亡。在CHO细胞中，过表达HSP27和HSP70导致由于在37°C时延迟表达半胱天冬酶2、3、8和9而增加了寿命。尽管报告了产品滴度的增加，但未描述产品质量属性和遗传稳定性，也未证明这种策略是否会改善更高温度下的CHO培养。事实上，在39°C培养CHO细胞增加了生长速率，但导致G2/M期细胞周期停滞，活力和生产力下降，尽管整体产品滴度增加。在NS0细胞中，转染HSP70基因的克隆也导致对凋亡的抵抗力增加。野生型NS0细胞中缺乏HSP70表示细胞系对温度诱导凋亡的特异性反应。在产品质量方面，CHO细胞生产的Epo-Fc融合蛋白的唾液酸化在37和39°C之间没有显著差异。在几种杂交瘤中，37°C以上的培养温度对mAb生产不利。具体来说，这种效应在39°C和38°C的杂交瘤细胞培养中观察到。有人建议温度的效应可能是搅拌依赖的，因为非搅拌杂交瘤培养在38°C（与37°C相比）时具有更快的特定生长速率，产生mAb的速率相似；搅拌培养的情况正好相反，在38°C时生长较慢，产生mAb的速率较低。 低于最佳温度的温度也会影响培养寿命、细胞生长和生产力。在CHO培养中，单克隆抗体的聚集在33°C时比37°C高2到5倍。当生产双特异性抗体的CHO细胞的温度从36°C降低到32.5°C时，也观察到相同的效应。在这种情况下，重要的是确保细胞产生所需的双特异性mAb，而不是截短版本或完整的单特异性mAb。降低温度降低了生长，但促进了所需双特异性mAb结构的形成；尽管在较低温度下也观察到聚集，但总体上认为降低温度是有益的。建议采用两阶段培养策略，即在36°C进行生长，在32.5°C进行mAb生产，提高整体产品质量和下游处理产量。这些观察是细胞系和产品特异性的。在表达人类组织型纤溶酶原激活剂（tPA）的CHO细胞中，将温度从37°C降低到30°C在指数生长期增加了细胞周期抑制剂2A（细胞周期停滞诱导剂）的表达，对DNA损伤响应基因没有影响，尽管相应的基因没有上调，但tPA生产率增加（未提供产品质量数据）。此外，与能量产生和凋亡保护相关的基因上调，葡萄糖和乳酸的代谢速率减慢，而谷氨酰胺消耗保持不变。 在低温（30°C）条件下，CHO细胞的代谢速度较慢与G0/G1期阻滞有关。Trummer等人报告了产品质量数据，并显示唾液酸化减少了40%。对NS0细胞的研究表明，将温度从37°C降低到34°C可以在不影响培养寿命的情况下略微提高单克隆抗体（mAb）的产量。进一步将温度降低到22°C则显示无增殖并诱导凋亡，同时细胞周期在G2/M期被阻滞。尽管有DNA微阵列证据表明，在低温条件下培养细胞会停止代谢并诱导凋亡，但据我们所知，还没有研究报告低温诱导凋亡的详细机制。 3.2.5.pH值 在哺乳动物细胞培养中，严格的pH控制至关重要，因为即使是微小的偏差也可能导致细胞死亡。此外，pH值影响生长、单克隆抗体（mAb）产量、多种氨基酸的摄取率以及产品质量，如表5所示。尽管pH值很重要，但其在凋亡中的作用机制尚未完全阐明。 尽管最佳pH值取决于细胞系，但在哺乳动物细胞生物加工中，接近7.0的pH值通常被认为是理想的。在pH 6.8下培养CHO细胞对培养寿命最有利，而最大细胞密度在pH 6.9下获得。在所有评估的pH条件下，主要碳源（葡萄糖）的耗尽导致显著的活性下降和代谢转向乳酸消耗。Brunner等人表明，即使是短期的pH扰动也会影响细胞生理，而Trummer等人则表明，尽管在pH 6.8下获得了最高的单克隆抗体滴度，但在pH 7.1下达到了最高的体积生产力。尽管Trummer等人没有观察到pH 6.8和7.1之间产品质量（Epo-Fc的唾液酸化）的显著差异，但Brunner等人报告了在pH 6.8、7.0和7.2下培养的mAbs的基本和酸性变体中的几种差异。在另一项研究中，CHO灌注培养中第9天将pH从7.15降至6.85，增加了细胞密度和寿命，并改善了单克隆抗体的糖基化和效力，同时保持了生产力。 对其他细胞系也观察到了类似的效果。在Sp2/0补料分批培养中，中性pH最理想，当pH从7.2降低到7.0时，活细胞的积分和滴度都有所增加，尽管没有报告产品质量数据。在F2N78细胞培养中，pH从6.8增加到7.4会减少寿命并加速代谢，导致副产品积累更多，pH 6.8被认为是最佳选择。Osman等人受到在添加碱/酸时对生物反应器进行pH扰动的调查的启发，将GS-NS0细胞在pH 7.3下培养，并研究了单一和多重pH扰动的影响。作者报告说，单一pH 8扰动没有显著的不利影响，但对pH 9扰动有时间和剂量依赖性的反应。因此，有效的搅拌和谨慎选择添加碱/酸的点对于避免生物反应器非均匀区域的凋亡很重要。 如上所述，有毒代谢物（如乳酸）的积累会降低培养pH值。虽然在某些研究中，酸化是早期凋亡的特征，与DNA损伤有关，但在其他研究中，酸化并未导致细胞死亡，也没有影响生长，Bcl-2和Mcl-1提供了保护。在NS0细胞培养中，凋亡可以独立于细胞内pH变化发生，在酸度下HL-60细胞中观察到增加的半胱天冬酶活性。事实上，Bax在pH 4.0时形成线粒体膜孔的能力是在pH 7.5时的8倍，而Bcl-2几乎可以完全抵消这种效果。由于氨的产生，培养基的碱化是一个已知的增殖过程特征。然而，其对细胞生理的影响机制仍需阐明。碱性环境可能会抑制半胱天冬酶-3，但如果之前已经激活，蛋白质在pH值增加后仍然保持活性。 3.2.6.渗透压 关于渗透压的研究评估了盐分和代谢物对生长和生产力的影响，如表6所总结。尽管高渗透压在CHO细胞中激活了半胱天冬酶3和7，导致DNA碎片化，在小鼠肾细胞中导致DNA双链断裂，但渗透压诱导凋亡的机制需要进一步研究。在生物反应器中，由于pH控制通常是通过碳酸盐/碳酸氢盐缓冲剂实现的，这需要CO2，因此很难将盐分和CO2的影响分开。一项使用低盐培养基配方的研究表明，高渗条件与凋亡强烈相关，而CO2分压单独对Sp2/0细胞培养的活性没有显著影响。相比之下，pCO2对CHO细胞的生长有显著影响，而高渗压（尽管在310至376 mOSm/kg的非常窄的范围内）没有。氯化钠（NaCl）通常用于渗透压研究，并且已经证明了其对CHO细胞生长的剂量依赖性影响。有趣的是，脯氨酸补充已被成功用于抵消由NaCl添加引起的高渗压力的影响。这些结果令人惊讶，因为添加溶质进一步增加了培养基的渗透压，表明对NaCl或氨基酸诱导的渗透压增加有不同的反应机制。事实上，向小鼠肾细胞培养中补充尿素至最终渗透压600 mOsm/kg对DNA的损伤程度与添加NaCl至最终渗透压300 mOsm/kg相同，证实了溶质特异性效应的假设。这在生物加工中特别相关，因为人们一直在努力使用氯化钠提高细胞对渗透压应激的抵抗力；然而，这样的研究可能并没有针对与渗透压相关的问题的真正原因。最近，通过使用“渗透压空间”成功地从培养基配方中去除了氯化钠（和其他成分），以增加营养物质浓度而不使细胞受到高渗压力。在蛋白质生产方面，高渗性效应是产品特异性的，导致EPO-Fc滴度降低但单克隆抗体滴度不变。 与CHO细胞不同，当渗透压从290增加到450 mOsm/kg时，NS0细胞培养实现了延长的寿命，尽管细胞密度较低。只有在高渗培养（450 mOsm/kg）的最后几天才观察到滴度差异，这归因于它们改善的寿命。然而，在高渗条件下，特定单克隆抗体（mAb）的生产力和特定增长率更高。有趣的是，另一项研究表明，将补料分批NS0培养的渗透压从平均276增加到平均326 mOsm/kg显著改善了生长和单克隆抗体滴度，而进一步增加到381 mOsm/kg则有轻微的负面影响。这些结果表明，渗透压对细胞生长的影响取决于细胞系，可能还特定于克隆，并且对生产力和滴度的影响是产品特异性的。 3.2.7.错误折叠蛋白引起内质网应激 为了实现高滴度培养，需要过度表达蛋白质。然而，过度表达蛋白质可能触发内质网（ER）应激，导致凋亡和产品质量下降，因为由于内质网无法应对高蛋白质浓度，不完全的产品被分泌出去。表7显示了有关内质网应激对相关生物加工细胞系影响的文献综述。 未折叠蛋白反应被描述为内质网和细胞核之间的相互作用。错误折叠或未折叠蛋白的聚集激活了ER应激受体，即atf6（激活转录因子6）和需要肌醇的酶1（IRE1）。这些事件，连同atf4的激活，导致内质网和细胞核之间的相互作用，目的是重新建立ER的折叠能力，并通过合成蛋白酶和分子伴侣来减少正在处理的蛋白质数量。严重的ER应激导致一系列不同的事件，包括CHOP（C/EBP同源蛋白，一种促凋亡转录因子）的表达阻断和JNK（c-Jun N端激酶）对Bcl-2的磷酸化。这些结果导致Bim激活，进而激活Bax通道在ER和线粒体膜上形成。因此，钙，细胞色素C和其他凋亡激活剂被释放，最终触发半胱天冬酶激活和凋亡细胞死亡。另一个关键的相互作用是ER和线粒体之间的串扰。ER是钙离子的主要内部储存库，它们介导几种信号传导途径，ATP产生和凋亡。