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摘要：蛋白质的足量生产对其研究或作为生物治疗剂的使用至关重要。大肠杆菌是重组蛋白生产的优选宿主，因为它生长迅速、易于操作且成本效益高。因此，其蛋白质生产能力正在不断改进。此外，相关的工具（如质粒和培养条件）也是正在进行的研究课题，以优化产品产量。在这项工作中，我们回顾了大肠杆菌中重组蛋白生产的最近进展。 1.引言  蛋白质的研究或在生物技术应用中的使用通常需要将其从其他细胞组分中分离出来。可以从蛋白质的天然来源进行纯化；然而，这种方法通常对于大多数蛋白质来说既繁琐又效率低下。感兴趣的蛋白质的编码序列可以插入到适当的表达载体中，并转化到原核宿主中，例如细菌大肠杆菌。利用大肠杆菌作为微生物细胞工厂生产重组蛋白可以降低生产成本并提高产量。如今，许多商业感兴趣的蛋白质都是在大肠杆菌中生产的。在实验室中，大肠杆菌中的重组蛋白生产是进行其结构和功能研究的首选方法。 从基因克隆到蛋白质纯化，过程中所有步骤所需的细胞和分子工具都是广泛可获取的，并且有许多选择。然而，由于蛋白质对宿主的毒性或在包涵体中聚集，未能获得功能性重组蛋白的情况并不少见。这就是为什么对优化大肠杆菌中重组蛋白生产的新方法持续感兴趣的原因。许多综述已经详细涵盖了该主题的不同方面。在这篇综述中，我们涵盖了过去5年在宿主工程、表达载体设计和培养条件方面的进展。新开发的工具在该领域显示出巨大的前景，我们期望它们能迅速在科学界传播。最后，对于那些即将进入异源蛋白表达的迷人世界的人，我们建议不仅要阅读这篇综述，还要参考我们之前的综述，因为两者是互补的。 2.BL21(DE3)菌株：向王者致敬 在20世纪最后几十年发生的生物技术革命中，不同的大肠杆菌系被测试了它们在重组蛋白生产方面的特性。B系因其显著特点而胜出。一个衍生品，BL21(DE3)，已成为重组蛋白生产的优选宿主。B系菌株的基因组测序帮助我们理解了异源蛋白合成的有用表型的分子基础。 3.快速细胞生长和非运动性 在丰富的培养基中，常见的大肠杆菌菌株的翻倍时间约为20分钟。在最小培养基中生长时间的差异更为明显：B细胞通常比其他系（如克隆菌株K-12及其衍生品）生长得更快。许多研究人员重新发现B细胞是非运动性的：当培养容器被放置在实验台上时，B细胞会沉到底部，而克隆菌株的培养物保持浑浊。由于fli基因（用于鞭毛蛋白生物合成的必需基因）的大段缺失，B细胞没有鞭毛。一些作者提出，这在一定程度上解释了B细胞的快速细胞生长，因为鞭毛的生物合成和组装是一个能量密集型的过程。 减少乙酸产生 与K-12相比，大肠杆菌B在以葡萄糖作为唯一碳源培养时产生的乙酸较少。培养基的pH值通常在7.0左右，因此乙酸与乙酸处于平衡状态，后者又扩散到细胞内，改变内部pH控制并损害细胞活性。此外，在培养过程中，酸的产生进一步降低pH值，导致更多的乙酸积累。与此一致，Wang等人表明，在pH 7.5-8.5下培养可以降低乙酸压力，从而改善重组蛋白的生产。 4.蛋白酶缺陷 任何给定蛋白质的积累是其生物合成和降解之间的微妙平衡。大肠杆菌B中关键蛋白酶系统的缺陷可以在某些情况下延长重组蛋白的寿命。lon基因启动子中的IS186插入消除了这种主要蛋白酶。外膜蛋白酶OmpT基因的缺失可以导致在纯化期间的蛋白水解减少，因为细胞破裂会导致这种蛋白酶的大量释放。 5.卓越的分泌能力 在某些情况下，外源蛋白的分泌比在细胞质中的生产产生更好的结果。B细胞分泌的蛋白质比其他实验室菌株多，部分原因是存在第二个T2S分泌系统。 上述特点使B系在重组蛋白生产方面成为首选。一个重大突破是Studier和Moffat生成了衍生品BL21(DE3)。