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在大规模生产诱导多能干细胞（iPSC）的过程中，确保其质量和多能性以满足临床需求面临着诸多挑战。iPSC的多能状态极为敏感，且对培养基质有较强的依赖性。为了实现可放大的干细胞生物工艺，必须采用能够实时监测细胞分化、生长状态及活性的标记物。此外，开发适合的细胞培养模式，以支持高质量的悬浮干细胞生长，是实现工业化规模生产的关键。本文将综述在iPSC的诱导、扩增和生产过程中，如何通过优化培养基、悬浮培养模式和监测技术来维持其质量和多能性。 干细胞生产的最新进展以及挑战 干细胞疗法，包括组织移植和药物发现等应用，已被广泛用于治疗多种临床适应症，特别是在肿瘤、心脏病、免疫疾病和神经疾病等领域。因此，干细胞研究的核心目标之一是在保持细胞分化精确控制的同时，优化细胞生长策略。传统上，胚胎干细胞（ESC）因其固有的多能性而被视为细胞治疗的理想选择，这种多能性使得细胞能够分化为任何特定的细胞类型。ESC的发现为再生医学以及多种病理疾病的治疗提供了巨大的潜力。无论干细胞的来源如何，ESC在增殖过程中必须进行自我更新以维持其多能性，同时抑制向特定细胞类型的分化。 在2007年，Yamanaka及其团队实现了干细胞研究领域的一项重大突破，成功地将人类体细胞转化为具有与人类胚胎干细胞（hESC）相似的基因表达谱和多能性的细胞。这些细胞被命名为人类诱导多能干细胞（hiPSC）。iPSC的产生避免了从胚胎中提取干细胞所带来的伦理问题，使其成为研究和临床应用的一个更为有利的平台。由于其固有的自我更新能力、多能性以及相对较低的免疫原性，iPSC成为一种极具前景的、来源于患者的无限细胞资源，可用于人类遗传疾病的建模和毒理学研究，从而降低了药物开发和临床试验的总体成本和相关风险。凭借其多方面的能力，iPSC技术仍然是个性化细胞治疗和再生医学领域的一个有前途的科学工具。 目前，临床细胞治疗和人类组织再生需要大量（10^8至10^10）符合现行良好生产规范（cGMP）的临床级干细胞。然而，由于多能干细胞对支持基质的依赖以及其多能状态的敏感性，将细胞培养放大到所需规模仍面临重大挑战。在收获过程中，iPSC的最终质量取决于其代谢状态；具体而言，维持多能状态和自我更新对于生产临床级iPSC至关重要。因此，监测细胞分化状态、生长状态和活性的内在标记方法对于大规模生产具有重要意义。此外，现有平台正在不断优化，以满足cGMP标准，从而有效地将生物工艺放大到临床生产环境。本文将重点介绍iPSC细胞培养方法的最新进展，包括培养基、悬浮模式和监测技术，这些方法在一定程度上保持了iPSC的质量和多能性，以满足临床生产的需求。此外，我们还将探讨未来可能提高iPSC生物工艺效率和产量的技术。 从异质细胞群中分离iPSC 许多信号能够激活干细胞分化，因此，细胞培养条件的微小变化或对细胞的应激可能导致细胞群体的异质性分化。这构成了一个严重的安全问题，因为分化细胞的污染可能在细胞移植受体中引发潜在的肿瘤或畸胎瘤形成。然而，干细胞分化也可能自发发生，例如在细胞外基质中长期培养时观察到的间充质干细胞（MSC）的情况。为了调节这种类型的反应并保存用于未来应用的多能干细胞（PSC），已经应用了分离多能细胞和分化细胞的细胞分选方法。荧光活化细胞分选（FACS）和微孔粘附是流行的高通量方法，用于基于定义的多能性特征分离细胞，通过细胞培养条件增强多能性标记阳性干细胞的选择性。对于iPSC，当添加四种抑制剂的小分子混合物（SMC4培养基）时，分选后观察到SSEA4/TRA-1-81阳性iPSC克隆比在传统重编程培养基中分选的细胞衍生克隆增加了55倍。尽管FACS是高度自动化和标准化的，但分选单个细胞以产生稳定的多能细胞克隆仍然是一项劳动密集型且耗时的工作。因此，能够产生多能细胞群体作为池培养的方法是首选的，因为池可以保持多能标记物的长期稳定表达。为此，使用细胞表面标记抗体的磁激活细胞分选（MACS）方法已被用于生成iPSCs池。在这种情况下，用TRA-1-60和SSEA4抗体进行一轮异质性细胞池分选后，TRA-1-60和SSEA4阳性细胞的数量分别增加了28%和11%。另外几轮的MACS进一步富集了表达多能性标记的细胞群体。一般来说，MACS是比FACS更好的方法，因为它可以轻松快速地同时在多个样品上进行，同时仅对细胞施加较小的剪切应力。 尽管细胞分选技术在基于形态学和表面标志物表征干细胞群体方面表现出有效性，但其在分离动物或临床研究级别的多能干细胞方面的广泛应用仍受到限制。这主要是由于GMP级抗体的高昂成本以及临床级FACS设备和专业技能的有限可用性。因此，在未来的细胞治疗临床试验中，迫切需要开发可放大的平台，以生成可靠、均一且安全的临床级多能干细胞群体。 最佳iPSC培养基及培养基的开发 在iPSC扩增过程中，确保其质量的关键步骤之一是使用经过良好表征的材料，其中细胞培养基和基质发挥着至关重要的作用。细胞培养基通过提供营养、矿物质和pH值的良好平衡，对维持健康且增殖的细胞至关重要。细胞培养基质则作为细胞粘附和增殖的支撑结构，通常被饲养层细胞或生长支持因子包裹，以进一步促进细胞的粘附和生长。使用完全表征的细胞培养系统对于控制良好的生物工艺过程至关重要，尤其是对于生产临床级别的生物样品。在过去十年中，iPSC培养基配方和基质已经得到了显著的发展，这主要得益于对维持iPSC细胞系多能性和整体工艺可放大性的信号通路的深入考虑。 在为iPSC设计培养基时，一种有效的策略是识别多能性依赖的信号转导途径中涉及的内源性生长因子。调控干细胞多能性基因表达的途径多种多样，包括转化生长因子（TGF）-β超家族激活级联、受体酪氨酸激酶信号通路（如碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的下游信号）、以及涉及胰岛素样生长因子（IGF）的途径等。值得注意的是，维持小鼠胚胎干细胞（mESC）多能性的蛋白质和生长因子（如骨形态发生蛋白（BMP）和白血病抑制因子（LIF））与人类胚胎干细胞（hESC）不同。多能干细胞在维持多能性和自我更新方面可能需要不同的生长因子。例如，bFGF已被确定为维持体外hESC自我更新的关键添加物，在无饲养层培养物中其浓度通常在40 ng/ml到100 ng/ml之间。此外，Wnt/β-catenin信号通路与hPSC的自我更新相关，尽管单独添加Wnt3a不足以在没有饲养层细胞的情况下维持未分化的hESC。由于这些代谢研究主要在hESC上进行，而非iPSC，因此需要对iPSC进行更深入的表征，以便设计培养基，并考虑每种新细胞系在临床应用中开发的独特要求。 通过提供特定的干性支持因子以及创造富含细胞外基质（ECM）的环境，基于饲养层细胞的基质可以防止干细胞自发分化，并改善ESC和/或iPSC的附着。最常用的饲养层细胞是增殖失活的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF），因为它们能够产生多种对维持多能性至关重要的蛋白质，如TGF-β1、激活素A、BMP-4和多营养因子（肝素结合生长因子）等。然而，由于饲养层细胞的增殖能力有限，经过多次传代后，其支持iPSC多能性的效率会降低，且在分离iPSC过程中存在较高的污染风险，这在大规模生产iPSC时会引发相关技术挑战。此外，动物源性饲养基质可能增加病原体和未知病毒向宿主细胞转移的风险，从而导致免疫系统的排斥反应。因此，iPSC的培养方法主要转向使用ECM蛋白、条件培养基或合成生物材料，以实现无动物成分和无细胞（称为“无饲养”）的培养系统。 在过去十年中，随着培养基技术的进步，iPSC细胞培养基质逐步达到了cGMP标准。最近的研究表明，长期使用动物源性血清和含异源分子的培养基可能会影响细胞形态、扩增潜力、基因表达和细胞因子谱。这促使了无异源成分培养基（XFM）配方的开发，随后是无动物源性成分（ACF）培养基，以支持iPSC的扩增。