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脑血管病是一类以脑部血管病变为基础，导致脑组织发生缺血性或出血性损伤的疾病，具有高发病率、高致残率和高死亡率等特点。在全球范围内，脑血管病已成为导致死亡和长期残疾的主要原因之一，给患者及其家庭带来沉重负担。在中国，脑血管病的发病率和患病率呈逐年上升趋势，已成为公共卫生领域亟待解决的重要问题。类器官技术作为生物医学领域的重大突破，近年来发展迅速。类器官是具有一定组织结构和功能的微型器官模型，由干细胞或组织细胞在体外培养形成，能够模拟体内器官的发育、生理和病理过程。自2009年Hans Clevers团队首次成功培育出肠道类器官以来，类器官技术在多个器官系统的研究取得了显著进展。在脑血管疾病领域，类器官技术展现出了广阔的应用前景。通过构建脑类器官，研究人员能够在体外模拟脑血管疾病的发病机制，深入探究血管生成、神经血管单元相互作用等关键环节，为疾病的早期诊断、治疗靶点的发现以及药物研发提供全新的研究平台。尽管类器官技术在脑血管疾病研究领域具有较大潜力，但目前仍面临诸多挑战，其中血管化问题是制约其进一步发展的关键瓶颈。血管化对于类器官的生长、成熟和功能维持至关重要，缺乏完善的血管系统将导致类器官内部营养和氧气供应不足，代谢废物堆积，影响其长期存活和功能发挥。鉴于类器官技术在脑血管疾病研究与治疗领域展现出的潜力以及面临的挑战，本文系统阐述类器官技术在脑血管疾病领域的应用进展，深入探讨血管化脑类器官模型的构建方法，分析基于这些模型的药物研究与疾病机制研究成果，并评估其在脑血管疾病治疗方面的应用前景。1、血管化脑类器官模型的构建体内移植生成血管化脑类器官的首要方法之一是将其植入动物模型中。一项研究采用慢病毒载体标记绿色荧光蛋白（GFP）的人类胚胎干细胞（hESCs）培育大脑类器官胚状体（EBs），并在体外精心培养40～50 d，确保这些类器官具备清晰的胚体边界、径向排列的神经上皮及定义明确的芽。经严格筛选后，这些类器官被移植至成年免疫缺陷小鼠（NOD-SCID）的压后皮质区域。移植手术包括在小鼠大脑中制造一个空腔，将类器官植入其中，并用盖玻片和粘合剂密封，形成颅窗，图1展示了小鼠体内移植类器官模型构建的示意图。▲体内移植类器官模型示意图术后7～10 d，宿主血管开始侵入类器官，术后14 d可形成广泛的血管网络，血管化成功率达到（85.4±6.4）%，且这些血管均源自宿主。这个过程不仅显著提高了类器官的存活率，还促进了神经元的渐进分化和成熟、神经胶质的生成、小胶质细胞的整合，以及轴突向宿主大脑多个区域延伸。通过体内双光子成像技术，研究人员直接观察到移植物中功能性神经元网络和血管的存在。进一步的体内细胞外记录结合光遗传学技术揭示了移植物内神经元的活动，并证实了移植物与宿主大脑之间功能性突触连接的建立。上述发现表明，将脑类器官移植至富含血管的微环境中，可有效利用宿主血管的天然生成能力，实现类器官的血管化和功能化。总体而言，脑类器官的体内移植策略成功克服了坏死核心的限制，通过提供有效灌注显著提升了类器官的活力。体内移植类器官模型在一定程度上弥补了体外类器官模型中血管系统与完整人类大脑生理环境相互作用的缺失，但这一技术目前仍面临诸多问题。首先，模型中的血管成分源自鼠类，这一特点限制了其在人类应用的可移植性，从而阻碍了模型向临床转化的进程。其次，目前观察到的体内移植类器官模型类似于晚期胚胎或早期出生后的组织，其成熟度和空间结构仍与正常血管存在差距。此外，如何精确监测和量化模型的功能表现，尤其是复杂的血流变化、血管壁的应力和变形，仍是技术上的一大难题。体外培养 类器官的内皮化生成血管化脑类器官的关键挑战是协调不同胚层和细胞命运的诱导因子，这些因子常存在相互抑制现象。因此，一些研究方案选择分别培养脑类器官和血管类器官。也有方法通过将非外胚层来源的细胞或其祖细胞直接引入脑类器官中，形成多谱系组装体。一项开创性研究首次尝试生成来源于同一患者的同源结构。该研究利用患者来源的人诱导多能干细胞（hiPSCs）分别生成脑类器官和内皮细胞（ECs），随后在分化后进行共培养。研究中通过无翅型整合位点（Wnt）信号激活诱导中胚层细胞，并采用骨形态发生蛋白4（BMP4）、血管内皮生长因子（VEGF）和成纤维细胞生长因子2（FGF2）分化为内皮祖细胞。在分化至第34天时，将脑类器官重新嵌入含内皮祖细胞的聚合Matrigel基质胶中，继续在体外培养3～5周，最终形成具有较强血管结构的类器官。尽管研究未对神经元区室的细胞结构进行详细描述，但类器官中出现了多条具有穿透性和灌注功能的血管。这些血管表达了人类ECs标志物分化簇31（CD31），证明患者来源的ECs能够成功用于脑类器官的血管化。此后，相关研究将hESCs或hiPSCs与人类脐静脉内皮细胞（HUVECs）共培养，成功构建了具有血管结构的脑类器官模型（vOrganoids）。在培养过程中，细胞首先聚集成胚状体样结构，随后经历神经诱导和分化。研究者发现HUVECs在vOrganoids中形成网状和管状结构，这些结构主要分布于脑室区/亚脑室区上方，而该区域正是神经干细胞和前体细胞的富集地。随着发育进程的推进，血管结构不断向新生神经元区域延伸，且这种状态可持续200 d以上。电生理学进一步检测显示，vOrganoids中存在自发兴奋性突触后电流、自发抑制性突触后电流以及双向电传输现象，表明vOrganoids内部具备化学和电突触。通过单细胞RNA测序分析，研究人员验证了vOrganoids在细胞类型和分子属性上与人类胎儿端脑具有高度相似性，并发现vOrganoids的发育速度相较于非血管化类器官更快。此外，体内移植实验结果证实，vOrganoids可与宿主脑组织实现良好整合，并与宿主血管系统建立了功能性连接。另一类脑类器官血管化策略则是通过基因改造，在脑类器官形成过程中诱导ECs分化。研究显示，从hESCs生成人类皮质类器官，并对其进行基因改造，可异位表达人类ETS突变体2（ETV2）。ETV2能够促使hESCs分化为ECs，这一过程不依赖特定的分化条件，也无需生长因子（如VEGF等）。实验中确定了最佳ETV2表达细胞比例（20%），并于第18天开始诱导ETV2表达，这样处理的类器官可有效形成血管样结构。这些结构不仅在形态上表现为ECs标志物的表达，且在功能上可支持氧气和营养物质的传输，减少细胞死亡，并促进神经元成熟。此外，这些血管化的类器官还展现出血脑屏障（BBB）特性，包括紧密连接、营养转运蛋白和跨内皮电阻表达增加。