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摘要:佐剂是添加到疫苗中以增强产生的免疫反应的材料，是疫苗的重要组成部分，但很多时候被忽视。虽然疫苗总是包含一个抗原来告诉身体要接种什么，但同样重要的是，佐剂提供了如何产生一个完整的反应的重要因素。佐剂领域的发展一直很慢，20世纪30年代首次在获得许可的疫苗中使用佐剂，并且在接下来的80年里一直是获得许可的疫苗中唯一的佐剂。然而，随着疫苗成为抵御新的和复杂病原体的前沿，设计有效疫苗时考虑所有组成部分是很重要的。在这里，我们总结了获得许可的疫苗中佐剂的使用情况，以及临床试验中新型佐剂的使用情况，特别关注所使用的材料及其对免疫反应的影响。我们讨论了五大类佐剂材料：铝盐、纳米颗粒、病毒载体、TLR激动剂和乳液。对于每一类，我们深入探讨了当前的临床试验空间，这些材料对疫苗接种的影响，以及它们可以改进的一些方式。佐剂为改善疫苗反应和稳定性提供了一个激动人心的机会，这篇综述将有助于了解这一领域的当前进展。 转化影响声明：在COVID-19大流行之后，针对传染病的疫苗成为了焦点。虽然抗原一直是疫苗设计的重点关注对象，但佐剂是增强疫苗免疫反应的重要工具，大部分尚未得到充分开发。本文广泛回顾了佐剂的历史、当前疫苗佐剂领域以及临床试验中佐剂的进展。特别强调了佐剂的材料格局及其作用机制。展望未来，尽管新型疫苗佐剂领域具有令人兴奋的新技术和材料，但仍需要更多的东西来满足新的和复杂病原体的保护需求。 1.引言 疫苗接种是对抗传染病的重要公共卫生策略。疫苗通过使用抗原训练免疫系统，从而让身体产生针对特定抗原的抗体和/或特定抗原的T细胞的免疫反应。抗原和佐剂是疫苗的两个基本组成部分。抗原向免疫系统传达“要对抗什么”，而佐剂则增强免疫反应的强度。佐剂还可以提供额外的好处，包括减少所需抗原剂量，这提供了成本和依从性的好处。 自1926年Alexander T. Glenny发现铝盐（alum）作为佐剂以来，佐剂在疫苗中一直很常见。它被用于20世纪30年代美国食品药品监督管理局（FDA）批准的白喉和破伤风疫苗中。从那时起，alum就被添加到许多疫苗中以增强免疫反应。然而，尽管研究不多，直到2009年才有除了alum之外的其他佐剂被用于许可的疫苗中。由于佐剂材料的缺乏，许多疫苗设计时使用了减毒活病毒（例如，麻疹、腮腺炎和风疹疫苗以及水痘疫苗），以利用它们固有的佐剂特性；但它们对免疫受损个体构成风险。此外，许多疫苗使用了无佐剂的灭活（杀死）病原体（例如，季节性流感和脊髓灰质炎疫苗），这些疫苗单独使用可能难以实现效果。由于这些困难，以及20世纪80年代出现的重组蛋白抗原，其免疫原性低于减毒活病毒和全杀死抗原，佐剂创新的重要性变得更加明显。自2010年代以来，随着几种大流行病（如埃博拉、寨卡和COVID-19）的出现，FDA许可的疫苗中添加了几种佐剂材料，许多其他佐剂也在临床研究中，佐剂创新呈上升趋势。在这里，我们提供了针对传染病疫苗接种的当前临床佐剂景观的概述。我们重点介绍了FDA许可疫苗中的12种佐剂，并讨论了300多项疫苗佐剂的临床试验。本综述中的佐剂被广泛定义为与抗原分开的成分，它产生免疫反应，这允许评估脂质纳米颗粒和病毒载体等抗原载体，尽管它们不被CDC认定为佐剂。本综述的主要目的是向读者提供当前疫苗佐剂的临床景观，这可能指导未来开发更安全、更有效的佐剂的努力。 2.许可疫苗中的佐剂 自2010年代以来，许可疫苗中使用的佐剂迅速发展，在此之前，铝盐是唯一被许可疫苗中的佐剂。随着我们对免疫学和疫苗学的了解不断发展，更多具有不同作用机制（MOA）的材料被开发出来。到目前为止，FDA许可的疫苗中已经使用了12种佐剂（表1）。在这里，我们回顾这些产品并强调它们的适应症。 2.1.铝盐 自20世纪30年代以来，各种形式的铝盐一直占据着佐剂领域的主导地位。它最初是在Glenny用铝钾硫酸盐纯化白喉类毒素时偶然发现的，发现含有铝盐沉淀物的疫苗导致了更强的抗体反应。目前有四种类型的铝盐用于疫苗——氢氧化铝（AH）、磷酸铝（AP）、硫酸铝钾（alum）和无定形羟基磷酸硫酸铝（AAHS），其中AH和AP在许可疫苗中使用最多。AH是通过将铝溶液与氢氧化钠混合制备的，形成结晶铝羟氧化物。结晶度影响其吸收能力，由小晶体组成的AH具有更大的表面积和更强的吸收能力。AP是化学上无定形的羟基磷酸铝，是通过将铝盐溶液与三钠磷酸盐溶液混合或通过将铝盐与磷酸盐溶液混合并用氢氧化钠沉淀来配制的。与AH不同，AP是非结晶的，其吸收能力通常由缓冲条件和起始材料的组成决定。除了结晶度，还存在粒径和形状的变化。AH以长形颗粒的形式存在，平均计算尺寸为4.5×2.2×10纳米，而AP是大约50纳米的片状颗粒。尽管它们具有不同的物理化学特性，但由于它们在临床上验证的效力和安全性，含铝佐剂已被用于许多疫苗中，以特别增强体液反应，并继续在活跃的临床试验中使用（表1和图1b）。 2.2.AS04 AS04在2009年获得FDA批准，并由葛兰素史克（GSK）开发，用于HPV疫苗Cervarix。这种佐剂仍然使用氢氧化铝作为关键成分之一，但它还添加了一种Toll样受体（TLR）4激动剂，单磷酸脂A（MPL），被吸收到铝颗粒上。MPL是脂多糖（LPS）的一种纯化和解毒衍生物。LPS由许多革兰氏阴性细菌产生，并存在于它们的外膜上，使它们能够被免疫系统识别。脂质A是LPS的主要毒力因子，使其成为操纵成激动剂的理想选择。对于AS04，MPL衍生自Salmonella minnesota R595菌株的LPS。在临床前开发中，发现200纳米的颗粒大小是理想的，每剂含有50微克的MPL和500微克的氢氧化铝。添加MPL被证明能够产生比仅含铝的疫苗更强大、更持久的免疫反应（尤其是细胞免疫反应）。这在很大程度上是由于MPL能够通过激活抗原呈递细胞（APCs）和增加炎症细胞因子来诱导早期免疫反应。 2.3.AS03 AS03由GSK开发，用于H1N1疫苗，并在2013年获得许可使用；然而，这种疫苗目前在美国储备中，且AS03不在当前接受的任何疫苗中。这是第一种在许可疫苗中使用的不含铝的佐剂，属于油包水乳液新型佐剂。AS03包含角鲨烯（21.38 mg/ml）、Tween 80（9.72 mg/ml）和（D,L）-α-生育酚（23.72 mg/ml），配制在磷酸盐缓冲液（PBS）中。AS03的粒径约为150 nm，这被认为有助于抗原呈递细胞（APCs）的摄取。与铝盐相比，AS03诱导更强的抗原特异性抗体和T细胞反应，以及更高水平的细胞因子和免疫细胞募集到引流淋巴结。在配方方面，（D,L）-α-生育酚增强了AS03诱导的免疫反应的幅度，这将在本综述后面讨论。 2.4.MF59 MF59用于季节性流感疫苗（Fluad和Fluad Quadrivalent），在1997年获得欧洲许可后，于2015年获得FDA许可。目前，MF59佐剂的季节性流感疫苗仅用于65岁及以上的人群，以补偿他们减弱的免疫反应。这种佐剂由诺华公司开发，也是一种类似于AS03的油包水乳液。MF59由角鲨烯（4.3%）和两种表面活性剂，Tween 80（0.5%）和Span 85（0.5%），在柠檬酸缓冲液中组成，粒径约为160 nm。MF59可以通过在注射部位产生免疫能力环境来增强细胞和体液免疫反应，并且依赖于配方中的所有三个组分协同工作以产生最强大的免疫反应。 2.5.外膜囊泡 OMVs并不被传统定义为佐剂，因为它具有载体能力；然而，它们固有的佐剂特性在它们添加到配方中很重要。OMVs源自革兰氏阴性细菌的外膜，形成约25-250 nm的球形囊泡，展示许多细菌抗原和蛋白，可以作为TLR激动剂。这项技术仅被许可用于一种脑膜炎球菌B群疫苗，Bexsero，由诺华公司开发，然后被GSK在2015年美国批准前收购。各种革兰氏阴性细菌自然产生OMVs以应对压力，但也可以通过用于Bexsero的洗涤剂提取法获得。在Bexsero的情况下，OMV与重组蛋白抗原一起传递，并提供自身的固有抗原成分，主要的是PorA，因为它源自N. meningitidis细菌。OMVs的一个主要优势是它们同时表达的细菌抗原和自然存在于它们上的强效TLRs，这使得OMVs成为先天免疫反应的强大驱动力。Bexsero还与氢氧化铝配方，以增加佐剂效果。 2.6.AS01B AS01B是另一种组合佐剂，由皂苷QS-21和TLR4激动剂MPL的脂质体配方组成，大约100 nm大小。这种佐剂用于2017年FDA许可的带状疱疹疫苗（Shringrix），以及WHO预认证的RTS,S疟疾疫苗。虽然MPL之前在AS04佐剂系统中使用过，但这是首次在许可疫苗中使用QS-21——一种从南美树木Quillaja saponaria Molina树皮中提取的皂苷分子。QS-21特别被发现可以调节先天免疫系统，从而增强抗原特异性抗体反应和CD8 T细胞。以脂质体配方的QS-21仍然被用来传递许多TLR激动剂，将在本综述的TLR激动剂部分进一步讨论。当一起配方时，MPL和QS-21协同工作以增强对抗原的免疫反应。 2.7.CpG基序（1018和7909） 未甲基化的CpG基序，CpG 1018和CpG 7909，是两种TLR9激动剂，用于之前许可的疫苗中。CpG 1018首次在2017年用于许可的乙肝疫苗Heplisav-B中；CpG 7909则在2023年7月用于许可的炭疽疫苗Cyfendus中。CpG基序由中心未甲基化的CG二核苷酸和侧翼区域组成，源自合成的寡脱氧核苷酸（ODN），模仿细菌DNA。细菌DNA代表一种强大的病原体相关分子模式（PAMP），激活先天免疫系统。在感染期间，细菌DNA中高比例存在的未甲基化CpG基序与免疫细胞上的TLR9相互作用，触发保护性免疫反应。通过合成复制细菌DNA和分离特定触发特定免疫反应的合成未甲基化CpG基序，CpG 1018和7909是具有特定TLR9激活能力的佐剂，导致特别偏向细胞介导的或Th1反应的保护性反应。CpG基序通常与铝佐剂（例如，在含有CpG 7909的FDA许可的炭疽疫苗中）结合使用，因为这两种佐剂的结合导致强大的细胞和体液免疫。 2.8.rVSV 西非埃博拉病毒流行（2013-2016）导致了第一种许可的病毒载体疫苗。Vesicular Stomatitis Virus (VSV)是一种基于病毒载体的佐剂，用于默克公司的埃博拉疫苗ERVEBO（也称为V920, rVSVΔG-ZEBOV-GP或rVSV-ZEBOV），该疫苗于2015年获得FDA许可。ERVEBO是一种具有复制能力的、减毒的重组水泡性口炎病毒（rVSV）载体，其糖蛋白基因被ZEBOV替代。VSV糖蛋白G允许附着和进入宿主细胞，这被ZEBOV糖蛋白模仿以产生ZEBOV抗原特异性免疫反应。与其他许可的佐剂系统相比，rVSV是独特的，因为它编码抗原在载体表面表达，而不是被混合或绑定。然而，由此产生的免疫反应仍然由rVSV载体决定，与抗原无关，表明这项技术本身就是一种强大的免疫调节剂。具体来说，疫苗引发与VSV类似的感染，导致针对病毒蛋白的特定细胞和抗体反应，因此保护人们免受未来的暴露。疫苗在超过5000名接种者及其未接种的接触者中实现了100%的疫苗效力。 2.9.脂质纳米颗粒 两种基于脂质纳米颗粒的疫苗已由Pfizer-BioNTech和Moderna获得FDA许可。Pfizer-BioNTech COVID-19疫苗中的脂质纳米颗粒，现在称为Comirnaty（BNT162b2），是美国第一种COVID-19疫苗，于2021年8月获得FDA许可。BNT162b2在43,548名参与者中显示出95%的效力预防COVID-19。疫苗的抗原是修饰的核苷酸RNA（modRNA），编码SARS-CoV-19病毒的刺突蛋白，由四种脂质配制的脂质纳米颗粒保护：一种离子化脂质（（（4-羟丁基）吖啶二基）双（己烷-6,1-二基）双（2-己基癸酸酯）），一种聚乙二醇化脂质（2-[（聚乙二醇）-2000]-N,N-十四烷基乙酰胺），以及两种结构脂质（1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DSPC）和胆固醇）。疫苗在接种后显示出强烈的抗原特异性抗体反应、CD8+和CD4+ T细胞反应，以及免疫细胞产生的IFNγ。