在已开发的ACF培养基中，Essential 8™（Thermo Fisher Scientific）培养基是iPSC培养中使用最广泛的基础培养基之一，因为它包含了8种对干细胞增殖至关重要的成分：DMEM/F12、L-抗坏血酸、磷酸镁、硒钠、FGF-2、胰岛素、NaHCO3以及转铁蛋白、TGF-β1或Nodal。 无饲养iPSC扩增技术的发展为未来的自动化生产提供了可能性。事实上，利用CompacT SelecT™细胞培养系统，在无饲养条件下，大规模自动化生产未分化的iPSC是可行的。在这种情况下，使用含有Activin A和FGF-2的化学限定培养基（CDM）进行自动传代的聚体hiPSC能够保持其特征形态和多能性标记物的表达。生物材料也被探索作为无饲养iPSC培养系统的增强基质。例如，一项研究发现，具有最佳弹性（25 kPa）的水凝胶基质能够使细胞保持多能性。进一步的研究表明，接枝到水凝胶（储存模量为25 kPa）上的双链体外连接素衍生的寡肽支持hESC和iPSC的长期生长，可持续超过10代。细胞外基质（ECM），如纤维连接蛋白、层粘连蛋白和玻璃体连接蛋白，或来自ECM的寡肽，具有特定的细胞结合结构域，使其成为支持iPSC在无饲养基质系统中生长的重要成分。3D生物打印和细胞/组织打印技术也为未来的工艺放大和自动化提供了新的可能性。最近的研究表明，当iPSC在涂有纤维连接蛋白的无饲养壳聚糖或聚氨酯膜上驯化和扩增时，细胞打印技术的有效性得到了验证。在这项研究中，嵌入热敏聚氨酯（PU）水凝胶基质的iPSC显示出更高的活性。然而，需要进一步优化基于聚合物的无饲养基质，因为PU水凝胶培养的多能性标记（如OCT4和NANOG）与对照MEF饲养层培养存在差异。 细胞培养动力学不仅决定了iPSC的最终行为，还影响了整个生物工艺的成本。尽管在具有监测和反馈控制pH值和溶解氧（DO）能力的一次性多层培养器皿中，已经证明了在2D静态培养中大规模生长hPSC的可行性，但在2D或3D静态基质上大规模生产hPSC仍是一种成本高、劳动密集且空间需求大的方法。已知静态培养条件会导致培养基成分、代谢废物、旁分泌因子和气体的不利梯度。目前的共识是，动态悬浮培养是实现临床应用所需的多能干细胞密度的最佳方法，目前正积极开发高效且可放大的悬浮多能干细胞扩增的新策略。例如，可以利用成功的基质研究来设计最佳的悬浮培养模式。 iPSC悬浮方式的关键考虑因素 (聚集体、微载体和微胶囊) 无基质的iPSC悬浮培养系统克服了静态基质在放大生产方面的局限性，同时支持iPSC的生长和多能性维持。由于iPSC的贴壁特性，在悬浮体系中接种和扩增时，会自发形成3D聚集体（或球体）。这些iPSC聚集体与胚状体（EB）相似，因此可以作为扩增后直接进行谱系分化的有效途径。iPSC聚集体的生长和多能性主要受微环境、聚集体大小分布和细胞培养罐大小的影响。已有研究对培养条件进行了优化，使得hiPSC在转瓶中于E8™无饲养条件下，以未分化的悬浮细胞聚集体形式扩增超过10代。此后，搅拌悬浮培养已扩展至3000 ml的一次性生物反应器（1000 ml工作体积），以生产大量的hiPSC聚集体（多达2x10^9个细胞），同时保持多能性标记物的表达，包括TRA-1-81、SSEA-4、OCT4和SOX2。 然而，动态悬浮培养中iPSC聚集体的扩增存在一些限制。与静态悬浮培养相比，其扩增效率较低，且聚集体大小分布不均匀。若不加以控制，细胞团块（>800 μm）的形成可能导致细胞活性下降、自发分化增加、营养和氧气扩散梯度加剧，以及整体扩增过程变慢。通过优化搅拌桨类型和搅拌速度，可以有效控制iPSC培养中的聚集体尺寸。垂直轮生物反应器（VWBR）是一种新型的生物反应器系统，能够在扩增iPSC的同时降低聚集体的大小。该系统通过垂直叶轮搅拌实现容器内的高效均质化。使用该系统，在保持多能性的同时，成功产生了平均直径为350 μm的聚集体（最高密度可达2.3x10^6 cells/ml）。 培养基添加剂对聚集体的形成有显著影响。例如，在hiPSC聚集体的扩增过程中，短期应用维甲酸（RA）可以进一步维持其多能性。类维生素A通过提高多能依赖性转录因子（如Nanog和Oct4）的表达以及激活磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）信号通路来支持iPSC的自我更新。此外，在化学限定培养基中添加Rho相关卷曲螺旋激酶（ROCK）抑制剂Y27632可以促进多种悬浮罐类型中从单细胞接种开始的iPSC聚集体的形成。ROCK抑制剂通过减少解离诱导的细胞凋亡和提高克隆效率来支持干细胞聚集体的存活。然而，最近的研究表明，长期暴露于ROCK抑制剂会改变iPSC的代谢特性。因此，培养基添加剂、接种策略和生物反应器设置是优化生物工艺产量的关键参数。通过进一步优化，可以实现足够用于临床应用的iPSC聚集体的大规模生产。在这种模式下，需要改进营养物质的运输机制和聚集体的大小分布，以在高密度条件下保持细胞聚集体的多能性和活力。 微载体 在生物反应器系统中加强干细胞培养扩增的工作已经在微载体的应用方面取得了显著进展。微载体的优势在于它们提供了一个表面积以支持多能干细胞（PSC）的生长和附着，同时保留了动态悬浮培养系统的特点。微载体可用于细胞种子制备，如果是可生物降解的，还可以在治疗过程中用于将细胞运送到受损组织。各种生物可降解材料通常用于制造针对细胞系扩增的微载体，包括葡聚糖、胶原蛋白、明胶、聚乳酸-羟基乙酸（PLGA）、聚L-乳酸（PLLA）、聚苯乙烯（PS）和羟基磷灰石（HA）。与较大的静态基质类似，微载体通过其表面电荷的适当调控，以及当被细胞外基质（ECM）蛋白（如玻璃体连接蛋白、纤维连接蛋白和层粘连蛋白）包裹时，为PSC的生长提供了进一步增强的支持。搅拌微载体培养系统已被证明可以促进贴壁依赖性干细胞的扩增和规模放大，同时为监测和控制干细胞健康和分化提供了必要的工具。通过增强氧气供应和代谢物的质量传输以及降低微环境毒性，PSC的产量得以提高。 然而，在使用微载体扩增hiPSC时，存在一些需要考虑的问题。微载体的限制主要取决于其直径（100-400 μm）、密度（通常为1 g/ml）和化学成分，这些因素会影响细胞的附着，从而影响扩增能力。由于微球的表面积有限，hiPSC的峰值密度似乎受到微球与细胞比例的限制。附着在微载体微球上的细胞需要经过酶解和过滤处理，这可能会损害细胞的活力和多能性，具体取决于所采用的方法。为了解决这一问题，生物可降解微载体正在开发中。与传统的聚苯乙烯（PS）微载体相比，无异源可溶性微载体的开发取得了显著进展，使得转瓶中的细胞回收率大幅提高。 搅拌式生物反应器会对微载体微球施加流体动力剪切应力，这可能会影响hiPSC的整体健康和多能性。通过优化生物反应器的工艺参数（如搅拌速率），可以减轻剪切应力对iPSC的不利影响。例如，Gupta及其同事的研究表明，在转瓶中，iPSC在微载体上的长期附着、多能性和扩增依赖于维持25 RPM的最佳搅拌速度。这种参数优化方法需要应用于更大规模的iPSC扩增（如生物反应器）。 微载体微球的制造成本是另一个需要考虑的问题，因为根据所使用的材料和添加剂，该工艺可能会变得异常昂贵。因此，微载体材料应具有成本效益，如果可能的话，应可回收，并且在每次生产运行后可消毒。目前，基于微载体的iPSC培养方法正在开发中，旨在通过控制良好的生物工艺系统实现人类iPSC在细胞治疗和组织工程中的持续扩增和回收。 利用微载体制备人诱导多能干细胞 (hiPSC) 的生物工艺研究进展，典型工艺包括静态培养、放大工艺、下游工艺和制剂，微载体通常在放大过程中引入，在下游工艺过程中去除。 微胶囊化 微胶囊与将细胞附着在微球表面的微载体不同，微胶囊化涉及将细胞捕获在球形胶囊内，细胞生长所需的营养物质、氧气和其它生长因子可以通过球形胶囊扩散。球形胶囊由半透性材料或膜组成，在悬浮培养系统中可以保护细胞免受聚团和剪切力的影响。用于生成微胶囊的生物材料包括海藻酸盐、琼脂糖、尼龙、胶体、聚苯乙烯、丙烯酸酯、聚赖氨酸-海藻酸盐水凝胶、醋酸纤维素-乙基纤维素和聚酯膜。通常通过乳化或挤压方法捕获细胞，形成保护管，使细胞增殖。