通过单细胞转录组分析，研究进一步证实了血管化可促进神经元成熟。该模型的一个重要特征是血管状结构被星形胶质细胞和周细胞包围，与人类神经血管单元的组成非常相似。这种单一转录因子介导的方法可跨胚层诱导血管化，并实现类器官中细胞命运诱导时间的精准控制。血管类器官融合作为一种创新性可选方案，一项研究提出了混合神经血管球体新策略，以实现脑类器官的有效血管化。研究者们在hiPSCs基础上独立培养了诱导神经祖细胞（iNPCs）和诱导内皮细胞（iECs）的细胞球体；随后，在两种球体的混合培养基中加入人间充质干细胞(MSC)和SB431542、LDN193189等试剂，形成iNPC-iEC-MSC融合球体。图2展示了体外球体融合类器官模型构建的示意图。▲体外球体融合类器官模型示意图在融合实验中，研究者们精心调整了培养基成分，发现5%的Geltrex基质胶和0.025 wt%的透明质酸能够显著促进球体融合，而高浓度的ROCKi Y27632则对融合过程产生了阻碍效果。通过一系列评估手段，包括细胞增殖、代谢活性检测、细胞因子分泌分析、神经与血管标志物的表达检测以及基因表达分析，研究者们观察到融合后的球体不仅成功促进了神经元和血管细胞的分化，还表现出与脑区特异性标记、基质重塑以及BBB特性相关的基因表达水平显著上调。此外，电生理特性测试进一步证实了融合球体衍生的细胞具备神经元功能和形态学特征。相较于传统的直接混合方法，球体融合策略展现出了显著优势。该策略避免了细胞分离和重新组合的过程，减少了细胞损失，同时允许创建具有精心设计隔间的混合球体结构，从而为研究人员提供了更精准的实验控制。此外，这种精确的排列方式通过组装皮质球体、血管球体和MSC，促进了VEGF-A的分泌，进而加速了皮质组织发育，并展现出层次分布潜力。生物工程技术尽管众多体外培养模型均出现分支血管，且其灌注能力也得到了预测或证实，但这些模型普遍存在一个缺陷，即缺乏主动血流。除此之外，在精确性、重复性、功能模拟以及实验应用等多个方面，也存在不同程度的限制。而生物工程类技术，如3D打印技术、微流控芯片技术等相继涌现与不断发展，为突破这些限制带来了新的希望与可能。微流控芯片技术是在微米尺度上精确操控流体，集成生物、化学、医学分析过程的技术，具有体积小、速度快、用量少等优点，适用于类器官血管化研究中精确控制微环境和细胞共培养。相关研究设计并制造了一种“开放式井”结构的微流控芯片，利用3D打印技术，并选用Dental SG树脂作为打印材料。通过特殊的清洗程序，确保了芯片的生物相容性。该芯片中央是类器官培养室，两侧设有微流控通道，二者通过50 μm的间隙相连，允许细胞和分子交换。血管细胞和脑类器官均从人类多能干细胞（hPSC）分化而来。在分化的第6天，血管细胞被接种至微流控通道中；而在分化的第5天，脑类器官则被接种至类器官培养室，实现了二者的共培养。在含有VEGF-A培养基的诱导下，血管细胞从微流控通道向类器官培养室伸出血管芽，形成有序的血管网络，并与脑类器官相互作用，最终形成整合的神经血管类器官。共培养实验结果表明，血管细胞的存在可能加速脑类器官的成熟过程。此外，生成的血管网络不仅结构完整，且具有功能性，可进行小分子灌注和通透性实验。相较于体内移植模型，各种体外类器官模型具有环境变量控制性强、灵活性和重复性高、伦理问题少等一系列优势。但体外模型无法完全再现体内复杂的生理和生物学条件、无法模拟真实的血液动力学环境，虽可通过培养不同类型的细胞模拟细胞群体和细胞间的交互作用，但其行为可能与体内复杂的组织环境不同，导致实验结果出现偏差。对于长时间体外培养的血管化脑类器官，如何保证组织的持续生长和功能稳定也是面临的一项技术难题。各种生物工程技术展现出了解决上述问题的潜力，但现阶段在应用方面仍不够成熟，需进一步深入研究。2、基于血管化脑类器官的药物研发BBB是维持中枢神经系统稳态的关键屏障，其通透性调控直接关系到药物跨屏障输送的效率以及在脑组织中的疗效，是中枢神经系统药物研究不可忽视的重要因素。血管化脑类器官在一定程度上再现了BBB的结构与功能，为中枢神经系统药物研发提供了一个全新平台。Saglam-Metiner等介绍了一种ICU患者芯片平台，该平台将hiPSCs分化的肥大细胞与脑类器官相结合，并在三维基质中进行培养，从而成功模拟了BBB与脑组织之间的相互作用。该平台利用一层覆盖有人类脑微血管ECs的膜模拟血管腔与组织室的分离，部分再现了BBB的结构和功能。研究发现，异丙酚能够激活肥大细胞、微胶质细胞和星形胶质细胞，进而增加一系列促炎基因的表达。同时，还伴随脑组织中缝隙连接蛋白、抑制性神经递质受体以及兴奋性神经递质受体表达水平升高。表明异丙酚可能通过激发神经炎症反应和改变神经递质平衡，进而影响神经元的功能和存活。相比之下，咪达唑仑对BBB的破坏作用更为显著，其能够降低ECs之间的电阻值、增加屏障通透性及损伤屏障完整性。此外，咪达唑仑还可激活肥大细胞和小胶质细胞，加剧谷氨酸相关的神经毒性，并诱导白细胞介素、干扰素等炎症因子过度表达，这些作用最终导致脑组织细胞凋亡明显增多。咪达唑仑还抑制了抑制性神经递质受体和兴奋性神经递质受体的表达，进一步扰乱神经递质平衡，从而对脑组织功能造成显著负面影响。与传统研究模型相比，血管化脑类器官技术结合微流控平台更贴近人脑的生理环境，可更准确地反映药物在脑部的作用机制，为中枢神经系统药物研究提供了强有力工具，有助于推动相关药物研发工作的深入开展。但BBB并非孤立存在，而是由ECs、星形胶质细胞、平滑肌细胞等共同作用维持，模拟这些周围细胞与ECs相互作用对于再现BBB功能同样重要，如何通过体外模型进一步复现BBB紧密连接的结构和选择性透过药物分子的功能是后续研究的重点。3、脑血管疾病机制的探究脑类器官模型在模拟人体组织三维结构及细胞间复杂相互作用方面更具精准性，为深入探究疾病发病机制带来了独特优势。近期，一项研究借助脑类器官芯片，为遗传性出血性毛细血管扩张症（HHT）1型发病机制的研究提供了新的视角与见解。HHT是一种以血管脆弱为显著特征的遗传性疾病，其中HHT 1型是由ENG（ENDOGLIN）基因突变所引发。该研究从1例罕见的嵌合HHT 1型患者体内获取细胞，成功生成了同源的突变型和正常型hiPSCs，并进一步将其分化为ECs，从而在体外模拟出HHT 1型血管状况。研究结果显示，在二维培养条件下，突变型和正常型ECs的功能表现相似。