BL21(DE3)菌株携带一个受lacUV5启动子控制的噬菌体T7 RNA聚合酶（T7RNAP）的副本。感兴趣的基因在表达质粒中受T7启动子的控制，一旦加入诱导剂异丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG），就开始蛋白质生产。该系统为用户提供了完全控制诱导蛋白合成的高选择性和活性。所有这些属性确立了BL21(DE3)作为优选宿主的地位。其基因组已被测序并最近整理（GenBank条目CP001509.3）。后来的衍生品改善了大肠杆菌生产外源蛋白的其他方面，如稀有密码子的使用和二硫键的形成。然而，基于T7RNAP及其启动子的系统自创建以来几乎保持不变。 6.菌株工程的进展 如上所述，BL21(DE3)及其衍生品的菌株工程已经推进了大肠杆菌作为细胞工厂的能力（表I）。通过两种不同的方法可以进行基因组操作以最大化异源蛋白生产：假设驱动和发现驱动。假设驱动策略旨在操作已知途径或过程的分子组分，并直接解决妨碍蛋白质生产的问题是。在发现驱动策略中，细胞被突变，然后筛选或选择以增加蛋白质生产。 表1. 常用于重组蛋白生产的大肠杆菌菌株 7.假设驱动的菌株设计 像BL21(DE3) pLysS（用于控制基础表达）、CodonPlus或Rosetta（用于密码子偏差校正）、Origami、SHuffle或CyDisCo（用于正确的二硫键形成）、Tuner或Lemo21（用于可调诱导）等流行菌株，都是使用这种方法合理构建的。在过去的5年中，描述了几个菌株，它们利用已知的分子系统来增强蛋白质生产。例如，通过Tat分泌途径的蛋白质分泌允许完全折叠的蛋白质（与TorA信号肽融合）以高达150 kDa的分子量进行出口。这个系统可以是Sec途径的极好替代品；然而，它的低丰度可能导致产量低下。Browning等人通过将强诱导型启动子ptac置于染色体tatABCD操纵子的上游，对BL21进行了工程改造。由此产生的菌株，被称为TatExpress BL21，被证明可以分泌30 mg L−1的重组人生长激素到周质中。 另一个最近的发展是更严格的控制基础表达和通过双转录-翻译控制辅助的核糖开关来调节蛋白质生产。对于极其有毒的蛋白质，泄漏表达可能导致细胞死亡。BL21(DE3) pLysS菌株包含一个质粒（pLysS），其中含有T7溶菌酶基因，这是一种天然的T7RNAP抑制剂。19这提供了一种有效的机制，以抑制在没有诱导剂的情况下合成的少量T7RNAP，这是由于lacUV5启动子的随机转录。然而，即使有了这种更严格的控制，泄漏表达仍然已知会发生。此外，IPTG是一种强大的基因表达诱导剂。微调其浓度以减少有毒基因产物的表达是一项繁重的任务。在这种情况下，允许轻松和可预测地优化诱导剂浓度的可调系统是非常理想的。Dixon实验室设计了RiboTite系统，包括BL21(IL3)菌株（或最近的BL21[LV2]菌株20）和pETORS质粒。BL21(IL3)拥有与BL21(DE3)中非常相似的T7RNAP基因配置。然而，一个正交的核糖开关序列包含在T7RNAP基因的50非翻译区，以及在pETORS表达质粒中克隆的感兴趣基因之前。核糖开关是信使RNA中的一段，它折叠成复杂的结构，通过干扰翻译来阻止基因表达。效应分子的结合诱导构象变化，允许转录后调节表达。在RiboTite中，核糖开关是工程化的来自Vibrio vulnificus的腺嘌呤感应add A-核糖开关的修改版本，以结合效应分子吡啶吡啶-2,4-二胺（PPDA）。因此，只有在IPTG和PPDA都存在的情况下，外源编码序列的表达才能发生，这有效地将泄漏表达降低到几乎无法检测的水平。