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本文为转化医学网原创，转载请注明出处 作者：Jerry 导读： 肿瘤异质性及其驱动因素影响肿瘤进展和癌症治疗。单细胞RNA测序用于研究肿瘤生态系统的异质性。 近日，浙江大学郭国骥、梁廷波等研究人员在权威期刊《Advanced Science》上发表了题为“Pan-Cancer Single-Nucleus Total RNA Sequencing Using snHH-Seq”的研究论文，本研究中， 研究人员开发了一种高通量、高灵敏度的方法snHH-seq，该方法将随机引物与液滴微流控平台的预索引策略相结合。 这种创新的方法允许从临床冷冻样品中检测单个细胞核中的总RNA。并且建立了一个强大的流水线，以促进全长RNA-seq数据的分析。snHH-seq应用于来自32例不同肿瘤类型患者的73万多个单核。泛癌症研究使其能够全面分析肿瘤转录组数据，包括表达水平、突变、剪接模式、克隆动态等。 https://onlinelibrary-wiley-com.libproxy1.nus.edu.sg/doi/10.1002/advs.202304755 研究背景 01 癌细胞及其驱动因素的异质性在肿瘤发生和恶性进展中起着重要作用，并对癌症治疗有重要影响。单细胞RNA测序(scRNA-seq)能够在单细胞水平上测量转录信息，从而准确地解决肿瘤异质性。 许多研究利用scRNA-seq来阐明肿瘤微环境的多样性，揭示治疗策略的机制，并据此提出新的分子标记和治疗靶点。 然而，scRNA-seq在处理临床肿瘤样本，特别是档案材料(如冷冻组织)方面具有独特的后勤和技术挑战。首先，临床肿瘤样本的scRNA-seq需要实施快速组织解离程序，目前大多数医院的常规病理实验室不存在这种程序。其次，大多数scRNA-seq方法使用oligo-dT引物来捕获和扩增聚腺苷化转录本，这一过程高度依赖于组织样品的质量。此外，寡聚dt捕获导致缺乏对许多生物过程很重要的非聚腺苷化转录本。第三，高通量scRNA-seq方法只能检测转录本3 '或5 '端的短片段，这限制了临床样本的突变和剪接分析，特别是对肿瘤。 为了克服这些挑战，研究人员开发了“高通量高灵敏度单核总RNA测序”(snHH-seq)，将随机引物和预索引策略结合在液滴微流控平台上。单核RNA-seq (snRNA-seq)减少了对样品收集和处理的要求。这也为纵向样本的分析铺平了道路。使用随机引物而不是oligo-dT引物捕获转录本，不仅可以拯救部分降解转录本的档案临床样本，而且具有更高的灵敏度(一个转录本有多个可捕获的位点)和更高的覆盖率(转录本的3 '和5 '端，非聚腺苷化转录本和聚腺苷化转录本)。该预索引策略应用于基于液滴和基于平板的方法，提供至少一个数量级的吞吐量增益，并促进临床样品的多路分析。 研究进展 02 为了能够评估大量临床冷冻样本，减少解离的批次，研究人员建立了snHH-seq，一个基于液滴的高通量、高灵敏度的单核总RNA测序平台。snHH-seq是一种结合随机RT引物和预索引策略优势的强大方法。 snHH-seq具有高通量和高灵敏度，为肿瘤图谱绘制和其他基因组研究提供了新的可能性。 接下来，研究人员使用snHH-seq分析冷冻临床肿瘤样本。研究人员分析了32例患者的735 722个细胞核，涵盖了中国发病率和死亡率最高的肿瘤类型，包括肺腺癌(LUAD)、肝细胞癌(HCC)、肝内胆管癌(ICC)、胶质瘤、结肠腺癌(COAD)、直肠腺癌(READ)、乳腺浸润性癌(BRCA)、食管癌(ESCA)和胃腺癌(STAD)。在单细胞癌症研究中，识别恶性细胞是至关重要的一步，因为它们构成了癌症样本的主要组成部分。为了在研究人员的数据集中识别细胞类型(恶性细胞和非恶性细胞)，研究人员使用了标记基因和推断拷贝数变异(CNV)的组合。考虑到所研究的癌症类型，研究人员使用带注释的非上皮细胞，如内皮细胞、基质细胞和巨噬细胞作为intercnv的参考，以推断每个患者的CNV特征。 为了进一步说明TME(肿瘤微环境)的异质性，研究人员收集了来自不同患者的内皮细胞、骨髓细胞和基质细胞，并进行了亚聚类分析。