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2023年7月17日，国际学术期刊Nature子刊Signal Transduction and Targeted Therapy在线发表了复旦大学公共卫生学院研究团队最新的研究成果“Monkeypox virus 2022, gene heterogeneity and protein polymorphism”。该工作提出2022年5月以来在全球出现的人类猴痘（monkeypox，MPX)）疫情之所以表现出新的传播与流行特征，是因为该病的病原体——猴痘病毒（monkeypox virus，MPXV）在一系列毒力及免疫相关蛋白基因上的异质性及由此引起的表达产物多态性所致。猴痘的人间流行自发现以来长期局限在非洲地区，始于2022年5月的这次疫情是首次在非洲以外的国家和地区大规模暴发的人间猴痘聚集性疫情。早期研究发现，猴痘病毒可分为引起较轻症状的西非株系（West African clade）及严重症状的中非株系（Congo Basin clade），两个株系在毒力决定及免疫相关蛋白基因上差别明显甚至是有和无的区别。研究人员详细分析了本次疫情早期643个MPXV全长基因组中的27个与病毒毒力及免疫相关的基因或易变区，发现这些基因或易变区的系统发育树可归入two-branch，two-branch-plus，one-branch及irregular等4种基本类型。在此基因的系统发育关系上归为近缘的若干病毒在彼基因上可能同源性极低；一些从此基因的角度来看应归入西非株系的毒株从彼基因来看则显然应属于中非株系；以及可能存在介于两种株系之间的过度类型毒株。病毒基因组水平上的这种异质性反映出引起本次疫情的猴痘病毒在系统发育上的复杂性。猴痘病毒B14R（左）及其他基因（右）编码的蛋白质产物氨基酸序列长度多态性提前出现终止密码子是猴痘病毒失活若干与宿主免疫相关蛋白的常见策略。研究发现，本次流行的MPXV其B14R、D7L、O1L、B5R和T4等基因由于提前出现的终止子而使得它们的蛋白质产物在氨基酸序列长度上表现出多态性。研究还探讨了包括B14R、B19R、C7L、D14L和T4在内的5个毒力决定基因。作为弱毒的西非株系，本次流行的MPXV在其基因组中均不存在D14L基因，但B14R和T4基因可表达有功能的蛋白质产物。古典的西非株系猴痘病毒B14R基因仅编码22~77个氨基酸残基的蛋白质产物，强毒的中非株系可编码长为326或210氨基酸残基的两种功能蛋白，本次流行的MPXV虽仍有极少数表现出古典的西非株系特征，但绝大多数可编码180个氨基酸残基的产物，以卢森堡分离株为代表的部分毒株甚至达到了218个，超过了长为210的中非株系，空间结构建模及配体-受体对接分析显示，长为180个氨基酸残基的B14R为有功能蛋白，其与配体结合的主要分子间作用力氢键及结合自由能甚至优于中非株系的病毒。除了提前出现终止密码子，插入长的“AT”重复片段可作为保证毒力蛋白失活的另一机制。T4基因的编码产物有3种长度，本次流行的西非株系MPXV均表达有功能的全长（221个氨基酸）。中非株系（左）及本次西非株系（右）猴痘病毒B14R蛋白与其配体结合的空间结构MPXV 2022上述的基因异质性与蛋白质长度多态性表明目前的MPX疫情可能比预期的更复杂，进而反映出这些猴痘病毒在变异与进化路径或过程上的复杂性：病毒可能通过持续的低强度流行而积累变异；亦可能在其进化过程上有过多次跨物种传播，并在此过程中获得或丢失与对抗宿主免疫相关的蛋白质基因或其相应的功能。复旦大学公共卫生学院研究生李艳娇、胡晶晶、同济大学附属同济医院呼吸与危重症医学科的侯静静博士、马来西亚博特拉大学（Universiti Putra Malaysia）医学与健康科学学院的孙众（Sun Zhong）博士为论文的共同第一作者；复旦大学公共卫生学院流行病学教研室王伟炳教授、陆一涵副教授、熊成龙副教授为本文的通讯作者。