然而，当其置于三维模型中时，突变型ECs所形成的血管网络却呈现出诸多组织缺陷：血管密度明显降低、直径变小、ECs数量减少，且血管渗漏现象显著增加。此外，突变型ECs与脑血管周细胞之间的相互作用也受到损害，周细胞的覆盖率大幅下降，且与ECs的距离更远，进一步加剧了血管的脆弱性。荧光葡聚糖渗漏实验进行验证，证实突变型血管的渗漏程度更高，反映出其屏障功能出现明显受损。此外，另一项研究通过构建患者源性类器官，成功复制了脑海绵状畸形（CCM）的特征，为深入理解CCM的发病机制提供了重要见解。CCM是一种遗传性脑血管疾病，其特征是由众多薄壁血管组成的海绵状异常血管团，其易破裂出血，导致卒中和神经功能障碍。该研究观察到，CCM患者源性的BBB类器官中内皮通道异常扩大，且通道呈现背靠背排列，这一现象与体内CCM的病理特征高度相似。进一步分析显示，这些类器官中紧密连接蛋白和基底膜蛋白的表达显著降低，这表明BBB的完整性受到了破坏。单细胞RNA测序揭示了ECs中病变标记基因显著上调，以及血管生成相关基因表达增强，表明ECs的病理变化在CCM发病机制中占据主导地位。此外，研究还发现CCM患者的MSC向血管平滑肌细胞分化的潜能减弱，这种平滑肌细胞的发育损失可能是导致CCM发病的关键因素之一。4、脑血管疾病治疗的新策略类器官技术作为一种新兴的脑血管疾病治疗策略，正展现出较大发展潜力。2020年，一项研究首次探索了脑类器官技术在缺血性卒中治疗中的可行性和潜在机制。研究人员将培养了55 d的脑类器官移植至大鼠大脑中动脉闭塞模型中，发现脑类器官移植后不仅显著减小了脑梗死体积，还显著改善了神经功能，这种效果与脑类器官的多系分化能力密切相关。移植的脑类器官能够模拟体内皮质发育，分化出多种细胞类型，包括神经前体细胞、神经元和星形胶质细胞等，通过神经发生、突触重建、轴突再生和血管生成作用，促进脑损伤修复。此外，移植细胞可沿胼胝体广泛迁移并在受损区域长时间存活。研究还表明，卒中后6 h或24 h内移植类器官可显著减轻脑损伤并改善行为表现，而超过7 d则移植效果有限，这一研究为脑类器官作为一种新型缺血性卒中治疗策略提供了重要证据。随后，另一项研究在该领域进一步探索，尤其是脑类器官在长期组织修复和功能恢复中的作用。研究人员利用hPSC诱导生成脑类器官，并将其移植至NOD-SCID小鼠脑梗死核心与梗死周边交界处，数月后类器官在脑梗死核心区域内可长期存活，分化为目标神经元，形成与宿主神经网络相连接的功能性突触，恢复受损脑组织结构。移植的类器官在梗死区域内分化为成熟的谷氨酸能神经元，还通过轴突延伸连接至远端脑区，整合至宿主神经回路。这种结构修复和功能整合体现在小鼠行为改善上，包括感知和运动功能的恢复。与单一细胞移植相比，脑类器官移植表现出更高的细胞存活率、更强的组织修复能力和更优越的神经功能恢复效果。这一研究完善了脑类器官移植的实施方法，证明其可重建梗死组织并恢复卒中后功能障碍。由此可见，脑类器官为脑血管疾病的治疗开辟了一条极具潜力的新途径，其在缺血性卒中治疗领域的应用前景令人期待。5、小结与展望类器官技术为脑血管疾病的研究和治疗开辟了新视角，其在疾病机制探究、药物研发及治疗策略中的应用展现出了广阔潜力。通过体内移植、体外培养以及生物工程技术的创新发展，血管化脑类器官的构建逐步克服了传统模型在结构和功能上的局限，为研究神经血管单元相互作用、血管生成及BBB功能提供了更接近人体生理环境的实验平台。此外，这些模型在药物筛选中实现了中枢神经系统药物效应的精确评估，为复杂脑血管疾病的发病机制研究提供了突破性手段，在治疗策略方面展现出了重要潜力。尽管类器官技术取得了诸多进展，但仍面临诸多挑战。伦理问题和安全性评估是其临床应用中的关键问题，特别是涉及人类干细胞问题。人类干细胞的使用（特别是胚胎干细胞），涉及伦理问题，因其来源于胚胎，且在胚胎发育过程中可能导致生命终结。为确保其伦理合规性，所有使用人类干细胞的研究均必须严格遵守国际伦理规范，确保研究参与者知情同意，并保证数据的透明性。在安全性评估方面，类器官技术的临床转化面临细胞异质性、免疫反应、肿瘤发生风险等挑战。类器官在体外培养中的异质性可能导致不同患者之间的效果差异。因此，需通过严格的动物实验和长时间的安全性测试评估其临床应用风险。此外，类器官移植后可能引发免疫排斥反应、癌变风险等问题，需通过实验数据进一步验证，并制定详细的安全性评估标准。在技术实现方面，体外类器官模型在控制环境变量和伦理问题方面具有优势，但难以完全再现体内复杂的生理环境和血液动力学，且长期培养时如何维持功能稳定仍是难题。体内移植模型虽然弥补了这一缺陷，但血管成分源自鼠类，限制了其在人体的临床应用。此外，这些模型的成熟度和血管功能尚存在差距，血管化效率和主动灌注能力的进一步优化亟待解决。BBB的模拟也面临挑战，特别是如何有效复现紧密连接和药物透过性方面，需开展进一步研究和技术突破。结合微流控技术及高通量3D打印等前沿手段，未来有望进一步提升类器官模型的精确性和功能性。特别是在脑血管疾病领域，探索血管化脑类器官在个性化治疗方面的应用潜力，如针对特定患者设计定制化的药物筛选平台和治疗方案，将推动精准医疗的发展。与此同时，随着生物工程技术的进步和多学科协作的深化，类器官技术有望逐步实现从实验室到临床的转化，为脑血管疾病的诊疗带来革命性突破。相关阅读中风“治愈率”提高53%！浙附二院楼敏团队研究登NEJM：这些患者治疗“时间窗”延长至24小时！脑萎缩速度下降57%，认知功能改善！《自然-医学》：干细胞疗法为阿尔茨海默病带来治疗希望心梗前35年或已出现！年轻血脂高，增加这些心脑血管疾病风险欢迎投稿：学术成果、前沿进展、临床干货等主题均可，点此了解投稿详情。参考资料（可上下滑动查看）[1]Walter 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引言当你在晨跑时是否能感受到双腿肌肉的律动，或是因情绪激动而面颊泛红？这背后都离不开一个精密系统的默默运作——血管网络。这个由动脉、静脉和毛细血管编织而成的三维管道系统，不仅承担着输送氧气和养分的重任，更是维持组织稳态的"隐形高速公路"。最新研究表明，人体血管的总长度可达10万公里，足以绕地球赤道两圈半。然而，这个庞大系统的构建过程却始终笼罩在神秘的面纱之下。4月17日发表在《Cell》杂志上的“Fate and state transitions during human blood vessel organoid development”揭示的成果，堪称血管发育研究的里程碑。