研究人员获得了15个肿瘤内皮细胞(TEC)亚簇，包括动脉TEC (C4、FBLN5和SULF1)、静脉TEC (C6、ACKR1)、淋巴TEC (C2、PROX1)、毛细血管TEC (C7、BTNL9和CD36)、外周血TEC (C9、PDGFRB)、尖端TEC (C3、COL4A1)、细胞周期TEC (C12、C2orf48和CIT)和免疫样TEC (C10、DOCK2和PTPRC)。Tip TEC (C3)和cell cycle TEC (C12)在多个肿瘤中富集。在泛癌髓系细胞中，研究人员观察到肿瘤和NAT之间共享和特异性的基因特征。此外，研究人员在乳腺肿瘤和NAT样本中观察到显著的异质性。C2和C5主要驻留在乳腺肿瘤中，表达抑癌基因，可能调控乳腺TME中硫酸肝素的表达;C13主要存在于乳腺NAT和高表达的LRP1B中，LRP1B是一种可能抑制肿瘤迁移和侵袭的肿瘤抑制因子。表达C8的TNXB主要存在于NAT中，对多种肿瘤有贡献，可能阻碍肿瘤细胞的侵袭和转移。 总的来说，研究人员对细胞区室的泛癌症分析揭示了肿瘤环境的共享和癌症限制特征。 使用snHH-seq进行泛癌分析 研究结论 03 总之，研究人员证明了高分辨率单细胞全长转录组测序在鉴定新的肿瘤生物标志物方面的价值，并为全长单细胞测序提供了详细的分析。研究人员的综合分析方法包括检查基因表达、体细胞突变、剪接模式和克隆行为。通过利用这些不同的观点，研究人员可以确定与癌症相关基因和细胞类型相关的特定变异。这个项目代表了研究人员理解癌症潜在遗传机制的能力的重大进步。最终，这些发现加深了研究人员对肿瘤生物学的理解，并为更有效的诊断和治疗方法铺平了道路。 参考资料： https://onlinelibrary-wiley-com.libproxy1.nus.edu.sg/doi/10.1002/advs.202304755 注：本文旨在介绍医学研究进展，不能作为治疗方案参考。如需获得健康指导，请至正规医院就诊。 热门·直播/活动 🕓 北京｜12月19日-20日 ▶第四届单细胞测序技术应用研讨会暨单细胞&空间组学研讨会（日程稍后公布） 点击对应文字 查看详情

胃癌是严重威胁人类健康的常见消化道恶性肿瘤，2020年我国癌症新发病例和死亡病例胃癌均位居第3位。近年来，基于肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）的免疫检查点（PD-1 胃癌是严重威胁人类健康的常见消化道恶性肿瘤，2020年我国癌症新发病例和死亡病例胃癌均位居第3位。近年来，基于肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）的免疫检查点（PD-1/PD-L1）抑制剂在改善胃癌患者预后方面体现出前景，但不同个体疗效差异大，而且缺少理想的疗效预测指标。微卫星高度不稳（MSI-H）患者的肿瘤具有更高的免疫原性，更适合免疫检查点抑制剂治疗，但单药治疗的客观缓解率仅约40%；EB病毒感染患者常伴有大量细胞毒性T细胞浸润，但其多数呈微卫星稳定状态（MSS）；基于病理切片的CPS评分也常用于预测胃癌免疫治疗疗效，但评判具有一定的主观性和局限性。因此，亟需寻找更为有效的定量指标评估胃癌TME状态，准确筛选免疫检查点抑制剂获益人群，探索提升免疫检查点抑制剂疗效的新策略。 近日，北京大学人民医院胃肠外科申占龙教授课题组在Theranostics上发表了题为Histone deacetylase-mediated tumor microenvironment characteristics and synergistic immunotherapy in gastric cancer的研究论文。研究团队发现胃癌组织中组蛋白去乙酰化酶（Histone deacetylase，HDACs）广泛参与调控肿瘤微环境中免疫细胞浸润水平，并首次利用HDACs表达模式建立了HDS评分模型，能够有效区分胃癌肿瘤微环境“冷”、“热”肿瘤。为了探究相关机理，研究团队通过单细胞转录组分析等发现低HDS胃癌患者的肿瘤微环境中成纤维细胞和内皮细胞比例显著高于高HDS，靶向抑制免疫细胞互作通路中的MIF分子可重塑肿瘤微环境和抑制肿瘤生长。然而，肿瘤细胞本身的异质性也是影响肿瘤微环境的关键因素，研究团队通过纯化肿瘤组织中的肿瘤细胞，利用药物敏感性预测等发现铁死亡诱导剂-GPX4抑制剂对低HDS患者更为敏感，敲低肿瘤细胞GPX4的表达可使肿瘤从低HDS转变为高HDS状态，并显著增强CD8+T细胞浸润和杀伤毒性。