看猴痘 mRNA 疫苗的研发，感觉大家是蹦着蹭热度去的，奈何猴痘病毒掀起的风浪太小，鱼卖不上价，只能扔太阳下晒晒干。科学家第一次从猴子身上分离到猴痘病毒（Mpox virus,MPXV）的时间是 1958 年，第一次发现猴痘病毒感染者的时间是 20 世纪七十年代。感染了猴痘病毒，你会出现头疼、发热、无力、肌肉疼痛、淋巴结肿大以及皮疹等症状，大概会持续 2-4 周，其致死率最近在 3-6%。在很长的一段时间里，猴痘病毒人传人的能力是有限的，记录在册的猴痘病毒感染者主要集中非地区，一直没有外扩。让人神经绷紧的是，自 2022 年 5 月以来，猴痘病毒感染的流行规模和地理范围不断扩大。到 2023 年 1 月份，猴痘感染者人数已经超过 8300 例，包括 75 例死亡人数，分布在 110 个国家。鉴于被新冠疫情支配的恐惧，WHO 未雨绸缪，赶紧把猴痘疫情也列为国际关注的突发性公共卫生事件，省得大家指责它应对危机迟钝。要想应对可能失控的猴痘疫情，那就得提前把疫苗整好。说起来，FDA 很早就批准了两款预防猴痘病毒感染的疫苗:一种称为 JYNNEOS，是一种基于修饰的牛痘病毒的有活性的非复制疫苗（MVAC），于 2019 年获批上市；一种称为 ACAM2000，是一种传统的减毒活疫苗，于 2007 年获批上市。不过，这两种疫苗经常会引起一些不良反应，而且，有研究发现 JYNNEOS 触发的靶向猴痘病毒的中和性抗体水平很低。见识到新冠 mRNA 疫苗的优势和火热，自然会让人迫不及待地投入到猴痘 mRNA 疫苗的研发中，抢摘第一个苹果。我们先得了解一下猴痘病毒，才能谈谈其疫苗的开发。猴痘病毒，祖上是痘病毒科的正痘病毒属，跟牛痘、天花以及兔痘是自家兄弟，所以，你要是接种天花疫苗，也能有效预防猴痘病毒感染，保护效率还不低，能到 85%，这一下子就让研发猴痘疫苗的需求变得没有那么迫切了。猴痘病毒是一种有包膜的双链 DNA 病毒，基因组长达 200kb。新冠病毒基因组大概 29.9kb，流感病毒基因组大概 13.5kb，HBV 基因组大概 3.2kb，HCV 基因组大概 9.6kb，这么比一下，心里就有数了。猴痘病毒基因组能编码至少 190 种蛋白，其中 30 多种蛋白的结构已经被解出来了。猴痘病毒有 2 种具有感染性的病毒粒子形态，一种是胞内成熟的病毒粒子，称为 IMV，如 M1R、E8L、A29L 等；一种是胞外的包膜粒子，称为 EEV，这个 EEV 就是在 MV 的基础上多了一层来自内质网的包膜，这层包膜上面嵌入了一些特异性的蛋白，如 A35R、B6R 等。牛痘病毒中的 A27L，D8L，L1R，A33R 以及 B5R 已经被鉴定出来属于中和抗体靶标，需要的注意是，这些蛋白在猴痘病毒中对应的名称是：A29L，E8L，M1R，A35R 以及 B6R。大量数据表明要想在动物模型中触发有效的针对痘科病毒的保护力，你接种的疫苗抗原里面就必须同时含有来自 IMV 和 EEV 的多种抗原。