肌醇三磷酸受体类型1（IP3R-1），是钙信号传导机制的关键因素，被认为是半胱天冬酶-3的底物，Bcl-2或BcL-xL可能与ER表面不同类型的IP3R（1、2或3）相互作用，以控制钙离子释放速率，这种相互作用被Bax阻止。删除IP3R1基因导致对凋亡的抵抗。这些发现证实了钙在ER应激诱导的凋亡中的重要作用。 来自同一亲本CHO克隆的高和低单克隆抗体生产克隆中ER应激的动态表明，重链mRNA的上调与每个克隆的生产水平相关，并且分子伴侣的浓度将在培养结束时增加，此时达到最大单克隆抗体滴度。然而，低生产者比高生产者晚2天进入凋亡，而凋亡率保持不变。在IgG生产的CHO细胞中，过度表达未折叠蛋白反应基因成功地产生了一个生产力更高的克隆，尽管没有评估产品质量。同样，在NS0培养的下降阶段，ER蛋白表达的增加与单克隆抗体产量的增加相关。这些结果表明，未折叠蛋白反应（UPR）基因是增加单克隆抗体生产的好目标。然而，也有研究表明高单克隆抗体生产与分子伴侣表达增加有关，但X盒结合蛋白1（XBP1）的表达没有变化，XBP1是UPR的标志，这表明未折叠蛋白反应途径在GS-NS0细胞中活性并不更高，这些细胞具有更高的单克隆抗体生产率。作者建议这一观察可能是特定于克隆的。 识别对ER敏感的克隆和ER报告基因可以帮助选择高产者并在凋亡发生之前的所有工艺开发阶段监控压力。基于ER的选择策略已应用于CHO细胞，采用GRP78（ER应激报告基因）的表达作为高表达的标志；类似的策略已应用于NS0细胞，使用GADD153基因，其在几个NS0克隆中的表达被修改。GADD153被认为是ER应激开始的良好报告基因，其过度表达本身并不是凋亡的原因。总之，ER应激应考虑在内，特别是在细胞系开发和克隆选择的早期工艺开发阶段。 4.系统方法  传统上，生物工艺优化是通过顺序实验进行的，因此仅限于筛选设计空间的一小部分区域。最近，高通量策略和“组学”技术使评估范围更广的设计空间成为可能，尽管它们既耗时又成本高昂。凋亡工程和凋亡建模是合理的“系统”方法，可以促进细胞生物工艺的优化，因为它们可以筛选整个设计空间，有可能减少时间和成本。下面回顾了这些策略，可以单独使用或结合使用（图1）。 4.1.凋亡工程 凋亡工程是一种针对细胞系工程的方法，目标是通过合理的基因表达修改，发展抗凋亡细胞系。可以过度表达抗凋亡蛋白和/或下调促凋亡蛋白。这些研究的总结见表8。 最常用的抗凋亡基因是Bcl-2，它在各种环境压力下都能提供抗凋亡能力。在杂交瘤细胞中过度表达Bcl-2延长了几种培养条件下的寿命。在NS0细胞中，过度表达Bcl-2导致相互矛盾的观察结果：一些研究报告了对细胞密度和单克隆抗体生产的积极影响，而其他报告则没有显著影响。在CHO细胞培养中，过度表达Bcl-2导致细胞密度增加，寿命改善和凋亡减少，但没有影响单克隆抗体生产。过度表达Bcl-xL或Mcl-1提供了有希望的结果的替代策略。一项关于CHO细胞中过度表达Bcl-xL和Bcl-2的比较研究得出结论，Bcl-xL是CHO细胞工程比Bcl-2更有希望的目标，因为后者可能会损害蛋白质生产。事实上，通过在CHO细胞中过度表达Bcl-xL实现了2.7倍的灌注蛋白生产增加，而另一个过度表达Mcl-1的CHO克隆报告了单克隆抗体滴度增加了40%，没有显著影响产品质量。有人建议Bcl-2和Bcl-xL的效果可能是功能上冗余的，这种可能性也在Sp2/0细胞的研究中被指出，其中Bcl-xL的表达显著改善了培养寿命。 在CHO细胞中的其他凋亡工程方法包括过度表达Aven（凋亡体抑制剂）和E1b-19k（BH3-only蛋白抑制剂），这可以延长培养寿命。另一种方法是消除促凋亡蛋白。具体来说，在CHO细胞中消除Bax和Bak增加了培养寿命，并产生了更高的单克隆抗体滴度，同时使细胞对凋亡更加抵抗（即使化学诱导的凋亡），在33和37°C下均如此。有关这些策略的详细评论，包括抑制其他基因和使用半胱天冬酶抑制剂，可以在其他地方找到。最后，据我们所知，尚未实施的凋亡工程的一个不同方法是直接针对凋亡逆转机制，通过过度表达凋亡可逆性基因（XIAP、PARP、HSPs等），这可能导致阻止凋亡事件并启动Anastasis，将凋亡群体恢复为活性。 尽管针对凋亡的细胞工程取得了有希望的结果，但关于产品质量和副作用（如代谢变化和遗传稳定性）的信息仍然不足。蛋白质生产要么没有报告，要么显示出微小的改进，这归因于生物能量学的下调。两个例外是使用NS0细胞进行的恒化器研究，其中实现了单克隆抗体产量的3倍增加，以及在CHO细胞中过度表达Bcl-xL的研究，实现了单克隆抗体产量的2倍增加。由于细胞将能量利用集中在基本功能上，因此非基本功能的能量减少。这突出了阐明细胞能量学、其在凋亡中的作用以及遗传操作引起的任何代谢变化的重要性。例如，一个潜在的有趣替代策略是通过氨基酸和葡萄糖喂养来提供凋亡保护。尽管理想情况下是互补的，但营养喂养和凋亡工程可能是不兼容的。在过度表达Bcl-xL的Sp2/0细胞克隆中，谷氨酰胺喂养后活性保持不变，而野生型在喂养后活性得到改善。细胞的遗传操作也引起了对过度表达抗凋亡蛋白的细胞系稳定性的担忧，不仅因为这些细胞中观察到异常，而且因为这些蛋白的表达可能在长期或在可能影响产品质量的特定应激条件下丢失。过度表达抗凋亡基因（Fadd、Faim、Alg-2和Requiem）的遗传工程CHO细胞不仅显示出增加的活细胞数量和γ-干扰素产量，而且还增加了唾液酸化。 4.2.凋亡的数学建模 如图2所示，凋亡是一个高度调节的过程，其中几种蛋白质的干预确保细胞以受控且无害的方式死亡。由于其在生物加工中的显著影响，凋亡的数学模型将有助于整合生物过程数据，并预测生物反应器几何形状和操作对细胞死亡的影响。然而，凋亡的生物学复杂性使建模具有挑战性。表9总结了各种有限的凋亡建模尝试。 详细数学描述参与不同凋亡途径的所有蛋白质和相互作用在（1）捕捉生物学，（2）获取验证模型预测所需的实验数据，以及（3）产生计算可追踪的预测模型方面提出了重大挑战，这些模型可用于基于模型的过程优化。因此，凋亡建模有两种先验选择。在生物学方面，需要仔细基于证据的决策，确定要建模的干预措施和相互作用，而在建模方面则决定模型结构。虽然一些研究人员选择了基于链反应的公式（启动、放大和执行）或模拟细胞群体在状态之间的转换（存活、凋亡和死亡），但大多数人选择了动力学/机制公式，由于其动态特性通常更受青睐（Kyriakopoulos等人，2018b年）。模型复杂性归因于通过建模少数相互作用以捕捉详细的动力学关联，或者通过考虑整个途径但仅考虑少数干预措施来建模。描述少数物种详细模型的例子包括（1）DNA损伤模型，（2）通过各种途径激活半胱天冬酶-3的模型，（3）Bax/Bcl-2相互作用模型，（4）包括双稳态研究的半胱天冬酶3和8相互作用模型，后来又与实验数据进行了比较，以及（5）UPR模型或自噬和凋亡之间相互作用的模型。复杂网络模型包括Fas信号模型，其中某些模拟与实验数据进行了比较，以及描述使用敏感性分析和实验验证的最小凋亡诱导配体/受体比例的CD95诱导凋亡途径模型。Bentele及其同事的工作提供了一个适合生物过程社区兴趣的模型特征示例，特别是在与生物过程优化相关的方面。在CHO细胞中使用代谢通量分析（MFA）对葡萄糖、乳酸、五种氨基酸和氨进行了代谢和凋亡的整合；然而，代谢物预测超出指数生长期与实验数据不符，未能捕捉代谢转变。尽管MFA提供了有关细胞平衡代谢状态的有价值信息，但它在动态过程中的应用有限。使用结合建模/实验方法分析了营养应激对GS-NS0细胞基因表达的影响，其中简化的动力学模型捕获了营养和代谢物剖面，并描述了批量模式下六个凋亡相关基因（半胱天冬酶3和8、atf5、bcl-2、bax和trp53bp2（p53结合蛋白2））的表达。这项工作的主要缺点是在补料分批模式下缺乏预测能力。 如前所述，跨尺度的凋亡诱导应激在生物过程开发中很重要（图4），需要在凋亡建模中纳入空间效应。例如，虽然细胞总体上可能不会经历高剪切应力环境，但有些细胞会物理上靠近搅拌器。同样，尽管pH可能得到了很好的控制，但在酸/碱添加点的局部扰动可能诱导暴露于扰动的细胞凋亡。同样，尽管气泡破裂在整体上不构成问题，但在气液界面附近可能是有害的。计算流体动力学（CFD）建模考虑了空间效应，集成CFD-动力学模型将为最佳反应器几何设计（尺寸、体积、挡板数量和搅拌器位置）、最佳操作条件（通气、O2水平、搅拌等）以及最佳培养基设计和补料策略提供有关生产力和产品质量优化的有价值信息。 5.结论和未来方向  生物反应器中的细胞死亡主要作为凋亡的结果，活力的降低可能会影响产品滴度和产品质量。为了实现最佳操作，了解引起凋亡的应激在生物过程开发中至关重要。对于各种工业相关的哺乳动物细胞系，仍然缺乏对凋亡的原因和效应的全面阐明，具体到细胞系和克隆。此外，建立稳健和快速的凋亡表征方法以及开发新方法，包括细胞工程和in silico建模，以对抗凋亡，将进一步改善生物过程优化。总之，生物过程开发和优化必须考虑细胞系和克隆特异性属性，并超越喂养策略、培养基配方和细胞工程，进行全生物过程设计，以减少/消除凋亡原因。上游改进将对下游加工产生积极影响，具有累加的有益影响。

