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徐寒梅中国药科大学二级教授（博导），海洋药学专业负责人，江苏省合成多肽药物发现与评价工程研究中心主任，国家药典委员会委员，国家级高层次人才项目入选者。主编出版 3 部论著（《新药非临床研究与开发》《抗肿瘤药物药理学实验指南》《酶类药物学》），发表学术论文 213 篇（SCI 收录 81 篇）， 申请国内专利 32 项（获授权 24 项），培养研究生 160 名（博士 29 名）。主办“第十四届中国国际多肽学术会议暨第五届亚太国际多肽学术会议”，多次受邀参加国内外学术会议报告。研究领域涉及多肽药物研发、全新微肽发现及机制研究、长链非编码 RNA 与疾病关系的分子机制。主持课题包括国家自然科学基金、国家 “863”计划、国家重大专项和重大横向课题等项目 30 余项。先后获中国药科大学“十三五”科技突出贡献奖，联合国教科文组织和平中心“2020 跨文化科技大使”，教育部技术发明奖一等奖，中国产学研合作创新成果 奖二等奖，江苏医药科技进步奖一等奖、二等奖各 1 次，中国发明创业成果奖一等奖，江苏省科学技术奖一等奖，江苏省高校“青蓝工程”中青年学术带头人，内蒙古组织部 “草原英才”等奖励和荣誉。优化规律间隔成簇短回文重复序列相关核酸酶 9 敲入效率的研究进展 PPS 洪秀，李臣诚，徐寒梅 *（中国药科大学生命科学与技术学院，江苏 南京 210009）[ 摘要 ] 基因编辑技术可以通过在基因组 DNA 中精确插入、缺失或替换而人为地修饰靶位点的遗传物质。近年来，随着规律间隔成簇短回文重复序列及其相关核酸酶9（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated nuclease 9, CRISPR/Cas9）系统的发展，研究人员对各种细胞基因组进行编辑的能力大大提高，但由于同源定向修复（homologous directed repair, HDR）效率低下，许多通过抑制非同源末端连接（non-homologous end joining, NHEJ）或增强 HDR 的方法，如化学调节、同步表达和同源臂优化等被开发出来用以提高基于 CRISPR/Cas9 系统的精确基因敲入效率，重点介绍这些方法如何优化 Cas9 敲入效率的最新进展。 基因编辑是针对靶基因进行插入、敲除和定点突变以完成精确修饰的基因工程技术 [1]，目前包括锌指核酸酶（zinc-finger nuclease，ZFN）技术、转录激活因子样效应核酸酶（transcription activator-like effector nuclease，TALEN）技术和规律间隔成簇短回文重复序列及其相关核酸酶9（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated nuclease 9，CRISPR/Cas9）技术[2]。天然的CRISPR/Cas9 系统由Cas9，CRISPR 衍生 RNA（CRISPR-derived RNA，crRNA）和反式激活crRNA（trans-activating crRNA，tracrRNA）3 部分组成，crRNA 和 tracrRNA 通过局部碱基配对形成引导RNA（guide RNA，gRNA），与 Cas9 蛋白结合并引导其识别和切割目标 DNA 序列 [3]。CRISPR 介导的基因编辑使研究人员能够使用 Cas9 和适当的 gRNA 在基因组特定位置有效地引入双链断裂，并且通过非同源末端连接（nonhomologous end joining，NHEJ）和同源定向修复（homologous directed repair，HDR）2 种修复途径，实现突变或外源基因插入 [4]。NHEJ 修复方式通过在双链断裂处引入小的插入或缺失，造成基因移码突变；当外源模板存在时，可通过 HDR 实现基因的精准修复或片段插入 [5]。尽管 CRISPR/Cas9 可通过 HDR 介导基因敲入，但 HDR 仅在 G2 和 S 期细胞中活性较高，因此，对于神经元细胞等分裂缓慢或处于有丝分裂后期的细胞并不适用；此外，NHEJ途径是细胞中 DNA 修复的主要方式 [6]。因此，上述2 种因素导致 HDR 介导的基因修复效率较低，仅为0.1%~6.5%[7]。CRISPR 系统递送是实际应用的关键，目前它能通过 3 种形式被递送到细胞中，包括 DNA（质粒DNA）、信使 RNA（messenger RNA，mRNA）以及核糖核蛋白（ribonucleoprotein，RNP），不同的递送形式在病毒载体或非病毒载体的协助下进入细胞，从而完成靶标基因的编辑。第 1 种 DNA 递送需将 Cas9 蛋白、单向导 RNA（single guide RNA，sgRNA）的 DNA 序列构建于质粒载体中，再对质粒进行病毒包装（如慢病毒、腺相关病毒等），最终 Cas9 蛋白和 sgRNA 序列在病毒介导下进入细胞从而起始基因编辑。它操作简单且成本低，适用于基因功能的研究，但存在如下缺点：1）质粒载体过大，从而导致病毒包装效率和递送效率降低；2）DNA 序列需经转录、翻译形成 Cas9 蛋白、sgRNA 再起始编辑功能，降低了编辑效率；3）转染后的 Cas9 基因序列不易去除，导致 Cas9 蛋白长期存在细胞中，易引发更大的毒性和副作用 [8]。第2 种 mRNA 递送是将 Cas9 的 mRNA、sgRNA 序列在非病毒载体的介导下递送至靶细胞，起始基因编辑。这种递送形式的优点是由于 mRNA 无需转录，经翻译后即可启动基因编辑，使得编辑效率高于DNA 递送形式，且因 mRNA 不会长久维持在细胞中，从而降低了 CRISPR 系统的脱靶率。不过，由于 mRNA 的稳定性较差，对递送载体有较高要求。第 3 种 RNP 递送是将 Cas9 蛋 白、sgRNA 组装成RNP，然后通过非病毒载体直接递送于细胞中起始基因编辑，为目前最高效的 CRISPR/Cas9 基因编辑策略。该递送形式优势明显，递送至细胞后无需转录、翻译过程，直接起始基因编辑，从而能显著提高编辑效率，且 RNP 一般在细胞内 48 h 即可降解，不会在细胞中长期存在，从而降低了对细胞的毒性和不良影响，极大降低脱靶率，此外 RNP 递送不受细胞类型限制，使编辑更加精准、高效。但是 RNP转染的缺点是编辑时间较短，需在一段时间内提供足够的编辑工具，以便进行足够的编辑；并且，由于需要大量合成 Cas9 蛋白和 sgRNA，导致 RNP 转染的成本相对较高；在实验中选择RNP 转染还需要考虑 sgRNA 和 Cas9 蛋白的适配性。总之，CRISPR技术的快速发展提高了研究人员对细胞进行精确基因编辑的能力，但 CRISPR/Cas9 技术目前仍面临递送效率低、HDR 效率低、脱靶性，以及毒性和副作用等多种问题 [9]。鉴于 Cas9 诱导断裂的 HDR 效率相对较低，本文主要通过对供体模板及递送方式的优化，外源加入调控 NHEJ 或 HDR 相关信号通路、染色质开放或关闭状态、细胞周期的小分子化合物，构建敲除或过表达细胞系或利用小干扰 RNA（small interfering RNA，siRNA）调控细胞信号通路关键蛋白的表达，以及对 Cas9 系统的优化等方法来优化Cas9 敲入效率，从而提高编辑的特异性和减少脱靶效应，提升基因编辑的传递效率和导入能力，并实现更大片段的精准编辑，加速了基因编辑技术向临床转化，对于解决基因编辑面临的主要难点具有重要意义。1供体模板的优化策略常见供体模板有质粒、双链 DNA（double strand DNA，dsDNA）和单链 DNA（single-stranded DNA，ssDNA）3 种。质粒作为基因敲入模板，不仅制备周期长，且高浓度导入会造成较强的细胞毒性 [10]。因此，研究者常使用 dsDNA 或 ssDNA 作为供体模板。对于小片段的插入，通常选用 ssDNA 供体；对于荧光蛋白或基因表达盒等大片段插入，则一般选择dsDNA 和质粒供体。值得注意的是，左右同源臂一般以待敲入的目的细胞基因组为模板扩增，以避免不同细胞基因组差异导致左右同源臂不同源而降低 HDR 效率。由于通过同源重组修复途径敲入大于 2 000 bp 的长基因片段很难成功实现，因此，供体模板的设计是基因敲入实验所面临的主要挑战之一。下面将对模板选取及设计过程中可能遇到的问题进行归类分析，如根据敲入目标片段的长度和靶标的类型选择合适的模板的类型及设计最佳的同源臂大小来提高敲入效率（见表 1）。1.1供体模板的设计在基因编辑实验中，当插入目标片段长度小于 2 000 bp 时，ssDNA 在包含较短同源臂的情况下可以产生比 dsDNA 更高的 HDR 效率；无论使用 ssDNA 或 dsDNA 供体，使用非前间隔序列邻近基序（protospacer adjacent motif，PAM）链供体的HDR效率略高于PAM链供体，Liang等[11]研究表明，最优ssDNA的总长度约为200个碱基，30个碱基的3'端短同源臂和 40 个碱基的 5' 端长同源臂组成的不对称同源臂供体 DNA 在诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cell，iPSC）中可实现 45% 的敲入效率。此外，当 sgRNA 的切割位点位于敲入位点上游 5 bp 或下游 3 bp 时，基因的敲入效率最佳。值得注意的是，为了避免二次切割，可将对应 sgRNA 的PAM 或邻近 PAM 的序列进行同义突变。当目标片段长度大于 2 000 bp 时，选择同源臂长度为 600 ~ 2 000 bp 的质粒或 dsDNA 更加合适。然而哺乳动物细胞中对于长片段 DNA 的精准插入效率非常低，Gao 等 [12] 开发了简单的基因组编辑方法，称为转录偶联 Cas9 介导的编辑（transcription-coupled Cas9-mediated editing，TEd）， 当 插 入 大DNA 片段时它可以实现比传统 Cas9 介导的编辑更高的效率。首先研究者发现处于转录耦合状态的供体 DNA 能够显著提高绿色荧光蛋白（gene fluorescent protein，GFP）的精准插入效率，随后基于上述发现设计开发了一系列优化的 TEd 基因编辑系统，通过在同源供体 DNA 上引入启动子以形成 TC-donor（transcription-coupled HR-donor）， 并在其转录产物 TC-RNA 的 3' 端添加多个 MS2 茎环结构（MS2 binding loops）以及在 Cas9 上融合 MS2适配体的结合结构域，该团队发现优化后的 TEd 系统对于 GFP 的精准插入效率可以达到传统方法的 10倍左右，并在高达 10 000 bp 的 DNA 片段敲入方面也获得了很好的效果。总之，在 Cas9 实验中，当插入片段长度小于2 000 bp 时，ssDNA 供体可提供更短的同源臂，获得比 dsDNA 形式的模板更高的插入效率；当目标片段长度大于 2 000 bp 时，应选择同源臂长度为 600 ~2 000 bp 的质粒或 dsDNA。