总的来说，聚合物微胶囊与凝胶微胶囊相比具有一定的优势，包括生物相容性和GMP相容性。每单位体积的胶囊材料可以容纳更多的细胞，并且由于在胶囊内空间存在液体细胞悬浮液，聚合物胶囊中的颗粒间扩散限制不那么严重。 在微胶囊系统中培养的干细胞既可以维持多能性，也可以被诱导分化，这取决于其胶囊的组成和微环境中存在的生长因子。微胶囊化技术在大规模生产中所面临的缺点与微载体类似，即制造成本和有限的表面积。此外，一些干细胞类型，如hMSC，在没有添加肽或蛋白质（如纤连蛋白）的情况下被包裹时 (例如，在海藻酸盐中) 增殖困难，前者可改善细胞附着。相比之下，如果细胞附着增强，在收获过程中回收被包裹的细胞可能会带来更困难的挑战。 iPSC监测技术、计算机建模和质量设计 hiPSC敏感的多能性受到细胞微环境、代谢和信号通路变化的影响，因此对需调节干细胞分化的细胞治疗和组织工程方法的发展构成了重大挑战。细胞聚集体悬浮培养和微载体系统的最新进展为有朝一日实现大规模生产用于各种临床应用的hiPSC提供了希望。然而，未来大规模生物反应器 (>5L) 的利用需要开发新的生物反应器监测技术，以便在控制干细胞分化的同时优化iPSC生产过程。 目前有几种离线分析方法可用于生物反应器监测，其中许多方法确定重要的过程变量，如细胞计数、细胞活力和培养基中特定成分的浓度。通常使用染料排除法 (即台盼蓝排除显微镜) 和流式细胞术来测量细胞浓度和活力，而一些流式细胞术也可以量化PSC群体。最近为提高iPSC表征工作的通量所做的努力表明，将荧光细胞条形码 (FCB) 结合到流式细胞术中可以识别多能性和细胞异质性。尽管条形码方法对连续平台不实用，但它们是有用的离线质量控制 (QC) 测试方式。质谱 (MS) 和高效液相色谱 (HPLC) 已被联合用于代谢组学和蛋白质组学研究，确定指示或影响多能性的代谢标记物和途径。这些发现揭示了在代谢物水平上预测和监测iPSC分化的计算机建模的必要性。有趣的是，糖酵解和蛋氨酸代谢被发现调节造血干细胞的分化，因此，模拟这些途径中涉及的关键代谢物的行为可能是一个合适的起点。与此同时，高效液相色谱和质谱系统也得到了改进，以促进在线和近线测量，例如采样自动化，但这些技术仍然受到维护成本和处理样品所需时间的限制。Western blots、qPCR或RT-PCR和免疫组织化学 (ELISA) 是常用的检测方法，通过检测相对于天然ESC的ESC标记基因的表达水平，来确定hiPSC在特定时间点的代谢功能和分化状态。总的来说，在整个制造过程中，有几种有效的离线分析方法可以确定iPSC的多能性和质量。然而，非自动化离线分析测试的样品收集和准备，以及仪器和试剂盒的成本和维护，限制了过程的可放大性，增加了生产成本，牺牲了样品，并存在培养污染的风险。此外，样品采集和数据输出之间的时间延迟大大限制了它们作为过程控制技术的实用性。 为了提高工艺可放大性，生物制药行业最近开始采用质量源于设计 (QbD) 战略，其中工艺和产品管理基于科学知识和风险评估。通过这种方式，可以利用传感器或其它实时检测变化的分析技术开发更灵活的生产工艺，允许通过数据驱动的过程控制进行快速响应，从而在潜在的运行故障发生之前减轻故障。QbD框架通过将可测量的细胞群体的分子和细胞特征与最终产品质量联系起来来运作。就iPSC而言，有效的QbD策略需要实时测量影响干细胞多能性和自我更新的关键参数。 在线传感器在生物反应器过程实时监测方面很有应用前景，包括目前最先进的DO和pH探针。先前的研究表明，缺氧和生物反应器流体动力学可以共同诱导hiPSC向心肌细胞分化，因此，DO水平是生产过程中维持iPSC质量的关键工艺参数。光谱方法，如拉曼和近红外，也可以作为有用的在线探针来监测代谢物 (葡萄糖、乳酸等)，因此，在开发化学计量模型和机器学习算法时，可以提供有用的信息，实时预测和调节iPSC多能性。除了标准的工艺特征外，可重复和稳定形成的hiPSC聚集体对工艺可放大性至关重要。在这方面，某些光学技术显示出作为实时监测细胞健康和分化状态的工具的潜力。例如，双光子激发 (TPE) 荧光显微镜光学测量NAD(P)H和FAD的自身荧光已被证明是监测三维组织构建中细胞分化的有效技术。结合荧光寿命成像显微镜( FLIM)， TPE可以通过NAD(P)H和FAD的光学氧化还原比和荧光寿命来确定MSC的分化状态。通过对NAD+/(NADH + NAD+)的LC-MS/MS测量证实，在分化的MSC培养物中观察到光学氧化还原比值的下降，这是为生物反应器设计的TPE-FLIM探针的潜在能力的一个例子。利用TPE-FLIM作为iPSC监测工具，必须开发一种稳健而灵活的TPEM探针，可以接近生物反应器内的细胞并收集在线数据；然而，目前还没有这样的产品存在。最近，一种原位显微成像装置被开发出来，用于实时可视化和监测连续搅拌罐生物反应器中hiPSC聚集。虽然聚集体大小的控制对维持多能性很重要，但分化进展的直接指示只能通过安装荧光显微镜模块来实现。毫无疑问，仍然需要新的创新工具，结合显微镜成像和荧光检测来评估hiPSC在动态培养中的多能状态。 质量控制措施和考虑因素 为了充分发挥iPSC衍生疗法的潜力，iPSC需要在临床级GMP标准下生产。这是一个复杂的过程，其中iPSC细胞系、传代和关键质量属性 (CQA) 可比性的表征和论证是必不可少的，并且有充分的记录。CQA被定义为生物、化学或物理性质，这些性质应保持在适当的限度内，以维持或控制最终产品的质量。随着自动化、封闭细胞培养系统和经过验证的测试方案的发展，iPSC生产线工业化的目标比以往任何时候都更接近。国际干细胞库倡议 (ISCBI) 最近为临床级hiPSC注册提供了推荐指南，包括：（i）多能性测试; （ii）体外和体内分化测试；（iii）核型分析显示遗传稳定性；（iv）细胞身份鉴定；（v）通过干细胞阵列分析基因表达特性；（vi）微生物试验。 目前用于iPSC扩增的GMP级培养系统需要多次更换培养基和传代，这导致了显著的可放大性、可重复性和成本挑战。由于这些原因，目前个性化iPSC生产的财务成本对大多数患者来说是负担不起的，因此，iPSC库的构建将是有益的。全球iPSC治疗联盟 (GAiT) 的成立旨在支持针对临床应用的iPSC库的创建和全球协调。Alvarez-Palomo及其同事总结了创建临床级iPSC库的关键考虑因素和标准操作程序。 iPSC领域的一个主要QC问题是遗传组稳定性。由于可获得的长期临床数据有限，需要制定严格的遗传稳定性检测指南。先前涉及iPSC的临床试验因在细胞重编程过程中观察到单核苷酸变异(snv)和拷贝数变异(cnv)而暂停。因此，全基因组测序(WGS)，包括snp和比较基因组杂交(CGH)阵列，被推荐作为iPSC产品进入临床前的QC测试。用于生成hiPSC的基因转染平台也对基因组整合带来了巨大的安全问题。由多肽生成的非转基因PSC效率较低，mRNA/miRNA转染需要多个步骤，这就产生了批次间的可变性。毋庸置疑，在整个细胞治疗生物工艺中，遗传标记验证对于开发安全有效的治疗方法至关重要。 结束语和未来展望 在过去的十年中，hiPSC生物工艺技术有了显著的进步，但在临床应用和新产品推出方面的进展仍然缓慢。主要挑战来自基础生物科学和当前大规模生产平台的局限性。现有的hiPSC工艺开发和生产方法是劳动密集型的，这在很大程度上限制了工艺的可放大性，并导致不可预测的批次间可变性。业界一致认为，生产iPSC的最佳方法是悬浮培养，从而提高细胞的生长能力。当选择悬浮方式进行放大时，应考虑将多能性iPSC的生长特征与其随后的分化细胞类型结合起来的工艺，因为一些研究已经发现了多种有益的基质来生长特定类型的高质量iPSC。与重复批次工艺相比，完全自动化的灌流操作与培养环境的反馈控制将允许营养物质的持续置换，并获得显著更高的细胞产量。由于诱导多能干细胞的应激敏感性，目前的灌流系统仅成功用于小鼠诱导多能干细胞。然而，使用现有的ACF培养基和微载体悬浮微球成功扩展hiPSC，表明该行业未来有能力实现可放大的高质量PSC密度。此外，存在进一步推进iPSC工艺发展领域的额外机会。 随着新技术和新模式的出现，需要工艺友好的表征方法和监测工具来控制iPSC在生产过程中的质量。由于基因组和代谢组稳定性对hiPSC的重要性，基因组维度的模型可用于确定影响多能性的关键工艺参数，并指导生产过程中生长表型的优化。此外，结合图像和荧光显微镜的更灵敏的细胞质量检测工具将进一步增强实时监测干细胞分化的PAT。随着这些分析工具的发展，进一步的培养基优化和QbD策略的扩大，临床级iPSC的大规模生产的目标将在未来十年实现。 参考资料：A.Polanco, B.Kuang, S.Yoon, Bioprocess Technologies that Preserve the Quality of iPSCs. Trends in Biotechnology, 2020. 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