该研究为免疫检查点抑制剂治疗获益患者的精准筛选和开发联合治疗新策略提供了重要科学依据。 组蛋白的乙酰化有利于DNA与组蛋白八聚体的解离和核小体结构松弛，从而使各种转录因子和协同转录因子能与DNA结合位点特异性结合激活基因的转录，而组蛋白的去乙酰化则发挥相反的作用。组蛋白去乙酰化酶共分为四类（HDAC Ⅰ，HDAC Ⅱ，HDAC Ⅲ，HDAC Ⅳ），但在胃癌中参与的肿瘤信号调控和微环境细胞浸润水平显著异质性。因此，靶向调控单一的HDAC靶点无法准确调整肿瘤细胞传导及免疫细胞浸润水平。 为解决以上问题，研究团队基于HDACs表达水平通过聚类鉴定出三种胃癌亚型，通过差异基因表达、NMF聚类以及PCA评分方法构建了胃癌量化HDACs亚型的评分模式（HDS），进一步分析发现对免疫检查点抑制剂治疗响应好的胃癌患者的HDS评分显著高于未响应的患者，HDS评分联合传统评价指标（MSI状态和CPS评分）能够显著提升胃癌对免疫检查点抑制剂疗效的预测效能（AUC=0.96）。 研究团队通过对临床队列转录组和多重免疫荧光分析发现：高HDS评分患者具有更好的生存预后；MSI-H和EB病毒阳性患者的HDS表达水平最高，且HDS与T细胞、NK细胞浸润水平显著正相关，与M2型巨噬细胞和MDSC细胞浸润水平显著负相关，提示HDS评分能够有效的评估胃癌肿瘤微环境中免疫细胞浸润水平，并解释了EB病毒感染患者呈现MSS特征但免疫浸润程度高的原因。 为了进一步探究导致不同HDS患者肿瘤微环境差异的原因，研究团队利用单细胞转录组数据分析发现，在低HDS患者中，MYH11+成纤维细胞和CD234+内皮细胞与T细胞、NK细胞的通讯频率显著高于高HDS患者，低HDS患者的成纤维细胞和内皮细胞高表达MIF，通过MIF-CD74信号通路抑制T细胞和NK细胞浸润。小鼠皮下种植瘤实验显示，抑制MIF可以显著抑制肿瘤生长和促进瘤内CD8+T细胞和CD4+T的浸润水平。 肿瘤细胞的异质性也是影响肿瘤微环境的重要因素。研究团队采用生物信息学方法删除肿瘤组织中微环境成分，纯化肿瘤组织，通过药物敏感性预测分析发现铁死亡诱导剂—GPX4抑制剂对低HDS肿瘤更为敏感。进一步研究显示：敲低胃癌细胞GPX4表达可使胃癌组织从低HDS转变为高HDS状态，显著增强CD8+T细胞浸润和杀伤毒性，而且抑制GPX4表达与PD-L1抑制剂联用的治疗效果明显优于PD-L1单药治疗。该结果说明GPX4抑制剂可能重塑胃癌HDS状态，使其更有利于免疫检查点抑制剂发挥作用。 综上所述，研究团队基于HDACs表达模式构建了评价胃癌肿瘤微环境的新指标-HDS，有助于精准筛选适合免疫检查点抑制剂治疗的人群，同时揭示了逆转胃癌“冷”肿瘤转变为“热”肿瘤的潜在靶点，为制定免疫检查点抑制剂的联合增效新策略提供了重要指导。 北京大学人民医院胃肠外科申占龙教授为该论文通讯作者，北京大学人民医院胃肠外科林易霖博士、荆翔湘博士、福建医科大学附属第一医院陈志华博士、潘晓娴博士为该论文共同第一作者。 原文链接： https://www.thno.org/v13p4574.htm

血液是生命的源泉，是人体不可或缺的运输载体，能调节各组织器官的生理活动。当人体失血过多时，各组织器官处在缺血缺氧的状态，机体内环境发生紊乱，无法维持正常的生理功能，失血者就会有生命危险。 血液是生命的源泉，是人体不可或缺的运输载体，能调节各组织器官的生理活动。当人体失血过多时，各组织器官处在缺血缺氧的状态，机体内环境发生紊乱，无法维持正常的生理功能，失血者就会有生命危险。 对于大量失血病人，输血是目前临床上最常用和最有效的措施，而这些血液主要来源于无偿献血。但过度依赖无偿献血容易造成“血荒”，即血库供血量严重不足，尤其是在学生放假的寒暑期。此外，对于稀有血型失血者，很难从血库中找到与之匹配的血液。 为了解决这些“血荒”问题，近日，英国NHS血液与移植中心、布里斯托大学、剑桥大学等机构合作，开展了世界上第一个人造红细胞的临床试验。这些红细胞完全是在实验室里培育出来的。研究团队从约470ml健康人捐献的血液中分离出50万个干细胞，在此基础上培养出500亿个红细胞，最终筛选出约150亿个成长到适合输入人体的红细胞。 这项临床试验是建立在2017年发表在 Nature Communications 的一篇论文的基础上【1】。