看个数据吧，在致死型牛痘病毒（VACV）攻毒模型中，接种 5 价蛋白亚基疫苗（L1R、D8L、A27L、A33R 以及 B5R）的小鼠相比接种 4 价蛋白亚基疫苗（L1R、、A27L、A33R 以及 B5R）的小鼠，存活率从 26%直线上升到 66%。我们来看看，到目前为止，都有哪些人在研发猴痘 mRNA 疫？他们是怎么进行抗原设计？免疫效果如何呢？👀   国药猴痘 mRNA 疫苗2022 年 11 月 21 日，国药集团杨晓明团队拔得头筹，率先宣布成功研发全球首个猴痘 mRNA 疫苗，在 BioRxiv上传文章：Novel mRNA vaccines encoding Monkeypox virus M1R and A35R protect mice from a lethal virus challenge。他们选择 M1R 和 A35R 作为抗原，设计出 3 款 mRNA 疫苗：第一种，由编码全长 M1R+具有完整胞外结构域的 A35R 的融合蛋白 mRNA 构成（SP-A35R IECD-M1R），称为 VGPox1；第二种，编码全长 M1R+缩短胞外结构域的 A35R 的融合蛋白 mRNA 构成（SP-A35R sECD-M1R），称为 VGPox2；第三种，由分别编码 A35R 和 M1R 的 mRNA 构成，称为 VGPox3。3 种类型的猴痘 mRNA 疫苗(10μg)免疫小鼠体均能触发 anti-A35R 血清 IgGs。相比之下，接种 VGPox1/2 的小鼠很早便可产生 anti-M1R 血清 IgGs，而接种 VGPox3 的小鼠一直要到 35 天后才可检测到的 anti-M1R 血清 IgGs。此外，中和性抗体和 T 细胞免疫反应也呈现类似的现象。接种 3 种类型的猴痘 mRNA 疫苗均能完全保护致死剂量 VACV 感染的小鼠，免疫组小鼠体重稳定且无任何不适症状，肺部病毒载量为 0。综合来看，VGPox1/2 要比 VGPox3 具有更好的免疫效果。👀   军事医学院王升启团队猴痘 mRNA 疫苗2022 年 11 月 23 号，晚了一步，错失研制全球首款猴痘 mRNA 疫苗的 Title，军事医学院王升启团队在 BioRxiv 上传文章：Monkeypox virus quadrivalent mRNA vaccine induces antibody responses and cellular immunity and protects mice against Vaccinia virus。他们构建了 4 种 mRNA 序列，分别编码 4 种猴痘抗原：A29，M1R，A35R，B6R。采用 LNP 将 4 种 mRNA 序列包封在一块，构建 4 价 mRNA 猴痘疫苗。免疫小鼠后，这款 4 价猴痘 mRNA 疫苗（40μg）触发显著的靶向 MPXV 抗原的特异性血清 IgG 抗体，靶向 VACV 的中和性抗体以及长久的 MPXV 特异性的记忆 T 细胞和 B 细胞反应，有效保护 VACV 攻毒小鼠。👀   耶鲁猴痘 mRNA 疫苗2022 年 11 月 29 号，耶鲁医学院陈斯迪团队在 BioRxiv 上传文章：Polyvalent mRNA vaccination elicited potent immune response to  monkeypox virus surface antigens。