此外，可以通过调节PPDA浓度来调节重组蛋白的数量。 重组蛋白生产中的密码子偏差问题可以通过补充额外的罕见tRNA编码基因的副本来解决。这些额外的副本被包括在pRIL和pRARE质粒中，分别导致了BL21(DE3) CodonPlus和Rosetta菌株。有趣的是，Lipinszki等人将六种最不丰富的tRNA物种整合到大肠杆菌BL21(DE3)染色体的核糖体操纵子中。这样，罕见tRNA的表达与翻译能力的实际需求相结合。此外，避免了第二质粒的负担及其相应的选择抗生素的补充。由此产生的菌株，命名为SixPack，在重组蛋白生产中的表现超过了（或与）BL21(DE3)和Rosetta2(DE3)。 蛋白质的共表达需要将相应的基因克隆到兼容的质粒中。或者，Novagen的Duet系列质粒允许在同一个质粒中，在不同的T7启动子下克隆两个编码序列。使用兼容的Duet质粒可以共表达多达八种蛋白质。然而，蛋白质水平的化学计量控制几乎是不可能的。在Duet系统中，所有编码序列都受到同一启动子的影响，如果需要为异源代谢途径的组分水平进行微调以获得最佳产量，这可能是一个问题。在一项结合了遗传工程、合理设计和定向进化的令人印象深刻的工作中，Meyer等人创建了Marionette菌株。这些细胞系（在MG1655、DH10B和BL21背景下可用），12个不同的遗传调节因子基因被插入到基因组中。所选择的转录因子通过结合（正调节因子）或脱离（负调节因子）它们的同源启动子来控制基因表达，并对添加到培养基中的化学诱导剂做出反应。从理论上讲，可以克隆多达12个感兴趣的基因（作者测试了一个五酶番茄红素生物合成途径），每个编码序列在传感器阵列的不同诱导启动子的控制下。通过这种方式，每种重组蛋白的水平都可以通过添加适当的诱导剂来随意操纵，具有很少的交叉反应、高特异性、低泄漏性和广阔的动态范围。 8.发现驱动的菌株选择和筛选 在发现驱动的方法中，使用化学剂或转座子进行突变、定向进化方法或在强选择压力下的自发突变来改变细菌基因组。然后，进行选择和筛选试验，以挑选显示比野生型更好的蛋白质生产的菌株。在这种策略中，不需要事先了解阻碍蛋白质生产的机制的知识。 发现驱动的方法适用于优化有毒蛋白质的合成。例如，表达有毒重组蛋白会导致细胞死亡或生长不良。因此，IPTG耐药菌落的生长可能表明该菌株的基因组修饰允许表达有问题的蛋白质。流行的C41(DE3)和C43(DE3)菌株就是这样分离出来的。由于原始BL21(DE3)菌株中T7RNAP基因的lacUV5启动子与lac操纵子的lac启动子发生同源重组，导致启动子变弱（placWeak），因此可以容忍蛋白质生产。因此，与BL21(DE3)相比，T7RNAP水平降低，然后可以获得亚致死量的重组蛋白。 如果使用额外的强选择或筛选方法，这个过程将大大便利，最重要的是在蛋白质表达不会导致生长障碍的情况下。例如，重组蛋白可以与抗生素选择标记或荧光蛋白融合。背后的假设是，如果标记蛋白是功能性的，那么异源蛋白也必须正确折叠。尽管可以找到一些例子，但遗憾的是，通常没有对分离出的高产菌株中的突变进行表征。此外，成功的结果有时可能是蛋白质依赖的，即当测试其他蛋白质（即使是同源物）的生产时，分离出的菌株可能无法产生显著的数量。 这限制了分离菌株的适用性，并解释了为什么除了C41(DE3)和C43(DE3)之外，在B线中使用诱变方法没有在菌株分离方面取得具有更优越表达能力的菌株的重大进展。重要的是，de Gier实验室报告了E. coli膜蛋白生产菌株Mutant56(DE3)的分离和表征，该菌株比C41(DE3)和C43(DE3)显示出更好的膜蛋白产量。在这个菌株中，允许更好蛋白质生产的突变改变了T7RNAP中的一个氨基酸，削弱了它与T7启动子的结合。 