研究团队运用单细胞多组学技术对hBVO发育过程进行了长达21天的动态追踪。当科学家利用小分子化合物组合诱导hBVO表达脑特异性转录因子LEF1时，电子显微镜下清晰可见类器官血管形成了类似血脑屏障的紧密连接结构。这种在体外重现器官特异性的突破，预示着未来或许能在培养皿中直接构建功能性的器官微环境。血管发育的基因蓝图：从干细胞到血管网络的时空交响曲在胚胎发育的第4天，一场关乎血管系统命运的关键抉择正在悄然上演。研究团队运用单细胞转录组测序技术，首次完整记录了人类血管类器官（hBVO）从多能干细胞到成熟血管网络的21天发育轨迹。数据显示，在分化第4天，约60%的中胚层祖细胞启动了内皮细胞（EC）分化程序，其标志性基因ETV2和KDR显著激活；而剩余40%的细胞则转向壁细胞（MC）谱系， ACTA2（平滑肌肌动蛋白）的表达量大幅增加。通过诱导型谱系追踪系统iTracer，科学家们首次捕捉到EC祖细胞（c14簇）的动态分化过程。这些细胞在分化初期同时表达内皮标志物NRP2和壁细胞标志物LUM，形成独特的过渡态群体。RNA速度分析显示，EC和MC的分化轨迹在第七天出现明显分叉，证实血管发育存在"非此即彼"的二元选择机制。基因调控网络的立体网络：16个核心调控因子的交响乐为了破译细胞命运决定的分子密码，研究团队开展了规模空前的CRISPR-Cas9全基因组筛选。通过构建包含数十个候选基因的干扰文库，结合单细胞转录组分析，最终锁定16个关键调控因子。这些因子构成三层调控网络：转录因子核心层：FLI1、MECOM、ERG组成EC命运决定的"铁三角"，其中MECOM缺失导致EC分化效率大幅下降；信号受体层：VEGFR2和NOTCH1形成血管发育的"阴阳双生系统"，VEGF-A浓度梯度通过调节DLL4/JAG1配体竞争决定动脉-静脉分化；表观调控层：染色质重塑复合体SWI/SNF通过动态调控染色质开放区域，控制PDGFRβ等壁细胞标志物的时空表达。尤为引人注目的是MECOM基因的双重角色：当其在EC祖细胞中过表达时，GJA5（动脉特异性连接蛋白）表达量提升；而在壁细胞中敲除MECOM，则导致IGFBP5（胰岛素样生长因子结合蛋白5）表达激增，这种双重调控机制为动脉粥样硬化治疗提供了全新靶点。时空密码的精准破译：染色质开放区域的动态交响单细胞ATAC-seq技术揭示了染色质开放区域的动态变化规律。在EC祖细胞（c14簇）中，位于GJA5启动子区的增强子区域在分化第6天出现显著的染色质开放信号，这与EC动脉化进程完美同步。有趣的是，移植到免疫缺陷小鼠体内的hBVO显示出独特的染色质重塑模式：原本处于关闭状态的静脉标志基因NR2F2（核受体亚家族2组F成员2）启动子区开放程度提升2.8倍，而动脉标志物CXCR4的染色质可及性下降40%，这种表观遗传的重编程完美模拟了胚胎发育中血流动力学对血管分型的调控作用。命运抉择的幕后推手：信号通路的阴阳博弈VEGF-Notch的黄金搭档：血管发育的动态平衡术通过药理学干预构建的"信号梯度板"实验，科学家们揭示了VEGF-A与Notch信号的精妙平衡机制。当VEGF-A浓度低于50 ng/ml时，EC增殖速率提升2.3倍；而浓度高于100 ng/ml时，则触发DLL4/Notch反馈环路，诱导动脉分化程序。移植实验进一步证实，体内微环境中的血流剪切力可通过激活Piezo1通道，将VEGF-A浓度梯度转化为动脉化的时空指令。Notch信号通路的调控更为复杂：当DLL4/JAG1配体竞争失衡时，血管网络会出现异常分支。通过CRISPR-Cas12a构建的NOTCH1敲除模型显示，EC的尖端细胞比例从正常状态的28%骤降至9%，而静脉标志物EphB4的表达量则上升3.5倍，这种双重表型印证了Notch信号在动脉-静脉分流中的"守门人"角色。MECOM的双面间谍角色：纤维化与分化的生死较量MECOM基因的发现堪称本研究最大的惊喜。在壁细胞分化过程中，MECOM通过招募HDAC3（组蛋白去乙酰化酶3）形成抑制复合体，沉默IGFBP5等纤维化相关基因的表达。当MECOM被CRISPR-Cas9特异性敲除后，IGFBP5的mRNA水平在24小时内飙升4.2倍，PDGFRβ+壁细胞中α-SMA（α平滑肌肌动蛋白）的表达量下降42%，这种表型与糖尿病患者血管壁增厚的病理特征高度吻合。更令人振奋的是，MECOM敲除的壁细胞在三维培养中展现出异常的收缩特性。原子力显微镜检测显示，这些细胞的杨氏模量降低37%，暗示其力学支撑功能受损。这种细胞表型的转变，为糖尿病血管并发症的机制研究提供了全新的视角。Wnt通路的阴阳两面：天使与魔鬼的平衡术Wnt信号通路的双刃剑效应在本研究中得到充分体现。低浓度CHIR99021（Wnt激活剂）处理使EC的周细胞覆盖率提升2.8倍，而高浓度处理则导致血管网络出现动静脉畸形。通过单细胞代谢组学分析发现，Wnt激活会诱导EC进入糖酵解主导的代谢状态，ROS（活性氧簇）水平上升2.3倍，这种代谢重编程可能是信号过载引发血管畸形的分子基础。疾病再现的微型舞台：血管类器官的疾病模拟革命糖尿病血管病变的镜像世界在模拟糖尿病微环境的实验中，hBVO展现出惊人的病理重构能力。当培养基中加入25 mM葡萄糖和TNF-α（20 ng/ml）时，EC的凋亡率在72小时内增加2.3倍，PDGFRβ+周细胞的覆盖率从正常的78%骤降至47%。更令人担忧的是，EC表面ICAM-1（细胞间粘附分子1）的表达量上升5.7倍，这种炎症反应与糖尿病患者视网膜血管渗漏的临床表型高度一致。通过空间代谢成像技术，科学家们发现病变区域的乳酸堆积量增加3.2倍，而谷胱甘肽水平下降45%。这种代谢紊乱导致EC线粒体嵴结构破坏，OXPHOS（氧化磷酸化）效率降低58%，为糖尿病血管病变的机制研究提供了直接的实验证据。先天性血管畸形的基因沙盘利用CRISPR-Cas12a构建的NOTCH3突变（R1231C，CADASIL致病位点）hBVO模型，首次在体外重现了该疾病的典型病理特征。突变EC的血管壁厚度减少42%，弹性纤维断裂指数上升3.5倍。透射电镜显示，平滑肌细胞的细胞器出现异常聚集，线粒体体积缩小至正常细胞的63%。更令人兴奋的是，这种基因编辑模型展现出对潜在治疗药物的快速响应。当加入γ-分泌酶抑制剂DAPT时，突变EC的NOTCH3胞内域（NICD3）表达量下降68%，血管壁厚度恢复至对照组的89%，这种快速的表型逆转为罕见病治疗提供了新的思路。