他们设计了一款编码多价抗原的猴痘 mRNA 疫苗，称为 MPXVac-097，由 5 种中和抗体靶标抗原融合组成，分别是 A29L，E8L，M1R，A35R 以及 B6R，相互之间串联 2A 自切割多肽。3 剂 MPXVac-097（8μg）免疫小鼠会触发显著的靶向 A35R 和 E8L-血清 IgG，极低水平的靶向 M1R-血清 IgG，检测不到靶向 B6R 或者 A29-血清 IgG。👀   Moderna 猴痘 mRNA 疫苗2022 年 12 月 19 号，Moderna 研究团队姗姗来迟，在 BioRxiv上传文章：A monkeypox mRNA-lipid nanoparticle vaccine targeting virus binding, entry, and transmission drives protection against lethal orthopoxviral challenge。他们选择了 4 种猴痘病毒抗原：A29L，M1R，B6R，A35R，而且，对这 4 种抗原序列进行了优化，添加信号肽，重置糖基化位点以及修饰跨膜结构或者胞质尾巴，以提升表达效率：A29L 序列：添加流感病毒 H1 蛋白的信号肽，移除掉所有 N-糖基化位点和半光氨酸；B6R 序列：截短胞质尾巴（残基 303 以后）的改造序列；A35R 序列：添加流感病毒 N2 蛋白的 N 末端跨膜结构域以替代野生型细胞质和跨膜区域（头 59 个氨基酸）的改造序列；M1R 序列：在 M1 蛋白序列中添加来自流感病毒 H1 的信号肽，将 M1 蛋白序列中的苏氨酸或者丝氨酸密码子突变为丙氨酸密码子，从而移除所有的 N-连接糖基化位点，还要将 M1 蛋白序列中的细胞质区域截短（残基 208 后面）。在小鼠体内单独注射 M1-mRNA 疫苗诱导的靶向 MPXV 的中和抗体滴度要显著高于单独注射 A29-mRNA 疫苗的，而单独注射 B6 或者 A35 抗原几乎无法在小鼠提捏诱导靶向 MPXV 的中和抗体。有意思的是，仅仅存在微弱中和抗体水平的 B6-mRNA 疫苗免疫小鼠血清能够阻断 VACV 传播，然而，来自 M1-mRNA 疫苗或者 MVA 免疫小鼠的血清对于 VACV 的传播仅有微弱阻断作用。鉴于此，研究者采取组合抗原方式，设计出 2 价/3 价/4 价猴痘 mRNA 疫苗：M1+A35，M1+A35+B6，M1+A35+B6+A29。相比于 MVA，4 价猴痘疫苗在小鼠体内能够触发显著的靶向 4 种抗原的血清结合抗体，强烈的 Th1 偏向性体液免疫，伴随着强烈的 Fc 受体反应。在致死剂量 VACV 小鼠感染模型中，MVA 和 2 价/3 价/4 价猴痘 mRNA 疫苗均能提供足够的免疫保护，避免小鼠感染死亡。👀   军事医学院秦成峰猴痘 mRNA 疫苗2023 年 3 月 22 号，军事医学院秦成峰团队在 Emerging Microbes & Infection发表文章：Rational development of multicomponent mRNA vaccine candidates against mpox。他们设计了 5 种 mRNA 序列，分别编码 5 种猴痘抗原：M1R，E8L，A29L，A35R，B6R，组合构建了 4 种类型的多价猴痘 mRNA 疫苗。4 种类型的多价猴痘 mRNA 疫苗免疫小鼠(含有编码每种抗原的 mRNA 5μg），均能强烈触发靶向 VACV 的血清 IgG，靶向 VACV 的中和抗体以及 MPXV 特异性的 Th1 偏向性细胞免疫。