与相同长度的 ssDNA 供体相比，长 dsDNA 供体更有可能产生细胞毒性：供体越长，细胞毒性就越明显，且增加较长 dsDNA 供体的浓度也会导致毒性的产生。dsDNA 供体的另一问题是它们更倾向于插入整个供体序列，包括同源组。此外，在设计 HDR 供体 DNA 的时候，还应该注意以下 2 点：1）如果在 HDR 实验中使用 Cas9 核酸酶，最好使用与目标 DNA 的 2 条链匹配的同源序列检测 ssDNA 供体；2）当使用 Cas9 系统时，要避免在 HDR 修复后重新产生 PAM 位点。设计 ssDNA供体序列，应在 PAM 位点引入同义突变，这样 RNP就不能识别修复后的序列。否则，Cas 核酸酶可能会重新切割修复后的 DNA，除了所需的 HDR 突变外，还会形成 NHEJ 介导的插入缺失。因此，设计 HDR供体模板时，要注意区分短型插入和长型插入。对于较短或中等长度插入，建议使用 ssDNA 作为 HDR 供体模板。根据敲入目标片段的大小选择合适的供体类型及最佳长度的左右同源臂，并对 PAM 位点引入同义突变，同时，也要考虑敲入不同靶标的难易程度，从而不断提高 HDR 介导的敲入效率。1.2 供体模板的修饰对供体模板进行化学修饰或组蛋白修饰将提高其稳定性及基因编辑效率。考虑到 dsDNA 在细胞内极易被降解、敲入效率低，Akhmetzyanova 等 [13] 研究发现，双链模板的末端修饰能提高供体的稳定性，他们采用体外合成 Cas9-RNP 和 5' 端修饰的短同源臂dsDNA 供体进行结合，选择了 13 种化学基团对双链模板进行修饰，并选用 HCT116 细胞进行筛选和效率测试，结果发现所有修饰均能在不同程度上提高编辑效率，其中利用化学基团 C6-聚乙二醇 5' 端修饰的dsDNA 模板能够将敲入效率提高为未修饰模板的 5~6 倍，并且在 293T 细胞中将长度为 700 bp DNA 片段的敲入效率提高到 65%。此外，在短的 ssDNA 模板的5'端或3'端添加硫代磷酸二酯键能提高其稳定性，减少核酸外切酶的影响，从而提高在 iPSC 和 Jurkat细胞等核酸酶水平高的细胞中的编辑效率。另外，在基于 HDR 的基因编辑中，通常以纯化或“裸露”的 DNA 为供体模板。但细胞中的DNA 是被组蛋白包裹成染色质的天然形式存在的，而组蛋白 H3K36 三甲基化（H3K36me3）是人类细胞HDR 至关重要的修饰，Cruz-Becerra 等 [14] 发现，与裸 DNA 供体模板相比，组蛋白修饰的染色质供体模板能够更有效地发生同源链配对，其基因编辑效率是裸 DNA 供体模板的 2.3~7.4 倍。综上，利用 5' 端化学修饰的 dsDNA 作为模板，结合高稳定和低脱靶性的 Cas9-RNP 递送，能够实现比未修饰情况下高出 5 倍的敲入效率，并且在人类胚胎肾脏细胞中对长度为 700 bp 的 DNA 片段实现了效率达 65% 的敲入。通过用更稳定的硫代磷酸二酯键替代磷酸键，对 ssDNA 供体进行末端修饰，可以增强其稳定性。该策略不仅大幅度地提高了敲入效率，也极大地缩短了制备周期，给未来的基因编辑实验和基因治疗手段提供了更大的可能性。另一方面，H3K36me3 和 H3K4me3 甲基化修饰介导人类细胞中的同源重组与 Cas9 融合，使得 HDR 效率提高了 3 倍，且减少了脱靶效应，证明了组蛋白修饰提高了 CRISPR/Cas9 介导的 HDR 修复效率。1.3 供体模板与 Cas9 的递送形式目前有以下几种方法可将 CRISPR/Cas9 及其组分递送到目标细胞，包括 Cas9-RNP，Cas9-mRNA和 Cas9 质粒形式以及病毒、非病毒等载体。1.3.1 Cas9-RNP Cas9-RNP 复合物由 Cas9 蛋白和sgRNA 组成，该形式递送 Cas9 蛋白和 sgRNA 是最直接简便的方法，无需转录和翻译过程，能直接快速启动基因编辑过程，脱靶率低且毒性小。但由于Cas9-RNP 复合物尺寸较大不易包封，该形式递送存在一定的难点 [15]。Chandrasekaran等[15]通过电转将 Cas9/sgRNA导入原代 T 细胞，成功实现了近 40% 的基因编辑效率；进一步引入 HDR 模板，产生了 20% 的基因敲入效率。Kim等[16] 通过电转的方式将 Cas9/sgRNA 递呈至人红白血病细胞系（K562），通过改变 sgRNA靶向不同的位点，分别获得 16%~72% 的编辑效率，平均效率为 44%。在其他方式难以转染的人成纤维细胞和多能干细胞中，通过电转也能分别得到 19%和 23% 的基因编辑效率。1.3.2 Cas9-mRNA RNA 水平递送编码 Cas9 蛋白的mRNA 和 sgRNA，mRNA 能较快启动基因编辑，但该递送方法的局限性在于 mRNA 本身稳定性差且在体内外都容易受到 RNA 酶的降解，限制了基因编辑的持续时间，降低了基因编辑效果 [17]。Liu 等 [18] 发现结合了二硫键的脂质纳米颗粒BAMEA-O16B可以高效地将 Cas9 mRNA 和 sgRNA传递到细胞中。研究表明，使用BAMEA-O16B同时递送 Cas9 mRNA 和 sgRNA 可以抑制 293T 细胞的 GFP 表达，基因编辑效率高达 90%。 1.3.3 Cas9 质粒 由于稳定性高、操作简单、成本低等优点，从 DNA 水平递送编码 Cas9 蛋白和sgRNA 的质粒成为常用的递送形式。然而递送质粒会降低基因编辑效率，延长 Cas9 切割时间从而增加脱靶率 [18-19]。Liu 等 [18] 设计了基于聚合物/无机杂化纳米粒子的双重靶向递送系统，将 CRISPR/Cas9 质粒递送至人乳腺癌细胞 MCF-7 细胞核中，基因编辑效率高达90%。Zhang 等 [19] 研发了基于聚乙二醇-b-聚乳酸-羟基乙酸二嵌段共聚物 [poly (ethylene glycol)-b-poly (lactic-co-glycolic acid)，PEG-b-PLGA] 纳米颗粒的递送系统，其能够将 CRISPR/Cas9 质粒 DNA 递送至多个器官的血管系统中，并实现了 80% 的基因编辑效率。1.3.4 病毒和非病毒载体 病毒载体是 CRISPR/Cas9系统最常用的递送载体，但病毒载体可能会导致宿主产生有害的免疫原性和突变，限制了其应用；非病毒载体具有免疫原性低、无内源病毒重组的优点，因而纳米粒子制剂载体受到广泛的关注 [20]。基于阳离子脂质体的纳米颗粒常用于递送CRISPR/Cas9 系统，Zhang 等 [21] 合成了新型聚乙二醇磷脂修饰的阳离子脂质纳米粒子递送系统，从而使体外 A375 细胞的转染效率达 47.7%，且含有酯基的可生物降解的脂质样化合物在体内外均表现出有效的 Cas9 mRNA 递送。壳聚糖也是良好的聚合物载体，Qiao 等 [22] 将红色荧光蛋白包封在壳聚糖中形成带正电荷的纳米颗粒，将 Cas9-RNP 和 ssDNA 供体同时递送到细胞质中，具有很高的基因组编辑效率且无细胞毒性。目前，基因编辑体内递送相关的免疫原性问题仍需进行全面分析，体内已存在的与递送载体相关的中和抗体有可能对基因编辑形成干扰，对 Cas9 或其他基因编辑元件的细胞免疫反应可导致转染细胞被清除，基因编辑在转染细胞中长期持续的表达也可能激活适应性免疫反应。与长期表达的递送方式相比，瞬时递送的优势就在于能够降低脱靶的概率，这在体内基因编辑中尤其重要，因为即使非常低频的脱靶在长期表达时也可能导致癌变。Cas9-mRNA 为快速、稳定性差且在体内外都易受到降解的递送形式，适用于周期短的实验研究；Cas9 质粒稳定性高、操作简单、成本低，是常用的体外递送形式，但由于各类转染试剂存在细胞毒性，并且切割时间长，容易引起脱靶效应；与以 DNA/RNA 为基础的递送技术相比，RNP 体系直接在体外将 Cas9 蛋白和 gRNA 组装形成 RNP 复合物，通过电转法等方式导入靶细胞，实现 Cas9 的瞬时表达。该递送形式使细胞毒性更低，半衰期更短，同时采用其进行基因编辑可带来更低的脱靶效应。由于 RNP 在血液中易被蛋白酶降解，RNP 介导的CRISPR 基因编辑更多用于体外实验 [23]。目前病毒载体仍然是临床试验的常用载体。病毒载体可实现高转染效率，但是存在包装外源片段长度有限、免疫原性强和具有潜在脱靶效应等局限性。其中，慢病毒宿主范围广，基因容量大，感染效率高，能整合基因到宿主细胞，实现长期稳定表达，常构建稳定株；腺相关病毒免疫原性低，具有多种血清型，体内扩散能力强，常用于体内研究；腺病毒携带外源基因片段大，感染效率高，主要用于体外难感染的细胞。非病毒载体的原理是采用人工合成的载体材料的物理化学性质来介导基因的转移，包括脂质纳米颗粒、电穿孔、细胞穿透肽等作为递送方式。与病毒载体相比较，非病毒载体具有安全性高、包装尺寸大、免疫原性弱、靶向性可控的优点，但实验耗材成本高，存在细胞毒性，部分细胞类型递送效率低 [24-25]。因此，研究人员可根据实验需求选取合适的递送方式，例如 Cas9-RNP，Cas9-mRNA，Cas9 质粒以及通过病毒和非病毒载体包装的递送系统，包括阳离子脂质体的纳米颗粒、壳聚糖等，从而能在体内外有效提高基因编辑效率。2 调控 DNA 双链断裂修复的小分子化合物 如前所述，自然界中 HDR 的频率非常低，哺乳动物细胞通过多种机制优先使用 NHEJ 进行 DNA 双链断裂（double-strand break，DSB）修复，除了有丝分裂外，NHEJ 在整个细胞周期中都是活跃的，而 HDR 仅限于 S 期和 G2 期活跃。研究表明，NHEJ小分子抑制剂、HDR 激活剂和细胞周期抑制剂可影响 DSB 修复的不同方面，使 DSB 修复平衡转向HDR，有利于提高 CRISPR/Cas9 系统的基因敲入效率（见图 1），如细胞周期抑制剂可通过延长细胞周期的 S 期和 G2 期的长度以提高 HDR 的效率 [26]。目前开发的小分子化合物已被用于提高 HEK 293细胞、人类 iPSCs、小鼠胚胎干细胞（embryonic stem cells，ESCs）和小鼠胚胎中的 HDR 效率（见表 2）。2.1 调控 HDR 与 NHEJ 相关信号通路的小分子 参与双链断裂 DNA 修复途径的某些小分子通过作用于 DNA 修复过程中的关键蛋白以有效提高敲入效率（见图 1）。DNA 修复途径包括 HDR和 NHEJ。HDR 激活剂或 NHEJ 抑制剂可有效提高 HDR 敲 入 效 率。 其 中 HDR 激活剂有 RS-1 和brefeldinA；NHEJ 抑制剂包括 SCR7，L755507，NU7026，白藜芦醇，NU7441 和 KU-0060648。RAD51 是有丝分裂细胞中催化 DNA 同源重组修复过程中同源配对的唯一蛋白，其通过介导 DNA链配对和交换而参与 DNA 同源重组修复。Song 等[27]研究表明，RS-1 可激活 RAD51 蛋白，使 RAD51 蛋白与 DNA 的结合更稳定，从而将 HDR 修复效率提高 3 倍，值得注意的是，高浓度 RS-1 具有较强的细胞毒性。