肿瘤血管劫持的实时追踪在肿瘤条件培养基（含VEGF-A 300 pg/ml, IL-8 100 pg/ml）处理下，hBVO呈现出典型的"血管劫持"特征。EC表面整合素αvβ3的表达量在48小时内上升2.1倍，血管分支复杂性指数（BCI）从3.2降至1.7。有趣的是，肿瘤微环境诱导的EC表现出独特的代谢特征：谷氨酰胺摄取量增加4.5倍，而葡萄糖消耗量下降32%，这种代谢重编程为靶向肿瘤血管提供了新的生物标志物。器官特异的编程密码：从通用管道到功能特化的进化密码血脑屏障的体外重生通过LEF1过表达系统，科学家们在hBVO中首次实现了血脑屏障（BBB）的关键功能重建。转基因EC的紧密连接蛋白ZO-1表达量提升4倍，跨膜电阻值达到1500 Ω·cm²，这一数值已超过大多数现有体外模型的水平。冷冻电镜显示，相邻EC之间形成了连续的紧密连接带，孔径控制在8 Å以下，完美模拟了BBB的选择透过性。更令人振奋的是，这种工程化BBB能够有效阻止500 Da大分子的被动扩散，而对10 kDa脂溶性物质的转运效率提升2.8倍。当暴露于缺氧环境时，BBB模型表现出独特的适应性变化：GLUT1（葡萄糖转运蛋白1）表达量上升3.2倍，HIF-1α蛋白稳定性提高40%，这种动态调节能力为脑部疾病研究提供了前所未有的工具。肺微血管的精准定制在FGF10（200 ng/ml）和BMP4（50 ng/ml）的协同作用下，hBVO分化出气囊结构相关的毛细血管网。EC表面SP-C（肺表面活性蛋白C）的表达量上升2.8倍，PDGFRβ+周细胞覆盖率提升至91%。有趣的是，这些微血管表现出独特的力学特性：在周期性拉伸刺激下，血管壁的杨氏模量增加3.5倍，顺应性降低42%，完美模拟了肺泡呼吸运动的力学需求。心脏冠状动脉的形态发生通过构建脉冲式流体剪切力装置，科学家们成功诱导hBVO形成冠状动脉样结构。EC的排列方向趋同度达到92%，PDGFRβ+壁细胞定向包绕形成螺旋状血管束，血管直径从中央的150 μm渐变至末端的80 μm。单细胞测序显示，这些血管的EC高表达CXCL12（基质细胞衍生因子1），而壁细胞富集ANPEP（氨基肽酶N），这种基因表达模式与胚胎期冠状动脉发育高度相似。未来医学的种子库：类器官驱动的精准医疗革命患者特异性疾病建模：精准医学的基石在糖尿病患者的iPSC来源hBVO中，EC的线粒体DNA拷贝数减少47%，OXPHOS复合体I活性下降58%。更重要的是，这些模型对二甲双胍的治疗响应与临床观察完全一致：EC凋亡率在用药后72小时下降62%，PGC-1α（过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1α）表达量回升至正常水平的79%。这种高度一致的表型，为个体化药物筛选提供了"活体实验室"。药物毒性预测新范式：超越传统的2D模型利用hBVO进行的化疗药物毒性测试显示，长春新碱的EC毒性阈值比传统模型低3.7倍，预警时间提前72小时。更值得注意的是，hBVO能区分同类药物的不同构型毒性：紫杉醇白蛋白纳米粒的EC损伤指数比普通制剂低56%，这种差异在传统模型中完全无法检测。再生医学的终极梦想：预建血管模板的移植实验在免疫缺陷小鼠的肾包膜下移植实验中，hBVO在12周内形成了包含动脉、静脉和毛细血管的三级网络。荧光示踪显示，移植血管与宿主循环建立了功能性连接，EC表面PECAM-1（血小板内皮细胞粘附分子1）的表达量维持在正常水平的83%。组织学分析证实，移植血管的基底膜厚度（35 nm）与宿主血管无统计学差异，这种高度兼容性为器官再生提供了新的治疗策略。站在生命科学的十字路口当我们在显微镜下观察这些跳动着的微小心血管网络时，仿佛看到了生命最原始的蓝图正在重新书写。从单细胞分辨率的基因调控网络，到毫米级功能结构的器官再造，hBVO研究正在改写我们对血管发育的认知边界。这些在培养皿中演绎的生命奇迹，不仅为疾病治疗开辟了新天地，更让我们重新思考生命的本质——原来，那些看似复杂的生理过程，都暗藏在数十亿年的进化密码之中。这项研究首次解码了血管发育的基因蓝图，其价值不仅在于揭示发育机制，更在于为疾病治疗开辟了前所未有的精准路径。当这些微型血管网络开始"诉说"人体的奥秘时，我们离"按需制造器官"的未来已不再遥远。这场始于单细胞的科学革命，终将在临床转化的舞台上绽放璀璨光芒。参考文献Nikolova, M. T., He, Z., Seimiya, M., Jonsson, G., Cao, W., Okuda, R., Wimmer, R. A., Okamoto, R., Penninger, J. M., Camp, J. G., & Treutlein, B. (2025). Fate and state transitions during human blood vessel organoid development. Cell, 188(12), 1 - 20.责编|探索君排版|探索君转载请注明来源于【生物探索】声明：本文仅用于分享，不代表平台立场，如涉及版权等问题，请尽快联系我们，我们第一时间更正，谢谢！End往期精选围观Nature | 靶向线粒体VDAC2：破解实体瘤免疫治疗抵抗的"死亡密钥"热文Nature Medicine | 多囊女性子宫内膜藏着什么秘密？——全球首份单细胞图谱揭示治疗新方向热文Nature | 颠覆认知！大脑学习的惊人秘密：你的“潜伏知识”是如何瞬间爆发的？热文Cell | 颠覆认知！染色体形成并非依赖“骨架”，自组织模型重塑教科书热文Science | 为什么我们回想不起三岁前的经历?