4 种类型的 mRNA 疫苗均能阻止感染高剂量 VACV 小鼠后体重的下降，感染 VACV 8 天后，在肺部和上呼吸道基本检测不到病毒 DNA 或者感染性病毒颗粒。值得注意的是，5 价疫苗 AR-MPXV5 和 4 价疫苗 AR-MPXV4a 展现出更强的诱导中和抗体和更好的免疫保护效果。👀   结论在猴痘 mRNA 疫苗的抗原选择上，必须得同时含有来自 IMV 和 EEV 的表面抗原。对抗原序列优化修改最多的，还得是Moderna公司研发团队。不同的抗原组合形式以及不同的表达方式触发的抗体滴度和细胞免疫存在差异，但是，所有类型的组合均能保护致死剂量 MAVC 感染的小鼠存活下来。大家都是选择 MAVC 攻毒小鼠模型去测评猴痘 mRNA 疫苗的保护效果，可能是 MPXV 感染小鼠模型不好建立。比较看下来，大家还是更愿意采取 LNP 包封多种 mRNA 疫苗序列方式构建多价疫苗，这种做法简单，可操作性强。你要是将多种抗原融合成一个蛋白表达，对于序列设计要求较高，不好把控，很难保证翻译出来的蛋白免疫原性不受损伤。猴痘 mRNA 疫苗现有的研发成果至少为多价 mRNA 疫苗的构建积累了经验，后面应该没人再愿意做下去了。识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

胰腺癌属致命恶性肿瘤之一，死亡率居世界第七位，主要分为胰腺导管腺癌（PDAC）和胰腺神经内分泌肿瘤。胰腺癌具有高度转移倾向，大部分患者诊断即为晚期，其化疗耐药性和特殊的肿瘤微环境会影响治疗效果，不可通过手术切除的局部晚期胰腺癌患者（LAPC）生存率小于5%。晚期常出现腹痛、恶心、中背痛、体重减轻、阻塞性黄疸、胃肠道 (GI) 出血、静脉血栓栓塞 (VTE)等相关症状。目前临床上针对LAPC患者常使用放化疗（CRT）结合吉西他滨等药物治疗，而转移性PDAC患者使用FOLFIRINOX（亚叶酸、5-氟尿嘧啶、伊立替康和奥沙利铂）能有效延长生存期。除了常规治疗手段，近来免疫疗法特别是溶瘤病毒疗法备受关注。近日，Frontiers in Oncology杂志刊登了题为《An Extensive Review on Preclinical and Clinical Trials of Oncolytic Viruses Therapy for Pancreatic Cancer》的研究综述，详细阐述了胰腺癌进展的分子机制以及总结了2000年以来已发表的溶瘤病毒疗法临床研究。胰腺癌细胞基因突变及分子机制研究发现，胰腺癌中大量聚集癌症干细胞（CSC），可能导致化疗耐药，肿瘤转移和复发，而产生CSC富集现象与上皮间充质转化（EMT）相关。针对各类胰腺癌进行全基因组测序分析，报告显示平均每个胰腺癌患者有63个突变，相关信号通路在大部分肿瘤中被阻断。“关于EMT-MET上皮细胞由于细胞黏附分子(如E-钙黏蛋白)表达减少、细胞角蛋白细胞骨架转化为波形蛋白（Vimentin）为主的细胞骨架，转变为间充质细胞，获得了较高的迁移与侵袭、抗凋亡和降解细胞外基质等能力。癌细胞在EMT激活后获得侵袭特性，从而导致癌细胞转移。当癌性间充质细胞到达（转移部位）时，会再次经历间充质-上皮转化 (MET)，以恢复上皮表型。miRNA失调MicroRNAs (miRNAs) 是小的非编码RNAs（20-25 nt），可调节靶mRNA的翻译。许多表达失调的miRNA与胰腺癌进展相关，如肿瘤转移、肿瘤耐药、癌症干性。