胞内蛋白运输抑制剂能抑制物质从内质网向高尔基体的运输，Hong 等 [28] 研究发现，使用胞内蛋白运输抑制剂 brefeldinA，可将 HDR 效率提高 2 倍。DNA 连接酶Ⅳ（DNA ligase IV，LIG4）是 NHEJ途径的关键酶，Ray 等[29] 发现 SCR7 是 LIG4 的抑制剂，能抑制 NHEJ 活性，在 A549 细胞中，相较于未处理的对照组，SCR7 使靶位点的插入效率提高约 3 倍。β3-肾上腺素能受体是一类 G 蛋白偶联受体，Murakami等 [30] 研究发现 L755507 和 NU7026 是β3-肾上腺素能受体激动剂，可增强 CRISPR 介导的HDR 效率，最佳使用剂量为 5 μmol·L-1，并且在 24 h以内效果最佳，可将敲入效率提高 3 倍。为了研究DNA 依赖性蛋白激酶催化亚单位（DNA-dependent protein kinase catalytic subunit，DNA-PKcs）对 DSB的 NHEJ 修复途径的影响，Sak 等 [31] 评估了 DNAPKcs 特异性抑制剂 NU7441 对不同状态的非小细胞肺癌细胞株 DSB 修复的细胞周期特异性作用，结果显示 NU7441 以细胞周期依赖性的方式抑制 NHEJ的效率。Robert 等 [32] 研究显示，DNA 蛋白激酶抑制剂 NU7441 和 KU-0060648 能抑制 NEHJ 活性，将 HDR 效率提高 3 倍。Li 等 [33] 研究发现，白藜芦醇可抑制 LIG4 的表达，使猪胎儿成纤维细胞的 HDR 效率提高 2~3 倍。此外，他们还发现白藜芦醇以剂量依赖性的方式抑制 S 期猪胎儿成纤维细胞，而 HDR 相关基因如RAD51 和 RAD52 的表达与白藜芦醇呈剂量依赖性增加。因此，白藜芦醇通过与多个 DNA 损伤相关蛋白相互作用，增加了 CRISPR/Cas9 介导的 HDR 效率。综上，为了提高 CRISPR/Cas9 介导的 HDR 效率，研究人员可选择性使用小分子化合物，如 HDR 激活剂 RS-1 和 brefeldinA 分别作用于靶标 RAD51 和高尔基体，将敲入效率提高 2~ 3 倍；NHEJ 抑制剂包括SCR7，L755507，NU7026，NU7441，KU-0060648和白藜芦醇等，通过作用于不同的靶标，主要有LIG4，DNA 蛋白激酶和 β3-肾上腺素能受体，抑制NHEJ 修复途径，从而使 HDR 修复效率提高 2~5 倍。2.2 调控染色质开放或关闭状态的小分子靶向 DSB 的可及性主要取决于染色质状态，并且 DNA 有效修复的第一步是允许修复途径相关的蛋白质结合，HDR 与 NHEJ 的修复平衡与染色质结构的状态相关。染色质结构的开放或关闭状态主要由组蛋白乙酰化和去乙酰化的平衡控制，而组蛋白乙酰化由组蛋白乙酰化酶（histone acetylase，HAT）和组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC）严格调控。乙酰化导致开放活跃的染色质状态，HDAC 使组蛋白去乙酰化，实现染色质致密卷曲。HDAC 抑制剂可通过提高染色质特定区域组蛋白乙酰化水平，促进开放染色质位点，从而调控CRISPR/Cas9 的基因编辑效率 [34]。HDAC 抑制剂能抑制 NHEJ 关键因子的去乙酰化，显著增加 G2/M 期的细胞百分比，并相应减少了 G1/S 期的细胞数量，从而促进HDR 修复途径。Li 等 [35] 通过评估组蛋白修饰剂如 HDAC 抑制剂和HAT（靶点包括 p300/CBP，Tip60 和 MOZ）抑制剂对 CRISPR/Cas9 介导的基因编辑效率的影响，证明了抑制 HDAC1 和 HDAC2 的活性，能够增强 HDR介导的基因敲入效率；相反，抑制 HDAC3 会降低基因编辑效率。因此，HDAC 抑制剂作为内源性途径调控因子，能抑制 NHEJ 修复途径，提高 HDR 修复效率，为细胞自身修复途径的基因编辑提供有力条件。2.3 调控细胞周期的小分子由于 HDR 发生在细胞周期的 S 期和 G2 期，所以一些研究将细胞周期抑制剂与基因编辑相配对，使细胞周期同步化并将靶细胞阻滞或延迟在 S 期或G2 期从而提高 HDR 效率（见图 2）。细胞周期抑制剂通过抑制微管聚合来使细胞停滞在 G2/M 期。Lin 等 [36] 对 6 种可逆化学细胞周期抑制剂进行了评估，包括 4 种 G1/S 阻滞剂（阿菲迪霉素、羟基脲、含羞草素和胸腺嘧啶），1 种 G2/M阻滞剂（诺考达唑）和 1 种 M/G1 阻滞剂（洛伐他汀），该研究发现诺考达唑和另一 G2/M 阻滞剂（ABT-751）可通过作用于 β 微管蛋白来增强 CRISPR/Cas9 活性，将 HDR 修复效率提高 3~6 倍。周期蛋白依赖性激酶（cyclin-dependent kinase，CDK）是调节细胞周期进程的异二聚丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在 S 期阶段该酶的活性增加激活了 HDR修复通路的关键标志，如激活 DNA 末端切除过程。Smirnikhina 等 [37] 利用 CDK 抑制剂靛红素，通过在S 期或 G2 期阻滞靶细胞，提高了 CRISPR/Cas9 介导的 HDR 修复效率。细胞分裂周期7 相关蛋白激酶（cell division cycle seven associated protein kinase，CDC7）属于丝氨酸-苏氨酸激酶，可被 Dbf4 依赖性激酶（Dbf4-dependent kinase，DDK）激活，是细胞进入 S 期的必要因子，抑制 CDC7 蛋白可导致细胞周期停滞在 G1/S 期。CDC7/DDK 复合体使微小染色体维持蛋白（minichromosome mantenance protein，MCM） 维 持 磷 酸 化， 从 而 启动 G1/S 期的过渡。Wienert 等 [38] 研究发现 XL413 为CDC7 抑制剂，能够可逆地阻断 MCM 的磷酸化，并在 S 期早期阻滞细胞。在 K562 细胞中，XL413将增强型蓝色荧光蛋白（enhanced blue fluorescence protein，EBFP）和增强绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）的基因编辑效率分别提高了1.4 和 1.8 倍。此外，敲低蛋白 CDC7 能在可逆的 S 期减缓过程中激活 HDR 途径，使许多情况下（包括原代 T 细胞）的 HDR 修复效率提高 3.5 倍。综上，使用不同细胞周期蛋白抑制剂将靶细胞阻滞或延迟在 S 期或 G2 期可针对性地提高 HDR 修复效率。不过，细胞周期抑制剂可能引起部分细胞凋亡，研究者需要进行预实验探索最适浓度。3调控 DNA 双链断裂修复的关键蛋白表达 除了 NHEJ 抑制剂或 HDR 激活剂，还可通过构建敲除细胞系或利用 siRNA/ 短发夹 RNA（short hairpin RNA，shRNA）敲低或过表达修复通路关键蛋白来提高 CRISPR/Cas9 诱导的 HDR 效率，如敲低 Ku70，Ku80，DNA-PKcs，p53 结合蛋白 1（p53-binding protein 1，53BP1），以及过表达 RAD51 和RAD52（见表 3[39-48]），具体作用机制如图 3 所示。Chu 等 [39] 发现，在 HEK293/TLR 细胞中，Ad4蛋白处理能降低 LIG4 的表达，显著抑制了 NHEJ的效率。该研究还发现利用 siRNA 降低 LIG4 的表达可使 HDR 效率提高 2.8 倍。Li 等 [40] 利用 siRNA减少 NHEJ 通路中关键因子 Ku70 和 Ku80 的表达，增加了多个 HDR 效率，包括同源重组、单链退火和单链寡核苷酸介导的 DNA 修复。DNA-PKcs 是磷脂酰肌醇 3-激酶相关激酶（phosphoinositide 3-kinase-related kinase，PIKK）家族的成员，该家族包括具有高度同源的催化结构域的蛋白质，如 PI3K，毛细血管扩张性共济失调突变蛋白（ataxia-telangiectasia mutated protein，ATM），ATR（ATM and Rad3 related）和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）[41]。DNA-PKcs 的激酶活性在 NHEJ 启动步骤中起着重要作用，Liu 等 [41] 研究表明 DNA-PKcs表达下调可使 HDR 效率增加 2.8 倍。53BP1 是真核细胞中 DSB 修复途径选择的关键调控因子，通过抑制末端切除导致 NHEJ 优先于HDR，使得 HDR 启动受限。Canny 等 [42] 通过阻断53BP1 在 DNA 损伤位点的积累，发现53BP1 抑制剂可以提高人类和小鼠细胞中 HDR 依赖基因组编辑的效率，最高可提高 5.6 倍，并提高了基因靶向性和与 dsDNA 或 ssDNA 供体的染色体基因转换。RAD51 和 RAD52 是 HDR 过程中的关键蛋白，Kurihara 等 [43] 研究发现在神经元细胞中共转染过表达 RAD51，敲入效率提高了 2.5 倍。Shao 等 [44] 研究显示，RAD52 在 293T 细胞中的过表达，使 HDR修复效率增加 3 倍。该课题组还发现 RAD52 和SCR7 的联合使用将 HDR 效率提高约 40%。CtBP相互作用蛋白（CtBP-interacting protein，CtIP） 是 同 源 重 组 早 期 步 骤 的 关 键 蛋 白， 主 要作为辅因子诱导减数分裂重组蛋白 11（meiotic recombination 11，MRE11）核酸内切酶对 DNA 末端切割，激活 HDR 途径 [45]。Charpentier 等 [46] 研究发现，CtIP 最小的 N 端片段可激活 HDR 修复，从而提高了靶位点的基因编辑效率。Engeland 等 [47] 研究显示，P21 蛋白与许多转录因子相互作用，P21 蛋白能抑制 CDK4 的活性，使周期抑制蛋白 Rb 不能发生磷酸化，细胞周期相关转录因子 E2F 不能释放，进而使细胞周期停滞在 S/G1 期，从而增加 HDR 效率。Gutshner 等 [48] 试图通过直接同步 Cas9 的表达与细胞周期进展来激活 HDR 修复活性，结果发现将人 Geminin 蛋白的 N 端区域与 Cas9 融合，诱导Cas9 在 G1 期降解，使目标 DNA 切割限制在 S/G2 期，HDR 效率增加至 87%。综上，干扰或过表达 DSB 修复途径关键蛋白的策略有利于生成精确基因修饰的细胞系和生物体，研究者可通过 siRNA 减 少 Ku70，Ku80，LIG4，DNA-PKcs，53BP1，CDK，CtIP 等表达或对蛋白RAD51 和 RAD52 过表达从而提高 HDR 修复效率，抑制 NHEJ 修复活性。