另一种脂质纳米颗粒用于Moderna的SPIKEVAX COVID-19疫苗，也称为mRNA-1273，该疫苗于2020年12月获得FDA紧急使用授权，随后于2022年1月获得许可。与Pfizer-BioNTech的疫苗类似，Moderna的SPIKEVAX在30,420名参与者中显示出94.1%的效力。尽管它有类似的局部和全身反应，如头痛、发烧和疲劳，但没有安全问题。疫苗包含一个由脂质纳米颗粒包裹的信使核糖核酸（mRNA）抗原，由四种脂质组成：SM-102、聚乙二醇（PEG）2000二硬脂酰甘油（DMG）、胆固醇和1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DSPC）。与BNT162b2类似，mRNA-1273诱导CD4 T滤泡辅助、CD8+和Th1反应。 2.10.Matrix-M Novavax生产的COVID-19疫苗NVX-CoV2373含有纳米颗粒佐剂Matrix-M，该佐剂于2022年10月获得FDA的紧急批准。后来暂停，并在包括SARS-CoV-2 Omicron变体的刺突蛋白的更新疫苗中重新授权紧急使用。目前，它已于2023年10月由FDA重新授权紧急使用。Matrix-M佐剂是一种40 nm基于皂苷的纳米颗粒佐剂，由来自Quillaja saponaria树皮的两种纯化组分混合，与胆固醇和磷脂结合。疫苗与SARS-CoV2刺突蛋白三聚体抗原配制成27.2 nm的纳米颗粒，并与Matrix-M佐剂结合，制成NVX-CoV2372疫苗。结合使用时，该疫苗已显示出诱导强烈的Th1型和T滤泡辅助细胞（Tfh）反应，促进中和抗体的产生，以及CD4+ T细胞和CD8+ T细胞反应。该疫苗已被证明是安全的，副作用轻微至中等，如注射部位疼痛、头痛和疲劳。 3.当前临床试验 在这一部分，我们提供了截至2023年6月当前新疫苗佐剂临床试验的概况。我们在clinicaltrials.gov数据库上使用关键词“vaccine”和“communicable diseases”以及“recruiting, not yet recruiting, active, not recruiting, or enrolling by invitation”的状态进行了搜索。我们还指定了研究类型为“Interventional Studies”。返回的条目（总共641个）然后手动筛选，排除已经获得FDA许可或WHO预认证的疫苗，并且正在寻求扩展到不同人群/剂量计划的使用。排除后，总共识别出523项试验。在这个集合中，对不同的疫苗配方进行了分析，以识别佐剂成分。当多个试验中疫苗配方一致时，即使用了相同的抗原和佐剂组合，这些试验被归为一类。相反，当一个试验通过使用多个佐剂和/或抗原评估多种疫苗配方时，该试验根据疫苗配方的数量被多次计数。这导致了389种独特的疫苗配方正在评估中。 在识别的活跃疫苗临床试验中使用了多种佐剂（图1）。然而，23%的识别试验的疫苗配方中没有包含佐剂（图1a）。大约50%的这些不含佐剂的配方使用减毒活病毒作为抗原，这种抗原具有固有的高免疫原性。然而，这些类型的疫苗可能对免疫受损者有增加的安全问题。在其他50%不含佐剂的疫苗试验中，大多数使用灭活病原体作为抗原。使用灭活病原体可以提高疫苗的安全性，但可能会降低免疫原性，因为病原体不能复制或进入免疫细胞以促进强大的免疫反应。此外，没有佐剂，这些疫苗配方完全依赖于身体识别灭活抗原为危险并产生免疫反应。年度季节性流感疫苗使用灭活的流感病毒作为抗原，没有佐剂。这些疫苗通常效果有限。例如，在2007-2008年流感季节，流感疫苗Fluzone的保护率据报道仅为68%，强调了增加佐剂以提高疫苗免疫原性的必要性。 图1 展示了当前临床试验空间中许可疫苗的佐剂情况。(a) 根据佐剂许可状态评估的临床试验中独特疫苗配方的分类，其中独特的疫苗配方由试验空间中不同的佐剂和抗原组合定义。每个部分显示了独特疫苗配方的数量及其在整个试验中的百分比。(b) 显示了包含许可疫苗佐剂的临床试验数量，作为该佐剂在独特疫苗配方中使用的次数，以及在重复疫苗配方中使用该佐剂的试验数量。 一些识别的疫苗试验没有指定使用的佐剂，我们将这些试验在图1a中归类为“未知”。此外，对于确实包含佐剂的疫苗配方——之前在许可疫苗中使用过或新颖的——我们根据不同的佐剂类别进一步对它们进行分类（图2）。在接下来的讨论中，我们将逐步了解这些佐剂类别，讨论它们各自的机制，并概述每个类别的临床试验概况。 图2 展示了按佐剂类别划分的临床试验数量。这既包括包含独特疫苗配方的试验，也包括包含重复配方的试验。 3.1.铝盐 铝盐在识别的临床试验中继续占据主导地位，代表目前正在评估的疫苗配方中使用最广泛的佐剂（图2）。这些配方中的许多，88%，将铝盐作为配方中唯一的佐剂。然而，10%的配方包括TLR激动剂作为组合。类似于在AS04中看到的，添加TLR激动剂可以增强免疫反应，特别是细胞免疫，这是基于铝的佐剂单独难以实现的。将在本综述后面更深入地讨论TLR激动剂重点试验。在当前的临床试验景观中，使用铝佐剂的疫苗正在用于保护多种传染病，包括COVID-19、HIV、霍乱、百日咳等。 尽管铝盐作为佐剂的使用历史悠久，但其促进免疫反应的作用机制尚未完全阐明。在发现之后，Glenny等人提出了佐剂的作用机制——库效应，建议抗原库的创建可能导致持续和缓慢的抗原释放。这个机制多年来被该领域广泛接受，但最近这一观点因观察到在注射后2小时移除注射部位的铝库并不影响抗原特异性免疫反应而受到挑战。这与早期的研究形成鲜明对比，早期的研究表明，在注射后4天内移除库影响了免疫反应，但在注射后7天移除时则没有影响。总体而言，库的形成和库的持续时间如何影响整体佐剂效果仍然不清楚。除了库效应，还探索了铝的其他免疫调节特性，以描绘更完整的机制图景。具体来说，已经显示铝佐剂在注射部位诱导大量坏死，导致DAMPs（如DNA和尿酸）的释放。这些DAMPs促进免疫细胞的渗透和激活，最终与下游免疫反应相连。在渗透到现场的免疫细胞中，树突状细胞被确定为铝机制中的关键细胞。树突状细胞不仅增强了从注射部位到引流淋巴结的抗原运输，而且对铝的反应激活并增加了通过单核细胞分化为树突状细胞的细胞数量。虽然铝难以启动细胞免疫反应，但它通过激活补体级联反应是强大的体液免疫反应调节剂。 即使没有完全的机制理解，铝佐剂仍然在许可疫苗或那些在活跃的临床试验中广泛使用（图2）。铝佐剂在所有许可疫苗的佐剂中拥有最长的安全记录，过去80年一直是值得信赖的添加剂。虽然需要新材料来扩大佐剂空间，但铝佐剂在临床研究中继续占据主导地位。 3.2.纳米颗粒 纳米颗粒是识别试验中另一种广泛使用的疫苗佐剂（图2）。纳米颗粒可以由多种材料配方制成，其物理和化学属性如大小、形状、表面结构、物理化学性质、溶解度以及疏水性/亲水性可以调节。这激发了纳米颗粒佐剂在疫苗开发中的使用，特别是在COVID-19大流行期间。虽然许多纳米颗粒仅被视为抗原载体，但根据其材料和物理化学属性，纳米颗粒可以作为佐剂增强免疫反应。 纳米颗粒作为疫苗中的候选物质具有吸引力，因为它们具有可调节性。使用的抗原可以是封装在颗粒内的核酸，也可以是配方在颗粒表面的肽和蛋白质。佐剂成分也可以来自构建颗粒所用的材料，如Matrix M的情况，或者来自结合在表面的配体，如TLR激动剂，包括可能对抗原的多方面免疫反应。一些纳米颗粒还允许定时释放，通过使用金材料，这可以通过频繁暴露增强免疫反应。在当前的临床试验景观中，有75种独特的疫苗配方使用基于纳米颗粒的佐剂，总共有98项试验，包括Matrix-M、金纳米颗粒、脂质纳米颗粒以及其他脂质载体的变化（图3a）。其中，三种纳米颗粒已在许可疫苗中使用，包括Pfizer-BioNTech和Moderna设计的脂质纳米颗粒以及牛津大学设计的Matrix-M。自COVID-19大流行以来，纳米颗粒在临床疫苗中取得了很大进展，并继续作为识别活跃临床试验中的第二大佐剂组，在独特的疫苗配方中占18.2%，在总试验中占16.4%（图2）。 图3 展示了临床中纳米颗粒佐剂的情况。(a) 根据纳米颗粒类型：脂质纳米颗粒、Matrix-M、白桦脂醇纳米颗粒（NP）、金纳米颗粒（GNP）、纳米结构脂质载体（NLC）和脂质无机纳米颗粒（LION），在临床试验空间中包含纳米颗粒佐剂的独特疫苗配方的构成。提供了独特疫苗配方的数量以及相应的整体空间百分比。(b) 根据负责临床试验的主体，包含脂质纳米颗粒的临床试验数量。这由包含独特疫苗配方的试验数量和包含重复配方的试验数量共同定义。 3.2.1.脂质纳米颗粒 脂质纳米颗粒（LNPs）是由可电离脂质、辅助脂质、胆固醇和聚乙二醇化脂质的不同比例制成的球形囊泡。通过在这些角色中使用不同的材料并改变它们的比例，许多公司已经生产了自己的LNPs用于疫苗接种（图3b）。这四种脂质的组成包裹了核酸和蛋白质作为针对目标疾病的抗原。在生理pH下，可电离脂质具有中性电荷，减少毒性并促进mRNA的摄取。当与细胞质相互作用时，可电离脂质的正电荷诱导mRNA释放到宿主细胞中。LNPs在识别的活跃临床试验中占纳米颗粒基佐剂的最大组（图3a），有55种独特的疫苗配方跨越67项试验，用于针对COVID-19、HIV、带状疱疹、尼帕病毒等多种疾病的疫苗接种（图3b）。如前所述，已有两项脂质纳米颗粒疫苗获得许可：Moderna的SPIKEVAX COVID-19疫苗和Pfizer-BioTech的Comirnaty COVID-19疫苗。在最近的一项研究中，发现LNPs可以诱导强烈的体液反应，如T滤泡辅助（Tfh）细胞、记忆B细胞和浆细胞。 Pfizer-BioNTech和Moderna疫苗都展示了类似的机制。疫苗包含编码SARS-CoV-2病毒刺突糖蛋白的修饰核苷mRNA，一旦进入宿主细胞质，就被放置在LNP中以保持稳定性和保护。然而，LNP不仅仅是抗原载体系统，而是具有自己的佐剂能力。BNT162b2（NCT05541861）和mRNA-1273（NCT05383560）LNPs以及临床试验中使用的其他LNPs，都包含类似的四个关键成分——可电离脂质、胆固醇、聚乙二醇化脂质和1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DSPC），这些脂质的确切组成和比例都有专利差异。在这两种情况下，可电离脂质被认为是产生佐剂反应的原因。当增加LNP配方中可电离脂质的摩尔比例时，发现促炎细胞因子如IL-6的诱导随之增加。此外，可电离脂质直接影响疫苗产生的体液反应。当LNPs与抗原蛋白共注射时，无论是否包含封装的IVT-mRNA，都能产生抗原特异性抗体。然而，在LNPs缺乏可电离脂质的情况下注射抗原蛋白时，无法产生抗原特异性抗体。这表明可电离脂质在抗原生成和先天免疫信号传导中都起着至关重要的作用，尽管负责免疫激活的确切机制仍然不完全清楚。配方中的聚乙二醇化脂质保护纳米颗粒免受吞噬作用，允许长时间循环。最后，辅助脂质、胆固醇和DSPC通过稳定抗原封装和增强膜刚性来增强纳米颗粒的稳定性，从而提高整体效果和生物分布。一旦宿主细胞被感染，mRNA被翻译成SARS-CoV-2刺突蛋白，在宿主细胞上表达。虽然这两种疫苗类似，但它们具有不同的储存能力。Pfizer的BNT162b2需要在-60°C至-80°C下储存，可以储存6个月，而Moderna的mRNA-1273疫苗可以在2°C至8°C下储存，长达30天。 3.2.2.Matrix-M Matrix-M是一种40 nm的球形基于皂苷的纳米颗粒，由Quillaja saponaria树皮中的两种纯化组分Fraction-A和Fraction-C混合，与胆固醇和磷脂配方。有两种皂苷组分，Matrix-A和Matrix-C，组合成Matrix-M。在临床上，Matrix-M纳米颗粒在纳米颗粒类别中占独特疫苗配方的20.3%，占总试验的25%（图3a），目前用于针对包括Epstein-Barr病毒感染、疟疾和COVID-19在内的多种疾病的疫苗接种。在最近一项测试Matrix-M在没有抗原的情况下的小鼠免疫刺激性的研究中，发现佐剂将淋巴结和脾脏中的免疫细胞数量增加了3倍，并诱导了强烈的Th1反应。在注射部位，Matrix-M增强了先天免疫细胞如中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞和树突状细胞的渗透，并促进了促炎细胞因子的释放。