9.质粒设计的进步 通常将感兴趣的蛋白质的编码序列克隆到表达质粒中。质粒至少必须包含一个启动子和一个翻译起始区域，以指导编码序列的表达，一个可筛选标记，以及复制元件。此外，载体可能包含其他遗传元素以便于检测、纯化或溶解蛋白质，如编码亲和标签和融合伙伴的序列。在过去几年中，所有这些特性都有许多进步，稍后将进行描述。 10.启动子和翻译起始区域 启动子通过调节异源基因表达的两个关键方面来影响蛋白质产量：诱导前的抑制严格性（低严格性导致高水平的泄漏表达）和诱导后添加诱导剂的转录速率。一个“理想”的启动子在基础表达时不应该允许表达，并应在诱导后允许大量信使RNA的合成（“强”启动子）。此外，通过调整诱导剂浓度来操纵RNA水平（可调性）是另一个理想特性。 正如已经解释的，T7启动子是最广泛用于重组蛋白生产的。它存在于pET系列载体中，可能是已知最强的启动子之一。然而，当使用BL21(DE3)/pET载体系统时，重组蛋白的水平很难操纵，因为IPTG即使在非常低的浓度下也是一个有效的诱导剂。因此，其他选择，如可调的araBAD启动子可能更适合。用于重组蛋白生产的启动子列表很长，包括10多个不同的选项，用户可以选择强/弱、可调/组成型或化学诱导/热诱导启动子。 最近几年，已经开发了用于确定给定蛋白质编码序列的最佳启动子的工具。Yang等人设计了一套载体系列，用于筛选10个IPTG诱导启动子（T7、A3、lpp、tac、pac、Sp6、lac、npr、trc和syn）。这些启动子包含在带有PLICing位置的质粒中，这样之前用硫代磷酸酯引物扩增的目标可以一步克隆到10个载体中，而不需要使用限制酶。类似地，Cheng等人设计了一种快速启动子替换方法，称为ReToAd（“退一步，进两步”）。七个启动子通过全质粒扩增和Touchdown聚合酶链反应（PCR）在单个反应中克隆到载体的特定区域。然后，筛选菌落以优化蛋白质生产。PLICable启动子和ReToAd是选择任何给定蛋白质的最佳启动子的有趣方法。毫无疑问，它们的传播和包含其他启动子是必要的。值得注意的是，Anilionyte等人发现PthrC启动子的变体通过生长阶段转换自我诱导（特别是，当培养物达到大约0.5的光密度时，这是用于添加诱导剂的常用值）。在表达载体中使用PthrC衍生启动子消除了监测细胞密度和手动诱导的需要，这在高通量试验中生产蛋白质时将是有用的。 翻译起始区域包含一个Shine-Dalgarno序列和到起始密码子的连接区域。这些序列在表达载体中被优化以生产蛋白质。然而，由于克隆程序，启动子和感兴趣的基因的起始点之间可能会产生新的次优序列（“克隆疤痕”）。Mirzadeh等人提出了一种基于PCR的方法来生成载体-编码序列连接的库。 简而言之，通过使用简并引物进行PCR，克隆疤痕序列以所有可能的组合进行改变。将库转化到大肠杆菌中，并通过细胞分选筛选蛋白质产量，因为感兴趣的编码序列被融合到绿色荧光蛋白（或者最近，通过翻译连接编码序列到抗生素抗性基因）。作者报告了低表达和高表达载体之间有1000倍的差异，这突出了优化翻译起始区域的重要性。然而，新的无限制克隆方法越来越受欢迎，允许克隆基因而不产生克隆疤痕。 11.选择标记 质粒的维持通过包含选择标记来确保。在筛选压力下，只有含有质粒的细胞才能存活。在蛋白质过表达菌株中，异源蛋白的积累会导致代谢负担，不产生蛋白的细胞最终会占据培养物，导致产量随时间下降。通常，质粒包含赋予抗生素抗性的基因。向培养基中补充抗生素简单、成本效益高、方便，是实验室规模蛋白质合成迄今为止最常用的策略。然而，在更大规模上，由于其相关成本、环境污染和监管限制，使用抗生素并不受欢迎。