2024年8月29日，苏州大学叶娜和中南大学程岩团队在Journal of Medicinal Chemistry上在线发表了题为“Structure–Activity Relationship Studies of Substituted 2-Phenyl-1,2,4-triazine-3,5(2H,4H)-dione Analogues: Development of Potent eEF2K Degraders against Triple-Negative Breast Cancer”的文章。作者基于hits I4和C1的2-苯基-1,2,4-三嗪-3,5（2H，4H）-二酮骨架进行结构优化，通过SAR分析发现了化合物36可以显著抑制TNBC细胞系MDA-MB-231和HCC1806的存活率、增殖和迁移，对eEF2K蛋白具有高结合亲和力，并有效诱导其降解。此外，在MDA-MB-231细胞异种移植小鼠模型中，36具有与紫杉醇相当的肿瘤抑制作用，没有明显的毒性，表明化合物36可以开发为TNBC治疗的潜在新疗法。 三阴性乳腺癌（TNBC）是乳腺癌中最具侵袭性的亚型，复发可能性高，总体预后差，占已确诊乳腺癌的15-20%。化疗仍是目前TNBC标准治疗的主要手段，因TNBC异质性高，对激素疗法和针对ER、PR和HER2的靶向疗法反应较低。化疗耐药性的出现也给TNBC的治疗带来了挑战。因此，开发新的有效疗法作为治疗TNBC的有效选择迫在眉睫。 真核细胞伸长因子2激酶（eEF2K）是唯一依赖于Ca2+和钙调素的非典型α-激酶，也被称为Ca2+/钙调素依赖性蛋白激酶III（CAMKIII）。eEF2K在细胞应激和缺氧、营养耗竭等不利条件下被激活。这使它能够使其下游蛋白eEF2磷酸化，从而阻止核糖体转运并抑制蛋白质合成的延长步骤，最终维持能量平衡并适应微环境挑战。eEF2K活性异常与肿瘤发生、侵袭和转移的增强有关。eEF2K在不同类型的癌症中高度过表达，包括乳腺癌、胶质瘤、胰腺癌、脑癌和肺癌。在TNBC患者中也观察到了eEF2K的表达失调。药理抑制eEF2K可抑制肿瘤进展并提高癌症免疫疗法的疗效。因此，eEF2K是TNBC的一个新兴治疗靶点。 目前，针对eEF2K的调节剂报道较少，已报道的eEF2K抑制剂在体外表现出显著抑制eEF2K酶活性的作用，但它们对各种癌症细胞类型的抗增殖功效相对有限，因此阻碍了体内验证研究（图1A）。新型高效的eEF2K的抑制剂亟待开发。 图1. 已报道的eEF2K调节剂的结构 作者基于A-484954的吡啶并[2,3-d]嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮框架的骨架跳转设计策略，以及随后对初始hit I4的初步优化，发现了一种eEF2K单价降解剂C1（图1B）。I4较低的抗增殖效力和C1中存在的不稳定酯基限制了其进一步的临床转化。因此，在本文中，作者通过分子对接预测C1和I4与eEF2K蛋白的结合模式（图2A-B），设计并合成了四个系列的I4和C1衍生物（图2C），在其2-苯基-1,2,4-三嗪-3,5(2H,4H)-二酮支架上探索更多的化学空间，并在药物化学方面建立eEF2K降解剂的结构-活性关系（SARs），最终提高化学稳定性和抗癌疗效。 图2. C1和I4与eEF2K蛋白的结合模式及新型eEF2K降解剂的设计 SAR分析 表1. 系列I化合物的抗肿瘤活性 表2. 系列II化合物的抗肿瘤活性 表3. 系列III和IV化合物的抗肿瘤活性 在合成的一系列结构衍生物中，化合物36显示出最显著的MDA-MB-231细胞抑制活性，IC50 = 43.71 nM。SPR分析表明化合物36与eEF2K的结合力很强，且与浓度有关，KD值为330 nM。 化合物36对TNBC细胞具有强效抑制作用 通过CCK-8试验测试化合物19和36对其他六种乳腺癌细胞的抗癌活性。如图3A所示，与其他亚型乳腺癌细胞株相比，36对TNBC细胞株MDA-MB-231和HCC1806表现出更强的效力，在菌落形成试验中优于19（图3B）。36以剂量依赖的方式诱导MDA-MB-231和HCC1806细胞的显著凋亡（图3C）。Western印迹分析发现，PARP和Bax的裂解水平升高，PARP、Bcl-2和XIAP的水平降低（图3D），进一步证明36诱导了MDA-MB-231和HCC1806细胞的凋亡。 图3. 化合物36可抑制细胞增殖并诱导细胞凋亡 化合物36能有效阻断上皮细胞向间质转化和细胞迁移 eEF2K是上皮细胞向间质转化（EMT）的介导因子，EMT是促进细胞迁移和侵袭的重要机制。通过Western印迹分析检测了化合物36对EMT标记的影响。如图4A所示，化合物36处理导致E-cadherin表达增加，N-cadherin和波形蛋白表达减少，阻止了TNBC细胞的EMT。通过细胞伤口愈合试验评估了化合物36对TNBC细胞迁移的影响。如图4B所示，化合物36能显著抑制细胞迁移。 图4. 化合物36抑制细胞迁移 化合物36通过泛素-蛋白酶体系统诱导eEF2K降解 作者检测了化合物36对eEF2K蛋白表达的影响，发现36能以剂量依赖的方式有效降低MDA-MB-231和HCC1806细胞中eEF2K蛋白水平（图5A）。化合物36在TNBC细胞中诱导的eEF2K下调效应与其对癌细胞的抑制作用呈正相关。细胞热转移试验表明，用36处理会增加eEF2K的热稳定性，这表明36与eEF2K蛋白结合（图5B），与之前的SPR结果一致。此外，根据36的分子对接结果，构建的携带eEF2K氨基酸突变（Phe8、Leu10、Cys146）的HEK-293T细胞，其中两个苯基环和核心与C1重叠良好（图6A-B）。同样，细胞热转移实验表明，Phe8、Leu10和Cys146氨基酸的突变损害了eEF2K蛋白在36存在下的热稳定性，表明eEF2K与化合物36之间的相互作用被破坏（图6C）。 图5. 化合物36能有效诱导eEF2K蛋白降解 图6. 化合物36能与eEF2K蛋白特异性结合 接着，作者进行了冲洗实验以评估36诱导eEF2K降解的持续时间。图5C显示，培养基冲掉后，eEF2K蛋白持续降解，48 h后由于蛋白的重新合成，eEF2K蛋白恢复，表明36可能是一种长效的eEF2K降解剂。为了验证用36处理的TNBC细胞中eEF2K的下调是否与eEF2K降解的调控有关，作者用MG132和MLN4924处理了细胞。如图5D所示，蛋白酶体抑制剂MG132和E1泛素激活酶抑制剂MLN4924能显著逆转36诱导的eEF2K表达下降，表明36能促进泛素-蛋白酶体途径介导的eEF2K降解。进一步探讨了36对蛋白质稳定性的影响，发现在36的处理下，eEF2K蛋白的周转率明显加快（图5E）。综上所述，36通过促进泛素-蛋白酶体途径介导的降解来下调eEF2K蛋白。 为了进一步证实36诱导的肿瘤抑制作用确实是通过靶向eEF2K实现的，作者通过shRNA转染建立了eEF2K稳定敲除（eEF2K-KD）的MDA-MB-231 细胞（图7A）。发现36对细胞存活的影响与敲除eEF2K对MDA-MB-231细胞的影响相当（图7B）。与对照细胞相比，稳定敲除eEF2K的MDA-MB-231细胞对36不敏感（图7C-D）。证实了36的抗肿瘤活性源于其促进eEF2K降解作用。 图7. 化合物36对TNBC细胞的抑制作用取决于eEF2K的降解 化合物36的药代动力学（PK）特性 当静脉注射和腹腔注射剂量为5mg/kg时，36的体内峰值浓度（Cmax值分别为549.3和194.3ng/mL）和暴露量（曲线下面积（AUC）值分别为860.6 和 287.5 h·ng/L）均可接受，半衰期分别为 5.9 和 2.1 h。然而，36的口服吸收可能较差，从而导致口服生物利用度不足（F = 1.5%，表 4），这主要归因于其低水溶性。现阶段通过腹膜内给药来确定其体内药效（F = 33.4%）。 表4 化合物36的PK特性 化合物36在体内具有强效的肿瘤抑制作用 化合物36以剂量依赖性的方式显示出有效的抗肿瘤活性，在5和10 mg/kg剂量时，肿瘤生长抑制率（TGI）分别为44.79%和59.26%（图8A-D）。此外，剂量为10 mg/kg的36在体内的抗癌活性（TGI ：59.26 vs 52.70%）与TNBC治疗中使用的标准化疗药物PTX相当。免疫组化分析表明，与对照相比，36治疗显著降低了Ki-67的表达（图8E）。此外，用36治疗的肿瘤中eEF2K的表达呈剂量依赖性下调（图8F）。 图8. 化合物36显著抑制体内肿瘤生长 体内毒性试验表明，在使用36的治疗过程中，小鼠体重没有减轻（图9A）。小鼠各器官的大小/重量或H&E染色检测均未显示出异常，这表明小鼠对5 mg/kg和 10 mg/kg的剂量均有耐受性，能有效抑制肿瘤生长（图9B-D）。