除了通过调控 DSB 修复的关键蛋白表达的策略之外，Ye 等[49] 开发了新的方法，用 CRISPR 激活（CRISPRa） 或 CRISPR 沉 默（CRISPRi）来调节NHEJ 和 HDR 通 路，CRISPRi 或 CRISPRa 复合物能抑制 NHEJ 修复途径并激活 HDR 修复，显著提高CRISPR 介导的基因编辑的 HDR 效率。4优化 Cas9 系统从 Cas9 蛋白的性质出发，如表面电荷、末端残基及拓扑结构，可以对其进行修饰或改造，使其更适配于不同载体系统的体内递送，促进 Cas9-RNP的基因编辑。具体包括如下方法：1）Cas9 核酸酶的末端修饰，如添加标签蛋白或融合蛋白结构域；2）基于 Cas9 蛋白的结构特点和催化原理对其进行工程化改造，从而筛选出优异的 Cas9 突变体；3）对 Cas9 拓扑结构进行调整，如与特定蛋白功能域融合，或同时表达多个 sgRNAs 或 Cas9 实现 CRISPR/Cas9 系统的多重编辑及调控 [50]。4.1 Cas9 的修饰 CRISPR/Cas9 介导的同源重组修复是由 Cas9在 gRNA 介导的双链断裂后，在切割位点利用供体DNA 进行的修复途径。供体 DNA 在切割位点的富集程度将决定同源重组能否发生，供体 DNA 在切割区域的低浓度是同源重组的限速步骤。基于此问题，Ling 等 [51] 采用非天然氨基酸偶联技术实现 Cas9 蛋白与供体 DNA 的直接或间接偶联，将其共递送进入体内，实现切割区域供体 DNA 的有效富集，在细胞水平实现同源重组水平大幅提升10~20 倍。此外，使用含叠氮基的氨基酸对 Cas9 蛋白进行化学修饰，通过加成反应缀合供体 ssDNA 或DNA 衔接子，从而将修饰的或未修饰的供体 DNA模板募集到 RNP 复合物中，结果显示用 G1367-AeF（苯丙氨酸突变位点 G1367）RNP 和二苄基环辛炔（dibenzocyclooctyne，DBCO）修饰的 ssDNA 共转染细胞的 HDR 效率增加了1.6 倍。Huang 等[52] 开发了 Cas9 ProSNA-sgRNA 核糖核蛋白递送系统，通过在 Cas9 蛋白 N 端修饰 3 个连续的 GALA 肽促进核递送效率。结果显示 Cas9 ProSNA RNP 在 4 种不同的细胞中的基因编辑效率为 32%~47%。4.2 Cas9 突变体 CRISPR/Cas9 推动了基因编辑技术的发展，但PAM 要求限制了精确基因编辑方法的适用性，使目标编辑发生在 PAM 的特定距离或特定范围内 [53]。不过，随着人们对 Cas9 蛋白三维结构和作用机制的深入认识，通过对 Cas9 蛋白进行工程化改造就逐渐成为优化提升 CRISPR/Cas9 系统的有力手段。该方法以 Cas9 蛋白的结构特点和催化原理为指引，对Cas9 蛋白相应的结构域进行设计改造，来筛选性能更为优异的 Cas9 突变体。Huang 等 [54] 研究发现通过定向进化生成的 4 种Cas9 突变体能够共同靶向人类基因组中大多数富含嘧啶的 PAM 序列。结果显示 Nme2Cas9 突变体成功突破了传统 PAM 的限制，并实现高效的基因编辑。Wang 等 [55] 研究发现将微生物单链退火蛋白（single chain annealing protein，SSAP）与催化失活的 dCas9结合形成无切割的基因编辑器 dCas9-SSAP 具有较低的目标误差和最小的脱靶效应，可有效插入千碱基的序列，效率约达 20%。4.3 Cas9 蛋白与特定功能蛋白融合目前通过将特定蛋白或功能域与 Cas9 融合，可以有效提高 HDR 敲入效率。单碱基编辑和引导编辑器（prime editor，PE）编辑可实现精准的碱基替换和片段的插入而无需 DSB过程。该系统通过对靶位点的“搜索”和“替换”，可实现 4 种碱基之间的任意替换及小片段的精准插入和删除，克服了 CRISPR/Cas9 系统介导的 HDR 效率低和碱基编辑系统不能实现碱基颠换的困难 [56]。 Peterka 等[57]将逆转录酶和野生型 SpCas9 进行融合构建了 PEn 蛋白，利用常规的先导编辑向导RNA（prime editing guide RNA，pegRNA），PEn可通过同源依赖性 DSB 修复机制实现小 DNA 插入，效率达 50%。Jiang 等 [58] 将具有双链切割活性的 Cas9 与逆转录酶融合，并结合 2 条靶向互补 DNA链 pegRNA，开发出了 PEDAR 系统，它可以高效地诱导 20 ~ 700 bp 片段的缺失和 30 bp 片段的插入。Adikusuma 等 [59] 同样利用野生型 SpCas9 构建了新的PE 系统，并且将蛋白、pegRNA 和 nicking sgRNA 整合在同一质粒中进行表达，该系统在 293T 细胞中平均编辑效率可达 67%。此外，将该系统注射小鼠胚胎，在新生小鼠中最高可以实现 100% 的编辑效率。Aird等[60]将HUH核酸内切酶与Cas9融合表达，实现了稳定的共价 RNP-ssDNA 复合体，结果显示通过 HUH-Cas9 融合蛋白与 ssDNA 共价结合可使HDR 效率增强 30 倍。Ma 等 [61] 将最小基元 Brex27与 spCas9 融合构建成 miCas9，研究发现以 Cas9-mRNA 形式递送时，miCas9 的编辑效率提高了 2.5倍；此外，Ma 等 [62] 将 Cas9 与全长睡美人（sleeping beauty，SB）转座子（Cas9- SB）、SB 的 RED 结构域（Cas9-N123） 和 SB 的 PAI 结 构 域（Cas9-N57）融合，经流式细胞术（flow cytometry，FCM）分析显示，Cas9-N57 融合蛋白将 HDR 编辑效率提高了 1.5 倍。由于 HDR 增强子（HDR-enhancer，HE）是同源重组早期阶段的关键蛋白 CtIP 发挥活性所必需的最小 N 末端多聚化结构域，因此 HE 可通过增强HDR 提高Cas9 基因敲入效率。Charpentier 等 [63] 将HE 与 Cas9 融合，结果显示 Cas9-HE 融合物在包括人类细胞系、iPSCs 和大鼠受精卵中获得的基因编辑效率为仅用 Cas9 的 2 倍或更高。如前所述，Cas9-HE 融合物允许在若干实验系统中获得更高的转基因整合效率。此外，使用 Cas9-HE 非常简单且不需要使用基因修饰的细胞或药理学试剂，极大地提高了基因编辑应用的靶向范围，从而有利于提高 HDR 效率。HDR 和 NHEJ 之间的平衡与位点特异性的染色质状态相关。研究发现 CRISPR/Cas9 诱导 DSB的 NHEJ 修复效率在常染色区域较高，而微同源末端连接（microhomology-mediated end joining，MMEJ）和 HDR 偏向异染色质 [64]。因此可通过染色质重塑因子来调控染色质状态，使平衡偏向 HDR。Chen 等 [65] 将染色质重塑因子 PRDM9 与 Cas9 融合，将 HDR 效率提高了 3 倍，且未增加脱靶效应。 综上所述，将 Cas9 蛋白与特定功能蛋白，包括逆转录酶、内切酶、同源重组关键蛋白以及染色质重塑因子，融合表达的策略具有较高的基因组特异性，是未来基因组工程应用的有效工具。4.4 gRNA 优化和表达策略多重编辑CRISPR/Cas9系统与 TALEN 和 ZFN等核酸酶相比具有很大优势，其意味着多个 sgRNAs或 Cas9 能够同时表达从而极大地提高了 CRISPR/Cas9 系统进行基因编辑或转录调控的效率和靶向范围，多重编辑性使该系统在生物工程领域得到极大应用和发展。Hsieh-Feng 等 [66] 研究表明，高效表达多个 sgRNAs 在实现优化或多重基因组编辑中起着关键作用，研究发现各种 CRISPR/Cas9 的表达盒配置、转录本处理过程和传递策略都优化 sgRNA 的表达。此外，通过修饰或改变 sgRNA 识别区长度，可实现 CRISPR 系统的多重编辑或调控。CRISPR/Cas9 系统的特异性主要体现在 sgRNA对 Cas9 切割位点的特异性识别与结合，增强细胞内sgRNAs 的稳定性和特异性有助于提高基因组编辑效率，减少脱靶效应。基于 sgRNA 的骨架结构，可在特定位点进行修饰或改造，例如截短或延长 sgRNA 的 5'端或 3' 端来增减其长度；引入 2' 核糖化学修饰 sgRNA的骨架。此外，sgRNA 含有保守的核酸序列，可合理设计与之碱基互补配对的序列，复合成双链连接到载体上，从而提高递送效率 [67]。Wang 等 [68] 针对 sgRNA种子区核糖 2'-OH 与 Cas9 蛋白之间的相互作用位点，发现可利用特定位点的化学修饰来调节Cas9蛋白活性，通过在这些特定的位点引入 1 个发光性基团，实现了Cas9 活性的光学控制，从而间接调控基因编辑效率。综 上， 研 究 人 员 通 过 工 程 化 Cas9 蛋白或sgRNA 等方式，使 CRISPR/Cas9 系统的靶向范围、靶向特异性和保真性均得到了拓展和提高。当然，无论是通过针对 Cas 蛋白自身结构的优化改造，还是采用优化设计 sgRNA 等方式，均能在一定程度上提升 CRISPR/Cas9 系统的应用性能。5总结与展望CRISPR/Cas9 诱导的 HDR 是精确可控的基因组 DNA 编辑工具 [69]。然而，由于哺乳动物细胞对NHEJ 的偏好性大于 HDR，基于 HDR 的精准基因敲入效率很低，因此，综合考虑细胞周期和 DSB 修复的关系对于提高基因敲入效率至关重要。目前，可采用在 ssDNA 或 dsDNA 供体末端引入化学修饰以增强供体稳定性，供体共价连接到CRISPR/Cas9 系统上提高切割位点局部浓度的方法提高基因敲入效率。但这些方法存在操作困难、成本高等问题。因此，需要进一步优化供体模板，以促进 CRISPR/Cas9 介导的基因敲入在临床治疗中的应用。此外，该系统还受限于 PAM 序列的依赖性和脱靶效应，应用在人类疾病基因治疗时需要提高其保真性、安全性等因素。例如通过优化 Cas9 蛋白或gRNA 从而拓宽 PAM 序列识别范围并提高靶向特异性，通过融合效应结构域或进行转录调控。CRISPR/Cas9 系统在临床试验中的递送主要依赖于物理途径和病毒载体，这受到细胞损伤和安全性问题的严重阻碍。非病毒纳米载体的开发将有助于拓展 CRISPR/Cas9 系统的医学应用。有效和安全的递送策略仍然是 CRISPR/Cas9 系统临床应用的主要挑战。研究人员需根据每种 CRISPR/Cas9 模式的作用机制和理化性质，合理设计载体，使基因组编辑效率最大化，脱靶风险最小化。尽管研究人员已对 CRISPR/Cas9 技术进行了广泛的探索，但该技术的特异性还有待进一步提高，以减少脱靶风险，确保安全性。此外，CRISPR/Cas9系统具有多重编辑的优势，可应用于筛选对表型有调节作用的相关基因，如对化疗药物或毒素产生抑制的基因、影响肿瘤迁移的基因以及构建病毒筛选文库对潜在基因进行筛选，极大促进了基因编辑技术在生物工程领域的发展和应用。