这种细胞因子的释放启动了更多先天免疫细胞的涌入，引发了一系列局部免疫反应，在随后的24-48小时内展开。Matrix-M和抗原也一起流向淋巴结，导致B细胞激活和增殖增加，以及T细胞的激活和极化。B细胞进一步增殖和分化为记忆B细胞和浆细胞，产生高亲和力抗体，通过疫苗针对的目标感染威胁提供保护。基于皂苷的佐剂一直被认为是有利的，并已用于动物疫苗以及在许可疫苗中使用的AS01b佐剂中的脂质体配方QS-21。如前所述，Matrix-M是Matrix-A和Matrix-C皂苷组分的组合，而QS-21包含Matrix-C。由于其不稳定性，QS-21与胆固醇一起在像AS01B这样的脂质体基佐剂中配方。 3.2.3.基于白桦脂醇的球形纳米颗粒 基于白桦脂醇的球形纳米颗粒大小为100-180 nm。白桦脂醇是由桦树皮产生的五环卢帕烷型萜类化合物配方而成，已显示出具有抗真菌、抗病毒和抗致癌作用。目前在临床景观中，基于白桦脂醇的纳米颗粒出现在一项名为Betuvax-CoV-2（NCT05270954）的COVID-19疫苗试验中。Betuvax-CoV-2包含基于白桦脂醇的球形纳米颗粒表面的重组RBD-SD1-Fc融合蛋白，该配方旨在模拟SARS-CoV-2病毒以类似方式触发免疫系统。在BetuvaxcoV02的最新研究中，它被证明是安全且可耐受的，并且对疫苗接种有轻微反应。已显示出特异性IgG抗体滴度以及对抗原的强烈CD4+和CD8+ T细胞反应。白桦脂醇的免疫调节机制有限，但已证明白桦脂醇可以增强人外周血淋巴细胞的增殖，以及增强巨噬细胞中的抗炎和促炎活性。由于白桦脂醇是一种常见自然资源的提取物，该化合物的丰富性和低细胞毒性使其作为疫苗佐剂更受欢迎。 3.2.4.金纳米颗粒 金纳米颗粒（GNP）在疫苗中特定用于增加抗原稳定性、抗原在淋巴结中的积累以及抗原呈递细胞的有效抗原摄取。在当前的临床研究景观中，有一项试验使用了金纳米颗粒，具体是用于COVID-19的生物制剂PepGNP-COVID-19，这是一种经皮COVID-19疫苗（NCT05633446）。虽然尚不清楚这种精确配方如何结合COVID-19抗原，但GNP可以通过多种方式与抗原结合，如通过硫醇和胺链接的化学缀合、吸附和封装。GNP的大小对于免疫反应至关重要。比较20 nm和40 nm的球形GNP时，较大的球形GNP被发现更有效地产生IL-6和IL-12等细胞因子。GNP的形状也很重要。当骨髓源性树突状细胞用杆状GNP处理时，发现两种特定的促炎细胞因子IL-1b和IL-18的产生增强。相比之下，像临床疫苗中看到的立方体和球形GNP导致不同促炎细胞因子如肿瘤坏死因子α（TNFa）、IL-6、IL-17和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的水平升高。 3.2.5.纳米结构脂质载体 纳米结构脂质载体（NLC）被称为第二代脂质纳米颗粒，有可能克服以前脂质纳米颗粒的限制。它们由一个由液态和固态脂质组成的脂质基质核心组成，形成结晶结构，由脂质和表面活性剂壳层包围，与具有固态脂质核心的LNP相反。具体来说，NLCs由于其不完美的晶体结构，表现出更高的药物载荷能力，通过避免脂质结晶来防止药物驱逐，并增加药物溶解度和控制释放。目前，有一项活跃的试验中使用了NLC，其中自放大RNA（saRNA）抗原结合在NLC的外部。这种鼻内疫苗AAHI-SC2是由Access to Advanced Health Institutes（AAHI）开发的，用于保护COVID-19（NCT05370040）。这种疫苗中使用的NLC大约为125 nm，核心由固态脂质三酰甘油和液态脂质（角鲨烯）组成，壳层由表面活性剂和阳离子脂质1,2-二油酰-3-三甲基铵丙烷（DOTAP）组成，这有助于复合RNA。该平台是全球分发的绝佳候选物，因为它允许在冷藏状态下作为液体长期稳定，同时至少保持一年颗粒大小和浓度。疫苗可以很容易地从其液体形式配方，通过将疫苗RNA与NLC混合以创建NLC/RNA复合物，该复合物通过与阳离子脂质DOTAP的静电相互作用形成。此外，整个复合物可以很容易地冻干，并在室温下储存8个月或冷藏近两年。这种热稳定性是以前LNP配方所未见的，并且可以显著改善疫苗的分发。AAHI-SC2疫苗被证明可以产生高血清特异性IgG和SARS-CoV-2武汉株特异性中和抗体。在小鼠中比较肌肉内主剂和鼻内增强剂时，发现IFNγ分泌T细胞显著增加，具有强烈的Th1偏向反应和微不足道的Th2和Th17反应。此外，鼻内途径有强大的呼吸道粘膜免疫反应，具有SARS-CoV-2反应性的肺驻留记忆和肺归巢T细胞群体。异质给药方法，肌肉内主剂和鼻内增强途径，显示出使用这种佐剂最大化强大的粘膜和系统免疫的潜力。 3.2.6.脂质无机纳米颗粒 脂质无机纳米颗粒（LION）是52 nm颗粒，旨在增强治疗剂的稳定性、传递和免疫原性。在当前的临床试验中，LION在两项独特的疫苗配方中使用，共进行了三项针对COVID-19疫苗接种的试验。在这两种配方中，LION与自复制mRNA（repRNA）结合，编码SARS-CoV-2的刺突蛋白，结合在LION的外部，形成了在韩国由Quartis开发的疫苗QTP104（NCT05876364）和在美国和巴西由HDT Bio开发的疫苗HDT-301（NCT05132907，NCT05542693）。LION由含有15 nm超顺磁性氧化铁（SPIO）纳米颗粒的角鲨烯乳液核心组成，以增强稳定性，并由表面活性剂和阳离子脂质DOTAP包围。基于角鲨烯的佐剂在本综述中已多次提及，而SPIO纳米颗粒在MRI对比和铁替代疗法中有着临床历史。一旦LION配方完成，它就与RNA结合，形成LION复合物。RNA的复合类似于NLCs中的情况，阳离子脂质DOTAP与嵌入的RNA分子形成静电连接。LION的优点是它可以在室温下稳定至少3个月，使其成为全球分发的绝佳候选物。对repRNACoV2S进行的持续研究表明，可以诱导SARS-CoV-2刺突蛋白的抗原特异性T细胞和抗体反应。此外，疫苗诱导了强烈的Th1偏向免疫反应，疫苗诱导了抗刺突蛋白IgG抗体和强烈的T细胞反应，更高剂量增强了Th1反应。在小鼠中进行的单次肌肉内免疫接种在14天后实现了100%的血清转换以及强烈的抗原特异性IgG反应。免疫接种还在年轻和老年小鼠之间进行了比较，所有年龄的小鼠都有强烈的脾T细胞反应，最老的17个月龄组的T细胞反应各异。非人灵长类动物如猕猴与小鼠的结果一致，并表明长期抗原特异性记忆T细胞反应。 3.3.病毒载体 病毒载体是被修改的病毒，普遍用于将目标基因传递给宿主细胞。在疫苗接种中，它们主要被识别为抗原载体，传递DNA抗原和蛋白抗原给免疫细胞。然而，病毒载体也具有佐剂能力，因为它们可以模仿由病毒引起的自然感染。通常，自然感染是通过病毒通过表面受体附着到宿主细胞上发生的。病毒的存在通过识别载体上的病原体结构或PAMPs以及与模式识别受体（PRR）的相互作用，有效地触发先天免疫反应。虽然载体诱导类似病毒的感染，但病毒载体被修改为非致病性和复制缺陷，以避免进一步的病毒特异性感染。虽然病毒载体是有效的佐剂，但它们也有一些缺点。主要的是，很难调节启动的先天反应，有时载体可能引起过于强烈的先天反应，导致细胞毒性、对重复剂量的免疫以及强烈的炎症反应，这些可能会降低效果甚至被身体清除。 在临床上使用的载体来自几个病毒家族，包括副黏液病毒、腺病毒科和正黏液病毒科。在每个家族中，有几种不同的病毒载体通过基因编辑进行了修改，以避免预先存在的免疫，同时减少毒性和免疫原性。如前所述，有一种病毒载体佐剂，即rVSV，已被用于默克公司的许可rVSV-ZEBOV扎伊尔埃博拉疫苗中。还有两种病毒载体获得了WHO和FDA的临时紧急批准。阿斯利康COVID-19疫苗中的ChAdOx1载体在2021年2月获得了WHO的紧急批准，但此后该批准已被撤销。此外，詹森COVID-19疫苗中使用的Ad26载体在2021年2月获得了FDA的紧急批准，但由于与疫苗接种相关的潜在血凝块风险，这一批准已被撤销。在当前的临床景观中，有27种病毒载体佐剂分布在八个病毒家族中。在临床试验中的佐剂中，15.8%的总试验和13.6%的独特疫苗配方使用了病毒载体，使其成为临床试验疫苗景观中第三大佐剂组。 3.3.1.弹状病毒 rVSV是临床试验中正在测试的唯一弹状病毒家族的病毒载体。rVSV是一种活的、减毒的重组水泡性口炎（印第安纳）病毒（VSV）。目前，该载体正在评估针对尼帕病毒、拉沙病毒和埃博拉苏丹病毒病（ESVD）的疫苗中的四种独特疫苗配方。VSV是一种11 kb非分段、单链、负义RNA病毒，由11,000-12,000个核苷酸组成，编码五个基因：N、P、M、G和L。该病毒主要感染昆虫、马、牛和猪，因此避免了人类的预先存在的免疫，并增加了VSV病毒载体疫苗的有效性。VSV的糖蛋白G是一种III类病毒融合蛋白，允许细胞附着和膜融合并使感染成为可能。在许可的rVSV ZEBOV疫苗中，VSV-EBOV，EBOV糖蛋白（GP）被整合到VSV载体中，其中G开放阅读框架被故意移除。这种修改允许复制rVSV显示弹状病毒的形态，同时在其表面表达EBOV GP。与其他病毒载体一样，rVSV产生与宿主的Toll样受体（TLRs）和模式识别受体相互作用的信号。这种相互作用触发先天免疫反应，从而增强适应性免疫反应。VSV病毒载体已被证明是一个有希望的平台，因为它的血清价、高复制性和接种个体中的低至温和症状。然而，虽然在产生所需抗原的免疫反应方面有效，但许可的疫苗也在超过三分之一的受试者中证明了对载体本身VSV的细胞毒性T细胞和抗体反应；这可以直接影响VSV-EBOV的复制能力。尽管如此，由于对免疫反应的积极影响和高制造性，这种载体继续被探索用于各种疫苗：rVSV可以通过转染表达感兴趣基因的哺乳动物细胞或HEK293T来高滴度生产。 3.3.2.腺病毒 腺病毒是非包膜双链DNA二十面体形状的病毒，在病毒载体空间中占主导地位，包括人类和黑猩猩腺病毒载体。在腺病毒科家族中，Mastadenovirus属由感染人类和非人灵长类动物（如牛、犬和黑猩猩等灵长类动物）的血清型组成。血清型进一步分为A-G种。在当前的临床试验空间中，人类腺病毒载体代表最大的病毒载体家族，有17种独特的疫苗配方跨越33项试验，研究多种COVID-19疫苗，以及HIV、狂犬病、霍乱等（图4a）。在56种人类腺病毒血清型中，野生型血清型引起轻度至中度的呼吸道或胃肠道疾病症状。这些多样化的菌株通常源于病毒复制过程中发生的自然基因变异。数字命名有助于科学家对这些变体进行分类和研究，每个数字代表人类腺病毒大家族中一个独特的基因组和血清型身份。在临床试验景观中，Ad5是最常用的病毒载体，包括针对COVID-19和诺如病毒的10种独特疫苗配方。在COVID-19大流行期间，Ad5病毒载体已被用作COVID-19疫苗平台，临床试验中正在测试几种载体修改的COVID-19疫苗。在最近的一项研究中，发现不同剂量并没有显著增加抗体产生水平，这表明腺病毒载体的限制。Ad5病毒载体被证明可以产生特异性抗体和长期T细胞反应，但证明了高血清流行率，因为52%的参与者有高预先存在的免疫。Ad5载体被证明是有效和安全的，但由于其高血清流行率，许多其他衍生物已经从稀有人类腺病毒物种和非人灵长类动物中创造出来，这些物种今天出现在临床试验空间中，如用于COVID-19疫苗Ad26.COV2.S的Ad26。 图4 展示了临床中病毒载体的情况。(a) 根据病毒家族，临床试验空间中包含病毒载体的独特疫苗配方的构成。提供了独特疫苗配方的数量以及相应的整体空间百分比。(b) 根据血清型，包含腺病毒载体的临床试验数量。这由包含独特疫苗配方的试验数量和包含重复配方的试验数量共同定义。 由于黑猩猩腺病毒（ChAd）在系统发育上与人类腺病毒相似，这两个腺病毒家族之间有许多相似的特征。ChAd在临床试验景观中的13种独特疫苗配方和27项总试验中被发现，构成了第二大病毒载体组。ChAd载体在各种传染病的试验中，包括HIV、COVID-19、狂犬病和埃博拉。在ChAd载体中，ChAdOx1在临床上最流行，有四种独特的疫苗配方和16项总试验（图4b）。ChAd病毒载体是起源于腺病毒科Mastadenovirus属的猴腺病毒；它们主要结构为非包膜双链DNA，能够感染人类和非人灵长类动物。