进一步检测了一系列肝肾毒性血清生化指标，在异种移植模型中未观察到明显的药物相关毒性（图9E）。 图9. 化合物36在体内显示低毒性 总结 本文基于hits I4和C1的2-苯基-1,2,4-三嗪-3,5(2H,4H)-二酮骨架进行结构优化和SAR研究，发现化合物36对三种TNBC细胞系表现出最强的效力，其IC50值从43.7到585.3 nM。此外，化合物36能明显抑制MDA-MB-231和HCC1806细胞的迁移和凋亡，并与eEF2K蛋白有很高的结合亲和力，能有效地诱导其降解。此外，36在TNBC细胞异种移植小鼠模型中发挥了强大的肿瘤抑制作用，且无明显毒性，有希望成为TNBC治疗的潜在新型疗法。 原文链接：https://doi-org.libproxy1.nus.edu.sg/10.1021/acs.jmedchem.4c01484 药物筛选中心（暨南大学）对外提供新药筛选服务 声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！ 长按关注本公众号  粉丝群/投稿/授权/广告等 请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓

摘要：严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV）、中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）以及当前的严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）是人类历史上影响最大的冠状病毒，尤其是后者，它为人类疫苗学带来了革命性的变化。由于其高度传染性，这种病毒迅速在全球传播，并在2020年3月被宣布为大流行。疫苗通常需要超过10年的时间来开发。因此，目前还没有针对SARS-CoV和MERS-CoV的疫苗。目前，世界卫生组织（WHO）已批准10种疫苗用于针对SARS-CoV-2的紧急使用。病毒样颗粒（VLP）是类似原生病毒的纳米颗粒，但不包含病毒基因组。由于其自我佐剂特性，VLP已被广泛探索用于疫苗开发。然而，没有一种针对SARS-CoV-2的批准疫苗是基于VLP的，而且只有4%的临床试验中的疫苗候选是基于VLP的。在当前的综述中，我们集中讨论了针对SARS-CoV、MERS-CoV和SARS-CoV-2的基于VLP的疫苗候选物开发的主要进展，包括临床和临床前研究，以提供对针对冠状病毒的基于VLP的疫苗的全面概述。 1.引言 在严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV）出现之前，已知的人冠状病毒（HCoV），如HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-OC43和HCoV-HKU1，仅会引起上呼吸道感染，这种感染约占普通感冒的15%至30%。SARS-CoV于2003年首次被确认为严重急性呼吸综合征（SARS）流行病的病原体，其源头可追溯至2002年底中国的广东省。早期SARS-CoV感染通常会导致类似流感的症状，如发热、寒战、头痛、肌肉疼痛和腹泻。SARS-CoV感染已知会导致高热（超过38摄氏度）和肺炎，这可能发展为严重的急性呼吸综合征，导致呼吸衰竭和死亡，没有呼吸机的帮助。据报道，SARS-CoV感染了29个国家的8000多人，导致774人死亡（9.6%的死亡率）。这激发了全世界科学家的兴趣，以了解免疫力以指导针对冠状病毒的疫苗开发。这场流行病持续了8个月，世界卫生组织（WHO）于2003年7月5日宣布结束。SARS-CoV感染的控制主要是通过公共卫生措施和对患者的严格隔离来实现的。 中东呼吸综合征（MERS），也称为骆驼流感，是2003年SARS-CoV爆发后出现的另一种致命的呼吸系统疾病。MERS的病原体是另一种冠状病毒，称为MERS冠状病毒（MERS-CoV）。该病毒于2012年在沙特阿拉伯首次被发现。截至2022年2月，MERS-CoV感染在27个国家报告，有2585例实验室确诊病例和890例相关死亡，这对应于已识别病例的34%死亡率。在所有报告的病例中，有2184例发生在沙特阿拉伯，有812例相关死亡，或37.2%的死亡率。 骆驼被认为是MERS-CoV的宿主，病毒主要是在沙特阿拉伯通过人-骆驼频繁接触而从动物传播给人类。大多数涉及人际传播的报告病例是通过医护人员与感染患者的密切接触在医院获得的。迄今为止，尚无针对MERS-CoV感染的特定治疗或疫苗。尽管死亡率很高，但由于MERS-CoV似乎不容易在人与人之间传播，因此MERS-CoV并没有受到太多关注。尽管MERS-CoV爆发主要在阿拉伯半岛流行，但几年前韩国的一次爆发始于一位访问中东并被MERS-CoV感染的商人。他回到韩国后，一系列人际超级传播事件被触发，最终导致186例病例和38例相关死亡（20%死亡率）。病毒传播到第二代和第三代接触者立即引起了对MERS-CoV多重突变的担忧，这可能导致了增强的人际传播。 自2019年底以来，另一种新的大流行冠状病毒已经出现。严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）最初是从中国湖北省武汉市分离出来的。尽管SARS-CoV-2感染的死亡率（2%）明显低于SARS-CoV（10%）和MERS-CoV（20-37%），但SARS-CoV-2的传播率异常高，其受体结合域（RBD）与人类血管紧张素转换酶2（hACE2）受体的结合亲和力比SARS-CoV的RBD高10-20倍。截至2021年12月28日，SARS-CoV-2已感染全球超过2.82亿人，导致超过500万人死亡。到2022年4月1日，SARS-CoV-2已感染超过4.88亿人，造成超过600万人死亡。SARS-CoV-2的死亡率已显著降低，从1.8%（2019-2021）降至0.5%（2022年至今）通过使用疫苗。 疫苗通常需要10-15年的时间才能开发出来，直到被批准用于人类。然而，由于这场大流行的严重性，COVID-19疫苗的开发正在以极快的速度进行，特别是临床阶段大大加快了。迄今为止，世界卫生组织（WHO）已批准10种疫苗的使用，分别是BNT162b2（辉瑞-BioNTech）、mRNA-1273（Moderna）、AZD1222（阿斯利康）、Ad26.COV2.S（强生）、Covishield（印度血清研究所）、BBIBP-CorV（国药）、Covaxin（印度生物技术）、Coronavac（科兴）、COVOVAX（印度血清研究所）和Nuvaxovid（诺瓦瓦克斯）。此外，目前有153种疫苗候选正在进行临床试验，196种候选正在进行临床前试验。尽管SARS-CoV-2大流行给世界带来了非常严重的社会和经济影响，但它也给疫苗开发带来了革命性的变化，包括临床试验指南的快速发布、监管审查和批准流程的加快。此外，联合临床试验加速了新型COVID-19疫苗进入临床应用的过程。值得一提的是，这场大流行还允许在人类疫苗历史上首次使用基于mRNA的疫苗（辉瑞-BioNTech的Comirnaty）。 在所有批准的COVID-19疫苗中，没有一个是基于病毒样颗粒（VLP）的。在当前的综述中，我们集中讨论了针对SARS-CoV、MERS-CoV和SARS-CoV-2的基于VLP的疫苗候选物开发的主要进展，包括临床和临床前研究。Scopus和谷歌搜索引擎被用来实现与这些冠状病毒的基于VLP的疫苗相关的期刊文章的全面覆盖。此外，还讨论了SARS-CoV-2候选疫苗的最新进展，并与WHO COVID-19疫苗追踪器和景观进行了交叉检查。本综述旨在提供对针对冠状病毒的基于VLP的疫苗的全面概述。 2.β-冠状病毒的分子特征 SARS-CoV、MERS-CoV和SARS-CoV-2是感染人类的β-冠状病毒。这些病毒包含一个长度分别为29.7、30.1和29.9 kb的单链、正义RNA基因组。所有这些冠状病毒在5'-非翻译区（5'-UTR）都含有一个帽子结构，包括一个转录调节序列（TRS）和一个3'聚腺苷酸（poly(A)）尾巴。整个基因组直接作为mRNA发挥作用，编码开放阅读框（ORFs）ORF1a和ORF1b，然后由病毒NSP3（PL蛋白酶）和NSP5（3CL蛋白酶）处理成各自的非结构蛋白（NSP）。另一方面，结构蛋白由亚基因组RNA（sgRNAs）编码，这些是在合成负义RNA链期间产生的，其中病毒RNA依赖的RNA聚合酶（RdRp）可以在结构蛋白5'端的每个TRS上暂停，然后是RdRp的分离和重新定位到位于5'-UTR的领袖TRS，从而在NSP和部分结构蛋白上创建主要缺失。这创建了一组将转录成结构蛋白的mRNA，包括刺突（S）、包膜（E）、膜（M）和核衣壳（N）蛋白，以及每种冠状病毒特有的辅助蛋白。 