然而，对于 sgRNA 在细胞内的机制及其对Cas9 竞争作用的了解仍有待加强。参考文献 ：[1] Cong L, Zhang F. 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摘要自20 世纪初，先后暴发了多次威胁人类健康和社会稳定的传染病疫情，如埃博拉出血热、冠状病毒感染引起的严重急性呼吸综合征、中东呼吸综合征和新型冠状病毒肺炎以及寨卡病毒病等。对于尚未表征的新发病原体，尤其是变异速度快、宿主范围广、传播能力强的病毒病原体导致的相关疫情暴发尚无法进行有效预测。目前没有针对上述病毒感染的特效抗病毒药物，接种疫苗是防控疫情最为经济有效的策略。本文对埃博拉病毒、冠状病毒、寨卡病毒的病毒特征以及与之相关的核酸疫苗和病毒载体疫苗技术研究进展做一综述。近几十年各种新发突发传染病的不断流行充分说明，时至今日，世界依然面临着疫情大暴发的严重威胁。在几次让人类记忆犹新的疫情中，由各种病毒病原体引起的传染病流行情况更为严重，不但影响范围广，而且对人类公共卫生健康和社会经济造成的破坏更为剧烈。截至目前，应对大多数病毒感染并没有特异的抗病毒药物，因此接种疫苗成了有效控制疫情并消灭传染病的终极武器。传统的疫苗技术如灭活全病毒疫苗、减毒活疫苗和组分亚单位疫苗在疾病防控方面起到了重要的作用，如天花病毒的消灭、脊髓灰质炎和麻疹的有效控制等。但是由于病毒尤其是RNA 病毒超强的变异能力以及目前对于病毒感染的致病机理和免疫机制研究的缺乏，致使应用传统的疫苗技术可能无法有效应对未表征的新发病毒传染病，如: 艾滋病病毒、埃博拉病毒、冠状病毒、寨卡病毒、甲流病毒、基孔肯雅病毒、尼帕病毒、拉沙热病毒等。现对近年来暴发的埃博拉病毒、冠状病毒、寨卡病毒传染病及其疫苗研发新技术进行综述。1新发传染病及其病原体1．1 埃博拉病毒埃博拉病毒( Ebola virus，EBOV)属于丝状病毒科，该科由2 种埃博拉病毒和马尔堡病毒组成，其天然储存宿主可能为蝙蝠，感染后可导致出血热，死亡率极高。埃博拉病毒首次暴发于1976 年，此后呈现出定期暴发特点，主要发生在中非国家。在此期间，虽然尝试开发埃博拉病毒疫苗，但都处于研究和早期研发阶段。2013—2016 年在西非暴发了规模空前的埃博拉疫情，共有28 616 病例，其中11 310 例死亡［1］。在疫情流行的后期，一些候选疫苗开展了临床试验研究，其中最先进的疫苗( rVSV-ZEBOV) 在环围接种临床试验中显示出了较好的临床效果［2］。1．2 冠状病毒截至目前，冠状病毒( coronavirus，CoV) 感染已经导致3 次传染病的大流行。冠状病毒最早引起人类的注意是在2002—2003 年间的严重急性呼吸综合征( severe acute respiratory syndrome，SARS) 大流行，目前普遍认为该病毒的储存宿主为蝙蝠［4］。SARS 冠状病毒暴发流行导致全球26 个国家出现疫情，大约8 000 人感染，774 人死亡［4］。值得注意的是，由于制定了有效的阻断措施，SARS疫情传播得到迅速遏制，因此，SARS 疫苗的研发工作也很快停止［4］。2012 年一种新的冠状病毒出现在沙特阿拉伯，并引起中东呼吸综合征( middle eastrespiratory syndrome，MERS) 。与SARS-CoV 一样，该病毒起源于蝙蝠，可能通过受感染的单峰骆驼传染给人类［5］。根据WHO 报道，截至2016 年4 月，共有包括27 个国家的1 728 例MERS 确诊病例发生， 624 例死亡［6］。目前正在开发针对MERS 冠状病毒的疫苗，但是尚未有获得许可的疫苗上市。新型冠状病毒肺炎( coronavirus disease 2019，COVID-19) 是一种急性呼吸系统传染病，是由另一种新型冠状病毒( severe acute respiratory syndrome coronavirus2，SARS-CoV-2) 感染引起［7］。虽然COVID-19致死率较SARS 和MERS 低，但传染性更强。截至2020 年9 月13 日，已导致全球28 637 952 人感染，死亡917 417 人，全球197 个主权国家几乎无一幸免，COVID-19 疫情是一个世纪以来影响最严重的公共卫生事件［8］。更糟糕的是，目前疫情没有任何减缓的迹象，研发安全有效的COVID-19 疫苗成为当前科学研究的重中之重。1．3 寨卡病毒( Zika virus，ZIKV) ZIKV 于1947年首次在乌干达的非人灵长类( non-human primates，NHPs) 动物中被发现［9］，此后在不同地区数次暴发，但报告病例均为轻度症状，如自限性发热等。然而，自2014 年以来，亚洲和美洲的暴发显示出严重的临床症状，包括成人的格林-巴利综合征和妊娠期感染后的新生儿先天性异常，即新生儿小头畸形症。之所以出现症状加重的情况，可能的解释是病毒发生了突变，允许其适应新的环境并导致致病性的改变。南美洲约有100 万实验室确诊的寨卡病例，并且超过4 000 例小头畸形的发生，导致在2016 年2 月WHO 宣布寨卡疫情为国际关注的突发公共卫生事件。疫情暴发的惊人规模以及该病毒在北美和其他地区的本地传播的可能性提高了人们对这种新出现的蚊媒疾病的认识［10］。寨卡危机促使寨卡病毒疫苗得到了快速研发，其中7 种疫苗已进入临床试验阶段［11］，但目前仍然没有安全有效的疫苗获得上市许可。1．4 其他病毒需要引起重视的还有甲型流感病毒、基孔肯雅病毒、尼帕病毒、拉沙热病毒等。甲型流感病毒虽然呈现出常规性的季节性暴发，但是由于该病毒宿主的多样性和病毒基因组的高变异性，虽然几乎可以肯定未来流感会发生大流行，但是预测流行病毒的型别及其引起症状的严重程度是不可能的［12］。目前季节性流感疫苗针对的是预测的特定病毒型别，并不能确定可以预防未来的大流行。因此，迫切需要开发具有广谱保护作用的新型流感疫苗。另外，基孔肯雅、拉沙热和尼帕等病毒的传播均引起了较为严重的地方流行病［13 － 16］，但遗憾的是，目前没有可用的针对这3 种疾病的疫苗。鉴于此3 种病毒感染有可能导致传染病的大流行，流行病防范创新联盟( CEPI) 将针对此3 种传染病的疫苗研发列为优先支持的项目［17］。2新发传染病对疫苗研发的挑战通过减毒或灭活相应病原体而开发的常规疫苗已成功地减轻了许多传染病的负担，不但消灭了天花，而且也限制了诸如脊髓灰质炎、麻疹等病毒感染疾病的流行。然而，过去建立的传统疫苗方法在疫情突发时可能并不总是有效［18］。减毒活疫苗存在返祖的风险，使得该方法不适用于高致病性、未表征的病原体。灭活疫苗成本高、研发周期长，而且有时可能不会诱导保护性应答，如埃博拉疫苗［19］，甚至可能导致疫苗接种相关的严重不良反应，如接种甲醛灭活的呼吸道合胞病毒( respiratory syncytial virus，RSV) 疫苗的受试者，在感染野生型RSV 后产生更严重的疾病［20］。为适应复杂多变的外界环境，病毒尤其是RNA病毒基因组具有很高的变异性，如发生突变、基因重组和重配等［21］，使得新发病原体的不可预测性成为应对大流行的关键难题之一，也是疫苗研发面临的巨大挑战之一。如人免疫缺陷病毒( human immunodeficiencyvirus，HIV) 逃避宿主免疫的高变异和异质群体［22］，流感病毒通过重配产生新的基因型、获得适应新的宿主和环境的能力等［23］。另一个疫苗研发的主要挑战是成本问题和生产能力。据统计，使用传统的疫苗开发和生产技术，新疫苗的开发估计将超过5 亿美元，生产设施和设备又将额外花费0． 5 ～ 7 亿美元［24］。传统的疫苗技术在短时间内扩充生产能力有限，难以支持全球范围的疫苗接种。即使是疫苗技术相对成熟的流感疫苗，在一个年度能达到的极限接种率也仅有43%［25］，更别说人类还未表征的导致全球大流行的新型冠状病毒SARS-CoV-2 了。基于以上事实，建立可快速研发、生产大量价廉的疫苗新技术和通用疫苗技术平台成为目前亟须解决的重大科研课题。在过去几十年间，各种新疫苗技术得到了快速发展并获得了有希望的临床或临床前研究结果。如靶向减毒疫苗技术、基因工程疫苗、多肽抗原疫苗、病毒载体疫苗、核酸疫苗技术以及新型疫苗佐剂技术等［26］。由于篇幅限制，本文仅对适用范围广、发展迅速的核酸疫苗技术和病毒载体疫苗技术进行重点介绍。3核酸疫苗技术 核酸疫苗技术包括DNA 疫苗技术和RNA 疫苗技术。经靶细胞摄取后，核酸编码的抗原可在细胞内表达，模拟病原体蛋白质在感染细胞中的合成过程，不但可以将蛋白质定位在质膜中，也可对表达的蛋白进行正确的翻译后修饰，诱导产生体液免疫和细胞免疫应答。重要的是，该方法支持各种抗原的递送，因此可以用于多种病原体的疫苗开发。由于疫苗的生产特点与编码的蛋白质种类无关，因此可以开发不同的疫苗而无需建立新的生产、纯化和验证方法以及建造新的生产设施。由于各种疫苗使用的基础原料( 脱氧核苷酸或核苷酸) 相同且为生物或化学合成，因此可以在同一个车间中快速地生产多种疫苗，从而可显著降低疫苗生产成本、减少生产时间。3．1 DNA 疫苗DNA 疫苗是通过将编码抗原基因的表达盒插入真核表达质粒中产生的。质粒基因组骨架通常含有允许其在大肠杆菌中复制和选择的元件，即支持质粒高拷贝的复制起点和选择标记。由于人用质粒载体中的非功能性序列，特别是抗生素抗性标记物存在安全隐患，标记物已在新一代DNA 疫苗中被替换或去除［27］。真核表达盒由5' 启动子、目的基因和3' 聚腺苷酸化( poly A) 信号组成。5' 启动子通常来自支持高转录水平的巨细胞病毒( cytomegalovirus，CMV) ，3' 末端的Poly A 信号是核转出、翻译和确保转录mRNA 的稳定所必需的，通常是从兔β-球蛋白或牛生长激素基因中获得的。DNA 疫苗接种能够通过分别激活CD+8细胞毒T 淋巴细胞和CD+4辅助性T 淋巴细胞来诱导细胞免疫和体液免疫应答，其确切的作用机制还有待深入研究。自1990 年首次报道以来，DNA 疫苗已被用于预防多种病毒感染导致的流行病疫情，如艾滋病毒、埃博拉病毒、寨卡病毒和冠状病毒等多种疫苗的开发，部分疫苗已进入到临床试验阶段。Xu 等［28］报道，肌内注射或基因枪皮内注射接种编码埃博拉病毒糖蛋白( GP) 和核蛋白( NP) 的DNA 疫苗后，可诱导产生体液免疫和T 细胞介导的免疫，并且可对啮齿动物病毒适应株的攻击产生保护作用。鉴于积极的临床前研究结果，2003 年启动了编码缺失GP 跨膜区和NP 蛋白的DNA 疫苗预防埃博拉病毒的临床Ⅰ期试验研究［29］。结果表明该疫苗具有较好的安全性和耐受性，并在所有受试者中至少对3 种抗原中的1 种产生了特异性的抗体反应。可惜的是，并没有诱导产生病毒中和反应。2008—2009 年进行的另一项Ⅰ期临床试验表明，编码2 种埃博拉病毒GP 的DNA 疫苗具有较好的安全性，其中80% 的受试者对其中1 个GP 产生了特异性的抗体反应。2009 年在乌干达进行的Ⅰb期临床试验结果表明，疫苗均耐受性良好，但免疫反应仍然较差，仅有约50%的受试者对埃博拉病毒产生了抗体反应［30］。