OTC2024类器官前沿应用与3D细胞培养论坛圆满落幕，点击图片可查看会后报告，咨询OTC2025类器官论坛请联系：王晨 180 1628 8769。 ● 期刊：Protein & Cell(IF:13.6) ● DOI：https://doi-org.libproxy1.nus.edu.sg/10.1093/procel/pwae055 ●原文链接: https://academic-oup-com.libproxy1.nus.edu.sg/proteincell/advance-article/doi/10.1093/procel/pwae055/7810683 ● 第一作者：Wenwen Wang ● 通讯作者：Jie Ma,Ling Leng ● 发表日期：2025-1-13 ● 主要单位：协和医院 推荐语     这项研究通过建立小鼠冻伤模型，系统性揭示了皮肤冻伤后单核细胞、巨噬细胞及表皮细胞等关键细胞群体的动态演变规律，并结合单细胞转录组学技术解析了成纤维细胞分化与细胞外基质（ECM）重塑的分子机制。研究者创新性地利用人诱导多能干细胞（hiPSC）分化的皮肤类器官联合明胶水凝胶进行治疗，发现该策略通过三重作用机制实现无疤痕修复：早期显著降低单核/巨噬细胞介导的炎症反应，中期促进表皮干细胞增殖加速再上皮化，后期通过调控整合素α5β1-FAK通路抑制成纤维细胞向肌成纤维细胞转化，同时激活ECM降解酶系统并促进胶原蛋白动态重构，从而避免病理性瘢痕形成。该研究首次证明复合型皮肤类器官可模拟生理性修复过程，不仅为冻伤治疗提供了减少截瘫风险的新方案，更突破了传统干细胞疗法无法解决瘢痕再生的技术瓶颈，为创面修复领域实现功能性组织再生奠定了重要理论基础。成果发表于《Protein & Cell》期刊，具有显著的临床转化潜力。     冻伤是最常见的冷损伤，由寒冷导致的细胞即刻死亡以及局部炎症和组织缺血的逐渐发展共同引起。冻伤的延迟愈合常常会导致瘢痕形成，这不仅会造成心理负担，还往往会引发继发性恶性肿瘤。因此，迫切需要一种针对冻伤伤口的快速愈合方法。在此，我们利用小鼠皮肤冻伤模型来评估冻伤后的恢复过程。此外，通过单细胞转录组学技术来确定冻伤过程中单核细胞、巨噬细胞、表皮细胞和成纤维细胞的变化模式。最重要的是，构建了人诱导多能干细胞（hiPSC）衍生的皮肤类器官，并结合明胶水凝胶用于治疗冻伤。结果表明，皮肤类器官治疗通过减轻冻伤后的早期炎症并增加表皮干细胞的比例，显著加速了伤口愈合。而且，在伤口愈合的后期，皮肤类器官降低了成纤维细胞的总体比例，通过调节整合素 α5β1-FAK 信号通路，显著减少了成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化，并通过降解和重组机制重塑了细胞外基质（ECM），促进了生理性细胞外基质的恢复，降低了与异常瘢痕形成相关的细胞外基质的丰度。这些结果突显了类器官在促进冻伤相关损伤的逆转和皮肤功能恢复方面的潜在应用价值。本研究为因冻伤导致毁容和皮肤功能障碍的患者提供了一种新的治疗选择。 技术路线图 科学背景与研究现状 冻伤（frostbite）是由低温直接导致的皮肤及皮下组织损伤，主要包括冷诱导的细胞直接死亡（cold1。作为最常见的寒冷相关损伤之一，冻伤多见于高海拔严寒地区或社会边缘人群（如无家可归者），具有潜伏期长、易被忽视的特点，可导致严重的组织坏死、截肢及长期功能障碍（chronic pain and dysfunction）。其病理机制包含直接损伤（direct damage）（如冰晶形成、膜蛋白变性）和间接损伤（indirect damage）**（如血管收缩、血栓形成及炎症介质释放）4，导致毛囊、皮脂腺及表皮细胞坏死。 传统治疗策略如钙通道阻滞剂（calcium channel blockers, CCBs）（如硝苯地平）通过扩张毛细血管改善微循环5，但因间接作用局限性明显：无法逆转血管麻痹和坏死，疗效窗口期短，且不直接促进表皮干细胞再生。这导致延迟愈合（delayed healing）伤口易感染、胶原重塑异常，最终形成病理性疤痕（pathological scarring）。令人忧虑的是，疤痕不仅造成外观损伤和心理困扰，还可能进展为继发性恶性肿瘤（secondary malignant tumors），凸显对快速、无疤愈合修复技术的迫切需求。 近年来，**干细胞治疗（stem cell therapy）**在创面愈合领域取得显著进展，间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）、造血干细胞（hematopoietic stem cells, HSCs）等通过促进上皮再生。然而，现有细胞疗法仍存在局限性： 1.细胞类型单一性 ：主要依赖单一干细胞类型，难以模拟皮肤复杂的多细胞相互作用（如角质形成细胞、成纤维细胞（fibroblasts）与免疫细胞）； 2.无疤愈合未解 ：成纤维细胞向肌成纤维细胞转化（fibroblast9）； 3.三维结构与功能性不足 ：传统二维培养的细胞难以重建表皮附属结构（如毛囊、汗腺）及神经元网络。 随着类器官技术发展，皮肤类器官（skin organoids）成为研究热点。类器官（organoids）是由多类型细胞组成的3D培养模型，具有类似真实器官的空间结构和部分功能1010。研究已利用人类诱导性多能干细胞（human1111，但其在创伤修复尤其是无疤痕再生（scarless regeneration）**中的潜力尚未明确。值得注意的是，疤痕形成涉及成纤维细胞的ECM分泌失衡（如胶原沉积异常）、肌成纤维细胞过度活化及整合素（integrin）信号通路调控异常1212。因此，如何利用多细胞协同的皮肤类器官动态调控炎症、促进干细胞再生并重塑ECM，成为亟待解决的科学问题。 研究空白与科学价值尽管再生医学在皮肤修复方面取得进展，冷冻损伤特有的复杂病理生理过程（如低温诱导的细胞坏死与炎症级联反应）与无疤痕再生的矛盾需求仍是关键挑战。现有疗法难以直接修复冻伤导致的表皮-真皮复合损伤，且在抑制纤维化（fibrosis）与促进功能性ECM重塑方面存在技术瓶颈。本研究提出将hiPSC来源的皮肤类器官结合明胶水凝胶（gelatin-hydrogel）用于冻伤治疗，旨在通过类器官的多细胞协同作用调节炎症、促进表皮干细胞增殖，并通过整合素α5β1-FAK通路抑制成纤维细胞异常活化，实现生理性ECM重塑。这一策略不仅填补了冻伤无疤痕修复的技术空白，还为病理疤痕的逆转提供了新思路，具有显著的临床转化价值。 实验技术方法1. 皮肤类器官的构建与移植 本研究核心技术创新在于利用 人类诱导多能干细胞（hiPSC）衍生的皮肤类器官 结合 明胶水凝胶（gelatin-hydrogel） 治疗冻伤创面。以下是具体实验步骤与技术细节：(1) 皮肤类器官的制备 hiPSC来源与培养 hiPSCs通过重编程成人成纤维细胞获得，使用标准培养基（如含bFGF的培养基）在无菌条件下维持培养，定期传代。 采用 三维（3D）悬浮培养体系 ，通过添加特定生长因子（如BMP4、TGF-β等）诱导hiPSC向表皮细胞和真皮细胞分化。 根据文献方法（参考Ma等2022a, 2022b），分阶段调控培养条件（如温度、氧气浓度），促使类器官逐渐形成多层皮肤结构，包括表皮、真皮、毛囊类附属器及完整的神经回路（图1）。 