文章解读+创新点拓展，为您带来科研新体验～ 导读 在生物学研究中，理解细胞间的通信机制对于揭示复杂生物过程至关重要。近日，《Nature Methods》上发表的一项突破性研究《Inferring pattern-driving intercellular flows from single-cell and spatial transcriptomics》引入了一种名为FlowSig的新方法，该方法通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）和空间转录组学（ST）数据推断由通信驱动的细胞间信息流。这项技术不仅为科学家们提供了深入洞察细胞内部运作的新视角，也为临床医生带来了探索疾病发生发展机制的新工具。 研究背景 细胞通过生化信号相互交流以组织生物活动，这些时空流动的“因果”关系推动着每一个生物学进程。然而，传统的分析方法往往将细胞间通信视为独立事件，忽略了其与细胞内基因调控模块之间的关联。为了填补这一空白，研究人员开发了FlowSig，这是一种基于图形因果模型和条件独立性的新方法，它能够从scRNA-seq或ST数据中推断出由通信驱动的细胞间信息流。 研究设计与结果 FlowSig的核心在于建模细胞间信息流动，即从流入的细胞间信号到捕捉细胞内调节响应的基因表达模块（gene expression module，GEM），再到流出的细胞间信号。具体而言，FlowSig利用额外的扰动数据和下游转录因子靶点路径知识来学习准确的细胞间流动。当处理难以精确推断配体-受体相互作用的数据时，FlowSig结合“对照vs.扰动”实验提供的信息，使用差异表达分析和条件不变性测试推断最可能驱动细胞间流动的输入输出变量集合。此外，FlowSig还支持从空间转录组学数据直接推断每个空间位置接收到的流入信号量，从而无需额外的扰动数据即可推断细胞间流动。 在验证过程中，研究人员首先使用合成数据集进行测试，确保FlowSig能正确反映数学模型模拟出的细胞间流动特征。随后，他们应用FlowSig分析了新生成的皮质类器官实验数据，展示了该方法捕捉刺激诱导变化、展现因COVID-19严重程度增加而引起的细胞间流动转变以及重建小鼠胚胎发育中形态发生素驱动激活剂-抑制剂模式的能力。 图1：对FlowSig模型的描述 研究者开发了FlowSig模型，用于描绘细胞间信息流动的方向性。该模型包含从流入信号（受体基因表达量与下游转录因子基因集平均表达量的乘积Ri×TFi）到基因表达模块（即细胞成员归属至潜在GEM因子GEMi），再到流出信号（信号配体基因表达Li）的有向边（图1a）。在“对照vs.扰动”实验中，系统可能因外部刺激、疾病或时间变化而改变。FlowSig通过差异表达分析和条件不变性测试，识别出分布显著变化的流入和流出变量，以确定最有可能驱动细胞间流动的因素，从而减少数据生成的所有可能网络的数量，并构建更精确的完全部分有向无环图（completed partial directed acyclic graph，CPDAG）（图1b）。 对于难以准确推断配体-受体相互作用的情况，FlowSig能从空间转录组学数据中更精准地估算每个位置接收到的流入信号量，使得即使没有额外的扰动数据，也能推断细胞间的流动（图1c）。具体来说，FlowSig使用COMMOT推断接收的信号配体量（rec. Li），并结合空间解析的GEM（GEMi），最终关联到流出变量（Li）。 图2：FlowSig的合成验证 为了验证FlowSig的有效性，研究人员生成了基于数学模型的模拟实验数据集，用以模拟真实的细胞间流动情况。结果表明，FlowSig能够准确恢复预期的细胞间流动网络结构，证明其算法设计合理且可靠。 研究进一步探讨了SHH信号诱导的单向细胞间流动（图2a）及其对组织模式化的影响（图2b），以及SHH与BMP4之间的竞争关系（图2c）。通过量化FlowSig的真阳性率（TPR）和真阴性率（TNR），研究人员发现：在所有场景中（图2d-f），结合受体表达作为信号流入或引入扰动数据并不会改变平均TPR。使用结合受体进行流入测量显著提高了平均TNR，尤其是在复杂的多方向流动模型中，如SHH驱动的模式化以及SHH与BMP4的竞争关系（图2e,f）。 通过条件不变性测试整合扰动数据，可以减少TNR值的变化，包括四分位数范围和异常值，从而获得更精确的细胞间流动估计。这些结果显示，FlowSig有效地减少了基线GSP和UT-IGSP算法推断中的假阳性数量，提升了细胞间流动预测的准确性。 图3：使用皮层样器官模型验证FlowSig的实验验证 研究者使用皮层发育的类器官模型进一步验证了FlowSig的有效性。从人类胚胎干细胞中生成皮层类器官，并在培养第18天（D18）和第35天（D35）收集样本进行scRNA-seq分析。在该模型中，皮层身份的细胞命运于D18确定，而FGF和BMP信号响应则在D35建立。研究者将D35的数据视为对D18“对照”数据的“扰动”，模拟了这些信号通路的影响。 通过CellChat分析，识别出77个独特的配体-受体相互作用，这些相互作用在细胞间流动中扮演不同角色。FlowSig进一步筛选出26种流入的差异信号（图3a）和16种流出的差异信号（图3b），包括关键的FGF和BMP信号。研究者利用pyLIGER从2,793个高度可变基因中构建了20个GEM，并基于此构建了用于推断细胞间流动的62个变量（图3c）。 为了确定主要驱动因素，研究者根据信号流入变量的总边频次进行了排序，发现FGF、MK（中胚层因子）、PTN（多效生长因子）和NRG（神经调节素）是细胞间流动的关键驱动者。特别是FGF流入通过多个GEM驱动了BMP4、IGF-II、NGF、NRG1和NRG3等信号的流出（图3d）。此外，EOMES被确定为潜在的FGF流入调控候选者。相比之下，BMP流入通过较少的GEM被调节，且可能由PAX6或NR2F1介导（图3e）。 为了验证FlowSig分析结果，研究者在D15-D21期间分别添加FGF8b和BMP4激活相应的信号通路，并在D35时收集样品进行RT-qPCR分析。结果显示，激活FGF信号显著下调了EOMES的表达（图3f），而激活BMP信号则下调了PAX6并上调了NR2F1的表达（图3g），证实了FlowSig预测的准确性。 图4：FlowSig在胰岛扰动非空间scRNA-seq中的应用 为了验证FlowSig在恢复由外部扰动驱动的细胞间流动方面的能力，研究者分析了干扰素-γ（IFN-γ）刺激的人胰岛scRNA-seq数据。使用pyLIGER构建了10个GEM，这些模块与独立识别的5个细胞类型簇（alpha、beta1-3和delta）对齐（图4a）。基于这些细胞类型注释，CellChat推断出各细胞组之间显著的成对配体-受体相互作用。 IFN-γ刺激显著改变了多个信号通路的流入量：通过FGFR1增加了FGF信号通路的流入，通过IL-6R和IL-6ST增加了IL-6的流入，通过CD74和CD44增加了MIF的流入，通过NCL增加了MDK的流入，并通过SSTR2增加了SST的流入（图4b）。