寨卡DNA 疫苗是2016 年寨卡危机后首次进行临床试验的疫苗形式之一。Inovio 公司开发的第一种DNA 疫苗是通过将来源于非洲和最近分离的亚洲和美洲毒株的膜蛋白前体和囊膜蛋白( prM-E) 的蛋白基因进行修饰，使其包含有IgE 信号肽。通过电穿孔肌内注射后，该疫苗在小鼠模型中产生了免疫原性和保护作用。在NHPs 中的实验表明，电穿孔皮内接种后该疫苗可诱导产生病毒中和抗体和T细胞免疫应答。基于这些实验结果，启动了2 个Ⅰ期临床试验。临床试验的初步结果表明，该疫苗有良好的耐受性，并在62%的受试者中诱导产生了中和抗体应答［31］。分别于2016 年8 月和2016 年12月开始的另2 个Ⅰ期临床试验结果表明，2种疫苗的安全性和耐受性良好，并可诱导产生体液和T 细胞免疫应答。全程接种程序完成4 周后，中和抗体阳性率在60% ～ 100%之间［32］。为了应对2020 年初暴发的新冠病毒疫情，基于前期在MERS-CoV 病毒疫苗的研发经验［33］， Inovio公司又启动了靶向新冠病毒SARS-CoV-2 刺突( spike，S) 蛋白的DNA 疫苗研发( INO-4800) ［34］。在小鼠和豚鼠模型中的体内免疫原性研究表明，经INO-4800 免疫的动物血清中产生了较高水平的S蛋白反应性IgG 抗体。另外，经INO-4800 免疫的小鼠和豚鼠的肺洗液中也检测到抗SARS-CoV-2 结合抗体。这些肺中存在的抗体具有防止这些组织感染和预防与COVID-19 严重病例有关的下呼吸道疾病( LRD) 的潜力。除体液免疫应答外，在接种疫苗后的d 7 就可以诱导产生针对SARS-CoV-2 的T 细胞应答。快速的细胞免疫应答具有降低病毒载量的潜力，并有可能减少SARS-CoV-2 和相关COVID-19 疾病的传播。目前，在美国开展的INO-4800 Ⅰ/Ⅱ期临床试验正在进行中。值得注意的是，寨卡病毒DNA 疫苗和新冠病毒DNA 疫苗都是在疫情发生几个月后启动的临床研究，这突显了DNA 疫苗平台在用途广泛性和研发速度方面的优势。但是DNA 疫苗存在的缺点也不容忽视，其中之一是注射后DNA 质粒会长期存在于体内，存在外源基因整合到宿主染色体中的风险。实际上，在各种临床前研究中都证实了DNA 的持久存在，这些研究证明通过肌内注射小鼠模型后质粒DNA 的存在时间可长达2 年，并伴随有低度但可检测的表达和免疫原性［35］。另外，用于增强DNA 免疫原性的细胞因子或共刺激分子的表达及其释放可能会导致无法预料的不良反应，例如发生广泛的免疫抑制、慢性炎症或自身免疫。因此，WHO 已建议将整合研究和表达细胞因子质粒在体内的存在时间检测作为DNA 疫苗临床前安全性评价项目的一部分［36］。3．2 mRNA 疫苗mRNA 疫苗是指通过特定的递送系统将表达抗原靶标的mRNA 导入体内，在体内表达出蛋白并刺激机体产生特异性免疫反应，从而使机体获得免疫保护的疫苗形式。mRNA 用于疾病防治最早可追溯到1990 年Wolff 等研究者开始的基因治疗探索性研究，但由于当时无法解决mRNA 不稳定易降解的特点，其发展受到了一定的限制。目前通过分子修饰技术、mRNA 合成技术和传递技术等方法已大大提高了mRNA 的稳定性［37］。被用作疫苗的RNA 主要有2 种类型———非复制型mRNA和自我扩增型mRNA。两者的区别在于，自我扩增型mRNA 除含有帽子结构( Cap ) 、5' 非编码区( UTR) 、编码抗原蛋白的开放阅读框( open readingframe，ORF) 、3' 非编码区( UTR) 和Poly( A) 尾结构外，还含有亚基因组启动子和编码依赖RNA 的RNA 聚合酶( RdRP) 等非结构蛋白的ORF［38］。由于自我扩增型mRNA 疫苗编码的任何遗传信息将被扩增多次，从而使得较低剂量的疫苗即可产生高水平的抗原表达。通过mRNA 疫苗刺激模式识别受体( patternrecognition receptor，PRR) 可诱导产生强烈的固有免疫应答，包括在接种部位产生趋化因子和细胞因子如白介素-12( IL-12) 和肿瘤坏死因子( tumor necrosisfactor，TNF) ，这是诱导产生针对编码抗原的有效适应性免疫应答必需的前提条件［39］。研究表明，自扩增和非复制型mRNA 疫苗都具有良好的应用前景，可以提供针对多种具有大流行潜力的病原体的免疫保护。编码HIV-1 包膜糖蛋白的自扩增mRNA 疫苗在非人灵长类( non-human primates，NHPs) 中诱导产生了有效的细胞免疫和中和抗体应答［40］。包裹在病毒样复制子颗粒( virus-like replicon particles，VRPs) 中编码拉沙病毒糖蛋白复合物的自扩增型RNA 复制子疫苗在小鼠中具有免疫原性和保护作用，并诱导产生了具交叉反应的、多功能T 细胞应答［41］。Chahal等［42］在小鼠模型中证明，基于枝状聚合物纳米颗粒( MDNP) 修饰的自扩增型RNA 复制子疫苗平台提供了针对致死性流感和埃博拉病毒感染的保护，并诱导产生了针对寨卡病毒的抗体和CD +8 T 细胞应答。Pardi 等［43］证明，通过皮下途径免疫脂质体纳米颗粒( lipid-based nanoparticle，LNP) 包封的编码ZIKV prM-E 糖蛋白的修饰非复制型mRNA 使小鼠和NHPs 产生了具有保护作用的有效且持久的中和抗体应答。Richner 等［44］的后续研究表明，类似设计的ZIKV 疫苗通过肌肉接种小鼠后可达到消除性免疫( sterilizing immunity) 的效果，不但诱导产生高水平的、具有保护性的中和抗体滴度，并且可限制ZIKV 在小鼠的宫内传播。该ZIKV mRNA 疫苗( mRNA-1325) 的随机、安慰剂对照、多个剂量范围的Ⅰ/Ⅱ期临床研究已于2016 年12 月启动。LNP 包封的编码埃博拉病毒GP 的修饰mRNA 可诱导产生特异性的IgG 抗体和中和抗体反应的能力，并可保护豚鼠免于致死性感染的攻击和不发生临床症状［45］。在2019 年末暴发的新冠肺炎疫情中，mRNA 疫苗又一次显示了其作为快速研发技术平台的巨大潜力。在疫情暴发不到半年的时间，先后有14 个mRNA疫苗启动了临床试验研究［46］，其中由美国国家过敏症和传染病研究所( National Institute of Allergyand Infectious Diseases，NIAID) 和生物技术公司Moderna 合作开发的mRNA-1273 是进展最快的mRNA 疫苗。该疫苗在2020 年3 月启动了Ⅰ期临床研究，通过初免-加强免疫二针接种法( 0 d， 28 d)分别对高( 250 μg) 、中( 100 μg) 、低( 25 μg) 3 个剂量的疫苗安全性和免疫原性进行了初步评估。第一阶段的结果表明，初免15 d 后，接种中、低剂量的8例初始受试者均检测到中和抗体，且免疫强度呈剂量依赖关系; 加强免疫2 周后，低剂量组和高剂量组受试者抗体水平达到或超过新冠患者痊愈后的水平［47］，目前该疫苗已经进入Ⅲ期临床研究阶段。德国生物科技公司BioNTech 与辉瑞制药公司合作开发的另一款mRNA 疫苗BNT162 于2020 年4月22 日获得德国相关部门批准，开始了首次临床试验［48］。该疫苗在约200 例18 ～ 55 岁健康受试者中进行，初步评价疫苗的安全性和免疫原性。初步数据表明BNT162 的耐受性良好，且可产生剂量依赖性的免疫原性。接受2 次疫苗接种的24 例均产生了中和抗体。安全性方面，接受10 或30 μg 剂量的受试者没有发现严重的不良反应。但是第2 剂注射30 μg 的群体中，有3 /4 出现38 ℃及以上的发热。目前该公司正在对更多受试者进行10 和20 μg 的剂量测试，希望减少不良反应的发生［49］。其他mRNA 疫苗目前均处在临床申报阶段或临床前研究阶段。mRNA 疫苗保留了DNA 疫苗能够胞内表达抗原的优点，同时又克服了其免疫原性低、可产生载体非特异性免疫的缺点以及整合到宿主DNA 的风险。但是mRNA 疫苗仍有不足需要引起注意。一是mRNA 的稳定性问题。核糖核酸酶遍布存在于细胞外，因此未受保护的“裸露”mRNA 在正常生理条件下很容易被降解。目前通过将mRNA 与LNP 结合可以克服这一难题。LNP 可保护mRNA 免受核糖核酸酶的降解从而允许目的抗原在体内长期表达，产生有效的体液和细胞免疫应答。另外，最近的临床研究表明，mRNA 免疫可产生轻度至中度的不良反应以及罕见的严重局部和全身不良反应［50］。因此，未来的研究应进一步评估mRNA 的分布、编码抗原在远端器官中的表达、局部和全身效应在内的潜在安全风险、新递送系统的毒性作用以及人体内的自身反应抗体的产生情况。4病毒载体疫苗技术 病毒载体疫苗通常使用病毒疫苗减毒株或非复制型病毒作为载体，将一种或多种抗原递送至宿主细胞内进行表达并诱导产生免疫应答的疫苗形式。病毒基因组可以表达任何特定的抗原，并且在其基因组中可稳定接受较大的插入基因的能力使得可用病毒载体技术开发多种疫苗。因为靶抗原是作为病毒自身遗传信息进行递送的，因此可以确保抗原在宿主中准确的合成、修饰以及靶向特异细胞。病毒载体在靶细胞中诱导刺激与自然感染过程相同，因此可诱导产生强烈的免疫应答。目前已有多种病毒作为载体用于疫苗的研发，包括腺病毒( adenovirus，Ad) 、麻疹病毒( measles virus，MV) 、水疱性口炎病毒( vesicular stomatitis virus，VSV) 和重组牛痘病毒安卡拉株( modified vaccinia strain Ankara，MVA)等［51］。4．1 腺病毒载体疫苗腺病毒为双链DNA 无包膜病毒，长度在30 ～ 40 kb 之间。人体内的大部分细胞表面均表达有腺病毒受体，因此腺病毒具有广泛的组织趋向性，是最常用的病毒载体之一。复制缺陷型的腺病毒载体通过用抗原表达盒替换病毒的E1A 和E1B 基因区域( 早期转录物1A 和1B) 而产生，从而消除了病毒的复制能力。此外，为防止免疫系统清除被腺病毒感染的细胞使插入抗原无法表达，病毒E3 和E4 基因经常也被删除。复制缺陷型腺病毒载体需要在可提供反式作用因子E1 蛋白的哺乳动物细胞中进行培养，最常见的是HEK 293 细胞。腺病毒载体能够稳定表达高达8 kb 的插入片段，可以支持大多数靶抗原以及多价或多病原体疫苗的表达。复制缺陷型Ad5 是使用最广泛的腺病毒载体之一，能够诱导产生很高的CD+8 T 细胞以及抗体免疫应答。然而，由于人群中广泛存在对该病毒的免疫力，阻碍了Ad5 在临床上的应用［52］。通过开发非人源的腺病毒载体，例如来源于黑猩猩的病毒载体ChAd63，已经克服了这一问题。另一种方法是选择在人群中流行率低的罕见血清型作为载体，例如Ad26 或Ad35，其诱导产生的免疫记忆更强、多功能CD +8 T 细胞更多［53］。Sullivan 等［54］通过用复制缺陷型Ad5 同时表达埃博拉病毒的GP 和NP 的病毒载体在非人灵长类动物模型中进行了评价。结果表明，单次接种即产生了完全的免疫保护。