在病毒组装期间，N蛋白结合并包裹病毒基因组，形成核糖核蛋白（RNP）复合体，然后突出到含有S、E和M蛋白的内质网-高尔基中间区室（ERGIC）的膜上，形成完整的病毒粒子，通过胞吐作用从宿主细胞释放。S蛋白是最重要的成分，负责病毒的附着、融合和进入宿主。因此，S蛋白是开发针对冠状病毒的疫苗的主要靶标。天然S蛋白本质上是三聚体，每个亚基由两个域组成，称为S1和S2。S1包含一个N端域（NTD）和一个RBD，负责病毒附着到宿主受体。虽然SARS-CoV和SARS-CoV-2的RBD识别存在于肺和小肠上皮细胞中的高密度的人类血管紧张素转换酶2（ACE2），但MERS-CoV通过二肽基肽酶4（DPP4）与其宿主结合，后者在下呼吸道更为丰富。S2另一方面，介导膜融合以允许病毒进入宿主。 大多数疫苗，包括临床试验中的候选疫苗，使用整个刺突（S）蛋白或至少是刺突1（S1）亚基的RBD。RBD，一个由223个氨基酸（a.a.）组成的蛋白质亚基，在SARS-CoV-2感染中发挥直接作用，因为它结合到存在于包括肺和胃肠道上皮细胞在内的大多数人类细胞类型的人类ACE2受体，然后促进病毒进入宿主。因此，针对S1蛋白RBD区域的抗体被证明是有效的中和抗体。 3. 病毒样颗粒的特征 病毒样颗粒（VLPs）是由一个或几个病毒结构蛋白形成的非传染性纳米颗粒，它们在形态上类似于原生病毒，但没有病毒基因材料。VLPs最初是在1968年在患有唐氏综合症、白血病和肝炎的患者的血清中发现的。最早的两个VLPs是从乙型肝炎病毒（HBV）衍生的，并在1980年代中期在大肠杆菌和酿酒酵母中表达。VLP的自组装驱动因素是病毒包膜或衣壳蛋白。VLP主要由静电和疏水力维持在一起，通过其他分子相互作用（如二硫键）进一步增强，形成强大但略有弹性的结构。通常，有两种类型的VLPs，一种只包含病毒衣壳或核衣壳蛋白，另一种包含嵌入在通常来自宿主的脂质膜中的病毒糖蛋白。虽然非包膜VLPs通常包含刚性的衣壳结构，呈二十面体或杆状，但包膜VLPs大致呈球形，没有固定形状，大小范围广泛。VLPs可以根据其结构复杂性进一步细分为不同的组。衣壳蛋白可以排列成三层。单蛋白VLPs具有相对简单的结构，而多蛋白VLPs包含独特的结构组分，如存在几个不同的衣壳层。其他如源自人类免疫缺陷病毒（HIV）-1和流感病毒的VLPs具有包含环绕衣壳结构的病毒表面抗原的脂质包膜。 由于通常有数百个衣壳或糖蛋白副本形成每个VLP，所需的表位可以融合到VLPs上以高密度展示，这可能有助于诱导更强的免疫反应。例如，乙型肝炎病毒核心抗原（HBcAg）VLP是由180（T=3）或240（T=4）个HBcAg衣壳蛋白亚基形成的，并且每个VLP能够展示高达240个外源表位。 3.1.VLP作为疫苗开发平台 迄今为止，已建立了多种平台，以期获得高效且安全概况的疫苗。灭活疫苗是通过化学或热应力处理生产的。与减毒疫苗相比，灭活疫苗的安全性更高。然而，由于灭活处理，它们的免疫原性通常降低。另一方面，蛋白质亚单位疫苗相对安全，能够诱导免疫记忆反应。然而，几乎必须使用佐剂。虽然病毒载体疫苗将编码抗原的基因传递到目标细胞，但由于宿主免疫系统在之前接种期间发展，会迅速清除病毒载体，因此重复使用相同的病毒组分将导致效率降低。此外，对病毒载体疫苗（特别是复制型疫苗）的安全性存在争议。与此同时，mRNA疫苗和DNA疫苗将遗传物质传递到目标细胞，以产生重组病毒抗原，从而诱导特定的免疫反应。尽管mRNA疫苗安全，生产相对快速且成本低廉，但由于RNA不稳定，需要冷链系统。尽管DNA疫苗稳定，但通常效果较差。由于VLP坚固且具有自我佐剂特性，基于VLP的疫苗可能很容易成为针对冠状病毒最有效的疫苗之一。 VLP已被用作乙型肝炎病毒（Engerix®和Recombivax HB®）和人类乳头瘤病毒（Cervarix™和Gardasil®）的疫苗。此外，基于VLP的疫苗，如戊型肝炎病毒（HEV）Hecolin和HBV ABX203（HeberNasvac®）也已获得许可，用于人类预防和治疗戊型肝炎和慢性乙型肝炎。VLP类似于病原体，并包含保守的病原体相关分子模式（PAMPs），这些模式可以被宿主免疫系统迅速识别。通过克隆病毒结构基因并利用原核或真核表达系统来生产VLP。VLP的产生是为了在其表面展示目标病原体的抗原决定簇。基于VLP的疫苗的目标是提高针对展示的抗原的免疫反应，这些抗原可以是肽或整个抗原。 VLP可能对结合的抗原诱导强烈的先天和适应性免疫反应。VLP也可以装载免疫调节剂，如先天免疫系统刺激物，以诱发更有效的免疫反应。因此，它们是理想的抗原载体，比基于整个病原体的疫苗（如活减毒病毒疫苗）更安全。 重组VLP疫苗的构建利用了具有自我组装能力的病毒结构蛋白的核苷酸序列知识，以展示病原体的抗原决定簇。已开发出基于原核细胞、酵母、昆虫细胞、植物和哺乳动物细胞的个体异源蛋白表达系统，这些系统允许在实验室和工业规模上生产携带目标抗原的VLP。已建立具有扩大潜力的高产量VLP生产，并可以支持在大流行环境中使用这些技术。 不同的表达系统各有优缺点。例如，细菌表达系统（如大肠杆菌）在最短时间内以高产量生产非包膜VLP特别有用。然而，它们不适合生产包膜VLP，容易误折叠，且无法进行翻译后修饰（PTM），这对于许多基于真核生物的抗原（如SARS-CoV-2的S蛋白）很重要。另一方面，哺乳动物细胞表达系统可以进行所有PTMs，缺点是成本高且耗时长。因此，已经探索了结合两种表达系统的策略，在其中SARS-CoV-2抗原在哺乳动物细胞中产生，然后与大肠杆菌生产的异源VLP结合。 然而，并非所有基于真核生物的免疫原性表位都需要PTMs。例如，在大肠杆菌上生产的SARS-CoV HRC1 B细胞表位和SARS-CoV-2受体结合基序（RBM）在用于免疫小鼠和兔子时仍能诱导病毒中和抗体。 正如在哺乳动物细胞、酵母、昆虫和植物表达系统中也可以用于生产包膜和非包膜VLP，并具有执行PTMs的能力。然而，这些表达系统通常与人类和哺乳动物细胞不同地糖基化蛋白质。例如，酵母倾向于进行高甘露糖糖基化，而昆虫细胞糖基化含有α1,3-连接的岩藻糖残基，同时缺乏末端唾液酸。无论如何，已进入临床试验的基于酵母、植物和昆虫细胞生产的VLP疫苗候选物表明，糖基化类型可能不会对SARS-CoV-2表位的免疫原性造成不利影响。 到目前为止，已有35个病毒家族的110种病毒蛋白能够组装成VLP。几种基于VLP的疫苗目前正在进行不同的生产和批准阶段。VLP疫苗的优点包括其高特异性、效率和良好的药代动力学特性。以前的研究表明，与其他携带抗原的颗粒混合物相比，VLP能在不到10分钟的时间内到达淋巴结。毫无疑问，基于VLP的疫苗为免疫预防策略的发展提供了新的可能性，包括无注射剂型。无注射疫苗可以通过鼻内或口服途径给药。这对于大规模动物养殖行业尤为重要，因为对大量动物进行注射是非常费力的。 3.2.VLP作为免疫原 病毒衣壳由重复的蛋白质结构组成，可以触发先天免疫，并由B细胞产生中和抗体。树突细胞（DCs）是抗原呈递细胞（APCs）的重要组成部分，它们连接先天和适应性免疫。DCs可以通过巨胞饮和吞噬作用摄取100-500 nm大小的颗粒，如VLPs。DCs通过相同的模式识别受体（PRRs），如Toll样受体（TLRs）和C型凝集素受体（CLRs），与VLPs相互作用。给药后，基于VLP的疫苗被APCs如DCs识别，并运输到次级淋巴组织，如脾脏。DCs对VLPs的识别和摄取促进了DCs的成熟（图1）。这些事件导致产生促炎因子，如TNF-α和IL-1β，以招募更多的APCs，并增加DCs中的溶酶体蛋白水解活性。随后，基于VLP的疫苗被加工成小肽，并作为MHC-肽复合物呈现在DCs表面。同时，B和T细胞通过DC表面存在的淋巴细胞共刺激分子，如CD40、CD80和CD86被激活。MHC II类肽和共刺激蛋白激活CD4+ T辅助细胞，促进B和T细胞的增殖和分化。 图 1 病毒样颗粒（VLPs）诱导的免疫反应。1：VLP与树突细胞（DC）上的模式识别受体（PRRs）发生作用，例如Toll样受体（TLR）。然后DC通过吞噬作用或微囊泡作用吞噬VLP。2：这导致DC成熟，随后分泌促炎细胞因子如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白介素-1β（IL-1β），以招募更多的抗原呈递细胞（APCs），包括DC和巨噬细胞。3：被DC吞噬的VLP随后被酶消化成短肽，这些短肽与主要组织相容性复合体I类（MHC I）和II类（MHC II）结合，并被运输到DC表面。4：在MHC II上展示的短肽，与CD40和CD80/86一起，然后与辅助性T细胞（Th）上的T细胞受体（TCR）、CD40L和CD28相互作用。这促进了Th细胞增殖和分化为1型（Th1）和2型（Th2）Th细胞。