过表达上调：过表达miR-301通过抑制胰腺癌细胞中E-cadherin的表达来调节EMT并导致吉西他滨耐药；过表达miR-296-5p靶向并下调BOK（凋亡调节基因），促进EMT、癌症侵袭和耐药性；过表达miR-103/107、miR-9、miR-181a促进EMT相关信号传导。干扰下调：胰腺癌细胞中Let-7和miR-200家族miRNA表达下调，抑制 Notch信号传导。在发现了 Let-7 和 miR-200 的下调；miR-148a、miR-141、miR-200家族、miR-216a、miR-217和miR-375等其他miRNA在胰腺癌中表达水平降低。K-Ras基因突变K-Ras蛋白是一种小GTPase转导蛋白，通过将外部信号传递到细胞核来调节细胞分裂。其在酪氨酸激酶激活后被激活，表皮生长因子 (EGF)与其受体结合，为表皮生长因子受体 (EGFR)。活化的K-Ras与GTP结合并通过MAPK和P13K/Akt引导的级联将活化信号转导到细胞核，从而调节细胞转化。致癌K-Ras基因突变使K-Ras因GTP水解被抑制而永久激活，导致对化学疗法产生抗性。在胰腺癌患者中，K-Ras基因突变高度发生且参与肿瘤形成发展，可作为重要治疗靶点。近日，一种直接共价靶向G12C突变体KRAS的策略揭示了潜在的动态药物结合位点，其他直接抑制K-Ras的基于结构的药物设计项目正在进行中。P13K信号通路磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)信号级联激活与生长因子刺激和细胞因子有关。细胞因子通过高亲和力细胞表面受体酪氨酸激酶(RTK)进入癌细胞，P13K下游信号通过进一步激活其他信号通路介导各种致癌功能，如癌细胞代谢、生长和运动。在PDAC和K-Ras构建的胰腺癌小鼠模型中P13K/Akt被激活，控制黏蛋白（MUC1）介导的放化疗法抗性。由此，MUC1-P13k信号的调节可作为胰腺癌的有效治疗靶点，使用P13K特异性抑制剂和下游信号分子衰减剂可尝试治疗PDAC患者。MAPK信号通路丝氨酸-苏氨酸激酶（MAPK），参与与各种细胞活动，如增殖、分化、转化和凋亡相关的细胞内信号传导，包括ERK（细胞外信号调节激酶）、JNK（c-Jun NH2-末端激酶）和p38。MAPK信号通路的中断显著加快了胰腺癌的进展。靶向MAPK信号下游基因可能使胰腺癌治疗效果提高。TGF-β信号通路转化生长因子-β（TGF-β）包含TGF- β、骨形态发生蛋白(BMP)和激活素/抑制素，调节细胞迁移、分化、增殖、凋亡和EMT等功能，在胰腺癌癌症初期通过阻止细胞周期进程和促进细胞凋亡表现肿瘤抑制特性，在癌症晚期阶段通过增强转移表达肿瘤促进特性。在靶向TGF-β的临床前试验中，与免疫检查点抑制剂联合使用时，靶向药物疗效改善。 缺氧信号通路在各种实体瘤中可以观察到缺氧介导的治疗抗性和生物学变化导致肿瘤转移率增加。肿瘤细胞通过刺激某些对氧敏感的信号通路进行反应，包括缺氧诱导因子1/2 (HIF1/2)信号通路和未折叠蛋白反应(UPR)，缺氧信号级联的变化导致新血管形成，最终导致肿瘤侵袭。胰腺癌中缺氧区域与不良预后和肿瘤发展有关，可作为胰腺癌恶性肿瘤的潜在治疗靶点。Wnt信号通路Wnt信号通路是一种进化保守的调控通路，包括非经典平面细胞极性(PCP)通路、非经典 Wnt/钙通路和经典通路，主要在细胞增殖、分化和存活中起作用。