在开发无抗生素选择系统方面取得了很大进展，最重要的是在质粒成瘾和营养原自养领域。最近，Ali等人设计了包含编码来自Vibrio cholerae的烯醇酰基载体蛋白还原酶（fabV）的基因的表达载体，该基因赋予对三氯生（一种非抗生素生物杀真菌剂多氯苯氧酚）的抗性。与携带相同表达质粒的细胞相比，蛋白产量水平相同，该质粒包含用于筛选的β-内酰胺酶基因。此外，还描述了构建增加稳定性的高拷贝数表达质粒。Primelles Eguia等人使用par位点，这是一个顺式作用位点，允许稳定的质粒遗传，以确保保留质粒pARKanI。在诱导8小时后，在没有抗生素的情况下，几乎所有细胞都维持了载体。相比之下，如果携带商业pET28载体的细胞在没有抗生素的情况下生长，只有5%保留质粒。 前面提到系统选择含有质粒的细胞，但它们不选择蛋白质过表达细胞。即使细胞含有表达载体，蛋白质产量也可能随时间减少，由于累积的突变和移动序列的插入到感兴趣的编码序列中。Rubjberg等人报告了一种非常有趣的方法，奖励过表达细胞。该系统依赖于对生产甲羟戊酸的产品成瘾，因此只有过表达细胞才能存活。通过将两个非条件必需基因置于甲羟戊酸产生大肠杆菌菌株的pBAD启动子的控制下，然后提供工程化的甲羟戊酸响应AraC变体，使细胞变得对产品成瘾。得到的菌株在95代以上显示出高产和稳定的甲羟戊酸生产。另一个优点是该系统不依赖于外部输入，即培养基的补充。该系统适用于这种特殊情况（甲羟戊酸生产），但这种策略和其他依赖于类似原则的策略为未来的进展铺平了道路。 12.亲和标签和融合伙伴 在大肠杆菌中过表达感兴趣的蛋白质只是过程中的第一步。随后的目标包括检测和纯化蛋白质以达到均质性（至少通过变性条件下的凝胶电泳判断为>95%纯度）。将感兴趣的蛋白质与亲和标签和融合伙伴融合显著促进了下游处理。市面上有许多标签的商业抗体（例如，抗His标签、抗FLAG、抗StrepII标签等），允许通过西方印迹轻松检测标记蛋白。此外，标签可以在固定在树脂上时与其相应的底物或辅因子结合，从而允许通过亲和色谱进行蛋白纯化。此外，一些融合伙伴具有增强溶解性的特性，可以增加可溶蛋白的产量。典型的例子包括谷胱甘肽S-转移酶（GST）、麦芽糖结合蛋白（MBP）和小泛素样修饰蛋白（SUMO）家族的成员。选择众多选项中的一种并不简单，因为融合标签在一种情况下可能有效，在另一种情况下可能无效。为了在不同的融合伙伴中轻松筛选，Correa等人设计了一套T7载体系列（基于pET32质粒），包括六种具有增强溶解性的带组氨酸标签的蛋白质。通过无限制克隆使用所有载体的一对引物来实现感兴趣的编码序列的克隆。 在过去5年中，有许多报告描述了新的融合伙伴和亲和标签，包括深入的综述。在小肽标签领域，Ojima-Kato等人报告说，在初始N-末端甲硫氨酸密码子后添加编码丝氨酸-赖氨酸-异亮氨酸-赖氨酸（SKIK标签）的序列显著改善了重组蛋白的表达。Nguyen等人设计了NT-11标签，源自杜氏藻中重复的碳酸酐酶的前11个氨基酸残基。NT-11标签增强了所有测试蛋白的可溶性生产，这些蛋白也带有His标签。在更高分子量的融合标签方面，Kumar实验室设计了一个34个氨基酸的肝素结合亲和标签（HB标签）。HB标签蛋白可以使用肝素琼脂糖树脂在天然或变性条件下纯化。标记蛋白可以通过简单的NaCl梯度洗脱。Han等人使用来自Pyrococcus furiosus的截短麦芽三糖结合蛋白（MBP-Pyr）作为增强溶解性的标签。他们还包括了一个修改后的组氨酸标签，由插入的组氨酸和谷氨酸残基组成（HE标签）。MBP-Pyr与广泛使用的MBP标签密切相关。然而，与His标签的MBP(Pyr)融合蛋白相比，实现了HE-MBP(Pyr)融合蛋白的更高表达和溶解性。