5：同样，在DC上的MHC I展示的肽段，与CD40和CD80/86一起，与细胞毒性T淋巴细胞（CTL）上的TCR、CD40L和CD28相互作用。在Th1的帮助下，原始CTL增殖并分化为效应CTL和记忆CTL，分别提供即时和持久的细胞免疫。7：另一方面，原始B细胞通过B细胞受体（BCR）与血液中携带或DC传递的完整VLP相互作用。在Th2的帮助下，B细胞分化为浆细胞，这些细胞积极分泌抗体，以及记忆B细胞，这些细胞提供针对VLP上存在的抗原的持久体液免疫。 基于VLP的疫苗是优秀的候选疫苗，负责刺激细胞和体液免疫。例如，两剂HBcAg-zDIII（寨卡病毒包膜蛋白III域）VLP疫苗可以触发体液和细胞免疫。另一项研究还揭示了猪细小病毒（PPV）基于VLP的疫苗能够激活MHC I和II途径，刺激体液和细胞免疫。此外，还有几份报告称，基于VLP的疫苗可以独立于T辅助细胞刺激抗体产生和细胞毒性T细胞激活。即使没有佐剂，也有报道称基于VLP的疫苗可以诱导体液和细胞免疫，尽管佐剂可以显著增加其免疫原性。 4. 针对冠状病毒的VLP疫苗开发 由于这些传染病的严重性，全世界的科学家一直在不懈地努力开发针对SARS-CoV、MERS-CoV和SARS-CoV-2的疫苗。已报道了多种基于VLP的疫苗候选物（表1）。除了SARS-CoV-2外，大多数报道的研究都处于开发的初步阶段。 表1 针对SARS-CoV、MERS-CoV和SARS-CoV-2的VLP疫苗候选物的初步研究 缩写词：E（包膜蛋白）；HA（血凝素）；hACE2（人类血管紧张素转换酶2）；IAV（流感A病毒）；M（膜蛋白）；M1（基质蛋白1）；N（核衣壳蛋白）；PLGA（聚乳酸-羟基乙酸共聚物）；RBD（受体结合域）；RBM（受体结合基序）；S（刺突蛋白）；VLP（病毒样颗粒）。 4.1. 针对SARS-CoV的VLP疫苗 尽管自2003年7月以来没有报告过爆发，但已发表了有关SARS-CoV基于VLP的候选疫苗的数据。Pimentel等人开发了一种展示来自S蛋白C末端七肽重复序列（HRC1）的重组SARS-CoV B细胞表位的VLP。当将10μg的肽纳米颗粒在没有佐剂的情况下腹腔注射到小鼠体内时，观察到了积极的体液反应。广泛使用杆状病毒-昆虫细胞表达系统或杆状病毒表达载体系统（BEVS）来生产包含S蛋白的SARS-CoV VLP疫苗。含有基质M1佐剂的疫苗（1μg的SARS-CoV S）能够在BALB/c小鼠中诱导中和抗体反应。在另一项研究中，使用BEVS生产了包含SARS-CoV S蛋白和流感M1蛋白的重组SARS-CoV VLP疫苗。在没有佐剂的情况下，肌肉注射或鼻内注射0.8μg的S蛋白的SARS-CoV VLP疫苗能够保护小鼠免受SARS-CoV的致命挑战。观察到4μg的S蛋白剂量能够将肺部病毒滴度降低到不可检测的水平，保护小鼠免于体重减轻，并诱导高水平的抗SARS-CoV中和抗体。 此外，哺乳动物细胞也被选为生产VLP。Lokugamage等人开发了在哺乳动物细胞中传播的VLP作为SARS-CoV疫苗候选物。该研究中由哺乳动物细胞产生的嵌合VLP比使用BEVS生产的SARS-CoV VLP更具免疫原性。嵌合VLP是通过在293 T细胞中共表达SARS-CoV S、E、M和N蛋白以及小鼠冠状病毒（鼠肝炎病毒）产生的。当雌性BALB/c小鼠用1μg的嵌合VLP免疫时，抑制了肺部SARS-CoV的复制。另一项研究中，用BALB/c和C57BL/6小鼠免疫另一种嵌合SARS-CoV VLP（由S、E、M和N组成），以剂量依赖性方式诱导血清中和抗体，使用明矾佐剂进一步增强。VLP处理的SARS-CoV感染肺部的组织学中观察到显著的嗜酸性粒细胞，表明激活了先天和适应性免疫反应。 SARS-NC基因编码N蛋白（46 kDa），负责病毒复制和宿主细胞周期干扰。这种蛋白具有高度免疫原性，已成为设计有效疫苗的靶标。通过透射电子显微镜显示，在CHO细胞中表达的N蛋白自组装成VLP。用N蛋白免疫的小鼠展示了高水平的特异性SARS-CD8+ T细胞反应和抗体滴度，通过联合使用编码N蛋白的重组质粒、编码XIAP的重组质粒和montanide/CpG进一步增强。 4.2. 针对MERS-CoV的VLP疫苗 已开发并评估了多种MERS-CoV VLP疫苗，并在动物中进行了评估。BEVS被用来生产包含S蛋白的MERS-CoV VLP疫苗。与MatrixM™佐剂（基于皂甙的）配制的疫苗能够在BALB/c小鼠中诱导中和抗体反应。随后使用相同疫苗的研究表明，接种10μg的MERS-CoV S纳米颗粒的小鼠产生的抗MERS-CoV S抗体滴度显著高于较低剂量（1和3μg）。 同样，使用BEVS开发了一种包含修饰的MERS-CoV S蛋白（与H5N1的HA531-568融合）和禽流感基质1蛋白（H5N1）的嵌合VLP。在用1μg的嵌合VLP肌肉注射并用100μl的明矾和10μg的CpG佐剂的BALB/c小鼠中检测到显著的S特异性IgG和中和抗体。由S、E和M蛋白组成的MERS-CoV VLP疫苗在猕猴中刺激了IgG产生和病毒中和抗体，滴度高达1:40。同一研究小组评估了一种新的嵌合VLP疫苗，由MERS-CoV S蛋白的RBD和犬细小病毒VP2结构蛋白组成，其中嵌合VLP在小鼠中诱导了针对RBD的特异性体液和细胞免疫反应。 除了BEVS，Kim等人展示了一种使用铁蛋白作为分子支架自组装的新型细菌MERS-CoV抗原VLP。在大肠杆菌中表达了与RNA相互作用域（人类赖氨酸-tRNA合成酶）和细菌铁蛋白融合的MERS-CoV RBD。用该纳米颗粒免疫的小鼠的血清能够在竞争ELISA中抑制MERS RBD与hDPP4受体之间的相互作用。最近，Kato等人构建了包含在蚕幼虫和Bm5细胞系中通过表面活性剂处理和机械挤出生产的MERS-CoV S、E和M蛋白的VLP。与培养细胞相比，蚕幼虫对于重组蛋白生产是有用的，因为它们可以使用简单的人工饲料饲养，具有大规模生产重组蛋白的能力，包括VLPs。 4.3. 针对SARS-CoV-2的VLP疫苗 4.3.1. 初步阶段的SARS-CoV-2 VLP疫苗候选物 当前的COVID-19大流行挑战了国际科学界，在尽可能短的时间内找到针对SARS-CoV-2感染的有效疫苗。Hennrich等人开发了一种针对SARS-CoV-2的两合一安全复制子和VLP mini spike疫苗。在研究中，嵌合mini spike [由来自狂犬病病毒（RABV）糖蛋白的跨膜干序列链接的RBD组成]被纳入到缺乏其天然糖蛋白的囊泡性口腔炎病毒（VSV）构建中（VSVΔG），即VSVΔG-mini spike-eGFP。当与VSV G一起拯救时，mini spike在宿主细胞表面膜上以及分泌的非传染性VLP的包膜上显示了三聚体蛋白的SARS-CoV-2 RBD。含mini spike的VSVΔG不传播，并且能够诱导强烈的免疫反应。单一剂量（1 × 10^6感染颗粒）的VSV复制子疫苗（VSVΔG-mini spike-eGFP），当与VSV G补充时，在转基因K18-hACE2小鼠中刺激了高滴度的SARS-CoV-2中和抗体，这些抗体保护了小鼠免受SARS-CoV-2的挑战。 Tan等人基于在合成VLP平台上展示RBD，使用SpyTag/SpyCatcher技术开发了基于RBD的COVID-19纳米颗粒疫苗候选物，该平台为SpyCatcher003-mi3。在一次加强方案中，低剂量的RBD-SpyVLP能够在小鼠和猪中诱导高水平的针对SARS-CoV-2的中和抗体。这种RBD-SpyVLP还能与恢复期患者的单克隆抗体反应，这些抗体识别了RBD-Spy VLPs上的重要表位。此外，它具有热稳定性，并且可以以冻干形式全球分发。Liu等人基于在大肠杆菌中表达的噬菌体AP205 VLP展示SARS-CoV-2的尖峰RBM构建了疫苗候选物。RBM被融合到由二聚体衣壳蛋白组成的AP205 VLP的C末端。该疫苗能够诱导产生高水平的IgG抗体，这些抗体能够识别真核细胞表达的RBD和S蛋白的SARS-CoV-2。此外，这些抗体能够中和SARS-CoV-2，并且可以大规模生产用于免疫。 Mohsen等人通过将受体结合基序（RBM）遗传融合到黄瓜花叶病毒（CuMVTT）上，构建了COVID-19疫苗候选物。这种马赛克疫苗，即CuMVTT-RBM，在大肠杆菌中产生。每个CuMVTT-RBM VLP大约展示70-90个RBM抗原，对兔子和小鼠具有高度免疫原性，诱导产生的中和抗体能够与其他值得关注的变异体（包括野生型、K417N、E484K、N501Y、K417N/E484K/N501Y和L452R/E484Q）的突变RBD发生交叉反应，其亲和力超过了恢复期人类血清中的抗体。此外，Mohsen等人展示了一个概念验证，其中2升的发酵体积产出了0.5克CuMVTT-RBM，相当于在1000升的发酵中可以产出2500万剂。