最常用的猴腺病毒载体ChAdOx1源自黑猩猩腺病毒Y25，由牛津大学开发。这个载体是安全和高度可制造的，并且可以在2°C–8°C下储存，使其成为全球分发的理想选择。ChAdOx1还避免了人类腺病毒载体中发现的预先存在的免疫。在对单剂量ChadOX1 nCoV-19（AZD1222）进行的研究中，发现它诱导了强烈的Th1免疫反应、IgG1和IgG3抗体产生，以及CD8 T细胞、自然杀伤细胞和B细胞群体。像ChadOX1一样，许多其他载体，如ChAd155和ChAd36，显示出类似的免疫反应，具有强大的体液和细胞反应。总的来说，ChAd载体是有效的，并且适合全球分发，同时避免了人类腺病毒载体中发现的预先存在的免疫。 3.3.3.痘病毒科病毒 改良的安卡拉牛痘病毒（MVA）是痘病毒科家族中唯一的病毒载体，并且在临床上用于10种独特的疫苗配方和11项总试验，占病毒载体景观中独特疫苗配方的17.2%。痘病毒是双链DNA病毒，它们在宿主细胞的细胞质中复制，从而消除了病毒与宿主基因组的整合。通常已知感染人类和动物，痘病毒通常引起病变、皮疹和皮肤结节。MVA载体是天花病毒的高度减毒株，已证明在人类中安全，包括HIV感染者，同时是一个多功能平台，可以长期储存。冻干MVA疫苗被证明可以在37°C下储存长达2周，并且在冷藏时超过一年。MVA主要在临床试验中用于上呼吸道疾病，如COVID-19、呼吸道合胞病毒、中东呼吸综合征（MERS）和疟疾。它已被证明可以诱导大量抗原特异性CD8和CD4 T细胞反应和快速记忆分化。在最近的一项研究中，MVA-EBOV-GP的给药，一种针对埃博拉病毒（EBOV）糖蛋白（GP）的病毒载体疫苗，导致了病毒中和抗体的产生，而MVA-EBOV-NP，一种针对埃博拉核蛋白（NP）的病毒载体疫苗，触发了针对NP的细胞毒性CD8 T细胞的发展。两种疫苗都证明了在引发保护性免疫反应方面的同等效力。 3.3.4.副黏液病毒 目前临床试验中有来自副黏液病毒科的两种病毒载体正在接受测试：PIV5和新城疫病毒（NDV），代表了九项总试验中的五种独特疫苗配方（图4a）。副黏液病毒是大小为150-300 nm的包膜病毒。它们是单链RNA病毒，像痘病毒科家族一样在宿主细胞质中复制。病毒含有两种跨膜糖蛋白：三聚体融合（F）蛋白使膜融合，而血凝素-神经氨酸酶（HN）、血凝素（HA）或糖蛋白（G）使病毒附着。这些病毒以其感染脊椎动物而闻名，如腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒（RSV）和副流感病毒。两种病毒载体PIV5和NDV都含有相同的两种跨膜糖蛋白：血凝素-神经氨酸酶蛋白HN和融合蛋白F。这些载体目前正在进行针对COVID-19和合胞病毒等上呼吸道感染的试验。PIV5在哺乳动物中表现出低毒力，除了犬类上呼吸道感染外，并且由于可以在Vero细胞中生长至8×108 PFU/ml，因此具有很高的可制造性。在最近一项针对PIV5 RSV疫苗的鼻内研究中，大约50%的参与者在基线时对PIV5中和抗体呈血清阳性，但显示出对RSV F蛋白的强烈细胞免疫反应；因此，先前接触这种病毒载体并不会抑制反应。类似地，NDV可以低成本大规模生产，因为它是一种禽病毒，可以在受精鸡蛋中生长。NDV在人类中没有预先存在的免疫，但已知在禽类中具有传染性和危险性。过去，NDV已被用作癌症治疗的安全候选物，并通过在肿瘤细胞中诱导I型和III型抗病毒干扰素以及非癌症细胞中的III型而显示出溶瘤优势。 3.3.5.正黏液病毒科病毒 正黏液病毒科由球形病毒组成，包含分段的单链负链RNA。这个家族最显著地包括流感病毒，它们在当前临床试验病毒载体空间中有代表。有两种独特的疫苗配方跨越两项试验，包含流感A病毒（图4a）的变种，特别是H1N1和H3N2，用于针对COVID-19的疫苗。流感病毒可以感染哺乳动物和鸟类，引起人类的轻度至重度呼吸道疾病，有四个亚型：A、B、C和D。亚型是基于蛋白质血凝素（H–H18）和神经氨酸酶（N1-N11），常见的亚型H1N1和H3N2是常见的在人类中传播的病毒。血凝素（HA）对病毒进入宿主至关重要，而神经氨酸酶（NA）有助于从感染细胞中释放新形成的病毒颗粒。正在评估的疫苗之一Corfluvec利用两种不同的减毒流感载体通过鼻内途径传递，重组H3N2载体用于初次免疫，基于2009年出现的H1N1病毒的重组H1N1pdm09载体用于增强（NCT05696067）。DelNS1-2019-nCoVRBD-OPT1也在临床评估中，用于针对COVID-19的保护；这种疫苗通过鼻内途径传递，利用流感A H1N1载体（A/California/4/2009, CA4）（NCT05200741）。虽然在两项试验中使用的载体都是弱化株，但预先存在的免疫原性对载体对疫苗的整体有效性和反应原性的影响尚不清楚，需要进一步阐明。 3.3.6.沙粒病毒科 沙粒病毒科由包膜单链病毒RNA组成。来自这个家族的皮钦德病毒（PICV）和淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒（LCMV）构成了两种独特的疫苗配方，与交替载体免疫策略结合，测试慢性乙型肝炎治疗疫苗（NCT05770895）。PICV是一种非致病性RNA病毒，源自Oryzomys albigularis，也称为米鼠。它在感染啮齿动物的地区的人类人群中显示出低血清流行率，这减轻了PICV载体疫苗中的预先存在的免疫。LCMV由双节段负链RNA组成，但与PICV不同，LCMV是一种致病性病毒，通过有毒啮齿动物引起多种神经系统疾病，如脑膜炎、脑炎和婴儿出生缺陷。为了安全，LCMVs经历了遗传突变，减弱了复制能力并减少了疫苗中的致病性。沙粒病毒科因其能够诱导强大和功能性的细胞毒性T细胞反应而在过去的免疫学研究中被利用；然而，这两种基因相关的载体在初次增强组合中的使用增强了这种反应并避免了载体中和抗体。 3.3.7.疱疹病毒科 疱疹病毒科由大型双链DNA基因组组成。人类巨细胞病毒（HCMV）是疱疹病毒科中唯一目前在临床试验中的病毒载体，用于针对HIV疫苗VIR-1388，由Vir Biotechnology开发（NCT05854381）。这种疫苗已经显示出使用弱化的CMV病毒含有HIV材料来产生针对慢性HIV感染的HIV特异性T细胞。HCMV在欧洲和美国的人群中显示出80%的流行率，在非洲和亚洲为100%。HCMV感染在健康个体中通常是无症状的，但可能对免疫系统受损的患者，包括婴儿和艾滋病患者，构成严重的健康风险。症状可能表现为CMV单核细胞增多症、发热、白细胞减少、肺炎和胃肠疾病；在艾滋病患者中，常常导致视网膜炎。然而，这种疫苗目前用于没有HIV的健康成年人，并且由于HCMV在大多数成年人中是无症状的，因此它是健康个体中作为病毒载体的良好候选物。此外，在对小鼠CMV（MCMV）的研究中，即使在血清阳性患者中，病毒也被证明可以诱导T细胞反应；虽然这种特性使其难以预防CMV，但可以作为载体使用。HCMV是一个特例，因为它产生高频率的病毒特异性CD4+ T细胞，具有一系列的细胞毒性和效应功能，以及在宿主一生中充当效应记忆细胞的CD8+ T细胞群体。这种现象被称为“记忆膨胀”，使其成为具有长期免疫潜力的有效病毒载体，特别是对于需要强大细胞反应的疾病，如HIV。在非人模型中，CMV载体疫苗还证明了能够被遗传改变并编程多样化的CD8+ T细胞，具有不同的表位目标。这允许CMV载体针对特定的CD8+ T细胞反应量身定制，以针对不同的疾病模型。 3.4.TLR激动剂 TLR是一种模式识别受体（PRR），是具有识别微生物的病原体相关分子模式（PAMPs）或受损组织的危险相关分子模式（DAMPs）的先天免疫受体。PRR最初由Charles Janeway在1989年提出，他假设它们作为先天和适应性免疫系统之间的联系。在这一预测之后，TLR4在1996年首次被发现，1998年发现LPS可以与该受体结合。从那时起，已经鉴定出具有独特先天免疫途径的其他TLR受体。TLR激动剂首次在2009年获得FDA许可的HPV疫苗中的AS04佐剂中使用。AS04含有TLR4激动剂MPL，也用于2017年许可使用的带状疱疹疫苗中的AS01b佐剂。在AS04和AS01b中，MPL被吸收到另一种免疫调节剂上，如铝或QS-21的脂质体配方。另外两种TLR激动剂（CpG 1018和CpG 7909）分别在2017年和2023年在临床许可疫苗中使用，每种都是未甲基化的CpG基序，作用于TLR9。 3.4.1.TLR3激动剂 TLR3激动剂是目前在临床中使用的一个小众材料群体，只有六种独特的疫苗配方在八项总试验中被评估（图5b）。在免疫细胞中，TLR3特别存在于髓样树突状细胞（mDCs）、巨噬细胞和肥大细胞上，主要定位在这些细胞的内质体中。配体结合后，TLR3与适配蛋白TRIF相关联，导致以I型干扰素（IFN）分泌增加为标志的抗病毒反应。TLR3在DCs上的激活非常重要，因为这启动了强大的IFN释放，并诱导了对适应性免疫重要的抗原特异性免疫反应。TLR3激活产生的强烈IFN反应和先天免疫级联反应，使这条途径对保护免受多种病毒如流感、RSV等的侵害变得重要。这种受体识别双链RNA（dsRNA），这是病毒复制的中间体，因此被临床中的TLR3激动剂所模仿。 图5 展示了临床中TLR激动剂的情况。(a) 根据TLR编号，包含TLR激动剂的临床试验数量。这由包含独特疫苗配方的试验数量和包含重复配方的试验数量共同定义。(b) 根据TLR激动剂类型以及进一步指定的激动剂，临床试验空间中包含TLR激动剂的独特疫苗配方的构成。提供了独特疫苗配方的数量以及相应的整体空间百分比。 在已识别的临床试验中，有三种TLR3激动剂每种都在两种独特的疫苗配方中被探索——Poly I:C、PIKA和dsRNA发夹——只有PIKA作为其配方中唯一的佐剂（图5b）。Polyinosinic:polycytidylic acid (Poly I:C)是一种合成的dsRNA类似物，是一种常见的TLR3激动剂，用于癌症和传染病应用。在临床中，Poly I:C目前用于三种试验中的两种不同的疫苗配方。它与QS-21和脂质分子结合，形成MA105，正在作为带状疱疹疫苗中的佐剂进行测试。此外，它与另外两个组分，宿主防御肽IDR-1002和阳离子聚合物佐剂聚磷氮烷（PCEP），结合形成TriAdj，正在研究用于新型COVID-19疫苗。另一种结合使用的TLR3激动剂是dsRNA发夹，它与Ad5病毒载体结合，用于Vaxart开发的口服诺如病毒（NCT05626803）和口服COVID-19（NCT05067933）疫苗。利用TLR3激动剂进行这种给药途径可以在肠道中产生更强大的先天免疫反应，因为TLR3可以在肠道上皮细胞中找到。在这个系统中，dsRNA发夹被纳入病毒载体，并与抗原编码在同一病毒载体上。在小鼠的流感模型评估中，dsRNA发夹在载体中的包含被证明可以增强对抗原的抗体反应。在已识别的试验中评估的最后一个TLR3激动剂是PIKA，这是一种由YS Biopharma开发的dsRNA稳定化学类似物，在用于狂犬病（NCT05667974）和COVID-19（NCT05463419）疫苗的两种配方中，PIKA与TLR3相互作用并启动与该受体相关的先天免疫途径。 3.4.2.TLR4激动剂TLR4激动剂是当前在活跃的临床试验中评估的最常见的TLR激动剂（图5a）。这可能是由于TLR4激动剂MPL在AS04和AS01B中的FDA批准历史。TLR4是一种跨膜蛋白，主要表达在髓样起源的免疫细胞上，包括单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞。它也存在于非免疫细胞上，如上皮细胞、神经元和中枢神经系统（CNS）细胞。TLR4最初是通过其能够感知LPS而被发现的，然而，它也能够结合由组织损伤产生的内源性分子，即DAMPs。重要的是，TLR4本身不能感知LPS。相反，TLR4必须与细胞表面的MD-2物理相关联才能对LPS做出反应，形成LPS/TLR4/MD-2复合物以启动细胞中的相应免疫途径。一旦启动，TLR4可以触发两个独立且竞争的途径：MyD88独立（TRIF依赖）和MyD88依赖途径。适配蛋白如MyD88与TLR4复合物的关联决定了随后的免疫反应。