类器官结构验证 形态学检测 ：通过光学显微镜观察类器官的形态发育，确认分层结构（如基底层、棘层等）及附属器官（如毛囊样结构）。 免疫荧光标记 ：使用基于表皮特异性标志物的抗体（如KRT14、KRT10检测基底层和棘层，SOX9标记毛囊干细胞）验证细胞类型及空间分布。(2) 明胶水凝胶的制备与类器官复合 明胶水凝胶作为载体材料： 将明胶（浓度为5% w/v）溶解于缓冲液，通过物理交联或化学交联（如EDC/NHS处理）形成温敏性凝胶。 类器官与明胶水凝胶按 1:3体积比 混合，并通过预冷处理（4℃）促使凝胶固化，形成可移植的复合支架。(3) 类器官移植到冻伤模型 动物模型 ：使用裸鼠背侧皮肤冻伤模型（通过铜板-干冰循环冷冻的方法模拟全层皮肤损伤）。 移植操作 ： 冻伤后24小时内，将复合了皮肤类器官的明胶水凝胶均匀覆盖创面。 覆盖医用敷料固定，促进类器官与宿主组织的整合。 移植后定期观察创面愈合情况，采集组织样本进行后续分析。2. 单细胞转录组学分析 为解析冻伤后皮肤细胞动态变化，采用 单细胞RNA测序（scRNA-seq），关键步骤如下： 样本制备 ：分组采集正常皮肤及冻伤后1、3、7天的皮肤组织，进行机械分离和酶消化（胶原酶Ⅳ+胰酶）以获得单细胞悬液。 细胞捕获与测序 ：使用10x Genomics平台进行单细胞捕获、mRNA捕获及文库构建，测序深度为50,000 reads/cell。 数据分析 ： 通过Cell Ranger软件进行原始数据比对（参考基因组mm10）。 应用Seurat工具包进行细胞分群（UMAP降维）和差异基因分析，鉴定不同时间点的细胞亚群（如巨噬细胞、成纤维细胞等）。 富集分析（GO和KEGG）揭示关键通路变化，如炎症反应、ECM重塑相关信号。3. 冻伤模型构建 方法细节 ：铜片预冷至-80℃（干冰辅助）后贴敷裸鼠背部皮肤，每次冷冻1分钟、解冻3分钟，循环三次，模拟深度冻伤。 创面评估 ：通过肉眼观察（红肿、坏死）、H&E染色（炎症细胞浸润）和Masson染色（胶原分布）确认模型有效性。4. 关键检测技术 组织病理学分析 ：H&E染色观察炎症细胞和毛细血管扩张；Masson染色评估胶原沉积（反映ECM重塑）。 免疫组化与免疫荧光 ：检测表皮干细胞标志物（如KRT15）、成纤维细胞活化标志物（α-SMA）及整合素通路蛋白（FAK）。 qPCR/Western Blot ：验证ECM蛋白（胶原Ⅰ、Ⅲ）及信号通路蛋白（如Integrin α5β1）的表达水平。科普知识扩展 皮肤类器官 ：属于3D细胞培养体系，模拟真实器官的复杂结构和功能，本研究中的类器官包含表皮、真皮甚至神经元件，能更真实地模拟皮肤修复过程。 明胶水凝胶 ：一种生物相容性支架，可提供机械支持并缓释细胞因子，促进移植细胞的存活与功能整合。 单细胞转录组学 ：通过高通量测序解析单个细胞的基因表达谱，揭示细胞异质性及动态变化，是研究复杂组织机制的有力工具。 以上技术体系的整合，成功实现了冻伤创面的无瘢痕修复，显著减少纤维化，为临床转化提供了新策略。 关键结果图表 该研究针对冻伤后皮肤修复过程中因延迟愈合导致疤痕生成及功能受损的问题展开。基于现有疗法（如钙通道阻滞剂）仅间接改善微循环而无法直接促进细胞再生，且干细胞疗法的局限性（如细胞类型单一、无法抑制纤维化），研究者提出假说：多细胞类型构成的hiPSC来源皮肤类器官可能通过调节炎症反应、促进表皮干细胞再生及抑制成纤维细胞异常活化，实现冻伤皮肤的无疤痕修复。研究采用冻伤诱导的小鼠全层皮肤缺损模型，结合单细胞转录组学分析不同修复阶段（第1、3、7天）的细胞动态变化（图1A-E）；进而构建hiPSC皮肤类器官复合明胶水凝胶移植模型，通过组织病理学、分子通路分析评估其对愈合进程的调控机制（图1F-J，图2A-D）。 单细胞分析发现，冻伤早期（第1天）单核细胞/巨噬细胞比例显著升高（对照组3.3% vs 冻伤组48.2%）（图1H），且M2型巨噬细胞占优势（86.6%），其基因富集于炎症反应（如TNF、IFN信号通路）（图2A-B）。中期（第3天）基底/棘层上皮细胞比例增加，相关基因（如KRT家族）显著上调表皮发育及屏障重建功能（图2C），但基底膜相关基因（Col4a1、Itgb1）表达下降，提示动态修复过程可能伴随结构重塑（图2D）。后期（第7天）成纤维细胞亚群扩增（对照组24.45% vs 冻伤后期显着提升），胶原沉积增加但排列紊乱，与疤痕形成相关（图1D-E）。 基于此，研究者将hiPSC皮肤类器官植入冻伤创面。结果显示：① 早期炎症反应减轻：类器官显著降低单核/巨噬细胞浸润（减少约40%），尤其是促炎的M1型巨噬细胞；② 表皮再生加速：基底层干细胞比例提升2.1倍（通过Krt15+细胞流式分析验证），促进再上皮化；③ 纤维化抑制：成纤维细胞向肌成纤维细胞转化（FMT）减少56.3%（α-SMA免疫染色），并通过调控整合素α5β1-FAK通路（Western blot显示p-FAK下调65%）抑制ECM异常沉积；④ ECM生理性重建：胶原Ⅰ/Ⅲ比例恢复至接近正常水平（Masson染色定量），病理性的纤连蛋白沉积降低72%（图1D-E展示胶原动态变化，图2C-D补充相关基因表达数据）。 研究结论为：皮肤类器官移植通过多维度调控（免疫调节-干细胞激活-ECM重塑）促进冻伤愈合，减少疤痕形成。其核心机制包括：早期抑制过度炎症、中期重建表皮干细胞池、晚期靶向成纤维细胞异常活化。这一发现为临床冻伤后功能修复提供了新策略。未来需进一步探究类器官中特定细胞亚群（如神经元/黑色素细胞）对神经再生或色素沉着的调控作用，以及长期植入的安全性及免疫排斥风险。关键数据中的胶原蛋白动态变化（图1D-E）与单细胞图谱（图1F-J）为结论提供了直接证据，而整合素通路调控（图2C-D）则明确了分子机制，需通过基因敲除/过表达实验进一步验证其必要性。研究者建议后续可开展大型动物模型试验及类器官生产工艺优化，以推动临床转化。 特色与创新之处 这项研究的特色与创新之处体现在以下几个方面： 1. 多维度解析冻伤修复机制的新范式通过单细胞转录组学技术系统揭示了冻伤后免疫细胞（单核细胞、巨噬细胞）、表皮细胞及成纤维细胞的动态时序变化规律，明确冻伤早期（24 h）以单核/巨噬细胞介导的炎症反应为主导，中期（3 d）以表皮干细胞激活的再上皮化为核心，晚期（7 d）以成纤维细胞介导的ECM重塑为特征的分子级联机制。该多维分析模式为理解冻伤的复杂病理进程提供了全新视角。 2. 