Zarate实验室使用小（<10 kDa）的金属结合蛋白作为融合标签（SmbP和CusF），它们具有双重功能，即作为溶解性增强剂和与固定金属离子的树脂结合。 尽管异源蛋白在包涵体（IBs）中聚集通常不受欢迎，但对IBs的支持有所增加。IB形成允许高产品产量和纯度，以及在变性条件下生产有毒蛋白。在某些情况下，这种策略可能是生产重组蛋白的唯一选择。在那个场合，Jong等人发现，来自大肠杆菌的TorA蛋白的39个氨基酸信号序列（ssTorA）促进了IBs的形成，甚至是高度可溶的蛋白，如硫氧还蛋白和MBP。ssTorA标签是一个有趣的工具，用于在其他策略失败的情况下生产蛋白质，甚至可能成为特定情况下的首选。 13.培养条件和生长监测 改变培养条件是改变大肠杆菌生长的最简单方法，直接影响重组蛋白的体积产量。研究人员经常忽视优化外部因素的好处（除了诱导后的培养温度）。此前，我们提醒说，Luria-Bertani（LB）培养基（可以说是培养大肠杆菌最受欢迎的培养基）远非最适合蛋白质过表达的培养基。简单地切换到更丰富的肉汤（如Terrific Broth）会导致更高的最终细胞密度。此外，自动诱导培养基已经变得流行，许多在自动诱导培养基中培养大肠杆菌成功生产蛋白质的例子在文献中比比皆是。自动诱导培养基至少包含两种碳源：葡萄糖和乳糖（也添加甘油以增加产量）。葡萄糖是首选的碳源，一旦耗尽（通常在指数生长期间），乳糖开始被消耗。这反过来又诱导了基于lac启动子的系统产生蛋白质。使用自动诱导培养基有几个优点：达到更高的细菌密度，诱导时间点高度可重复，并且不再需要停止培养以添加IPTG。Briand等人已经证明，自动诱导也可以通过内部改变细胞代谢来实现。他们偶然发现，在大肠杆菌中产生人类Hsp70以某种方式干扰了内源性酶甘油醛3-磷酸脱氢酶的功能，间接地导致LacI去除，随后在lac启动子的影响下表达感兴趣的基因。这个平台（名为SILEX，Self-InducibLe Expression）允许在没有任何培养基适应的情况下进行自动诱导，并在许多培养条件下工作。 复杂培养基提供了丰富的营养素可用性，但对培养中细胞的代谢状态控制很少。降低生长速率有助于蛋白质生产，以便合成和折叠之间的平衡可以达成。培养温度是操纵生长速率的最简单方法。然而，在大型生物反应器中，温度控制可以指数级增加生产成本，因此使用其他生长速率控制方法。我们同意Krause等人的观点，即在补料分批培养和摇瓶培养中应用的重组蛋白生产原则存在脱节。在前者中，密切监测通气程度和葡萄糖进料速率，因为这些参数对于获得高产量至关重要。然而，在实验室规模上，这很少被考虑。幸运的是，这方面的进展显示出有希望的结果，将导致它们的采用。例如，通过控制从硅胶珠中扩散的葡萄糖释放或原位多糖降解，在摇瓶中实现了控制的碳源供应。适当的烧瓶设计或添加不混溶的含氧油可以调节氧气的可用性。最后，用于监测这些参数和其他人的设备已经适应了微孔板和摇瓶的培养，以便可以找到重组蛋白生产的最适条件。然而，由于摇瓶规模培养条件监测涉及专业硬件，它仍然没有被广泛使用。 最后，随着蓝光诱导的T7RNAP（Opto-T7RNAPs）的引入，光可能很快成为培养期间需要调整的另一个参数。为了创建Opto-T7RNAP，聚合酶被分割成两部分，然后分别融合到光诱导二聚体上。当用发射蓝光的LED灯照射培养物时，二聚体相互作用，产生功能性T7RNAP。因此，蓝光作为表达的诱导剂。此外，Opto-T7RNAP在黑暗中解离，从而允许动态和精确地控制蛋白质生产。蓝光/Opto-T7RNAP系统可以取代IPTG作为诱导剂，这是一个吸引人的特性，特别是在大规模发酵中。 14.