MyD88依赖的反应导致如IL-6和TNF-a等促炎细胞因子的释放，而MyD88独立的反应导致I型IFN释放。 如前所述，在许可疫苗佐剂部分，MPL是来自Salmonella minnesota R595的LPS的非毒性衍生物，包含多个单磷酸脂A（六酰基、五酰基、四酰基和三酰基）的同系物，并与铝盐和QS-21结合使用，以前许可的佐剂系统中针对TLR4途径。脂质A是LPS的保守分子模式，是LPS免疫反应的主要诱导剂，使其成为作为佐剂使用的关键焦点。临床级MPL由GSK独家生产，用于他们的佐剂系统，而其他“通用”形式的单磷酸脂A也在临床中使用，并被指定为MPLA。在本综述中，MPL和MPLA将被称为MPL。MPL已被证明可以激活MyD88依赖和TRIF依赖途径，但偏向于TRIF依赖途径，这有助于其与LPS相比的低毒性和其整体佐剂效果。由于其天然衍生，MPL具有一些固有的异质性和制造难题，促使产生了一种纯合成的六酰基脂质A衍生物，葡萄糖基脂质A（GLA）。MPL和其他天然衍生的内毒素可能具有不同数量的链、附着位点和链内的碳原子；而GLA作为合成替代品，具有明确定义的链附着数量和碳原子长度。GLA产生与MPL类似的反应，但与LPS相比具有较低的内毒素性，偏向于通过TRIF依赖途径发出信号，并在小鼠树突状细胞中具有相似的剂量和时间依赖性反应。然而，它在人类单核细胞衍生的树突状细胞上显示出更强的刺激能力。另一种合成MPL，3D-PHAD，也在当前的临床试验空间中普遍存在，存在于ALF佐剂家族中的ALFQ和ALF43中。尽管GLA是六酰基MPL的合成结构类似物，3D-PHAD是源自细菌LPS的3-脱酰基单磷酸脂A的纯五酰基合成类似物，在临床前分析中显示出与GLA的等效性。 GLA、3D-PHAD和MPL在当前临床试验空间中占有显著地位，其中GLA在约17%含有TLR激动剂的疫苗配方中最为常见，3D-PHAD约占12%，MPL约占10%。这些激动剂通常与其他佐剂或载体结合配方，只有一种疫苗配方仅评估TLR激动剂MPL。当与其他材料结合使用时，这些TLR4激动剂通常与氢氧化铝（AS04）、QS-21脂质体（AS01b、AS01e、ALFQ）配方，或者在GLA的情况下与角鲨烯乳液（GLA-SE）配方。MPL、GLA和3D-PHAD正在活跃的临床试验中评估，用于保护免受寄生虫和细菌感染，如血吸虫病和麻风病，以及病毒感染，如HIV和COVID-19。 尽管MPL、GLA和3D-PHAD在TLR4临床试验空间中占主导地位，但目前还有两种TLR4激动剂正在评估中。第二代脂质佐剂（SLA）由开发GLA的同一家公司AAHI开发，其设计基于TLR4/MD-2复合体的结构知识，而不是MPL。SLA旨在通过从GLA的酰链末端移除碳原子来更好地适应MD-2，这允许与TLR4/MD-2复合体进行更紧凑的相互作用。这种紧凑的结合导致与GLA相比TRIF途径偏向的转变，导致Th1趋化因子和细胞因子的增加。SLA与角鲨烯乳液配方，并在一项针对带状疱疹保护的临床试验中使用。在活跃的临床试验中评估的最后一个TLR4激动剂是EcML，它存在于一种疫苗配方中，跨越两项针对COVID-19的试验。EcML是由Eubiologics通过工程大肠杆菌（E.coli）菌株生产的纯化MPL。它已被证明在小鼠中产生与MPL类似的免疫效应，同时减少了商业可获得MPL的制造时间和成本。目前正在评估的EcML配方与QS-21脂质体结合。 3.4.3.TLR7激动剂 TLR7激动剂在临床试验空间中是最少的TLR激动剂（图5a）。TLR7是一种内质体跨膜蛋白，主要存在于浆细胞样树突状细胞（pDCs）和B细胞上。它也存在于其他非免疫细胞类型上，如角质形成细胞和上皮细胞，但水平较低。TLR7感应富含鸟苷和尿苷的单链RNA（ssRNA）、ssRNA病毒，以及合成抗病毒核苷类似物。当结合时，TLR7通过MyD88胞质适配蛋白发出信号，通过与其他下游蛋白的关联和激活，导致炎症体激活和促炎细胞因子的释放，以促进先天免疫反应。 图6 展示了使用TLR激动剂的独特疫苗配方与其配方组合材料的构成。提供了独特疫苗配方的数量以及相应的整体空间百分比。 Imiquimod是一种合成的咪唑喹啉胺，咪唑喹啉类药物是一类小于400 Da的合成核苷类似物，是迄今为止唯一被FDA批准用于细胞内TLR的激动剂。尽管它尚未作为传染病疫苗中的佐剂被用于许可的疫苗，但它目前被批准用于基底细胞癌或生殖器疣的局部治疗。Imiquimod已被证明可以结合TLR7并局部诱导多种促炎细胞因子，导致Th1偏向的免疫反应。目前在疫苗临床试验空间中，Imiquimod被用作流感和疟疾保护的局部佐剂，这两种抗原都被注入真皮空间。另一种TLR7激动剂正在临床试验中评估，之前在其他空间中未经批准。苯并萘骈吡啶-磷酸盐是一种TLR7激动剂，被吸收到铝上，产生完整的佐剂AS37，由诺华开发，后来被GSK收购。苯并萘骈吡啶类药物是通过体外筛选优化的一类新型TLR7激动剂，然后通过体内评估以产生具有低系统暴露、增加局部先天免疫反应和长期T细胞和抗体反应的顶级候选药物。产生的TLR7激动剂通过磷酸盐化学修饰，允许吸附到铝上，从而增强注射部位的保留，并加强随后的免疫反应。在临床试验空间中，AS37正在用于针对金黄色葡萄球菌和乙型肝炎的疫苗接种。 3.4.4.TLR7/8激动剂 TLR7/8激动剂具有独特的能力，能够结合TLR7和TLR8，以促进更强大的先天免疫反应。TLR8与TLR7类似，位于内质体膜上；然而，它在髓样树突状细胞和单核细胞上的表达更多，而不是像TLR7那样在pDCs上。TLR8通过MyD88途径发出信号，但在诱导的细胞因子谱上与TLR7不同。虽然TLR7主要与产生IFNα相关，但TLR8与产生其他促炎细胞因子如TNFα和IL-12相关。因此，激活这两个受体的能力有利于在对佐剂的反应中诱导更完整的细胞因子。 目前有两种TLR7/8激动剂正在活跃的临床试验中评估（图5b）：咪唑喹啉镓（IMDG）和3M-052。如前所述，咪唑喹啉类药物是一类能够与TLR7和TLR8特异性相互作用的核苷类似物。Ocugen开发的针对COVID-19保护的疫苗正在进行一项试验，该疫苗与吸附在铝上的IMDG一起使用。IMDG是一种二聚体咪唑喹啉分子，通过C2位置链接，具有拮抗TLR7和TLR8的独特能力，通过诱导强烈的I型干扰素反应，导致Th1免疫反应。3M开发的另一种TLR7/8激动剂3M-052在临床试验空间中有很强的流行性。这种激动剂出现在五项临床试验中，每项试验评估针对HIV和COVID-19的独特疫苗配方。在这五项试验中，3M-052都被吸附到铝上，其中一项试验还评估了未吸附的激动剂单独使用。3M-052是一种合成的咪唑喹啉酮，结构类似于resiquimod，但有一个18-C脂肪酸链，增强了分子的疏水性，因此减少了系统的扩散，并在免疫接种部位和引流淋巴结中提高了生物利用度。通过激活TLR7/8途径，3M-052诱导促炎细胞因子的释放，并增强Th1免疫反应。 3.4.5.TLR9激动剂 TLR9感应未甲基化的CpG二核苷酸，这是微生物DNA的特征。含有CpG基序的合成寡核苷酸（ODN）可以模仿这种感应并作为TLR9激动剂。TLR9是一种内质体膜受体，主要在pDCs和B细胞上表达，并在其他免疫细胞亚群上表达，通过MyD88途径发出信号，以启动I型干扰素的释放，从而改善对抗原的先天免疫反应。此外，TLR9激动剂有助于将适应性反应偏向Th1，并促进B细胞的增殖。有四种不同的CpG ODN类别，它们在人类细胞中的激活能力不同。B类ODN在临床试验中被最广泛研究，包括两种CpG佐剂，CpG 1018和CpG 7909，这些佐剂被用于许可的疫苗。这些ODN包含1至5个CpG基序，嵌入在磷酸硫代（PS）骨架中，可以触发pDCs分化并产生TNFα，同时仍然刺激B细胞增殖并分泌IgM。A类ODN包含一个CpG基序，被回文序列包围，导致形成茎环结构。虽然这些ODN同样触发pDC成熟和IFNα的释放，但由于它们定位在早期内质体上，它们不影响B细胞。 由于其在许可疫苗中的历史，TLR9激动剂在TLR激动剂的临床试验空间中占有强势地位，仅次于TLR4激动剂：共有30项试验和18种独特的疫苗配方。目前正在活跃的临床试验中评估六种TLR9激动剂，其中B类ODNs主导该空间，以及以前使用的TLR9激动剂CpG 1018在所有TLR9激动剂中最普遍。CpG 1018出现在10种独特的疫苗配方中，占19项针对COVID-19、流感、HIV和瘟疫的疫苗试验。除了一项试验（NCT05506969）外，CpG 1018都被吸附到氢氧化铝上。这种吸附已被证明可以增强对抗原的免疫反应。CpG 7909，另一种以前使用的B类ODN，是第二普遍的TLR9激动剂，用于四种独特的疫苗配方和五项总试验中；这种激动剂只在一半的配方中被吸附到氢氧化铝上，其余的独立交付。另外两种B类ODN也在评估中，CpG 10104和CpG55.2，都用于一种独特的疫苗配方中，分别针对钩虫（NCT03172975）和COVID-19（NCT05279456）。虽然CpG 10104正在测试吸附到氢氧化铝上，CpG55.2是与一种新型多糖佐剂Advax配方的，这是δ-菊粉颗粒。CpG 2216是一种A类ODN，正在评估结核病疫苗GamTBvac（NCT04975737）中。CpG 2216与一种阳离子衍生的右旋糖酐，右旋糖酐DEAE一起交付，以形成完整的佐剂系统。 3.4.6.组合材料 正如许多评估TLR激动剂的试验中所看到的，这些TLR激动剂并非总是单独交付；相反，只有15%的疫苗配方仅使用TLR激动剂和抗原。相反，这些激动剂通常与另一种佐剂材料结合使用，以增强其在注射部位的传递和持久性，以及由此产生的免疫反应。最常用的组合材料是氢氧化铝，占40%的疫苗配方正在评估中，其中TLR激动剂被吸附到铝颗粒的表面。脂质体是第二常用的组合材料，用于23%含有TLR激动剂的疫苗配方中。这些配方中几乎全都使用了QS-21的脂质体配方，如在许可疫苗中使用的佐剂系统AS01B。如前所述，QS-21是从南美树Quillaja saponaria Molina的树皮中提取的一种皂苷分子。QS-21是一种重要的免疫调节材料，促进促炎环境并增强对抗原的整体免疫反应。将QS-21与胆固醇结合在脂质体配方中是一个重要步骤；游离的QS-21具有毒性并导致细胞坏死。然而，当与胆固醇不可逆地结合时，它失去了毒性，同时保持了佐剂效果。虽然QS-21脂质体配方在化学组成和物理特性上有所不同，但使用的基础材料是一致的：磷脂、胆固醇、QS-21和TLR激动剂。在临床试验空间中最常见的脂质体配方是与TLR4激动剂、MPLA衍生物或合成类似物结合使用的，MA105是唯一含有TLR3激动剂Poly I:C的脂质体配方。AS01系统和ALFQ是临床试验空间中最普遍的脂质体佐剂。AS01使用中性的二油酰磷脂酰胆碱（DOPC），与磷脂的33.7摩尔百分比的胆固醇，而ALFQ使用两种磷脂，中性的二酰磷脂酰胆碱（DMPC）和阴离子的二酰磷脂酰甘油（DMPG），与55摩尔百分比的胆固醇。这些化学差异导致两种脂质体的大小差异，AS01产生均质的100纳米颗粒，ALFQ导致脂质体的大小从50到30,000纳米不等。在临床试验中评估的不含QS-21的脂质体，ALF43，是ALF家族的成员，保持与ALFQ相同的磷脂组成，并添加3D-PHAD，但由43摩尔百分比的胆固醇组成。与氢氧化铝不同，脂质体，特别是QS-21的脂质体配方，目前只在与TLR激动剂结合时出现在临床试验空间中。 角鲨烯乳液是与TLR激动剂结合的第三常见的材料，在已识别的临床试验中。这些与GLA和SLA结合的稳定乳液将在下一节中讨论。如前一节所讨论的Ad5载体也用于传递dsRNA发夹，它作为TLR3激动剂。这种组合出现在两项独特的疫苗配方和三项试验中，是临床试验空间中唯一的病毒载体和TLR激动剂的组合。临床试验空间中也有新颖的组合材料。TriAdj是一种独特的组合，由宿主防御肽IDR-1002、阳离子聚合物佐剂聚磷氮烷（PCEP）和TLR3激动剂Poly I:C组成。虽然IDR-1002尚未显示出增强免疫细胞释放促炎细胞因子的能力，但它已在体外显示出是强效的诱导剂，对人类外周血单核细胞产生中性粒细胞趋化因子CXCL1和CXCL8以及单核细胞趋化因子CCL2和CCL7。