并且发现，完全保护作用与特异性CD+8 T 细胞的产生和抗体反应均成正相关。鉴于令人鼓舞的研究结果， 2006 年开始进行该疫苗的临床试验。结果显示，该疫苗是安全的并且可以诱导抗体产生和T 细胞应答，但没有产生高滴度的中和抗体。该研究还发现，在预存Ad5 免疫力的受试者中诱导的抗体会减少［55］。鉴于Ad5 在人群中的流行率高达60% ～ 90%，这一发现可能会影响Ad5 在人类疫苗开发中的应用。2014 年，军事科学院军事医学研究院和康希诺生物技术有限公司联合开发了一种基于Ad5 的腺病毒载体疫苗，该疫苗于2017 年10 月获得原国家食品药品监督管理总局新药证书和药品批准文号。这种疫苗将2014 年埃博拉病毒的流行株整合到Ad5 载体中，并于当年启动了Ⅰ期临床试验。结果表明，该疫苗安全性良好，没有严重的不良事件发生。另外研究发现，通过注射高剂量的Ad5 载体疫苗能够克服受试者体内预存的Ad5 免疫力对疫苗应答的影响，并诱导产生较高的GP 特异性抗体和T 细胞免疫应答［56］。另外，基于相同技术开发的腺病毒载体COVID-19 疫苗Ⅱ期临床结果显示，单针肌内注射28 d 后，低剂量组( 5 × 1010病毒颗粒) 和高剂量组( 1 × 1011 病毒颗粒)均能诱导产生强烈的体液免疫和细胞应答。抗SARS-CoV-2 中和抗体几何平均滴度( geometricmean titres，GMTs) 分别为18. 3 和19. 5，并且在88%( 低剂量组) 和90% ( 高剂量组) 受试者中诱导产生了γ-干扰素［57］。目前该疫苗已进入Ⅲ期临床研究阶段。由美国国家过敏及传染性疾病研究院( NIAID)开发的2 种疫苗，即单独表达EBOV GP 或与苏丹型埃博拉病毒( SUDV) GP 共表达的复制缺陷型黑猩猩腺病毒3 型( ChAd3) 载体疫苗，在临床前研究中进行了评价。结果表明，单次注射5 周后2 种疫苗均能对NHPs 产生完全的免疫保护。然而，免疫反应在接种疫苗后几个月就会减弱，通过用表达EBOV 和SUDV GPs 的MVA 载体疫苗进行加强免疫可以避免这一情况的发生［58］。2014 年9 月开始的Ⅰ期临床试验结果显示，2 种疫苗都具有可接受的安全性，在大部分受试者中均诱导产生了GP 特异性抗体应答，在部分受试者中产生了T 细胞免疫应答［59］。4．2 MV MV 为副粘病毒科单股负链RNA 病毒。目前常用的麻疹病毒疫苗是通过将野毒株在不同细胞系中连续传代而产生的一种活的减毒株，MV 疫苗诱导产生的免疫力长达25 年之久［60］。研究表明，MV 可接受高达6 kb 的外源基因的插入，这为麻疹病毒载体提供了可用于多病原体或多价疫苗研发的机会。MV 能够感染免疫细胞，包括巨噬细胞和树突细胞，从而能将靶抗原直接递送至抗原提呈细胞，诱导高水平的体液和细胞免疫应答［61］。然而，由于需要通过反向遗传学构建麻疹病毒的反义RNA 基因组全长克隆，使得病毒的制造和转基因的插入较为困难。另外，由于MV 减毒活疫苗在许多国家用于常规儿童免疫接种计划，因此预存的免疫力也是MV 作为病毒载体需要关注的因素之一。表达基孔肯雅病毒( chikungunya virus，CHIKV)结构基因( C，E3，E2，6K 和E1) 的MV 病毒载体疫苗( MV-CHIK) 随机、双盲、安慰剂对照的Ⅰ期临床试验表明，单次接种后血清转化率为44% ～ 92%，第2 次接种后血清阳转率达到100%，安全性良好，没有与疫苗接种相关的严重不良事件。另外一个重要的发现是，受试者体内预存的麻疹免疫似乎没有影响这种CHIKV 疫苗的免疫原性［62］。2016 年进行的Ⅱ期临床试验结论和Ⅰ期基本一致，没有发现与疫苗接种相关的严重不良反应事件发生，血清转化率介于50% ～ 95． 9%［63］。另一项研究发现，接种表达寨卡病毒可溶性E蛋白的MV 载体疫苗，可使雌性小鼠产生针对E 蛋白的特异性中和抗体和细胞免疫反应，并可显著减少小鼠妊娠后受病毒攻击的胎鼠感染，没有发现胎鼠生长迟缓、贫血或死亡的现象，具有进一步开展临床前和临床研究的潜力［64］。4．3 VSV VSV 为弹状病毒科成员，是一种含有约11 kb 的单股负链RNA 包膜病毒。家畜为该病毒的自然感染宿主，在人群中仅呈现零星感染。因此，人群中预存免疫程度低，并且在病毒复制过程中缺乏DNA 中间体，作为载体在人群中使用具有较好的安全性。由于野生型VSV 在动物模型中具有脑内神经毒力，在使用前应对VSV 进行减毒。减毒可以通过不同方法实现，例如在病毒基质( M) 蛋白中引入突变、对病毒蛋白顺序进行重排、插入非病毒蛋白以及部分或完全缺失与病毒感染性密切相关的病毒糖蛋白。在不影响其遗传稳定性的情况下，基因组可接受4 ～ 5 kb 的外源基因插入。虽然VSV 可诱导产生中等强度的CD +8和CD+4 T 细胞免疫，但相比而言，其诱导产生的强烈抗原特异性体液免疫应答是VSV 载体疫苗的最大优势［65］。由加拿大国家微生物实验室开发的VSV 载体疫苗( rVSV-ZEBOV) 可能是目前最有希望的埃博拉候选疫苗。该疫苗通过用EBOV 分离株的GP 替换VSV 中的GP 而构建。临床前研究结果表明，单次接种即可完全保护NHPs 抵抗致死性EBOV 小鼠适应株的攻击［66］。当接种rVSV-ZEBOV 后仅7 d 即进行攻击，在NPHs 中仍然具有完全保护作用，并且在EBOV 暴露后的1 或24 h 注射1 剂或2 剂疫苗可获得33% ～ 67%的保护率［67］，表明该疫苗具有暴露后预防的潜力。Ⅰ期临床研究的初期结果表明，其可诱导产生强烈和持久的GP 特异性的抗体反应，并且在高剂量组诱导产生了较高滴度的病毒中和抗体。但是，高剂量组的受试者可能会发生关节炎类的病痛，部分受试者发展出斑丘疹，表明VSV 在受试者体内发生了复制和扩散。后期通过降低剂量使得不良事件的发生相应减少，尽管诱导的GP 特异性抗体水平仍然与高剂量的群组相似，但诱导的抗体应答水平却降低了［68］。令人意外的是，进一步Ⅰ期临床试验结果显示出了不同的结果。接种高剂量的所有参与者诱导的GP 抗体滴度均呈现出剂量依赖性特征，仅有轻度不良反应而无其他关节炎病例发生［69］。因此，2015年3 月在几内亚启动了该候选疫苗的Ⅱ/Ⅲ期临床试验，评价了接种高剂量( 2 × 107 PFU) 疫苗后的免疫效果。包括高风险个体在内的参与者，被随机分组到即时接种和延迟接种( 21 d 后) 的组群中。在随机分组后的至少10 d 后，即时疫苗接种组中未检测到出现症状的埃博拉病毒病例，而7 个延迟接种组中共发生16 例埃博拉病毒病例，疫苗接种的有效性达到100%。在接种疫苗后登记的43 个严重不良反应中，只有1 个被认为与疫苗接种有因果关系［70］。鉴于此， rVSV-ZEBOV 被认为是目前最有希望获得上市许可的埃博拉病毒候选疫苗。开发病毒载体疫苗在以下几个方面值得注意。首先，目前使用的大部分病毒载体为经过基因工程改造过的活病毒，即是一种转基因生物( geneticallymodified organisms，GMOs) ，在临床前和临床研究期间应充分评估转基因生物所带来的潜在环境和健康风险［71］。另外，如果使用的病毒载体是来源于感染人的病原体( 如腺病毒、麻疹病毒等) ，则应考虑人体预存免疫对病毒载体疫苗免疫效果的影响。5结语  如上所述，病毒载体疫苗和核酸疫苗技术，由于其可快速生产、高度通用和较低的成本优势，为快速应对新发、突发传染病疫情提供了新的解决思路。但是每种疫苗技术都有其自身的缺点，如DNA 疫苗的弱免疫原性和整合到宿主基因组的潜在可能性以及特殊接种装置( 如电穿孔或基因枪) 的依赖性、mRNA 疫苗的不稳定性和潜在毒性、宿主预存免疫对病毒载体疫苗免疫效果的影响等。因此，用单一的疫苗技术似乎不太可能为未来的所有疫情暴发提供解决方案。另外，尽管前期进行的临床前和临床研究已经在安全性和免疫原性方面得到了令人鼓舞的结果，但是由于各种原因，目前鲜有病毒载体疫苗和核酸疫苗获得上市许可。因此未来只有通过持续的努力和合作，将相关学科知识和疫苗研发经验相结合，才能为成功应对全球范围内的新发、突发传染病疫情并提供更有效的策略、方法和工具。参考文献详见 中国新药杂志 2020年 第29卷 第21期识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

//  荧光蛋白作为分子探针可以特异性地标记目标蛋白、细胞结构及细胞器等，在活细胞成像和超分辨率显微技术中发挥着至关重要的作用。其亮度和光稳定性是衡量荧光蛋白在荧光显微成像中应用价值的核心指标。自从1992年成功克隆出第一个绿色荧光蛋白（GFP）以来，科学家们就致力于提升荧光蛋白的这两个关键属性，以便拓展其在成像技术中的应用范围。最近，一种源自C. uchidae水母的绿色荧光蛋白被发现具有特别强的光稳定性，并且远超已知的任何荧光蛋白，经过工程改造后，其亮度不亚于mNeonGreen，因而被命名为StayGold2。然而，StayGold本身是二聚体，限制了其作为荧光标记工具的应用范围。2024年2月26日，西湖实验室Kiryl Piatkevich课题组联合莫斯科国立大学Fedor Subach课题组在Nature Methods杂志发表了题为《Bright and stable monomeric fluorescent protein derived from StayGold》的研究论文。他们采用定向进化的策略，成功开发出了StayGold的单体版本，命名为mBaoJin。该荧光单体不仅继承了原蛋白的优异特性，还具备了更广泛的应用潜力。通过对mBaoJin在不同pH条件下的晶体结构进行分析，并将其与StayGold及其他主流荧光蛋白进行比较，他们还揭示了单体化所必须的关键氨基酸突变，并进一步阐明了其优异光稳定性的分子机制。mBaoJin的亮度高和光稳定性强，加之其出色的化学稳定性，使其成为研究细胞及亚细胞结构形态和动态变化过程中，特别是超分辨显微成像技术和膨胀显微技术的理想荧光蛋白工具。文章链接：https://www-nature-com.libproxy1.nus.edu.sg/articles/s41592-024-02203-y论文截图图1. 单体化表达载体的示意图01单体化 StayGold为了单体化二聚体绿色荧光蛋白StayGold，作者构建图1a的蛋白表达载体，将SatyGold的突变文库与AraC蛋白的DNA结合域（AraCDNA）进行融合。当突变体是单体时，与AraCDNA融合的突变体蛋白驱动报告基因mTagBFP的表达水平比较低；当突变体是二聚体时，与AraCDNA融合的突变体蛋白驱动报告基因mTagBFP的表达水平比较高。在每轮随机突变过程中，作者挑选蓝色荧光比较暗而绿色荧光最亮的菌落，并用液相色谱确认它们的寡聚态。经过八轮定向进化后，最终确定一个亮度最高的绿色荧光蛋白单体，同时使用mNeonGreen蛋白的N端和C端作为连接肽段，以确保其在哺乳动物细胞中稳定表达，并将其名为mBaoJin。与StayGold的氨基酸序列比对，mBaoJin具有以下突变：S55T、H77R、E80G、Q140P、H141Q、C165Y、N171Y和T201A。