同时，IFN-γ刺激还影响了流出信号，增加了GCG、INHBA和NAMPT的流出量，减少了ANGPTL2、SPP1、TGFβ1、TNFSF12和UCN3的流出量（图4c）。FlowSig识别出FGF、IL-6、MDK和SST是主要驱动细胞间信息流动的因素，这些信号驱动了GCG、INHBA、NAMPT、SPP1、TGFβ1、TNFSF12和UCN3的流出（图4d）。 为了进一步探索IFN-γ刺激的影响，研究人员将全局细胞间流动网络分为两个子网络：上调子网络：对应于IFN-γ刺激上调的流出信号，连接到这些流出变量的GEM及相关的流入节点（图4e）。下调子网络：对应于IFN-γ下调的流出信号，以类似方式构建（图4f）。 这两个子网络共享相似的流入节点和GEM，但GEM-3仅存在于“上调”网络中，这表明它在IFN-γ刺激下具有专门的作用。GEM-3主要富集在α细胞内，表明刺激驱动了来自α细胞的GCG和NAMPT流出。其他流入信号和GEM则在两种条件下共享，显示了它们的双重调控功能。 图5：FlowSig在中度或重度COVID-19患者取样的人类BALF的scRNA-seq中的应用 为了验证FlowSig处理多个扰动的能力，研究者分析了健康对照组、中度和重度COVID-19患者支气管肺泡灌洗液（BALF）细胞的scRNA-seq数据。使用CellChat结合原始研究中的细胞类型注释，推断出显著的配体-受体相互作用，结果显示健康对照组、中度和重度COVID-19组分别有46个、55个和54个活跃信号通路。 通过pyLIGER构建了20个GEM，这些GEM捕捉了不同条件下的差异（图5a）以及细胞类型间的差异（图5b）。FlowSig识别出每种COVID-19状态相对于健康对照组特有的流入和流出信号变化（图5c）。 为了深入分析这些流出信号驱动的细胞间流动，研究者提取了每个不同流出信号集上游的流入信号及相应的GEM（图5d-f）。尽管随着COVID-19严重程度增加，不同流出信号数量增多，但推断的流入信号数量却从健康对照组的37个减少到中度患者的32个，再到重度患者的25个。类似地，调节性GEM的数量也从健康对照组的16个减少到中度患者的13个，再到重度患者的8个。这表明随着疾病进展，某些特定的细胞间通信路径逐渐丧失。 进一步分析显示，在所有三种条件下共有20个信号流入，而没有发现仅在中度或重度COVID-19中特有的流入信号。TNFRSF12A（由TNFSF12驱动）以及ITGAX和ITGB2 （由C3驱动）的流入信号仅在健康对照组中存在。CAP（来自RETN1）的流入信号则仅在中度和重度COVID-19之间共享（图5g）。 观察到的GEM趋势相似，共享程度最高的GEM是在健康和中度COVID-19群体中的7个GEM，以及在所有三个条件下的5个GEM。GEM-4和GEM-10仅在健康个体中驱动信号流出，而GEM-7（与嗜碱性粒细胞相关）仅在中度和重度COVID-19群体中共享（图5h）。 图6：FlowSig在E9.5小鼠相关性空间立体序列数据中的应用 研究者利用FlowSig对胚胎发育阶段E9.5的鼠胚进行了ST-seq数据分析，揭示了Shh（Sonic Hedgehog）和Wnt5a信号通路之间的复杂双向流动。通过非负空间分解法，研究者从712个空间可变基因中构建了20个高分辨率的空间GEM，这些GEM捕捉了细胞间通信的关键特征（图6a）。 FlowSig识别出多个Shh外流的上游驱动因子，这些因子通过特定的GEM调节Shh外流，并推断出接收的Shh内流（r-Shh）驱动多个信号配体的外流途径，涉及多个GEM（图6c）。为了进一步确定Shh外流的上游调控TF，研究者使用随机森林模型分析了前10个TF的重要性，最终识别出Foxa2、Foxp2、Myc、Zc3h7a和Foxa1为Shh外流的主要上游调控TF（图6d）。 为了识别r-Shh流入的下游靶标，研究者使用pyGAM拟合每个推断出的下游基因表达网络中前10个r-TF的表达与r-Shh流入之间的关系，并根据Spearman相关系数排序。结果显示，Barhl1、Nkx2-1、Meox1、Tcf21和Foxp2与r-Shh的相关性较低，而Foxe1、Nkx2-2、Pou3f1、Tlx2和Nkx2-4等已知靶点表现出显著相关性（图6e）。 研究者观察到Shh和Bmp4、Cxcl12、Igf2、Mdk以及Wnt5a之间可能存在双向流动。为了验证这一假设，研究者分析了各配体与其下游r-Shh流入的关系。结果显示，只有Wnt5a通过GEM-5的转录因子显著受r-Shh流入调节（图6f）。此外，研究者发现r-Wnt5a流入通过空间扩散下调Myc介导的Shh流出，形成一个激活抑制系统（图6g）。这种激活抑制系统的三个关键特征如下：1）信号传播：Shh和Wnt5a配体都能扩散；2）自我上调：Shh通过Foxa2上调自身，Wnt5a通过Foxa1、Nkx6-1 和Sox21上调自身；3）抑制机制：Wnt5a通过下调Myc来抑制Shh。 这些观察结果表明，Shh和Wnt5a之间的双向流动类似于Turing模式生成系统，该系统在发育过程中驱动细胞命运图案化。因此，在E9.5时，Shh和Wnt5a信号通路可能共同作用于胚胎发育中的细胞命运决定过程（图6h）。 综上所述，FlowSig是一款强大的细胞间通信和信息流分析工具，对于分析发育过程中以及强烈单因素（比如药物）或多因素（比如病理微环境）扰动带来的细胞间信息流变化有着非常积极的作用，有助于推动对生命科学和生物医学复杂系统过程的动态理解。 拓展延伸 FlowSig技术在其他科研领域的广泛应用前景： ● 肿瘤微环境与癌症治疗 在肿瘤学领域，单细胞RNA测序（scRNA-seq）和空间转录组学（ST）结合FlowSig方法的应用具有巨大的潜力。肿瘤不仅仅是单一类型的细胞集合，而是一个复杂的生态系统，包括癌细胞、免疫细胞、基质细胞等多种成分。通过scRNA-seq可以揭示肿瘤内部不同细胞亚群的异质性，以及它们之间的相互作用网络。例如，在乳腺癌研究中，科学家们利用scRNA-seq发现了多种肿瘤相关巨噬细胞（TAMs），这些细胞不仅促进了肿瘤生长，还影响了化疗药物的效果。借助FlowSig，研究人员能够更加细致地描绘出TAMs与其他细胞类型间的通信路径，从而找到新的治疗靶点或预测患者的预后。 此外，空间转录组学数据提供了额外的空间维度信息，这对于理解肿瘤组织内的结构特征至关重要。比如，某些类型的免疫检查点分子表达可能集中在特定区域，形成所谓的“免疫冷区”。通过整合ST和FlowSig分析，可以精准定位这些冷区，并探索其形成的分子机制，进而开发更有效的免疫疗法策略。这种多模态的数据融合为个性化医疗方案的选择提供了科学依据。 ● 再生医学与干细胞研究 再生医学旨在修复受损组织器官的功能，而干细胞则是实现这一目标的关键角色之一。scRNA-seq和ST技术可以帮助科学家深入了解干细胞分化过程中的基因调控变化，确保生成的组织具备正确的细胞组成。以心脏再生为例，心肌梗死后的心脏修复需要诱导内源性干细胞向心肌细胞方向分化。然而，实际操作中往往面临效率低下等问题。FlowSig可以通过构建详细的细胞间通信模型，指导优化培养条件，提高干细胞定向分化的成功率。 同时，对于移植后的干细胞存活率低的问题，scRNA-seq和ST有助于识别影响细胞存活的关键因素。例如，在骨髓移植过程中，宿主微环境中存在的炎症因子可能会抑制新植入干细胞的增殖。利用FlowSig解析这些不利信号通路，研究人员可以采取措施减少负面影响，改善移植效果。总之，scRNA-seq和ST结合FlowSig的方法为解决再生医学面临的挑战提供了强有力的支持。 ● 神经科学研究 神经系统由高度特化的神经元构成，每个神经元之间通过突触连接传递信息。scRNA-seq和ST技术使得我们能够在单细胞水平上研究神经元及其支持细胞（如星形胶质细胞、小胶质细胞等）之间的交流模式。这对于理解大脑发育、学习记忆等生理过程非常重要。