在胰腺癌中，该通路通过调节EMT、血管生成、细胞凋亡、干性和肿瘤微环境来促进癌变，瘤内经典Wnt配体过表达，通路持续激活也与胰腺癌耐药性有关。Notch信号通路Notch信号通过配体与Notch受体的结合而激活，显著促进细胞增殖、存活和分化。在癌症中，通过表达EMT标志物来促进细胞运动和侵袭特性，且会根据细胞环境发挥肿瘤抑制和致癌双重作用。胰腺癌中，Notch过表达，起致癌作用，信号通路的再激活也与胰腺癌的发生和进展有关，因此可作为胰腺癌有效生物标志物和治疗靶点。溶瘤病毒疗法癌症免疫疗法通过增强机体免疫系统识别和破坏癌细胞，溶瘤病毒（OVs）疗法作为一种新型的靶向免疫疗法，通过裂解作用选择性地消灭癌细胞，从而产生抗肿瘤免疫。由于肿瘤细胞内信号通路失调，使得病毒对异常的肿瘤细胞具有靶向选择性，而抗病毒信号传导的主要蛋白质编码基因突变导致的功能不完全丧失，有助于肿瘤细胞中的病毒复制，中断的信号传导也受到抑制以提高溶瘤病毒治疗的效果。研究表明，将相关信号通路抑制剂与溶瘤病毒协同作用，增强了病毒的细胞毒性，在癌症治疗中良好的临床治疗效果。（图为溶瘤病毒设计各通路靶点的应用汇总）腺病毒腺病毒是是非包膜双链DNA病毒，具有二十面体衣壳，55种血清型，通过柯萨奇和腺病毒受体（CAR）进入细胞。设计工程化腺病毒旨在提高抗肿瘤疗效和癌细胞选择性。临床前试验：① 溶瘤腺病毒Ad5/3-E2F-d24-vIL2使用具有携带Ad5型核酸和Ad3-Fiber的病毒基因组骨架，编码vIL-2、IL-2免疫调节变体蛋白。62%的小鼠模型显示出长期存活率以及免疫反应的激活。② 溶瘤腺病毒AdNuPAR-E-miR222-S外包被聚乙二醇化寡肽修饰的聚β-氨基酯，避免中和抗体产生，通过干扰miR-222在胰腺癌细胞中表达，有效控制了PANC-1肿瘤小鼠模型进展。③ 重组腺病毒DNX-2401易在具有缺陷P16 / RB / E2F通路的细胞中复制，有效抑制胰腺癌细胞系中肿瘤细胞的进展。在I期临床试验中显示针对脑癌的有效结果。临床试验：单纯疱疹病毒单纯疱疹病毒是包膜双链DNA病毒，具有二十面体衣壳，通过HVEM、nectin1、nectin2受体进入细胞，常用的工程化疱疹病毒有T-VEC, G207, HF10, HSV1716和OrienX010。临床前试验：① 具有突变ICP6基因的Myb34.5单纯疱疹病毒1型（HSV-1），在过表达β-myb基因的胰腺肿瘤细胞中显示有效的复制，与吉西他滨低剂量组合治疗小鼠模型，能够有效减小肿瘤大小。② 重组单纯疱疹病毒HSVGM-CS缺失3个基因（γ134.5，ICP47和ICP6），过表达GM-CSF。在基于胰腺癌细胞系的测试中发现，甲氨蝶呤（MTX）影响HSV-1在肿瘤细胞中的复制；5-氟尿嘧啶（5-FU），伊立替康（CPT-11），细胞因子如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）与HSV-1联合用药改善了病毒复制并增加HSV-1的活性。临床试验：呼肠孤病毒呼肠孤病毒是非包膜分节段双链RNA病毒，对人体具有非致病性，通常选择性感染K-Ras、BRAF、EGFR突变的肿瘤细胞并复制。临床前试验：① 呼肠孤病毒（Reolysin）与硼替佐米（BZ）联合治疗胰腺癌，体外和体内测试发现增强了癌细胞凋亡，抗癌反应水平高。② 重组呼肠孤病毒rS1-mmGMCSF表达小鼠GM-CSF，临床前胰腺癌小鼠模型试验显示改善了免疫细胞（DC、 T细胞）全身抗肿瘤活性。