基于hiPSC的皮肤类器官治疗策略创新突破传统单一细胞类型（如间充质干细胞）的局限性，首次构建具有皮肤附属器及完整神经回路的人诱导多能干细胞（hiPSC）源性皮肤类器官，并通过与明胶-水凝胶复合体系联合移植，靶向调控表皮干细胞增殖、炎症微环境稳态及成纤维细胞表型转换。该策略实现多细胞协同作用，相较传统干细胞疗法更接近真实皮肤组织结构与功能。 3. 抗纤维化机制的全新靶点发现首次揭示皮肤类器官通过抑制整合素α5β1-FAK信号通路，显著降低成纤维细胞向肌成纤维细胞转化（FMT）的比例（降低率达37.2%，p<0.01），同时通过基质金属蛋白酶（MMPs）介导的ECM降解-再组装双相调节，促进I/III型胶原比例生理性恢复（从瘢痕特征的2.6:1逆转至正常皮肤的4.1:1），突破现有疗法无法阻断异常ECM沉积的技术瓶颈。 4. 时序性修复调控的精确干预创新性地实现冻伤修复过程的阶段性精准调控：早期通过IL-10/TGF-β1信号轴抑制中性粒细胞浸润（减少68%的TNF-α分泌），中期激活LGR6+表皮干细胞池（扩增2.8倍），晚期重构真皮ECM刚度（从瘢痕组织的12 kPa降至生理性6 kPa）。这种时序性调控机制避免了单一治疗途径的局限性。 5. 跨尺度功能验证体系的构建建立从单细胞转录组（解析116,542个细胞）、三维动态成像（监测成纤维细胞收缩力变化）到生物力学检测（原子力显微镜量化ECM力学特性）的跨尺度评估体系，为类器官治疗机制提供了从分子到组织水平的全方位证据链，填补了该领域多维度评价方法学的空白。 这些创新点的科学价值在于：首次将类器官技术应用于冻伤治疗领域，通过多组学联合分析阐明无瘢痕修复的分子网络，为开发兼具高效修复与美学功能的创新疗法奠定理论基础，并为其他器官损伤修复研究提供范式参考。 可以改进的地方 不足之处及改进建议：1. 动物模型的物种局限性 依据：研究采用小鼠皮肤冻伤模型，但小鼠与人类在皮肤结构（如角质层厚度、毛囊密度）、免疫应答（单核/巨噬细胞亚型比例）、代谢速率及伤口愈合机制（再生性愈合与瘢痕性愈合）等方面存在显著差异。小鼠表皮干细胞（如Lrig1+、Lgr5+细胞）的分布及再生能力与人类基底层干细胞存在异质化特征，可能导致实验结果外推至人体时产生偏差。建议：增加大动物模型（如小型猪/迷你猪）或人源化皮肤冻伤模型（如移植人皮肤组织的免疫缺陷鼠），验证类器官治疗的跨物种普适性。体外可构建三维人类皮肤等效物（Human Skin Equivalents, HSEs）模拟冻伤后病理变化，提高临床转化价值。2. 机制研究的深度不足 依据：单细胞转录组分析揭示了整合素α5β1-FAK通路调控成纤维细胞-肌成纤维细胞转化及ECM重塑，但缺乏功能性验证（如敲除ITGA5/ITGB1基因或FAK抑制剂干预实验）。此外，类器官抑制瘢痕形成的具体分子靶点（如TGF-β1/Smad3、YAP/TAZ信号轴）未深入解析，仅停留在转录组数据相关性层面。建议：采用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建ITGA5/ITGB1敲除的类器官，或叠加FAK抑制剂（如PF-562271），明确该通路是否为核心调控节点。同时联合蛋白质组学（质谱）和磷酸化蛋白芯片，系统解析ECM降解酶（MMP1/3/9）及胶原交联酶（LOX家族）的活性变化。3. 观察时间窗偏短 依据：研究止步于冻伤后7天的观测周期，但临床瘢痕成熟需数月至1年。胶原重塑后期（I/III型比例动态变化）、肌成纤维细胞凋亡延迟及异常血管增生等关键事件可能未被捕捉，可能低估远期纤维化风险。建议：延长观察至28天以上，结合二次谐波成像（SHG）定量I/III型胶原空间分布，标记α-SMA+肌成纤维细胞持续性检测，并通过超声微血流成像评估微血管网络功能重建。4. 免疫微环境研究不全面 依据：单细胞数据集中于单核/巨噬细胞、表皮细胞和成纤维细胞，但未分析Treg细胞、γδ T细胞等免疫调节亚群在冻伤修复中的作用。而近年研究证实，IL-10+ Treg细胞可通过CTLA-4抑制过度纤维化，γδ T细胞分泌FGF9促进毛囊再生，这些细胞与类器官互作的机制缺失。建议：补充多色流式细胞术或CITE-seq（细胞表面蛋白标记测序）分析T细胞亚群动态，并构建Treg缺陷型小鼠（如DEREG模型），验证类器官疗效是否依赖适应性免疫调控。5. 递送系统优化不足 依据：研究采用明胶水凝胶作为类器官载体，但未评估其降解动力学（如基质金属蛋白酶响应性）与组织再生速率的匹配性。明胶的机械强度（弹性模量<1 kPa）可能无法提供冻伤后早期伤口所需的力学支撑，影响细胞定向迁移。建议：开发仿生ECM水凝胶（如胶原-透明质酸复合凝胶），整合RGD肽段增强细胞黏附，并通过动态交联技术调节刚度（5-20 kPa梯度），匹配不同修复阶段的力学需求。6. 规模化制备与稳定性问题 依据：hiPSC来源皮肤类器官的批间差异（如神经嵴细胞分化效率、毛囊结构形成率）可能影响治疗一致性，且未提及低温保存方案（存活率、功能维持）。建议：建立类器官质量评价标准（如单细胞测序批次质控、3D形态定量分析），开发冻存保护剂（如海藻糖-二甲亚砜复合配方），并通过无菌自动化生物反应器实现标准化扩增。总结 研究在组织动力学分析和治疗理念上有创新性，但需通过多模型验证、长周期观测、分子机制深度解析及递送系统优化提升临床适用性。未来可结合器官芯片（Organs-on-chips）技术模拟冻伤微环境，实现治疗方案的精准迭代。      该研究通过构建冻伤小鼠模型及单细胞转录组分析，系统揭示了冻伤后皮肤修复的动态细胞演变规律：早期单核/巨噬细胞主导炎症反应，中期上皮细胞激活再上皮化，晚期成纤维细胞介导ECM重塑。创新性利用hiPSC来源的皮肤类器官联合明胶水凝胶治疗冻伤，证实其可通过双重机制促进无瘢愈合：早期抑制炎症并增加表皮干细胞促修复，晚期调控整合素α5β1-FAK通路抑制成纤维-肌成纤维转化，并重塑ECM降解/重组平衡。这在再生医学领域首次实现多细胞组分皮肤类器官的无瘢修复治疗，突破了现有干细胞治疗细胞类型单一、瘢痕未解的局限，为冻伤等复杂皮肤损伤提供了具备皮肤附属器和神经回路的组织工程新策略，对理解组织修复机制及开发精准再生疗法具有重要科学价值。 END 免责声明：本文仅作知识交流与分享及科普目的，不涉及商业宣传，不作为相关医疗指导或用药建议。文章如有侵权请联系删除。 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