例如，FlowSig已被用于分析皮质类器官中的细胞间流动，揭示了Wnt5a-Shh双向流动关系，其中Shh促进自身及Wnt5a的表达，而Wnt5a则抑制Shh的表达，形成了一个潜在的Turing模式。这种反馈机制有助于解释某些特定的空间结构形成，并可能成为未来研究的重点方向之一。 此外，scRNA-seq和ST还可以帮助探究神经系统疾病的发生机制。阿尔茨海默病是一种常见的神经退行性疾病，其病理特征之一是β-淀粉样蛋白斑块沉积。通过scRNA-seq分析患者脑组织样本，发现了一些参与清除这些有毒蛋白质的免疫细胞类型。结合FlowSig，可以进一步探讨这些细胞如何响应损伤信号，并寻找增强其功能的方法，最终达到延缓疾病进展的目的。 ● 免疫学与感染性疾病 免疫系统负责保护机体免受外来病原体入侵。scRNA-seq和ST技术为解析免疫反应提供了前所未有的机会。特别是在病毒感染的情况下，了解宿主细胞对病毒复制的反应至关重要。例如，在新冠病毒（SARS-CoV-2）感染期间，肺泡灌洗液（BALF）中存在大量的免疫细胞。通过scRNA-seq分析，研究人员能够区分不同的免疫细胞亚群，并追踪它们随时间的变化情况。FlowSig则可用于推断这些细胞间的相互作用，特别是那些对抗病毒至关重要的细胞通讯。 另一个重要应用是在疫苗研发方面。为了评估疫苗诱导的免疫应答，通常需要监测接种者体内抗体水平和T细胞活性。scRNA-seq不仅可以检测到抗原特异性B细胞和T细胞的存在，还能提供关于它们克隆性和表型特征的信息。结合FlowSig分析，可以从整体上把握免疫系统的动态变化，为优化疫苗配方提供参考。此外，这种方法也有助于发现新型免疫调节剂，提升现有疫苗的效果。 临床应用与展望 FlowSig作为一种强大的数据分析工具，在转化医学领域具有广泛的应用前景。例如，在肿瘤学方面，了解肿瘤微环境中不同细胞类型的互动可以帮助识别新的治疗靶点；而在再生医学领域，FlowSig可以协助优化干细胞分化策略，提高组织工程产品的质量。此外，随着单细胞技术和空间转录组学技术的发展，FlowSig将帮助临床医生更深入地理解病理状态下细胞群体的行为变化，进而指导个性化医疗方案的选择。 注：本文旨在介绍医学研究进展，不做治疗方案推荐。如有需要，请咨询专业临床医生。 参考文献： Almet AA, Tsai YC, Watanabe M, Nie Q. Inferring pattern-driving intercellular flows from single-cell and spatial transcriptomics. Nat Methods. 2024 Oct;21(10):1806-1817. 点击下方「阅读原文」，前往梅斯官网查询更多相关课程和实验技术服务支持~

引言 衰老是生物体不可避免的过程，而大脑作为神经系统的核心，不仅在维持认知功能中扮演着重要角色，同时也是衰老影响最深远的器官之一。随着年龄增长，大脑中的细胞和组织会经历显著的退化，表现为认知能力下降、记忆力衰退，以及神经退行性疾病（如阿尔茨海默病）的风险显著增加。然而，尽管我们对衰老过程中分子和细胞水平的变化已有一定了解，现有研究大多集中于单细胞转录组学，忽视了细胞之间的空间关联和相互作用。这种空间维度的缺失限制了我们对衰老如何在组织层面扩散和加剧的深入理解。 为了填补这一空白，12月18日Nature的研究报道“Spatial transcriptomic clocks reveal cell proximity effects in brain ageing”，利用一种先进的高通量空间转录组学技术——多重误差修复荧光原位杂交（MERFISH），首次构建了涵盖4.2百万细胞的单细胞分辨率小鼠大脑衰老全景图谱，横跨小鼠整个成年生命周期。研究人员不仅在时间维度上捕捉了细胞种类和基因表达的动态变化，还在空间维度上揭示了不同细胞之间的相互作用与影响，甚至包括罕见细胞类型（如T细胞和神经干细胞，NSC）。此外，该研究进一步开发了基于机器学习的“空间衰老时钟”（spatial ageing clocks），可以精准预测细胞的生物年龄，揭示不同细胞类型对周围细胞的“促衰老”或“促年轻化”效应。 研究结果表明，大脑中的T细胞随年龄增长显著增加，并通过邻近效应对周围细胞产生强烈的促衰老作用；而神经干细胞则表现出显著的促年轻化效应，为潜在的抗衰老干预提供了重要的靶点。更为引人注目的是，研究还探索了运动和基因重编程等干预手段对衰老的影响，为延缓甚至逆转大脑衰老提供了重要的科学依据。 大脑衰老：隐藏的危机 随着年龄增长，大脑衰老逐渐成为影响人类健康的重要因素。它不仅导致认知功能的退化，例如记忆力减弱、信息处理能力下降，还显著增加了神经退行性疾病（如阿尔茨海默病和帕金森病）的风险。衰老对大脑的影响深刻且多层次，它改变的不仅仅是单个细胞的生理状态，更体现在细胞之间复杂的相互作用和空间组织上。然而，现有研究多聚焦于单细胞的基因表达变化，忽视了细胞与邻近细胞之间的关联性及其在组织衰老中的作用，这使得我们对大脑衰老的理解仍然碎片化。 研究发现，大脑的衰老不仅表现为某些细胞类型的减少，还伴随着一些细胞类型的显著增多。例如，小胶质细胞（microglia）和T细胞（T cells）在衰老过程中数量明显增加，而神经干细胞（neural stem cells, NSCs）和神经母细胞（neuroblasts）则逐渐减少。这种细胞组成的变化直接影响了大脑的生理功能和修复能力。数据显示，T细胞的比例从年轻小鼠（3.4个月）的极低水平增加到老年小鼠（34.5个月）时的显著高峰（相关性r = 0.72）。与此同时，NSC的比例则从年轻时的较高水平下降到几乎不可检测的低值（相关性r = -0.93）。这些动态变化为我们揭示了细胞种类间的“此消彼长”，预示着大脑环境的逐渐恶化。 此外，衰老不仅是“单细胞”的孤立现象，它可能通过细胞之间的“邻里效应”加剧整个组织的老化。例如，T细胞被发现对周围细胞具有强烈的“促衰老”效应，而NSC则展现出“促年轻化”的潜力。这种跨细胞的相互影响或许是大脑衰老过程加速的关键所在。 技术突破：揭开脑衰老的时空之谜 理解大脑衰老的复杂过程，需要不仅在时间维度上捕捉细胞变化，还要解码细胞在组织空间中的相互作用。然而，传统的单细胞RNA测序技术虽然能够揭示细胞的基因表达，但却无法提供空间位置信息，限制了我们对组织层面衰老机制的全面理解。该研究通过采用一种先进的高通量空间转录组学技术——多重误差修复荧光原位杂交（MERFISH），成功实现了对小鼠大脑在单细胞水平的时空解析，为揭示大脑衰老的全貌打开了一扇全新的大门。 MERFISH技术的核心优势在于其能够在保持组织空间结构的同时，对单个细胞内的数百种基因进行高精度测量。在该研究中，研究团队利用MERFISH对20个不同年龄阶段的小鼠大脑进行系统分析，涵盖了从3.4个月到34.5个月的完整生命周期。这项技术帮助研究人员从冠状切片和矢状切片中收集了总计超过420万细胞的空间转录组数据，分析了300个关键基因，这些基因涵盖了细胞类型标记、衰老相关通路以及疾病相关过程。这种无损组织结构的技术，使得研究人员能够以细胞类型为单位，准确定位不同基因的表达，同时揭示细胞之间的空间关联。 研究的创新之处在于，它不仅捕捉了细胞在时间维度上的变化，还首次揭示了空间维度中细胞比例和分布的动态特征。例如，研究发现，兴奋性神经元和抑制性神经元主要分布于皮层区域，而小胶质细胞和少突胶质细胞则更多集中于白质区。更重要的是，MERFISH技术揭示了特定细胞（如T细胞和神经干细胞）对周围邻近细胞的影响，这为理解衰老过程中的“邻里效应”提供了新的视角。 通过MERFISH，研究团队得以绘制出世界首个大脑衰老的时空地图，这不仅填补了单细胞技术在空间信息上的空白，也为进一步研究大脑衰老及其干预策略提供了强大的技术工具。 跨生命周期的大脑单细胞空间转录组学分析（Credit: Nature） 通过MERFISH技术进行的跨生命周期小鼠大脑单细胞空间转录组学研究，系统分析了不同年龄阶段的细胞类型和基因表达的动态变化。 a. 