这将有助于通过白细胞募集在注射部位创造一个免疫能力环境。另一方面，PCEP单独与小鼠抗原一起交付时，促进了IFNy和IL-4的产生，导致强大的抗原特异性Th1和Th2反应。另一种新颖的组合材料，右旋糖酐DEAE，用于针对结核病的GamTBvac疫苗（NCT04975737）。右旋糖酐是一种天然多糖，是药物和抗原传递中最研究的α-葡聚糖之一；它已被证明可以增强细胞和体液反应，尽管确切机制尚不清楚。在GamTBvac中，阳离子右旋糖酐衍生物，右旋糖酐-DEAE，被CpG 2216（TLR9激动剂）包围，形成完整的佐剂系统，而抗原与右旋糖酐结合域融合，并在右旋糖酐上非共价固定。与右旋糖酐类似，右旋糖酐-DEAE的机制尚不清楚，但已显示出这种多组分佐剂允许抗原缓慢释放，刺激TLR9，并激活吞噬作用，所有这些都导致Th1免疫反应。最后一个新颖的组合材料也是一种天然多糖，菊粉，被配方成颗粒并与TLR9激动剂CpG55.2结合，用于针对COVID-19的佐剂系统（NCT05279456）。作为一种植物衍生的多糖，天然形式的菊粉没有免疫调节活性；然而，当结晶成颗粒形成δ-菊粉时，它具有强大的佐剂活性。δ-菊粉在40°C以上的温度下才溶解，这意味着它在体内保持稳定，可能增强其免疫学能力。重要的是，它还显示出启动人类补体系统，导致抗体反应，以及结合到单核细胞并增强它们的趋化因子产生。这些组合材料在佐剂系统中各自发挥作用，与TLR激动剂协同作用，并增强整体免疫反应。 3.5.乳液佐剂 乳液佐剂自2013年AS03在许可的H1N1疫苗中使用以来，一直在FDA许可的疫苗中使用，随后在2015年的流感疫苗中使用MF59。AS03和MF59都是基于角鲨烯的水包油乳液，AS03还包括(D,L)-α-生育酚（维生素E）以增加额外的免疫激活。在当前的临床试验景观中，大约9%的试验和大约8%正在评估的独特疫苗配方包含乳液佐剂。目前正在活跃的试验中评估12种独特的乳液佐剂，其中两种（AS03和MF59）已经用于许可的疫苗中。水包油（O/W）乳液是临床试验中最主要测试的乳液佐剂形式，也是许可疫苗空间中的形式，12种独特乳液佐剂中有11种是水包油乳液。另一种正在评估的乳液是油包水（W/O）乳液。这两种乳液之间的主要区别在于它们的连续相和分散相。O/W乳液具有水的连续相，油相分散其中，而W/O乳液则相反。在这两种类型的乳液中实现乳液的稳定性都很困难，但由于水滴的高流动性，W/O乳液的稳定性更低。此外，由于油的高浓度，W/O乳液的毒性和局部反应原性是一个更大的问题，导致在临床中评估的W/O乳液较少。 3.5.1.油包水乳液 Montanide ISA-51是目前唯一在临床试验中测试的W/O乳液，与肽配方结合，用于针对COVID-19的保护。这种乳液由矿物油和来自曼尼德单油酸酯家族的表面活性剂组成。W/O佐剂将留在注射部位并创建一个库，以缓慢释放抗原，这有助于整体免疫反应。此外，这种W/O库诱导炎症，并导致免疫细胞的募集以摄取抗原。虽然这些佐剂在增强对抗原的免疫反应方面非常有效，但它们可能带来严重的局部和系统性不良反应，这也是过去相关临床试验终止的原因。特别是，当以前在HIV疫苗中评估时，Montanide ISA-51的注射随后是注射部位的局部肿胀以及头痛、恶心和发烧等系统性反应。最令人关注的是，在多名患者中注射部位形成了无菌脓肿，这被认为是由佐剂诱导的炎症引起的。佐剂可以长时间留在注射部位，免疫细胞清除疫苗需要数月时间。由于这一点，以及油中产品持续激活TLRs引发的炎症级联反应，这种佐剂可能导致严重的炎症反应，对患者产生负面影响。 3.5.2.水包油乳液 对于O/W乳液，角鲨烯是临床试验中这些佐剂中使用的主要材料。事实上，在活跃试验中的11种独特的O/W乳液中，除了一种之外，都包含角鲨烯在它们的配方中。角鲨烯是一种从植物和鲨鱼肝油等几个关键来源天然衍生的三萜。在许多配方中，角鲨烯被用来稳定配方，促进抗原的溶解，并改变抗原的释放。它也是一种生物相容材料，与许多W/O乳液中使用的矿物油相比，它表现出较少的持续毒性。然而，过度捕捞减少了鲨鱼的数量并增强了对它们的保护，未来几年需要更可持续的资源。 MF59类似物 许可的角鲨烯乳液佐剂MF59目前正在七项临床试验中评估流感和COVID-19疫苗。当前临床试验空间中使用与MF59相同成分的另外三种佐剂（表2），其中SCT-VA02B在三项针对COVID-19的独特疫苗配方中使用相同的配方。SWE用略微改变的组成配方乳液，因此可以自由进行技术转让，以装备发展中国家的疫苗制造商；其组成有角鲨烯占3.9%，两种表面活性剂均为0.47%，目前正在评估COVID-19疫苗。SQBA佐剂呈现出与SWE类似的配方，也正在评估COVID-19疫苗。尽管配方有轻微变化，但这些角鲨烯乳液利用相同的免疫激活和反应有效地发挥作用作为佐剂。它们通过肌肉细胞释放ATP和细胞因子诱导，导致炎症细胞涌入注射部位，摄取抗原并将其带到引流淋巴结进行处理，从而在注射部位创造短暂和局部的免疫能力环境。MF59还显示出在淋巴结诱导RIPK3依赖性坏死凋亡，随后是凋亡，这与其诱导CD8+ T细胞反应和抗体反应的能力有关。已经研究了MF59中每个单独组分在加强免疫反应中的影响。单独的组分并不像整个配方那样有效。事实上，角鲨烯、Tween 80和柠檬酸缓冲液单独交付时没有免疫刺激性效果。Span 85在肌肉中确实有刺激性效果，但没有导致抗体或T细胞的产生，而MF59配方实现了这一点。 AS03类似物 AS03是另一种基于角鲨烯的乳液，通过包含DL-α-生育酚和去除Span 85，所有这些都在PBS缓冲液中配方，略有不同的组成。目前正在临床评估的两种其他佐剂包含AS03的不同变体（表2），其中BFA03代表相同组分的类似配方，以及用较少DL-α-生育酚（10 mg/ml）和饱和衍生物角鲨烷（30 mg/ml）配方的角鲨烷基乳液。AS03目前正在11项试验中的五项独特疫苗配方中评估，用于针对COVID-19和乙型肝炎的保护，BFA03（NCT05398848）和角鲨烷基乳液（NCT05726084）每种都用于针对COVID-19的保护。添加DL-α-生育酚（合成形式的维生素E）区分了这些配方及其产生的免疫反应，与MF59类似。与角鲨烯类似，DL-α-生育酚是一种可生物降解的聚异戊二烯。与不包含DL-α-生育酚的AS03配方相比，其中使用了等量的角鲨烯作为替代品，不含DL-α-生育酚的配方在肌肉中细胞因子释放的增加更早，与完整的配方相比，后者在注射后24小时调节了更多的促炎细胞因子。此外，当从配方中省略DL-α-生育酚时，观察到引流淋巴结中粒细胞浸润和单核细胞抗原装载的减少。这些配方依赖的先天免疫反应的变化导致在没有DL-α-生育酚的情况下接种疫苗时抗体反应减少了3.5至6倍。总的来说，AS03及其目前在临床中的类似物受益于DL-α-生育酚的添加。与MF59直接比较针对H5N1株的保护时，两种佐剂都能诱导广泛的同源和异源亚型抗体反应；然而，AS03实现了比MF59更高的抗体滴度和广度，突出了DL-α-生育酚在配方中的潜在益处。 GLA-SE 和 SLA-SE GLA-SE 和 SLA-SE 都使用了相同的角鲨烯乳液，称为稳定乳液（SE），它允许分别吸收 TLR 激动剂 GLA 和 SLA。这些乳液由 AAHI 开发，该公司也开发了 TLR 激动剂。这些乳液最初是首先基于配方的稳定性，其次是基于由此产生的适应性免疫反应而设计的。所得到的乳液由磷酸铵缓冲液中的水相与表面活性剂poloxamer 188（0.9 mg/ml）和甘油（22.5 mg/ml）混合乳化，以及包含DMPC（19 mg/ml）和 GLA 或 SLA（0.25 mg/ml）的10%油相在角鲨烯油中。这种75-90 nm大小的颗粒被发现在小鼠中诱导依赖于配方的免疫反应。具体来说，在评估 GLA-SE、单独的 SE 和水溶液配方中的 GLA（GLA-AF）时，与其它配方相比，GLA-SE 显示出产生强大的抗原特异性 Th1 反应，增加抗原特异性 Th1 CD4 细胞和抗体同种型转换到 IgG2c 亚类。这种对先天和适应性反应的增强主要归因于 GLA-SE 启动 IFNy 产生和激活炎症体——一种病原体识别途径——的能力，与单独的 SE 或 GLA-AF 相比。在当前的临床试验空间中，SLA-SE 正在一项针对带状疱疹保护的试验中使用，而 GLA-SE 与 MF59 一样在该领域中占据主导地位，出现在九项试验中的七种独特的疫苗配方中，使其成为在活跃的临床试验中研究最多的乳液配方，尚未在 FDA 许可的疫苗中使用。 LiteVax LiteVax 是一种新型角鲨烯乳液配方，与 MF59 和 AS03 保持相似，其中角鲨烯是主要成分，浓度为 80 mg/ml，表面活性剂 Tween 80 为 40 mg/ml。目前，LiteVax 正在作为已许可的季节性流感疫苗的佐剂在临床中使用。LiteVax 与 AS03 和 MF59 不同之处在于引入了另一种免疫调节成分，麦芽糖 40-单硫酸酯 1,2,3,6,20,30,60-十七烷酸酯（CMS），浓度为 40 mg/ml，与其他成分在 PBS 中配方。CMS 是碳水化合物脂肪酸硫酸酯（CFASE）的单硫酸盐衍生物。CFASE 佐剂之前在癌症疫苗和如流感等传染病的佐剂中进行了探索；然而，其毒性和副作用，如局部反应原性和体温升高，导致探索 CFASE 的改良。CMS 比 CFASE 反应原性低，同时保持免疫学益处，并且在针对流感的疫苗接种中能够产生比 MF59 类似物高 10-20 倍的抗体滴度。尽管完整的 LiteVax 配方被发现在体外轻微调节树突状细胞激活，但单独的 CMS 被发现在上调成熟共刺激标志物方面比完整配方更有效。这表明 CMS 对 LiteVax 的免疫调节活性的重要性，以及 CMS 增强乳液佐剂免疫反应的潜力。 Ne01（20% 纳米乳液） Ne01 是活跃的临床研究中唯一不包含角鲨烯的 O/W 乳液配方。它专门设计为粘膜佐剂，目前正在评估作为鼻内 H5N1 疫苗。这种乳液（400 nm 大小）最初在密歇根大学发明，现在由 BlueWillow Biologics 开发。它通过在水中乳化十六烷基氯化吡啶（CPC, 1%）、Tween 80（5%）和乙醇（8%），与大豆油（64%）混合制造，并且在室温下与抗原结合保持稳定和免疫原性长达 6 个月，在 40°C 下保持 3 个月。这种佐剂已经在雪貂中显示出产生强烈的细胞和体液反应，并有效地保护它们免受 H5N1 的致命挑战。虽然这种佐剂的确切机制仍在阐明中，但它已经显示出通过产生 IL-6 和 IL-17 产生 Th17 反应，也通过产生 IFNy 产生 Th1 反应。此外，已经显示 Ne01 导致抗原摄取和随后的上皮细胞凋亡，然后被树突状细胞吞噬，导致抗原摄取和 APC 成熟的间接途径。 3.6.以前许可的减毒活疫苗 减毒活疫苗由于使用活体、减毒的病毒，具有固有的佐剂特性。在针对疟疾保护的临床试验中，卡介苗（BCG）——减毒结核病（TB）疫苗——和黄热病疫苗YF-17D（也称为Stamaril）被皮内注射，与抗原一起用作佐剂。卡介苗由Calmette和Guerin开发，自1921年首次用于人类以来，至今仍是唯一许可的TB疫苗。它由导致牛结核病的分枝杆菌的减毒株组成，已被证明除了结核病外，还能对其他分枝杆菌感染如麻风病和Buruli溃疡提供保护。卡介苗在注射部位广泛诱导促炎反应，导致免疫细胞浸润和IFNy释放增加。卡介苗表达的各种蛋白质作为TLR激动剂，可以刺激免疫细胞。最终，这些先天反应导致强烈的体液和细胞适应性免疫反应。 黄热病疫苗Stamaril或YF-17D由Sanofi开发，于1987年获得WHO预认证，但在美国仍被视为研究性产品，未获得许可。它使用黄热病病毒的减毒17D-204株；重要的是，黄热病病毒疫苗的17D系列被认为是迄今为止生产最有效和最安全的减毒活疫苗之一。该疫苗通过多种TLR激动剂激活几种树突状细胞亚群，导致促炎细胞因子的产生，并导致强大的体液和细胞适应性免疫反应。 4.结论 佐剂是疫苗的重要组成部分，不仅可以增强整体免疫反应，还可以增强疫苗稳定性。当用于针对传染病的疫苗时，应用能够使疫苗在没有有效冷藏的情况下运输到各个地区的材料，或通过减少所需疫苗剂量和/或频率来降低疫苗成本，这一点至关重要。然而，尽管佐剂有潜力改善疫苗接种，但在铝盐获得批准后的近80年里，第二个获得FDA批准的佐剂才出现。尽管自2010年代以来，许可疫苗中使用了更多的佐剂，但铝盐继续主导佐剂领域，并且仍然是临床试验空间中最常用的佐剂。然而，就像单一抗原不能期望对所有病原体提供保护一样，单一佐剂也不能。正如在COVID-19大流行期间所经历的那样，新的或复杂的病毒和病原体需要在佐剂空间以及抗原方面的设计意图。这种完整的疫苗设计对于引发广泛和长期的保护至关重要。虽然超过一半针对传染病疫苗的活跃临床试验没有使用佐剂或使用了以前许可疫苗中的佐剂，但36%的试验正在研究尚未在许可疫苗空间中使用的新型佐剂。这些佐剂基于各种材料，如纳米颗粒、病毒载体、TLR激动剂和乳液，单独使用或与其他免疫调节材料结合使用。 展望未来，应评估更多材料作为疫苗接种中的佐剂，并应对多种抗原和疾病评估其免疫调节效果。在临床试验空间中，佐剂创新和探索方面存在明显差距。我们不能继续依赖我们已经拥有的材料来满足即将到来的大流行病的需求，也不能期望一个免疫原性差的抗原能引发足够强烈的免疫反应。通过对免疫调节化合物的更强大的物质理解，我们可以准备制定涉及合理设计的抗原以及佐剂的有效疫苗。佐剂的安全性在为公众接种疫苗时也极为重要，可能是许多在临床试验中评估的疫苗不使用佐剂或涉及以前许可疫苗中的佐剂的主要原因，这些疫苗具有经过验证的安全性。然而，通过有意识地设计安全性和免疫原性兼顾的佐剂，我们最终可以制定出更有效的疫苗，而不会牺牲患者的安全性。虽然疫苗一直是公共卫生的一部分，但佐剂领域相对处于起步阶段，看到未来我们将欢迎哪些新材料进入该领域将是令人兴奋的。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