而且，基于CuMVTT-RBM VLP的疫苗在4摄氏度下储存至少14个月是稳定的。Mohsen等人的研究实际上基于Zha等人的早期研究，其中在真核细胞中生产的RBD而不是RBM，使用琥珀酰亚胺6-（β-马来酰基丙酰胺）己酸酯（SMPH）化学交联到大肠杆菌生产的CuMVTT。在CuMVTT VLPs上高度重复展示的RBD在小鼠中诱导了高水平的RBD特异性中和抗体，这些抗体阻止了SARS-CoV-2与hACE2受体的结合。 Newcastle病病毒样颗粒（NDVLPs）展示了前融合稳定的SARS-CoV-2 S ectodomain（S2P），即S2P-NDVLP，作为疫苗候选物进行了研究。对小鼠进行S2P-NDVLP的主要注射显示出显著更高的中和滴度（几何平均ID50为386），与用可溶性S2P蛋白免疫的小鼠相比（几何平均ID50为17）。在使用2到250微克剂量的S2P-NDVLP进行加强免疫两周后，中和滴度增加到2125-4552。 虽然其他研究使用了S RBD蛋白，Chu等人构建了一种在昆虫细胞中生产的基于流感基质1蛋白的VLP，以展示SARS-CoV-2的完整S、S1或S2。表达完整S和S1的VLP成功地诱导了能够部分抑制RBD与hACE2结合的病毒中和抗体，在替代病毒中和测试中表现出活性。 除了在异源VLPs上展示SARS-CoV-2 S蛋白外，很少有研究报告了生产同时表达病毒S、E和M蛋白的SARS-CoV-2 VLPs。Swann等人在哺乳动物HEK-293 T细胞中共表达S、M和E病毒蛋白，生产了模仿实际病毒的SARS-CoV-2 VLPs。VLPs在环境条件下干燥后保持结构完整性（通过原子力显微镜确认），这可能有利于作为疫苗应用时的运输和储存。另一项由Xu等人报告的研究表明，M和E蛋白的表达对SARS-CoV-2 VLPs的有效形成和释放至关重要。Xu等人在HEK-293 T和Vero E6细胞中表达了S、M、E和N蛋白，其中在Vero E6细胞中产生的VLPs的形态被认为比在HEK-293 T细胞中产生的更稳定和统一，TEM分析显示了大小均匀的VLPs，具有独特的冠状结构，表明SARS-CoV-2包膜上的最佳尖峰三聚体形成。还报告了一个工程化的酿酒酵母平台（D-Crypt™），用于共表达三种蛋白（S、E和M），随后自组装成SARS-CoV-2 VLPs。然而，这些SARS-CoV-2 VLPs的免疫原性尚未报告。 4.3.2. 临床阶段的SARS-CoV-2 VLP疫苗候选物 截至2022年4月，共有153种SARS-CoV-2疫苗候选物正在进行临床开发，196种候选物处于临床前开发阶段。目前正在进行临床评估的疫苗中有六种是基于VLP的（表2）。与SARS-CoV和MERS相比，由于SARS-CoV-2的爆发，SARS-CoV-2基于VLP的疫苗的开发速度更快。疫苗研究和商业开发的进程平均需要10到15年的时间，并且有22%的机会完成临床阶段（临床试验I、II和III期），这需要至少80亿美元的投资。最近的SARS-CoV-2爆发将时间线缩短到12-18个月，这得益于新的公共/私人资金的建立和全球协调计划，以对抗SARS-CoV-2大流行。这些计划包括世界卫生组织的团结疫苗试验、Operation Warp Speed (OWS) 和 Accelerating COVID-19 Therapeutic Interventions and Vaccines (ACTIV) 合作伙伴关系，以及国立卫生研究院 (NIH) 的 Rapid Acceleration of Diagnostics (RADx)。处于人体临床试验中的候选疫苗在I期中接受了安全性、副作用、耐受性、免疫原性和有效剂量的评估。在II期中，将进一步在更多的参与者中研究免疫原性、安全性和有效性。之后，在III期临床试验中，将在数千名个体中评估疫苗的有效性和副作用。迄今为止，已有9种COVID-19疫苗通过了III期试验，并已获得世界卫生组织的全球紧急使用批准。最后阶段，IV期试验将在获得国家监管机构批准后进行。药物警戒将涉及在更广泛的人群中长期进一步监测疫苗。 COVIVAXX是一种结合的SpyCatcher::VLP疫苗，该疫苗利用SpyBiotech的专利SpyCatcher/SpyTag超级胶蛋白技术，在乙型肝炎表面抗原（HBsAg）VLPs表面呈现SARS-CoV-2的RBD。该疫苗针对SARS-CoV-2 S蛋白的RBD，该蛋白与SpyTag肽融合。SpyCatcher/SpyTag技术已广泛用于疫苗开发，允许通过特定方向/表位呈现的不可逆共价键在VLPs上高密度展示抗原。由于HBsAg VLP是一种已获得许可的疫苗，在人类中已证明具有高度的免疫原性和安全性，它可以作为一个非常吸引人的通用即插即用载体，用于任何感兴趣的抗原，如疟疾。疫苗中的HBsAg-SpyCatcher组分在Hansenula polymorpha中生产，RBD-SpyTag组分在Pichia pastoris中生产。该疫苗可以大规模生产。在动物中，报告了100%的血清转换，并检测到针对S蛋白RBD的高抗体滴度。目前，澳大利亚正在进行I/II期试验（ACTRN12620000817943; ACTRN12620001308987）。非临床研究表明，对HBsAg的预先存在的免疫不会影响VLPs的免疫原性。COVIVAXX疫苗只需要正常的冷藏温度2到8摄氏度。I期临床研究是随机的、安慰剂对照的，涉及18-45岁的健康成年人。评估了接种5和25微克疫苗/安慰剂后的安全性和免疫原性结果。这之后是II期研究，涉及另一组18-79岁的健康参与者，比较了接种5或25微克疫苗的安全性和免疫原性结果，疫苗在28天间隔内接种，与安慰剂进行了比较。临床研究共招募了280名参与者。预计将在印度和欧洲进行III期试验。 表2 针对SARS-CoV-2的临床试验中的VLP疫苗 来源：改编自WHO. 缩写词：E（包膜蛋白）；IM（肌肉注射）；M（膜蛋白）；N（核衣壳蛋白）；RBD（受体结合域）；S（刺突蛋白）；SC（皮下注射）；VLP（病毒样颗粒）。 另一种潜在的SARS-CoV-2基于VLP的疫苗是Medicago的CoVLP，在澳大利亚杂草Nicotiana benthamiana中生产。植物的疫苗短暂生产是一种快速、可扩展且有效的技术，用于应对由流感病毒或SARS-CoV-2引起的大流行。CoVLP疫苗包含自组装的VLPs，由稳定前融合S蛋白的三聚体组成，在VLP表面形成，与ASO3和CpG佐剂配方。从II期临床试验中获得了CoVLP SARS-CoV-2的安全性和免疫原性数据。在II期临床研究中，疫苗作为两次肌肉注射，相隔21天，以三种不同剂量（3.75、7.5或15微克），单独或与AS03或CpG1018佐剂一起给予。在接种第二剂佐剂CoVLP SARS-CoV-2 21天后，检测到细胞（IFNγ和IL-4）和体液（抗S IgG和中和抗体）反应。研究还揭示了与从COVID-19感染中恢复的受试者血清相比，AS03佐剂疫苗（3.75微克）诱导了10倍更高的中和抗体滴度。没有报告严重不良事件，并且反应原性通常轻度至中度，持续时间短暂。CoVLP SARS-CoV-2目前在III期临床试验（NCT04636697）中，该试验在北美、拉丁美洲和欧洲招募了30,918名参与者。 另一个基于植物的疫苗候选物KBP-201由英美烟草公司（BAT）生产，目前正在进行I/II期临床试验（NCT04473690）。尽管KBP-201由RBD和改良烟草花叶病毒（TMV）的化学结合形成的嵌合VLP（cVLP）组成，但该疫苗候选物被归类为蛋白质亚单位而不是基于VLP的疫苗。 VBI Vaccines Inc.已加入国家研究委员会的SARS-CoV-2疫苗开发计划。使用基于小鼠白血病病毒（MLV）的包膜病毒样颗粒（eVLPs）生产SARS-CoV-2疫苗候选物，VBI-2900由两种疫苗组成：VBI-2901和VBI-2902。VBI-2901是一种三价泛冠状病毒疫苗，表达SARS-CoV-2、SARS-CoV和MERS-CoV S蛋白，而VBI-2902是一种单价疫苗，表达SARS-CoV-2 S蛋白的前融合稳定形式。临床前数据显示了eVLPs在小鼠中高抗原表达效力。包含与VSV-G的跨膜细胞质末端域融合的SARS-CoV-2 S的外细胞域的修饰S蛋白，使MLV-Gag eVLPs上的S表达产量和密度高。与Alum磷酸盐佐剂单剂量eVLPs（VBI-2902a）相比，SARS-CoV-2患者的中和抗体反应水平高。数据还揭示了VBI-2902a在仓鼠挑战模型中安全且高效。VBI-2902a正在进行持续的临床评估，作为针对SARS-CoV-2的单剂量疫苗，与VBI-2905a一起。VBI-2902a的I/II期研究（NCT04773665）于2021年3月启动，是随机的、观察者盲的、安慰剂对照的。