实验流程 实验的整体设计，研究通过从不同年龄段小鼠的大脑冠状切片和矢状切片中采样，并利用MERFISH技术测量300个基因的表达，这些基因涵盖了细胞类型标记、衰老相关通路和疾病相关基因。这项实验覆盖了整个成年生命周期，从年轻小鼠（3.4个月）到老年小鼠（34.5个月），提供了高分辨率的单细胞空间转录组数据。 b. 细胞类型的空间分布与UMAP投影 使用UMAP可视化所有冠状切片和矢状切片中的单细胞数据，并根据细胞类型进行着色：左侧UMAP图，展示了所有细胞的类型分布，如神经元、胶质细胞和免疫细胞等。右侧空间分布图，显示了一个典型冠状切片和一个典型矢状切片中细胞的空间分布，并标注了解剖学区域（如皮层、胼胝体等）。结果显示，不同细胞类型在空间上的分布高度一致，例如兴奋性神经元主要集中于皮层，而小胶质细胞和少突胶质细胞则更多分布于白质区域。 c. 细胞类型组成的年龄相关变化 研究分析了冠状切片数据集中不同细胞类型随年龄的比例变化，每个点代表一只小鼠。使用回归曲线拟合结果显示：随年龄增加，T细胞和小胶质细胞的比例显著上升（标记为红色，表明正相关），例如T细胞的相关性r = 0.72。神经干细胞（NSCs）和少突胶质祖细胞（OPCs）则显著下降（标记为蓝色，表明负相关），如NSCs的相关性r = -0.93。 d. 细胞在空间中的分布 以散点图显示了所有冠状切片中细胞的空间分布：不同类型的细胞用颜色标记，例如T细胞（红色）和NSCs（蓝色），其他细胞为灰色。结果揭示了不同细胞类型在空间分布上的显著差异，并且细胞间的空间邻近关系可能对衰老过程产生重要影响。 e. 基因表达的年龄相关变化 分析了每种细胞类型中随年龄表达显著变化的基因数量：小胶质细胞中表现出最多的基因表达变化，尤其是免疫相关基因的显著上调。统计了前五种细胞类型中基因变化幅度最大的基因，例如 Pdcd1（上调）和 Fcrls（下调）。 f. 时空基因表达轨迹聚类 构建了基因、细胞类型和空间亚区域的轨迹聚类，识别出九种不同的时空表达模式（如“逐步增加”、“早期下降”等）。这些轨迹揭示了基因表达在衰老过程中随时间和空间的动态变化规律，例如免疫相关基因的“晚期增加”轨迹与衰老炎症加剧一致。 g. 基因表达的分布趋势 绘制了基因表达随年龄的平滑中值曲线及其区间误差范围。不同基因轨迹显示了与年龄的Pearson相关性，例如某些基因在晚期表现出强烈的上调或下调趋势。 h. 两个关键基因的轨迹热图 以热图形式显示了两个代表性基因（Stat1 和 Gamt）的轨迹：Stat1（免疫响应基因）呈现“晚期增加”模式，尤其在免疫细胞中显著上调。Gamt（肌酸合成基因）在神经元中呈现“逐步减少”模式，反映了神经代谢功能的下降。 i. 空间基因表达的直接可视化 显示了细胞空间分布中的基因表达水平：例如，Stat1 的表达水平主要分布于免疫细胞区域（红色），而 Gamt 的表达则集中在代谢活跃的区域（蓝色）。 衰老的大脑地图：细胞组成的动态变化 大脑是一个由多种细胞类型构成的复杂网络，而衰老不仅改变了这些细胞的功能，还显著影响了它们的组成和分布。通过构建覆盖整个生命周期的小鼠大脑衰老时空图谱，研究人员揭示了不同细胞类型在衰老过程中比例的动态变化及其潜在的生物学意义。 在年轻阶段，大脑中神经元占据主导地位，这些兴奋性和抑制性神经元（neuron-excitatory, neuron-inhibitory）分布于皮层区域，维持着大脑的正常信息传递与处理功能。然而，随着年龄增长，这些神经元的比例逐渐减少，同时，支持性和免疫相关的细胞类型显著增加。例如，小胶质细胞（microglia）和少突胶质细胞（oligodendrocyte）在衰老过程中表现出持续上升的趋势。其中，小胶质细胞作为大脑的常驻免疫细胞，其比例从年轻小鼠的约0.03增加到老年小鼠的约0.06，增幅达一倍以上。这种增加表明大脑正在经历更强的炎症反应，而这种低度慢性炎症（也被称为“炎症衰老”）与神经退行性疾病的发生密切相关。 更值得注意的是，免疫细胞T细胞（T cell）的比例在衰老过程中显著提升，显示出其潜在的促衰老作用。研究发现，T细胞比例与年龄呈显著正相关（r = 0.72），而其分布并不局限于特定区域，几乎遍布整个大脑。这种现象暗示了T细胞可能通过释放促炎因子对周围细胞产生广泛影响，加速衰老进程。 相较之下，神经干细胞（NSC）和神经母细胞（neuroblast）的比例却大幅下降。研究显示，NSC在年轻阶段活跃于侧脑室区域（ventricular zone），但其比例从3.4个月的小鼠高峰下降到34.5个月时几乎不可检测（r = -0.93）。这一发现揭示了随着衰老，大脑的自我修复和再生能力显著减弱，进一步加剧了功能退化的风险。 这种细胞组成的动态变化反映了大脑在衰老过程中从“功能性”向“保护性”的转变——神经元减少，免疫细胞和胶质细胞增加。尽管这种变化可能是大脑自我保护的一种尝试，但同时也为疾病的发生和进展埋下了隐患。 邻里效应：细胞间的“善”与“恶” 衰老并非仅仅是个体细胞内的孤立事件，它更是一种由细胞间复杂互动所推动的“社会性”现象。在大脑中，某些细胞的“邻里效应”对周围环境的影响尤为显著，甚至可以在局部范围内加速或延缓衰老的进程。该研究通过“空间衰老时钟”（spatial ageing clocks）技术，首次揭示了T细胞和神经干细胞（NSC）在这一过程中截然不同的角色——前者扮演“加速衰老”的反派，而后者则以“促进年轻化”的方式对抗衰老。 研究发现，T细胞的促衰老效应尤为显著。随着年龄增长，T细胞在大脑中的比例持续上升，并且广泛分布于所有区域。利用空间衰老时钟分析发现，T细胞对周围细胞（尤其是少突胶质细胞和血管周细胞）的邻近效应表现为强烈的“促衰老”作用，这种效应在老年小鼠中更加明显。具体而言，当T细胞靠近其他细胞时，这些邻近细胞的生物年龄会显著加速。研究进一步指出，这种促衰老效应可能与T细胞释放的促炎因子（如干扰素-γ，IFN-γ）有关，这些因子会引发周围细胞的炎症反应，从而加速其功能衰退。 与之形成鲜明对比的是，NSC展现了强大的促年轻化效应。作为位于侧脑室区域的关键修复细胞，NSC的存在能够通过释放神经生长因子和其他调节因子显著减缓邻近细胞的衰老。研究显示，这种“促进年轻化”的影响主要作用于少突胶质祖细胞（OPC）和血管周细胞，帮助它们维持健康状态，并在年轻小鼠中尤为显著。然而，随着年龄增长，NSC的数量逐渐减少，其促年轻化效应也随之减弱。 有趣的是，这种细胞间的“善”与“恶”效应并非单向的。例如，T细胞的促衰老效应范围广泛，可以通过炎症信号传播到更远距离，而NSC的促年轻化效应则局限于近距离范围。这提示了T细胞和NSC在衰老过程中的不同作用机制：前者通过扩散性炎症信号驱动全局性老化，而后者则通过局部因子保护邻近环境。 这些发现揭示了细胞间互动在大脑衰老中的重要性，也为未来开发以T细胞和NSC为靶点的抗衰老疗法提供了新方向。 基因的时空轨迹：衰老如何改变大脑的分子图谱 衰老不仅改变了大脑中细胞的构成，也在分子层面上引发了基因表达的深刻变化。这种变化随着时间和空间的推移不断累积，塑造了复杂的衰老分子图谱。该研究通过对小鼠大脑中300个关键基因的时空表达轨迹分析，揭示了免疫、代谢和修复相关基因在衰老过程中如何动态调控，为我们提供了全新的视角。 首先，研究发现，随着年龄增长，与免疫反应相关的基因显著上调，显示出炎症在大脑衰老中的核心作用。例如，小胶质细胞中负责免疫调节的 Pdcd1（程序性死亡受体1编码基因）在衰老过程中显著上升，其表达水平与年龄高度相关（Spearman相关系数ρ = 0.93）。这种变化可能反映了随着衰老，大脑内部的炎症反应逐渐增强。同时，与补体系统相关的基因 C3 也在衰老过程中强烈上调，进一步佐证了大脑炎症环境的加剧。 与此同时，与代谢和修复相关的基因则呈现出截然不同的轨迹。研究显示，在少突胶质细胞和神经干细胞中，参与抗氧化和DNA修复的关键基因 Cat（编码抗氧化酶催化酶）和 Bmp4（参与组织修复的信号因子）表达逐渐下降。