摘要：植物作为生产药物蛋白的平台已经被探索了20多年。生产成本效益高、易于扩大到生产能力、无需冷链要求以及能够生产与哺乳动物同类产品在生物学和功能上完全相同的复杂治疗蛋白等重要特性，使植物成为疫苗生产的强有力替代品。这篇综述文章集中讨论了植物制造疫苗的表达以及下游纯化过程。概述了包括转基因、瞬时和悬浮细胞培养在内的表达策略，并描述了针对如叶片和种子等不同植物组织的目标。审查了用于植物制造疫苗下游处理的主要组成部分。综述以对植物生产平台对未来疫苗生产的潜在益处的反思结束。 1.引言 传染病是全球人类死亡的主要原因。最近的COVID-19大流行生动地展示了全球对新型病毒疾病的准备不足。除了新出现的疾病外，许多众所周知的传染病毒，例如严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）和流感，不断经历基因变化，从而引发频繁的爆发，与严重的疾病和死亡有关。SARS-CoV-2的迅速和广泛传播导致了前所未有的全球危机，导致数百万人死亡。因此，迫切需要以成本效益高和快速的生物制造方式大规模生产重组疫苗抗原，以应对众多传染病。分子农业，也称为生物制药，是一种尖端技术，利用植物的细胞、器官或组织作为生物工厂，生产有价值的生物制药和其他高价值蛋白，包括疫苗抗原。这项技术为使用原核和真核宿主的传统蛋白质生产方法提供了一个有希望的替代方案，例如酿酒酵母、中国仓鼠卵巢（CHO）细胞、大肠杆菌（E. coli）、人类胚胎肾（HEK）细胞、毕赤酵母，以及昆虫系统，如草地贪夜蛾（Sf9）。这些生产宿主因其明确的监管途径、更高的表达能力和生产便利性而被广泛接受用于大规模生产；然而，每个生产平台都有其自身的优缺点。植物是多样化和复杂蛋白质的生物工厂，并提供了几个优势。植物由于其能够大规模种植，允许可扩展且成本效益高的生产。植物细胞具有显著的转录后蛋白质处理能力，以制造定制的糖链结构（翻译后修饰）和正确的折叠，为生产具有特定糖基化模式的重组蛋白提供了优势。例如，与CHO细胞相比，植物提供了成本效益高且高度可扩展的生产能力。另一方面，瞬时表达系统允许快速可扩展性，超越了传统的发酵罐基础平台。此外，在安全性方面，植物携带人类或动物病原体的风险较低，使它们成为蛋白质生产的有利选择。因此，将植物作为重组疫苗的生产宿主具有巨大的潜力，并继续是生物技术领域积极研究和发展的领域。选择表达宿主涉及考虑宿主属性的混合，包括食品或饲料作物、遗传操作的便利性、特定内源代谢途径的存在、表达能力和知识产权限制。此外，产品特性，如预期用途、结构复杂性和所需的纯化水平，也是选择生产宿主的关键因素。 疫苗在预防和控制传染病方面发挥着至关重要的作用，其可用性和可及性对全球公共卫生至关重要。然而，传统疫苗生产过程通常面临可扩展性、成本效益和冷链存储要求方面的挑战。基于植物的系统为疫苗生产提供了几个优势。此外，植物可以被设计生产复杂和多组分的疫苗，允许生产组合疫苗或针对病原体多种菌株的疫苗。使用植物系统生产疫苗还提供了物流优势。与传统疫苗不同，基于植物的疫苗在更高温度下稳定，不需要冷链存储和分发，使它们特别适合资源有限地区或基础设施不足的地区。近几十年来，在植物基础平台上生产疫苗方面取得了显著进展。包括烟草、玉米、土豆和其他在内的各种植物种类已成功设计生产针对病毒、细菌和寄生虫疾病的广泛疫苗。这些植物生产的疫苗在临床前和临床研究中显示出有希望的结果，证明了安全性、有效性以及诱导强烈免疫反应的能力。在这种情况下，我们提供了分子农业领域内植物系统疫苗生产的当前状态的概述。它讨论了使用植物作为生物工厂生产疫苗的进步、挑战和前景，强调了这种创新方法的潜力，以彻底改变疫苗制造格局并改善全球获取救命免疫的途径。重要的是，在植物中表达重组蛋白/疫苗的不足之处被强调，综述以独特的视角和洞察力结束，探讨了使用最先进的基因组编辑技术来规避基于植物的表达系统的缺陷。 2.疫苗表达策略 2.1.转基因植物用于可食用疫苗 转基因植物作为生产可食用疫苗的潜在平台正在被探索。可食用种子或营养组织可以被设计生产重组疫苗，这些疫苗可以通过口服途径进行管理，从而最小化痛苦的注射针头，并不需要冷链要求，能够在疫苗分发期间实现快速和有效的全球规模部署。口服途径可以彻底改变当前的疫苗输送方法。在植物细胞中生产疫苗抗原具有巨大的潜力，可以消除成本高昂且复杂的发酵，简化其运输和分发，消除无菌注射，并在室温下延长保质期数年。有几个植物种类已经表达了重组疫苗以实现口服输送，如土豆、水稻、香蕉、番茄、生菜、烟草、紫花苜蓿、小麦、菠菜和胡萝卜。 植物制造的疫苗被细胞壁和细胞器生物封装，使疫苗蛋白能够抵抗降解并通过消化系统，以便它们可以被免疫监视系统识别。由于其巨大的粘膜表面积，人类肠道为口服植物衍生疫苗提供了最佳入口点。肠道相关淋巴组织（GALT），构成人体最大的免疫系统组织（超过70%），是一个关键的调节性T细胞（Tregs）的水库，并拥有约300平方米的广泛表面积。植物制造的疫苗抗原的独特优势在于它们被生物封装到植物细胞壁中；这使它们能够承受肠道腔内的酶促和酸性条件。由于人类消化酶无法分解细胞壁中存在的碳水化合物的糖苷键，植物制造的疫苗抗原能够成功通过消化道。存在于厌氧纤维素分解细菌中的纤维素体，作为一个细胞外酶复合物，包含结合、结构和催化域，使直接与植物细胞壁相互作用和糖苷键的裂解成为可能。一旦疫苗到达肠道粘膜层，居民细菌帮助分解植物细胞壁，从而促进疫苗抗原的释放。脆弱拟杆菌通过降解粘蛋白糖蛋白帮助穿透粘液层。进入肠道上皮细胞并将疫苗抗原呈现给免疫系统至关重要，这是通过附着在疫苗上的不同标签（受体结合蛋白）实现的，如CTB。 2.2.瞬时表达系统 植物瞬时表达系统因其快速高效生产、易于扩大规模、低成本、易于纯化，以及最重要的是一些植物已有的成熟协议而被作为首选表达系统使用。瞬时系统在生产高价值和复杂蛋白的能力和可靠性方面已成功展示。本氏烟（Nicotiana benthamiana）是研究和商业目的的主要生产宿主，它具有在DNA构建物传递后几天内制造蛋白的潜力，因此被多家公司用于商业生物制造，如激素、抗体、酶、治疗剂和疫苗等（Medicago Inc.、Forte Protein Inc.、Kentucky BioProcessing 和 Icon Genetics）。实现尽可能高的产量是表达高价值蛋白的首要问题，因为当蛋白从更稀释的混合物中提取时，下游处理成本会显著增加。转基因植物开发可能是一个耗时的项目，通常需要大约2-3年才能获得宿主植物的纯合系。相比之下，瞬时表达能够迅速生产大量重组蛋白。例如，Medicago Inc.，一家利用植物基础瞬时表达系统的公司，可以在收到序列后仅三周内生产出流感疫苗的纯化最终产品。最近，Medicago Inc.展示了使用瞬时系统生产针对SARS-CoV-2和流感疫苗的能力。数据显示在人类临床试验中具有一致的免疫原性。在最近的COVID-19大流行期间，几个研究小组使用不同的宿主系统生产了RBD作为疫苗抗原。例如，SARS-CoV-2刺突蛋白的受体结合域（RBD）在动物模型以及非人灵长类动物中诱导了体液免疫，使用本氏烟作为生产宿主。 瞬时表达系统通常可以在每公斤鲜重生物量中产生克级的重组蛋白，并且随着创新的进一步发展，产量还有提高的潜力。几种重组蛋白，即疫苗、生长因子、治疗剂、激素和抗体已使用瞬时表达系统生产。除了在竞争系统上具有几个优势外，瞬时表达系统还需要进一步创新，包括新的载体、表达策略、澄清，特别是下游处理，以实现大规模生产的目标，以更低的成本使替代蛋白更加负担得起和可获得。 2.3.植物悬浮培养系统 体外培养的植物细胞，也称为植物细胞悬浮培养，已被证明是替代蛋白生物生产平台的极有前景的选择。悬浮培养可能包括转基因植物、毛状根、原生质体或细胞培养，结合了整株植物培养系统的优势和微生物及哺乳动物细胞培养的好处，使它们成为生产治疗蛋白的高度有前途和多功能的选择。可扩展性、安全性、蛋白质折叠、翻译后修饰、生产成本、稳定性和灵活性是使用植物细胞悬浮培养的关键考虑点。与其他真核系统（如CHO或HEK细胞）不同，植物培养物可以在简单且廉价的生长介质中生长，易于快速扩大生产规模；这两个特点降低了生产总成本。高价值重组蛋白可以通过添加信号肽来分泌，以简化下游处理。来自不同来源的N端信号肽可以将重组蛋白输送到内质网（ER）腔。运输以信号识别颗粒（SRP）依赖的方式发生，由SRP受体促进。随后，在ER中，信号肽从前体蛋白中被切除，然后蛋白质被包裹成小囊泡，这些囊泡向高尔基体膨胀并最终释放到细胞外隔室。将重组蛋白靶向到ER和高尔基体有助于重组蛋白的正确折叠，这是其功能所必需的。分泌蛋白在内质网（ER）和高尔基体中经历额外的修饰，包括N-糖基化。在过去的几十年中，已经表达了几种重组蛋白并验证了它们的功能性。最重要的是，第一个获得FDA批准的植物制造的重组蛋白taliglucerase alfa是在胡萝卜悬浮培养中表达的。植物细胞悬浮培养已被用作疫苗生产的宿主。最近，烟草细胞（BY-2）和蒺藜苜蓿A17细胞中报告了RBD和刺突蛋白的生产。考虑到植物悬浮培养的优势，通过体内外分析已成功表达并验证了多种疫苗抗原的功能性。已经开发了使用胡萝卜、大豆、烟草、水稻、蒺藜苜蓿和土豆的细胞技术，并生产了针对多种疾病的疫苗。然而，未来研究和发展（R&D）在优化培养环境方面有很大的潜力，目的是提高生产水平和蛋白质回收效率。生物反应器的主要好处是受控的生长环境具有完全的封闭性，蛋白质质量、产量和均质性的一致性，以及从基因到蛋白质的快速生产速度在短短的时间内4-5周内。尽管如此，由于类似于哺乳动物细胞培养的扩大限制，生物反应器并不受欢迎，如相对较低的浓度、分泌蛋白产品的不稳定性以及与温室或露天种植相比更高的资本支出。从下游处理的角度来看，分泌蛋白产品的主要优点包括更简单、低成本的纯化，以及分泌效率可能受到蛋白质疏水性、大小和/或电荷的限制。对于非分泌型重组蛋白，植物细胞匀浆与叶状植物遇到相同的复杂性。因此，它们可能不像其他蛋白质表达系统那样经济上吸引人，因为与分泌蛋白相比，生产细胞内蛋白质的潜在节省可能会被抵消。 2.4.植物中疫苗及相关重组蛋白的表达 生物技术表达治疗蛋白需要有效的表达和纯化方案，以便以原生构象生成重组蛋白。植物中稳定或瞬时表达此类重组治疗或疫苗蛋白是实现规模扩大和降低生产成本潜力的有力工具。第一个概念验证是在植物中表达乙型肝炎表面抗原（HBsAg），此后，已成功生成几种亚单位疫苗和病毒样颗粒。最近，Medicago采用了这种方法来生成COVID-19疫苗和季节性流感疫苗，这些疫苗现在已经幸运地完成了临床试验。 