该研究评估了VBI-2902a的安全性、耐受性和免疫原性，剂量为1和2剂量（28天间隔）方案，每剂量5微克S蛋白，与安慰剂相比。最初的I期阶段已招募61名健康、未接种疫苗的成年人，年龄在18-54岁之间。所获得的数据显示5微克VBI-2902a耐受性良好，并在所有受试者中诱导了强大的免疫反应，水平高于恢复期患者血清中观察到的水平。此外，没有与疫苗相关的安全问题。 ABNCoV2是另一种经过临床测试的SARS-CoV-2基于VLP的疫苗，由Bavarian Nordic开发。ABNCoV2是通过结合独特的果蝇S2昆虫细胞蛋白生产（ExpreS2）和AdaptVac生产的专有衣壳VLP（cVLP）在大肠杆菌中生产。在果蝇细胞Drosophila melanogaster中生产的RBD抗原在大肠杆菌中生产的Acinetobacter phage AP205衣壳样颗粒上展示，通过分裂蛋白Tag/Catcher确保RBD抗原的单向和高密度展示。临床前数据显示，ABNCoV2在小鼠模型中高度免疫原性，其中ABNCoV2疫苗的单次注射在小鼠中诱发的病毒中和抗体滴度与SARS-CoV-2恢复期患者中发现的相似。当进一步增强加强剂量时，病毒中和滴度可以上升到1:10,000以上。I期临床试验（NCT04839146）评估了ABNCoV2两剂量（剂量范围从6到70微克）的安全性和耐受性，有和没有MF59佐剂在健康成年志愿者中单中心、开放标签试验中。来自人体试验的初步数据已确认其诱导强烈和广谱抗体水平的能力，优于目前批准的疫苗，同时还提供了有利的安全性概况。值得强调的是，数据证实了ABNCoV2疫苗触发针对SARS-CoV2的几个变体的中和抗体的产生，包括武汉、阿尔法、贝塔和德尔塔变体。最近，II期临床试验（NCT05077267）已开始招募参与者，以评估ABNCoV2疫苗（剂量为100微克）在血清阴性和血清阳性参与者中的安全性、耐受性和免疫原性。 虽然大多数临床试验中的基于VLP的疫苗基于SARS-CoV-2的RBD或S蛋白，但土耳其科学技术研究委员会开发了一种包含病毒的M、N、E和HexaPro S抗原的VLP疫苗，用K-3CpG ODN佐剂。疫苗的给药途径与其他临床测试的VLP疫苗不同，这种SARS-CoV-2疫苗是皮下注射的。SARS-CoV-2疫苗的I期试验（NCT04818281）设计为双盲、随机、安慰剂对照，并涉及两种不同剂量（10和40微克）。另一方面，II期试验（NCT04962893）招募了330名18至59岁的成年人，他们健康或患有医学上稳定的慢性疾病。受试者以1:1:1的比例分为两组，接受两剂VLP疫苗用于武汉（40微克）或VLP疫苗用于武汉+阿尔法变体（40微克）或VLP疫苗用于阿尔法（英国）变体（40微克），免疫间隔21天。 最近加入到临床试验中的疫苗候选物是烟台帕特柔斯生物技术公司开发的LYB001，它包括在氢氧化铝配方中展示的RBD的VLP载体。5 LYB001被设计为三剂疫苗，将进行随机、双盲、安慰剂对照的I期（NCT05125926）和II/III期（NCT05137444）临床试验。I期临床试验预计将涉及100名18-59岁的成年参与者，以评估LYB001在高剂量（50微克）下的安全性、反应原性和免疫原性概况，前提是在低剂量（25微克）下有良好的7天安全性和反应原性概况。II/III期试验预计将招募1900名成年参与者进行免疫原性和安全性测试，其中III期试验将开放标签进行扩展的安全性评估，这将在所有参与者接种第三剂疫苗后的360天安全性观察完成后进行。 4.3.3. 临床前阶段的SARS-CoV-2 VLP疫苗候选物 目前有18种基于VLP的COVID-19疫苗候选物处于临床前阶段（表3）。ContiVir，来自马克斯普朗克研究所的分拆公司，已经生产了一种冠状病毒VLP疫苗候选物。冠状病毒VLP是使用ContiVir的创新技术生产的，这些技术利用完全连续的管状生物反应器高效生产VLP，并使用基于尺寸的捕获色谱步骤，称为体积排除色谱（SXC），用于纯化冠状病毒VLP。IrsiCaixa艾滋病研究所、巴塞罗那超级计算中心（BSC）和动物健康研究中心（IRTA-CReSA）启动了一个项目，专注于开发SARS-CoV-2疫苗，将SARS-CoV-2 S蛋白展示在HIV的VLP上。另一个由Navarrabiomed进行的临床前项目使用了人类和杆状病毒表达系统，通过SARS-CoV-2 S、M和E蛋白的组成性表达分泌VLP。此外，他们还使用非复制性慢病毒假型S蛋白表达其余的结构蛋白。BIRB796也被纳入疫苗配方作为佐剂，以增强T细胞反应。同样，坦佩雷大学使用了展示重组S蛋白的杆状病毒载体。Saiba GmbH开发了一种潜在的疫苗，使用了专利的CuMVTT技术展示RBD，其中高度重复的RBD附着在CuMVTT上，显著提高了能够中和SARS-CoV-2的抗体。尽管是最早的SARS-CoV-2基于VLP的疫苗候选物之一，但由于缺乏资金，该疫苗候选物未能进入临床试验，这导致他们转而开发在安全性、效率、稳定性、成本效益和便携性方面更好的“第二代”疫苗。 表3 针对SARS-CoV-2的临床前VLP疫苗 来源：改编自WHO. 缩写词：CMV（巨细胞病毒）；E（包膜蛋白）；GBM（胶质母细胞瘤）；HIV（人类免疫缺陷病毒）；M（膜蛋白）；N（核衣壳蛋白）；RBD（受体结合域）；RCB（参考细胞库）；S（刺突蛋白）；VLP（病毒样颗粒）。 同时，伯尔尼生物技术公司和瑞士生物技术中心正在合作开发一种基于RBD VLP的COVID-19疫苗，该疫苗从人类细胞系平台表达，已在体内模型中显示出令人印象深刻的效力。亚利桑那州立大学的研究人员还开发了至少两种VLP疫苗平台：M20-234 L，其中使用粘液瘤病毒表达所有四个主要结构蛋白的部分：S、M、E和N；以及包含这些蛋白的质粒驱动的VLP生产。Imophoron与布里斯托大学合作生产的另一种潜在的基于VLP的疫苗候选物基于ADDomer™多表位展示系统，使用能够形成十二面体VLP的腺病毒的五边形基蛋白展示SARS-CoV-2的S蛋白， 具有热稳定性特性，不需要冷链储存。 几乎所有的疫苗都使用冠状病毒株特异性的S表面抗原。OSIVAX与3P生物制药公司合作，使用OSIVAX的oligoDOM®技术开发基于VLP的疫苗（OVX313），基于一种新型专有的自组装蛋白序列，带有带正电荷的尾部，展示SARS-CoV-2的高度保守的N蛋白，这可以触发强大的B细胞和T细胞免疫反应。OSIVAX旨在开发一种广谱冠状病毒疫苗，OVX-CoV，能够针对SARS-CoV和SARS-CoV-2。同时，另一种针对DCs的基于SARS-CoV-2 S蛋白的VLP疫苗正在曼尼托巴大学开发，其中Delta变体的假型VLP（PVLP）在人类巨噬细胞和DCs中诱导了更高水平的TNF-α、IL-1β和IL-6。ARTES Biotechnology已经开始基于其技术平台开发SARS-CoV-2疫苗候选物：SplitCore和METAVAX®。SplitCore使用分裂的HBcAg VLPs（cVLPs）作为抗原展示载体，展示SARS-CoV-2的S和N蛋白，而METAVAX使用基于H. polymorpha生产的鸭肝炎B小表面抗原的eVLPs在其N和C末端展示S和N蛋白。虽然VBI-2902a和VBI-2905a正在进行I/II期临床试验，但另一种eVLP疫苗候选物，VBI Vaccines Inc.的VBI-2901，表达SARS-CoV-2、SARS-CoV和MERS-CoV的S蛋白，仍处于临床前阶段。来自设拉子大学的Ghorbani等人使用计算方法鉴定表位，以构建针对SARS-CoV-2的理想疫苗候选物在植物衍生的VLPs中。然而，实际的生物学研究尚未报告或公开。除了上述提到的，根据世界卫生组织发布的COVID-19疫苗追踪器和格局，还有三个基于VLP的疫苗候选物目前处于临床前阶段，分别来自Mahidol University、Doherty Institute、圣保罗大学和ExcepGen。但是，这些项目的细节尚未向公众发布。 5.结论 尽管VLP作为疫苗平台具有优势，但与蛋白质亚单位、病毒载体、DNA、RNA和灭活病毒疫苗相比，它没有受到太多关注。基于VLP的疫苗已被证明对HBV（Engerix®、Recombivax HB®和HeberNasvac®）、HEV（Hecolin）和人类乳头瘤病毒（Cervarix™和Gardasil®）有效。在六种处于临床阶段的基于VLP的疫苗中，只有CoVLP Medicago已进入III期试验，并预计将于2022年4月完成。由于VLP具有高度免疫原性、自我佐剂性和多功能性，如果加大开发力度，基于VLP的疫苗可能很容易成为对抗冠状病毒最有效的疫苗之一。 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。