表达主义者工具包 涵盖大肠杆菌重组蛋白生产领域的综述描述了可用于成功结果的许多分子工具。然而，许多需要重组蛋白的领域外研究人员被信息量所淹没。事实上，许多人向我们承认，这是放弃项目的原因之一。在这一部分中，描述了三个工具包，它们配备了不同数量的资源，取决于研究小组的需求（图1）。 图1. 重组蛋白生产可用的工具包。图中的项目是经过多年广泛使用彻底测试过的，因此未包括文中描述的新发现。MB，膜。 15.起始工具包 此时，应该清楚的是，每个旨在在大肠杆菌中获得重组蛋白的实验室至少应该有BL21(DE3)菌株的库存（包括用于更严格控制基础表达的pLys库存）和pET系列载体。我们强烈推荐Correa等人的T7载体系列。克隆到这六种不同的质粒中相当容易，并且需要一对用于PCR的引物，如无限制克隆中所采用的。这些质粒还将允许调查五个（或在最新更新中六个）融合标签对溶解度的影响。该工具包中需要的其他试剂包括镍-NTA-琼脂糖珠用于纯化，以及烟草蚜虫病毒（TEV）蛋白酶（可以在家准备）用于标签去除。 16.中级组合 除了前面列出的工具外，纠正密码子使用情况的菌株通常会显著提高重组蛋白的生产水平。如果感兴趣的基因没有经过密码子优化，那么BL21(DE3) CodonPlus或Rosetta菌株是必备的。允许可调合成水平的菌株[如Lemo21(DE3)和Tuner™ (DE3)]和载体（例如，包含araBAD启动子的）是更好地控制产生的重组蛋白数量的好选择，这在蛋白质毒性情况下特别有帮助。这种中级组合适合满足蛋白质密集型方法的需求，如核磁共振或X射线晶体学。实际上，本节中列举的组件是结构生物学项目中最广泛使用的组合。 17.专业平台 最后，除了前面列出的工具外，一个完整的平台包括了完成具有挑战性的项目所需的其他工具。在膜蛋白、非常有毒、富含二硫键或易聚集的蛋白质的情况下，专业菌株和载体就派上用场了。对于膜蛋白，C41(DE3)和C43(DE3)（以及新开发的Mutant56）菌株比BL21(DE3)给出了更好的结果。使用Origami和SHuffle菌株及其衍生品可以正确实现二硫键的配置。在我们手中，Takara的质粒套件编码不同的分子伴侣适用于易聚集的蛋白质。如果需要共表达蛋白质，Novagen的Duet系列载体取得了巨大成功。此外，筛选不同启动子的基因表达效果的载体是平台的良好补充。本文中描述的新型工具包含在此子部分中，主要是因为在科学界缺乏传播。然而，我们毫不怀疑它们将来会变得更受欢迎，一旦研究人员开始越来越多地将它们纳入他们的重组蛋白生产方案。 18.该领域的发展方向 令人兴奋的是，定期有新的策略和分子工具用于大肠杆菌中的重组蛋白生产。我们特别赞扬那些可以同时轻松测试多个变体的工具。这不仅增加了成功的机会，也增加了新来者采用的机会，他们欣赏简单的设置和资源的有效利用。我们相信，使用菌株和载体套件进行快速优化将成为常态。此外，必须采用蛋白质设计和工程的创新，以最大化蛋白质生产。总的来说，研究人员不愿意改变蛋白质的序列，因为大多数氨基酸替代可能是不稳定的或破坏蛋白质功能。尽管如此，通过定向进化方法调整蛋白质序列可以提高重组蛋白的产量。根据引入的突变，可以保留整体结构和功能。此外，允许翻译后修饰的工具仍然很少。尽管可以使用工程化的大肠杆菌菌株获得糖基化模式，但这个领域需要更多的研究。最后，尽管大肠杆菌作为宿主的受欢迎程度很高，但其他微生物也应该被视为选择，如芽孢杆菌菌株、荧光假单胞菌、谷氨酸棒状杆菌等。在这方面，最近描述的易于在细菌之间转移的穿梭载体是重组蛋白生产可用工具库的一个很好的补充。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。