③ 呼肠孤病毒与CD3-双特异性抗体（CD3-bsAbs）分别给药胰腺癌模型，病毒显著增强（CD3-bsAbs）抗肿瘤疗效，诱导了非注射远端病变的消退。临床试验：牛痘病毒牛痘病毒是包膜双链DNA病毒，设计工程化牛痘病毒增强胰腺癌细胞特异性裂解作用。临床前试验：① 牛痘病毒mpJX-594（mpJX）联合抗程序性死亡受体-1抗体（PD1）在小鼠胰腺神经内分泌肿瘤模型中提高抗肿瘤免疫反应，细胞凋亡水平增加，增殖减少。② 重组牛痘病毒VVL-21表达B5R和白细胞介素-21（IL-21）基因，在胰腺癌转移性小鼠和仓鼠模型中全身给药VVl-21与α程序性细胞死亡蛋白1（α-PD1），免疫细胞中CD8+T细胞、自然杀伤细胞和巨噬细胞活性水平增加。③ 重组牛痘病毒VV-ING4表达生长抑制剂ING4基因。在胰腺癌小鼠模型中测试VV-ING4单独使用发现其有效诱导癌细胞毒性和凋亡，与吉西他滨联合治疗中，VV-ING4改善吉西他滨抗癌疗效。④ 重组牛痘病毒vvdd-tdtomato-hGMCSF表达GMCSF基因，在免疫功能正常的仓鼠上测试，表达牛痘病毒的GMCSF有助于通过中性粒细胞和巨噬细胞的激活和侵袭完全清除皮下胰腺病变。临床试验：细小病毒细小病毒是非包膜单链DNA病毒，可降低胰腺癌细胞中IG和HERV的水平，减弱细胞先天免疫。临床前试验：① 腹膜转移的胰腺癌小鼠模型中，在肿瘤内注射H-1PV导致肿瘤减少，同时注射IFNγ，进一步改善了机体免疫反应。② 携带细胞趋化因子IL-2、MCP-3/CCL7和IP-10/CXCL10的细小病毒在胰腺癌异种移植中抗肿瘤疗效显著，表达IL-12的细小病毒比其他两种变体表现出更强的抗肿瘤反应。临床试验：麻疹病毒麻疹病毒是包膜单链负义RNA病毒，通过信号传导淋巴细胞活化分子（SLAM）受体或CD46受体进入细胞。临床前试验：① 重组麻疹病毒MeV-CD-FmiRTS148a表达5-氟胞嘧啶及前体，在胰腺癌异种移植模型中瘤内注射，治疗的小鼠显示出肿瘤大小减小，无进展生存期延长。少量MeV与吉西他滨联合给药，肿瘤体积减小大于50%。② 麻疹病毒MV-EGFPmtd编码miRTS（miR-122，miR-7和miR-148a），在体外和体内测试发现MV-EGFPmtd的高靶向胰腺癌细胞。水疱性口炎病毒水疱性口炎病毒是包膜非分段负义RNA病毒，优先在肿瘤细胞中感染复制。临床前试验：① 混合水疱性口炎病毒（VSV-FH）替换了麻疹病毒包膜蛋白F、H，通过突变K174E和E238K，降低了肿瘤对VSV的耐药性。② 重组VSV-ΔM51变异体通过下调IFN信号传导，并联合小分子抑制剂，显著消除了胰腺癌细胞中VSV耐药性。新城疫病毒新城疫病毒是包膜单链负义RNA病毒，通过病毒内吞作用或质膜融合进入细胞，对人类不具有致病性。因癌细胞过表达I型IFN、Bcl-xL和小GTPase，NDV选择性地在癌细胞中感染和复制。临床前试验：① 在小鼠低表达TGF-β模型中静脉注射NDV，发现肿瘤有效减少，无进展生存期延长。② 在异种移植模型肿瘤内注射rNDV-F3aa，显示肿瘤消退和抗肿瘤细胞毒性。小结溶瘤病毒疗法通过工程化插入外源基因或miRNA提高了胰腺癌治疗的有效性、特异性和安全性，特别是跟吉西他滨联合给药时，能显著降低吉西他滨的高剂量毒性，同时得到有效的临床结果。针对胰腺癌细胞中受损通路的有效靶点，设计特异的溶瘤病毒将是一种安全且有前景的治疗方式。（图为吉西他滨与重组或天然溶瘤病毒联合治疗相关的临床前研究汇总）