图2. 利用液相色谱和HeLa细胞验证mBaoJin蛋白的单体状态02验证mBaoJin的单体状态为了检测mBaoJin在哺乳动物细胞中的是否为单体状态，作者在HeLa细胞中表达了与内质网锚定结构域（CytERM）融合的mBaoJin，统计没有出现涡旋结构的健康细胞的比例。同时使用了StayGold的串联和单体化版本（td8oxStayGold、StayGold-E138D和mStayGold，也称为QC2-6 FIQ）以及经过验证的单体（mEGFP、mClover3、mGreenLantern）和弱二聚体（EGFP、Venus）作为比较。mBaoJin的得分为93.7%，在细胞中达到了单体性的阈值。这些结果确定了mBaoJin是一种单体蛋白。03mBaoJin的晶体结构在文中，作者解析了mBaoJin在pH为 6.5、4.6和8.5时的X射线晶体结构，并与StayGold二聚体结构进行比对，发现mBaoJin在不同pH值下的结构差异不大，mBaoJin二聚界面之间的氨基酸相互作用比较少，mBaoJin的所有结构中荧光团附近的氯离子口袋相似且与StayGold相似。为了进一步理解mBaoJin增强光稳定性的分子基础，作者对与荧光基团相互作用的位点134、137、152（按PDB中的编号）的氨基酸进行了点突变。结果发现，mBaoJin/N137K、mBaoJin/S134P和mBaoJin/V152E突变体的光漂白速度比mBaoJin快1.5-6.5和4.5倍。比较耐光漂白的mBaoJin蛋白和较不耐光漂白的mNeonGreen及EGFP蛋白的荧光团环境，发现耐光漂白的mBaoJin蛋白在荧光基团周围形成更多的氢键和疏水键。04在细胞和纯化的蛋白中对mBaoJin的理化性质进行表征在验证mBaoJin为单体蛋白后，作者进一步对纯化的mBaoJin蛋白的光谱和生化属性进行了表征。实验发现，mBaoJin的吸收和发射光谱与StayGold相似。然而，mBaoJin的分子亮度比StayGold低1.09倍，但比mNeonGreen亮1.24倍。在低激发强度（约13 mW/mm^2，活细胞成像条件）下，mBaoJin的光稳定性比EGFP、mNeonGreen和mGreenLantern分别高15倍、9倍和130倍，尽管在高功率（约120 mW/mm^2）下这种差异不那么显著。mBaoJin在37℃下快速成熟，成熟时间半值为7.5分钟，比StayGold、mNeonGreen和EGFP分别快1.8倍、2.2倍和1.8倍，是最快成熟的荧光蛋白之一。此外，mBaoJin的荧光表现出极高的化学稳定性，与其他单体GFPs相比，mBaoJin具有较高的pH稳定性，pKa值为4.37。mBaoJin在6M GdnHCl中孵育24小时后，其荧光增加了18%，而化学稳定性最强的荧光蛋白之一hfYFP的荧光仅增加了1%，StayGold的荧光减少了2%，mNeonGreen的荧光则完全猝灭。图3. mBaoJin晶体结构、成熟时间、pKa值、细胞内亮度、膨胀显微前处理耐受性和光稳定性的表征在HEK和HeLa细胞中，通过P2A使 mBaoJin与红色荧光蛋白（FusionRed或mCherry）共表达，红色荧光则对蛋白的表达水平进行归一化。与EGFP相比，mBaoJin在HEK和HeLa细胞中的亮度一致地高出约70-140%，同时与(n1)StayGold(c4)和mStayGold相当。此外，mBaoJin在经过膨胀显微前处理的HEK细胞中，其亮度分别比mNeonGreen、hfYFP和mStayGold高出17倍、1.4倍、3.8倍。在HEK细胞进行的光漂白实验中，作者使用了比平时活细胞成像高3.5倍的照明功率（即50.5 mW/mm^2），以便在较短时间内观察到光漂白率的差异。除了StayGold及其衍生荧光蛋白比mBaoJin高1.9至2.3倍的光稳定性，mBaoJin的光漂白速度比其他现有的GFPs慢了4.6至85倍。StayGold的串联二聚体td8ox2StayGold，在亮度和光稳定性方面超过了所有测试的GFPs，在HEK细胞中表现最出色。05mBaoJin的活细胞成像和超分辨率显微成像为了验证mBaoJin能否作为荧光标签，标记目标蛋白在细胞中的分布，将其与结构蛋白融合后成像，包括vimentin，mitochondrial presequence of human cytochrome c oxidase subunit VIII，H2B，keratin，α-tubulin，β-actin等，实验结果如图4所示，mBaoJin可以很好标记结构蛋白在细胞中的位置和形状。作者使用超分辨率共聚焦显微镜对mBaoJin和mNeoGreen与α-tubulin的融合蛋白进行长达60分钟的成像，mBaoJin没有发生光漂白，而在相同条件下，mNeonGreen比初始荧光值降低了25%。接着使用稀疏去卷积结构照明显微镜对活细胞中的肌动蛋白纤维进行成像，在更高的照明功率（150-200 mW/mm2）下，mBaoJin的光稳定性比mNeonGreen高出2.5-4倍。图4. mBaoJin融合蛋白的成像和膨胀显微成像代表图06在线虫活体神经元中对表达的mNeonGreen和mBaoJin进行表征在线虫神经元中，mBaoJin的亮度比mNeonGreen高出约2倍，在连续的宽场照明下，mBaoJin展现了比mNeonGreen慢4倍的光漂白速率，在15分钟的光漂白后保留了超过50%的初始荧光。图5. mBaoJin在线虫神经元内表达的代表图及对其亮度和光稳定性的检测07在小鼠皮层神经元中对表达的绿色荧光蛋白进行表征在活的小鼠脑组织中，mBaoJin比mNeonGreen亮1.7倍，但比mStayGold暗1.7倍。然而，在PFA固定的脑组织中，mStayGold和mBaoJin表现出相当的亮度和光稳定性，显著优于mNeonGreen。由于mBaoJin的高化学稳定性，将其应用在HeLa细胞的线粒体、微丝微管以及小鼠脑组织的膨胀显微成像中。重要的是，mBaoJin在膨胀的脑组织中也保持了其高光稳定性，使得能够进行大体积的超分辨率成像，同时减少光漂白。图6. mBaoJin在小鼠大脑皮层神经元中表达的代表图及对其亮度和光稳定性的检测值得一提的是，先后有三个课题组尝试将StayGold改造成绿色荧光蛋白单体形式。Miyawaki课题组通过分子工程手段，成功开发了两个StayGold单体，mStayGold和mStayGold2（StayGold前面的m是monomeric的缩写），这两种单体在保持耐光漂白性的基础上，实现了亮度的进一步提升1。此外，Mohan K. Balasubramanian课题组联合其他两个课题组发现StayGold的一个点突变StayGold（E138D）在液相色谱实验中呈现单体状态，并且其亮度和光稳定性与StayGold相当3。Kiryl D. Piatkevich课题组联合莫斯科国立大学Fedor Subach课题组基于StayGold开发了绿色荧光蛋白单体mBaoJin，在细胞中其亮度和耐光漂白性均显著优于mNeonGreen，尽管其耐光漂白性能与mStayGold相比稍逊，但在膨胀显微成像中，其保留的荧光优于mNeonGreen和mStayGold。西湖实验室Kiryl D. Piatkevich研究员和莫斯科国立大学Fedor V. Subach教授为论文的共同通讯作者，西湖大学博士研究生张汉斌和莫斯科国立大学Gleb D. Lesnov博士研究生为本文的共同第一作者，西湖大学博士研究生张文皓和科研助理Stavrini Papadaki参与了部分研究工作。本项目获得了国家自然基金委、西湖实验室以及西湖教育基金会的资助；项目实施过程中得到了西湖大学实验动物中心和成像平台的大力支持。论文中用到的质粒可通过西湖实验室的质粒平台免费获取：https://wekwikgene.wllsb.edu.cn/ 。另外，Kiryl D. Piatkevich在2023年发表了一篇对近红外荧光蛋白进行系统性表征的论文4，相关的质粒也可在西湖实验室的质粒平台获取。WeKwikGene是中国第一个质粒库，由Piatkevich教授发起，由西湖生命科学和生物医学实验室资助。所有质粒都经过严格的质量控制和测试。在网站上，您可以找到每个质粒的完整序列，同时它提供了用户友好的体验，支持用户帐户和实验室页面的创建，并提供了增加科学工作可见性的机会。WeKwikGene保证高质量质粒的快速和免费传递，以支持和促进开放科学。实验室招聘：Kiryl D. Piatkevich博士的研究方向是研发和设计尖端分子和成像技术，用于分析、控制和修复复杂生物系统，如大脑。设计和开发用于光学记录和操控神经元活动的遗传编码分子工具，以及用于神经元解剖学追踪的荧光探针。Piatkevich实验室将系统地应用其研发的技术来揭示脑紊乱的分子机制并揭示神经编码的基本原理。这是一个跨学科研究计划，涵盖合成和化学生物学、生物工程、生物化学、生物技术、分子体内成像、神经科学、机器人和细胞生物学等领域，期待有兴趣的优秀博后加入，共同探索大脑未解之谜！招聘链接：https://www.westlake.edu.cn/Careers/OpenPositions/PostDoctoral/202112/t20211216_17044.shtml实验室网站：https://www.piatkevich-lab.com/ 参考文献：Ando R, Shimozono S, Ago H, Takagi M, Sugiyama M, Kurokawa H, et al. StayGold variants for molecular fusion and membrane-targeting applications. Nat Methods 2023.Hirano M, Ando R, Shimozono S, Sugiyama M, Takeda N, Kurokawa H, et al. A highly photostable and bright green fluorescent protein. Nat Biotechnol 2022, 40(7): 1132-1142.Ivorra-Molla E, Akhuli D, Mcandrew MBL, Scott W, Kumar L, Palani S, et al. A monomeric StayGold fluorescent protein. Nat Biotechnol 2023.Zhang H, Papadaki S, Sun X, Wang X, Drobizhev M, Yao L, et al. Quantitative assessment of near-infrared fluorescent proteins. Nat Methods 2023, 20(10): 1605-1616.文章来源 / Kiryl D. Piatkevich团队编辑 / 张玉璇校对 / 朱逸青审核 / 李凯娜