这种“逐步减少”的轨迹表明，随着衰老，大脑的修复能力正在逐渐衰退，可能为细胞损伤和神经退行性病变的发生埋下隐患。 更重要的是，基因表达的变化并不均匀地分布于整个大脑，而是表现出显著的空间异质性。例如，干扰素响应基因 Stat1 在多个细胞类型中表现为“晚期增加”的轨迹，尤其是在白质区域（如胼胝体），这提示了白质可能是衰老的“热点”。而参与代谢途径的 Gamt 基因（与肌酸合成相关）则在神经元中表现为“逐步减少”，显示出神经元代谢功能的逐渐低下。 这些基因的时空轨迹为我们描绘了大脑衰老的动态分子图景，也提示了细胞和区域之间在衰老过程中的不同“命运”。研究还发现，这些基因表达变化与神经退行性疾病的通路存在显著重叠，进一步凸显了其生物学意义。 空间衰老时钟：解码细胞的生物年龄 在衰老研究中，精准量化细胞的生物年龄是理解衰老进程的关键。然而，传统方法往往局限于分子标记的线性分析，无法全面捕捉细胞在复杂组织环境中的老化状态。该研究突破性地提出了一种“空间衰老时钟”（spatial ageing clocks）的方法，通过结合空间转录组学和机器学习，为量化细胞衰老提供了一个强大的新工具。 “空间衰老时钟”基于小鼠大脑的高通量MERFISH数据，利用机器学习模型训练了多种细胞类型的基因表达特征与年龄的关联。研究团队通过创新性的“SpatialSmooth”方法，在每种细胞类型内构建了邻域图，逐步平滑空间邻近细胞的基因表达数据，从而既保留了空间信息，又显著提高了预测精度。结果表明，该方法在14种细胞类型中均表现出较高的预测性能，Pearson相关系数R值均超过0.7，包括T细胞、神经干细胞（NSC）等罕见细胞类型。 通过这些时钟，研究不仅能够量化每个细胞的生物年龄，还可以识别特定细胞类型的“加速衰老”或“延缓衰老”状态。例如，研究发现，小胶质细胞和T细胞在老年小鼠中表现出显著的“年龄加速”现象，提示它们在衰老过程中可能起到驱动作用。而神经干细胞则显示出生物年龄显著低于实际年龄的特性，进一步确认了其“促年轻化”潜力。 更为重要的是，空间衰老时钟为研究疾病和干预提供了一个前所未有的工具。通过将该时钟应用于阿尔茨海默病模型小鼠和炎症诱导的加速衰老模型，研究揭示了特定细胞类型（如少突胶质细胞和神经元）的生物年龄显著加速，尤其是在大脑白质区域。这种精细的时空分析能够帮助研究人员锁定疾病早期变化的细胞和区域，为精准治疗提供依据。 此外，空间衰老时钟还能评估干预效果。在运动和基因重编程实验中，该工具成功检测到某些细胞类型（如内皮细胞、血管周细胞）的生物年龄显著“年轻化”，为验证抗衰老措施的有效性提供了一个可量化的指标。 通过这项技术，研究人员不仅能够更全面地解读衰老的复杂过程，还能预测不同细胞类型的老化轨迹。 逆转时间：运动与基因重编程的抗衰老潜力 如果衰老是不可逆的，那么如何延缓甚至逆转大脑的衰老进程？在这一领域，运动和基因重编程作为两种广泛研究的干预方式，展现了独特的抗衰老潜力。该研究利用空间衰老时钟，首次系统性地评估了这些干预措施对不同细胞类型的影响，揭示了它们的作用机制与局限性。 运动的系统性抗衰老效应 研究发现，运动对多个细胞类型展现了强大的抗衰老作用，尤其是在血管相关的细胞中效果显著。例如，在老年小鼠中，运动使内皮细胞（endothelial cells）的生物年龄平均降低了4.9个月，血管周细胞（pericytes）和血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells, VSMCs）的生物年龄分别降低了3.4个月和4.7个月。这些细胞类型分布在脑部多个区域，而运动对它们的年轻化作用广泛而强大，特别是在白质和皮层区域。这种现象可能与运动带来的全身循环改善和血管新生密切相关。研究还发现，运动对神经母细胞（neuroblasts）在部分区域（如胼胝体附近）也有明显的年轻化作用，可能是因为运动激活了局部的生长因子。 然而，运动的作用并非完全均匀。例如，在神经干细胞（NSCs）所在的侧脑室区域，运动未能显著延缓NSCs的生物年龄。这提示了运动可能更倾向于通过系统性因素（如血管修复）而非直接作用于神经干细胞发挥抗衰老作用。 基因重编程的选择性效果 与运动不同，基因重编程通过激活Yamanaka因子（Oct4、Sox2、Klf4、Myc，OSKM），直接作用于细胞内的分子调控，展现了细胞内在的年轻化潜力。研究显示，NSCs和神经母细胞在基因重编程干预后分别显著年轻化了2.7个月和2.8个月，尤其是在胼胝体区域的修复效果尤为显著。然而，这种干预效果更偏向于少数细胞类型，且其年轻化幅度普遍低于运动。此外，重编程还引发了某些细胞类型（如中型棘状神经元和小胶质细胞）的“提前老化”，提示这种方法可能伴随着副作用。 尽管运动和基因重编程在某些方面展现了显著效果，但两者均存在局限性。运动依赖全身性机制，对某些关键细胞类型（如NSCs）的直接影响有限；而基因重编程尽管靶向明确，却可能带来细胞功能失调或非预期老化。这些结果表明，单一干预可能难以覆盖所有衰老机制，未来或需结合多种方法，针对不同细胞类型制定个性化策略。 衰老干预的新希望 衰老的脚步不可阻挡，但它的影响可以被延缓，甚至部分逆转。该研究的发现，为探索大脑衰老的干预策略提供了崭新的科学依据，并为未来开发治疗神经退行性疾病的新型疗法指明了方向。 首先，研究揭示了不同细胞类型在衰老中的独特作用和动态变化。例如，T细胞的显著促衰老效应和神经干细胞（NSCs）的强大促年轻化能力，凸显了针对这些“关键角色”进行靶向干预的潜力。未来的治疗策略可以集中于抑制T细胞的促炎作用，例如通过调控干扰素-γ（IFN-γ）等炎症因子，减少其对周围细胞的促衰老影响。同时，激活或移植NSCs，也有望通过局部促年轻化效应，改善大脑的再生和修复能力。 其次，该研究的“空间衰老时钟”技术为精准治疗提供了全新工具。通过精确量化不同细胞类型的生物年龄，该工具能够帮助研究人员更早地发现特定区域和细胞的衰老迹象。例如，大脑白质区域在衰老过程中表现出基因表达和细胞功能的显著退化，这为早期诊断阿尔茨海默病等疾病提供了重要线索。未来，类似的技术还可以用于监测抗衰老干预的效果，为治疗方案的优化提供实时反馈。 此外，干预措施的组合应用可能是未来研究的重点。该研究表明，运动通过血管修复发挥了系统性抗衰老作用，而基因重编程则直接作用于细胞内部过程。将两者结合，或联合其他方法（如免疫调控或药物治疗），可以覆盖更多衰老机制，从而实现协同效应。例如，在衰老关键区域联合应用运动干预与NSC移植，可以同时改善局部微环境和细胞功能，进一步增强抗衰老效果。 最后，未来的研究将进一步探索衰老的根本机制，并推动精准治疗的发展。以MERFISH为代表的高通量空间转录组技术，结合人工智能和基因编辑技术，可能成为攻克衰老相关疾病的利器。这些技术将帮助我们更加全面地理解衰老的动态网络，从单一细胞到复杂组织层面提供多维度的解决方案。 衰老研究已经进入了一个全新的时代。从针对性靶向治疗到综合性干预策略，这些进步为延缓大脑衰老带来了前所未有的希望。 参考文献 Sun, E.D., Zhou, O.Y., Hauptschein, M. et al. Spatial transcriptomic clocks reveal cell proximity effects in brain ageing. Nature (2024). https://doi-org.libproxy1.nus.edu.sg/10.1038/s41586-024-08334-8 责编|探索君 排版|探索君 转载请注明来源于【生物探索】 声明：本文仅用于分享，不代表平台立场，如涉及版权等问题，请尽快联系我们，我们第一时间更正，谢谢！ End 往期精选 围观 Nature | 单细胞分析技术的革命性进展 热文 Nature | 环状RNA（circRNA）为何成为基因调控的新宠？ 热文 Cell | AI取代科研人员还有多远？ 热文 新英格兰 | 司美格鲁肽（semaglutide）又有新发现：助力关节炎治疗 热文 CRISPR技术进化史 | 24年Cell 综述