该研究从成体干细胞培养出永生化人类成体红细胞系（BEL-A），其可以持续增殖，这些永生化细胞系可以在实验室培养并有效分化为成熟的、有功能的红细胞。而且这些永生化细胞系分化而来的成熟红细胞与体外培养的红细胞在功能上和分子水平上没有发现差异，重要的是，没有异常的蛋白表达。 这项研究证明了从体外培养制造用于临床的红细胞的可行性。 2022年11月7日，英国国民保健制度（NHS）网站发布声明称，已经有两名志愿者接受“人造红细胞”输血，输入量在5至10ml之间。这些人造红细胞经过标记，输入人体后仍能被研究人员追踪。令人鼓舞的是，这两名志愿者目前未出现任何副作用。 研究团队表示，之后还将有另外至少8名志愿者参与这项试验。所有志愿者将间隔至少4个月接受两次少量红细胞输入：一次为人造红细胞，另外一次为普通红细胞。 在实验室中培育“人造红细胞” 如果这项临床试验被证明是安全有效的，这些“人造红细胞”将在镰状细胞病、造血障碍和稀有血型失血等血液疾病的治疗中大展身手。事实上，目前对于患有这些血液疾病的人来说，很难找到足够匹配的献血。 对于这项临床试验，镰状细胞学会的首席执行官 John James OBE 表示，这项研究为那些难以输血的镰状细胞患者带来了真正的希望，他们对大多数供体血型都会产生抗体。 除此之外，人造红细胞直接由干细胞培育而来，是“新鲜出炉”的，相比之下，从献血者中获得的红细胞有“新”有“旧”。这意味着，人造红细胞输血将维持更久的时间，相同时间内患者需要输血的次数更少。这将减少频繁输血导致的铁超载，后者可能导致严重的并发症。 现阶段人造红细胞投入临床应用仍要面临许多挑战。首先，人造红细胞产量少，因此在未来很长一段时间里，血库主要来源还是血液捐献；其次，人造红细胞造价高昂，比普通输血的费用高得多，其主要目标还是为一些有特殊用血需要的患者提供人造血液。 总而言之，这项世界领先的临床试验为制造人造红细胞奠定了基础，这些人造红细胞可以安全地用于镰状细胞病等血液疾病患者输血。虽然目前绝大多数血液需求仍依赖于献血，但毫无疑问，这项工作为难以输血的患者带来的新的希望。 值得一提的是，上述研究团队于2018年4月在 EMBO Molecular Medicine 期刊发表了一篇题为：Enhancement of red blood cell transfusion compatibility using CRISPR-mediated erythroblast gene editing 的研究论文【2】。 该研究更进一步，通过CRISPR-Cas9基因编辑了之前开发的永生化人体成体红细胞系（BEL-A），增强其输血相容性。为长期输血的患者的同种免疫以及“熊猫血”输血时难以匹配血型的难题带来了新的解决方法。 研究团队使用 CRISPR-Cas9 基因编辑技术敲除了永生化人类成体红细胞系（BEL-A）的5个与血型相关的基因——FUT1、ACKR1、KEL、GYPB、RHAG，这5个基因编码了最常见的输血不相容性抗原。 敲除这5个基因后，这些永生化人类成体红细胞系（BEL-A）分化而来的成熟红细胞将可以给多种血型的人输血，而不必担心发生血液凝集。 而在2019年6月，加拿大不列颠哥伦比亚大学的研究人员在 Nature Microbiology 期刊发表了题为：An enzymatic pathway in the human gut microbiome that converts A to universal O type blood 的研究论文。 该研究发现了存在于人体肠道中的微生物产生的两种酶，只需加入极低浓度，就可以成功地将A型血转换成万能的O型血。这一发现有望改变目前血液供应不足的现状。 决定血型的红细胞抗原，是糖脂分子，而人类肠道种的微生物群可以通过酶促反应分解各种糖蛋白，这些糖蛋白种的糖跟红细胞抗原类似。因此研究团队决定在人类肠道细菌中寻找更好可以去除红细胞抗原A的酶。他们通过收集人粪便样本，并分离出DNA，理论上这些DNA中包括编码消化糖蛋白的细菌酶的基因。然后，将这些DNA切碎并将不同的DNA片段转染到大肠杆菌中，监测是否有任何大肠杆菌随后产生具有去除抗原A的能力的蛋白质。 他们最终发现了一种名为 Flavonifractor plautii 的肠道细菌，它产生的两种酶，可以成功去除血液中的红细胞抗原A，从而可以将A型血转变为O型血。