使用植物生物合成重组药物蛋白的瞬时表达系统与其他系统相比具有优势。瞬时表达比任何其他发酵平台更快地扩大规模。此外，诸如源自完整或拆解植物病毒的瞬时表达载体促进了重组生物药物的高水平表达。然而，要将植物开发为重组治疗剂的表达载体，必须克服两个主要挑战：表达水平不足和不可扩展/低效的纯化方法。 2.5.基于种子的表达系统 种子已成功用于表达几种重组蛋白，如疫苗抗原、治疗剂、抗体、激素、工业酶和细胞培养蛋白。美国农业部已批准田间释放转基因植物种子，表达如乳铁蛋白、血清白蛋白和人溶菌酶的蛋白质，以及红花中的载脂蛋白和玉米中的巴西蛋白和乙型肝炎表面抗原（http://www.isb.vt.edu/searchreleasedata.aspx）。与哺乳动物细胞培养、转基因动物和小发酵微生物作为宿主平台相比，种子作物提供了几个优势，因为它们有关种植、收获、加工和储存的广泛知识基础。 Shi等人，2023年报告了在小麦种子组织中稳定表达编码Mycoplasma gallisepticum（MG）氨基酸序列的TM-1基因，被认为是针对影响鸡的慢性呼吸道疾病（CRD）的疫苗抗原候选物。在这项研究中，重组41.8 kDa蛋白在胚乳组织中普遍表达，并达到了1.03 mg/g干重的表达水平。在鸡口服给药后，这种植物制造的可食用疫苗在没有可识别的体重减轻的情况下有效诱导了抗体反应。口服给药的TM-1疫苗候选物的两剂触发了免疫反应，并在与商业生产的CRD灭活疫苗相当水平上对MG的挑战提供了保护。这项研究证明了植物制造的可食用疫苗是安全、可扩展、在室温下稳定且成本效益高的。 Shahid等人，2020年报告了一项研究，其中新城疫病毒（NDV）的保护性抗原，血凝素-神经氨酸酶（HN）和融合（F）蛋白分别使用组成性种子特异性Zein启动子和35S启动子在转基因玉米中表达。在这种情况下，观察到F基因mRNA在叶片中的表达几乎是2-7.1倍，而HN基因mRNA在种子中的表达约为8-28倍。对于F蛋白，观察到1.66 µg/ml，占叶片总可溶性蛋白的0.5%，而对于HN蛋白，发现2.4µg/ml，占总种子蛋白的0.8%。当小鸡口服转基因玉米的种子和叶片时，产生了针对两种NDV抗原的免疫反应。 通过农杆菌渗透生成了表达新城疫（ND）病毒F蛋白的稳定转基因水稻种子。当这种疫苗接种到无特定病原体的鸡时，显著触发了对异源和同源ND病毒株的中和抗体反应。两剂4.5 µg抗原完全保护鸡免受致死剂量NDV的挑战。此外，F蛋白免疫的鸡在挑战后15天内展示了更高的平均体重增加，与传统的全病毒疫苗免疫的鸡相比，从而产生了更高的成本效益。这项研究强调了植物基础疫苗作为NDV根除平台的成功。 在营养保健品、工业酶和口服疫苗的情况下，通过使用种子作物，最小化了加工和纯化的要求。与叶作物相比，种子作物每单位表面积的生物量产量较低。然而，如果作物在露天田地种植，蛋白质的稳定性和规模经济远远超过了与低生物量产量相关的劣势。 2.6.基于叶片和果实的表达平台 烟草和紫花苜蓿等叶菜作物由于其高生物量产量、每年可能有几个生长周期的可能性，以及与其种子对应物相似的农业基础设施，具有高度优势；然而，它们通过防止开花来降低花粉传播的风险。烟草是商业表达重组蛋白的领先叶基平台，自从表达单克隆抗体的烟草出现以来。此外，在叶片用于瞬时表达疫苗、单克隆抗体和其他治疗剂方面取得了重要进展，使用烟草（Nicotiana benthamiana）作为表达系统。瞬时表达规避了与转基因植物相关的监管问题，目前是低容量蛋白合成的重组蛋白表达的首选方法。使用叶组织进行瞬时表达对于在温室中生长的烟草具有独特优势，特别是在需要快速表达大流行疫苗的情况下。与从种子中提取相比，基于叶片的蛋白提取的简单性有时被视为一种优势，因为从种子中提取可能需要额外的操作，例如浸泡和研磨。 生菜和番茄是首选的蔬菜系统，可以生吃。生菜（Lactuca sativa）品种已被用于生产针对猪瘟、I期肝炎和大肠杆菌的可食用疫苗。同样，胡萝卜（Daucus carota）已被用于获得针对幽门螺杆菌和大肠杆菌的可食用疫苗。香蕉（Musa acuminata）已成为提高乙型肝炎疫苗的首选植物。香蕉生吃，广泛种植在发展中国家，香蕉的主要优势是在果实中表达足够的抗原蛋白水平。然而，叶组织涉及主要缺点，如高水分含量、收获的叶生物量存储不稳定，导致重组蛋白的稳定性问题，以及难以分离下游和上游处理。因此，叶表达的明显优势被表达蛋白在组织中的不稳定性（及其提取物）抵消了，这些组织是代谢活跃的。此外，叶提取物含有酚类物质、叶绿素衍生的色素和固有的蛋白水解活性，这些物质干扰了下游处理，导致繁重的多阶段纯化过程，影响了纯化蛋白的数量和质量。此外，尽管与叶菜和种子作物的生产相关的成本低于露天田地，但基于植物的制药生物合成已经转向在生物反应器和温室等封闭环境中表达。 2.7.植物制造的重组蛋白的下游处理 植物制造的疫苗利用植物作为生物反应器来生产疫苗抗原。这种创新方法相比传统疫苗生产方法提供了若干优势，例如更低的生产成本、可扩展性，以及对冷链存储的依赖性降低。蛋白纯化作为生物工业领域的一项基本下游技术，依赖于确定有效的纯化方法和建立连续的最优策略，以改进纯化步骤。目标是使用尽可能少的步骤获得期望的浓度、纯度和产量的目标蛋白。这个过程对于后续的研究工作至关重要，为研究人员提供高质量的蛋白，这些蛋白适合于多种应用。 此外，植物制造的疫苗的纯化策略对于确保创新疫苗的安全性、有效性和遵守监管规定至关重要。下游处理过程涉及一系列步骤（见图1、2）。每个步骤都应仔细设计，以去除杂质，实现高产品纯度，并保持目标抗原的完整性。在纯化之前，通过生物信息学分析软件收集有关目标蛋白的基本信息是有益的。这些分析提供了包括：等电点（pI）、半胱氨酸含量、蛋白稳定性、蛋白溶解度、分子量（MW）、二级结构、对氧化和高盐离子或pH敏感性的易感性等在内的各种属性的见解。选择适当的标签以便于在载体构建期间过度表达和纯化也很重要。应考虑细胞破裂方法及其对蛋白变性和结构变化的潜在影响。应综合评估这些因素，以确保最佳纯化结果。 图 1 植物系统中重组蛋白的生产过程、下游加工和应用。 植物衍生蛋白的纯化方法主要涉及利用所需蛋白的独特物理和化学特性。这些特性包括特定氨基酸序列及其组成、电荷分布、极性以及多肽链的亲水性或疏水性，以及蛋白表面存在的氨基酸残基的整体形状和排列。通过仔细考虑和理解这些特性，可以制定有效的纯化策略，以在植物系统中分离和纯化所需的蛋白。 选择合适的纯化方法是至关重要的，不仅应仔细考虑目标蛋白的特性，还应考虑杂质。以下是在选择合理时需要考虑的一些因素： 1.在考虑基于植物的蛋白的纯化系统时，了解特定于植物的杂质概况非常重要。在植物蛋白纯化过程中可能遇到的一些常见杂质包括植物细胞碎片、可溶性蛋白、色素和酚类化合物、脂质和蜡质、糖类和多糖以及核酸。这些化合物可能导致样品变色、样品浑浊，并影响蛋白的稳定性和纯度。了解特定于植物系统的杂质概况允许选择适当的纯化策略和优化纯化条件，以有效分离目标蛋白和不需要的成分。 2.澄清，作为纯化基于植物的疫苗的初始步骤，是上游和下游过程之间的重要环节。它对确定最终产品的产量、一致性和可重复性有至关重要的影响。一个执行良好的澄清过程应该产生一个低浑浊度的溶液，同时最大限度地减少对产品回收率的影响。它的设计目的是消除过程和产品相关的杂质。澄清过程应该针对去除与过程或产品相关的较大颗粒、不溶性和可溶性杂质，包括大聚集体。在植物基础疫苗的纯化中，有几种常用的澄清技术。 3.沉降：沉降是一种基于重力的澄清方法，其中植物提取物可以静置不动，允许较大的颗粒和杂质由于其更高的密度沉积在底部，或者涉及高速旋转提取物以分离较重的颗粒，如植物细胞、碎片和较大的杂质，从液相中分离出来。然后可以收集澄清的上清液，留下沉淀的固体。 4.过滤：过滤方法，包括深层过滤和微滤，被用于植物提取物的初级和次级澄清，用于生产人类乳头瘤病毒（HPV）和乙型肝炎病毒（HBV）。这些植物衍生疫苗的纯化通常涉及过滤步骤，以去除颗粒物质、杂质和宿主细胞蛋白，同时保留所需的疫苗抗原。深层过滤器由纤维或颗粒介质组成，可以有效地捕获较大的颗粒和杂质。孔径通常在0.1到10微米范围内的微滤膜用于去除较小的颗粒和胶体物质，从而获得澄清的溶液。 5.絮凝可以用于增强植物提取物的澄清。絮凝是一个涉及悬浮液中细颗粒和胶体物质的聚集，使它们形成更大的团块或絮凝物的过程。然后，这些絮凝物可以更容易地沉降或通过过滤轻易分离，从而提高提取物的清晰度。植物提取物澄清中的絮凝剂可以包括天然和合成聚合物，如聚乙烯亚胺（PEI）、聚丙烯酸或聚二甲基二烯丙基氯化铵（PDADMAC）、壳聚糖和硫酸铝。在Park等人，2015年进行的一项研究中。开发并评估了一种通过结合PEI沉淀和蛋白样品分级来提高TSP中Rubisco去除率的方法。通过应用50和100 mg/g的聚乙烯亚胺（PEI），实现了高效率的rubisco去除。此外，硫酸铵被用于纯化基于植物的结直肠癌疫苗候选物GA733-FcK，研究人员在纯化过程中使用了50%的硫酸铵浓度。结果显示，蛋白浓度显著增加了1.8倍。这些聚合物具有通过桥接、电荷中和或吸附机制促进絮凝形成的属性。通过选择合适的絮凝剂和优化絮凝条件（例如，pH、温度、絮凝剂用量），可以显著提高澄清过程的效率。 6.技术组合：通常，为了达到最佳效果，会采用多种澄清技术的组合。例如，可以使用离心和过滤的序列来去除不同大小的颗粒和杂质。特定澄清技术的选择取决于植物材料的性质、所需的纯度水平、过程的规模以及目标疫苗抗原的属性等因素。这些澄清方法有助于从植物提取物中去除不需要的颗粒、碎片和杂质，从而获得可以进一步用于下游纯化和植物基础疫苗配方的澄清溶液。 各种色谱技术，如亲和色谱（AC）、离子交换色谱（IEX）、疏水相互作用色谱（HIC）和凝胶过滤色谱（SEC）通常用于纯化重组生物药物。这些技术的主要目标是获得高纯度的产品，同时确保其生物活性得到保留。人们普遍认识到，在过程的初始阶段需要目标蛋白的高浓度，这需要更多的色谱树脂和增加的缓冲液需求。 亲和色谱是一种广泛认可且高选择性的技术，用于纯化包括带标签蛋白、双特异性抗体和疫苗在内的各种植物基生物分子。六组氨酸（His）、谷胱甘肽S-转移酶（GST）和麦芽糖结合蛋白（MBP）是常用的亲和标签。与蛋白A色谱相关的一个重要挑战是蛋白A的浸出，导致DNA、宿主细胞蛋白和其他源自细胞培养的杂质的结合。这些挑战涉及增加的树脂费用、限制的树脂寿命、对蛋白A配体的修改，需要探索替代品，包括微球和单体膜。这些努力旨在克服传统蛋白A色谱相关的限制，旨在提高纯化过程的效率和成本效益。 离子交换色谱是一种高度使用且成本效益高的纯化植物基重组蛋白的技术。它涉及阳离子CEX和阴离子AEX，有效地去除各种杂质，包括浸出的蛋白A、培养基成分、产品变体、宿主细胞蛋白（HCPs）和DNA。疏水相互作用色谱利用蛋白质分子的多样性疏水性质，是蛋白质精炼的关键部分。通过HIC，蛋白质在高离子强度条件下粘附到色谱配体上，而在低离子强度条件下释放。这种技术根据其疏水性质有效地分离和纯化蛋白质，从而增强整个纯化过程。 在SEC中，蛋白质分子根据其分子量进行分离。这种方法已广泛用于纯化不同的蛋白质，包括SARS-CoV-2刺突三聚体疫苗、人类白细胞介素-6（hIL6）、重组过敏原和低过敏性变体。 除了SEC，基于膜的色谱技术用于实现高纯度的重组蛋白。这种方法涉及将高特异性配体附着到微滤膜上。在这种方法中，可以在中性至碱性pH以及低电导率下从溶液中去除杂质。然而，在这种方法中，需要优化流分布以及膜的大小和厚度，以实现蛋白纯化。基于膜的色谱的进步提供了增强的纯化能力，并扩大了有效蛋白纯化过程的选项。 2.8.使用亲和标签纯化植物制造疫苗的例子 亲和标签对于台式纯化以及重组蛋白的表征至关重要。然而，并非每个纯化标签在生产规模上都具有经济可行性，因为通过化学或酶裂解去除标签（对于生物制药是必要的）会降低目标蛋白的产量，因此效率不高。 蛋白融合在基于叶绿体的表达中是有利的，因为融合伙伴稳定并保护叶绿体表达的重组蛋白免受蛋白水解降解，并使融合蛋白纯化。尽管如此，融合蛋白的表达水平> 10%的总可溶性蛋白形式包含体，需要溶解后经过复性才能纯化。因此，尽管在叶绿体转化和重组蛋白表达方面取得了很大进展，但很少有报告使用基于叶绿体的平台进行纯化开发。 融合蛋白中的融合伙伴可以有利于蛋白积累和简便的纯化。GUS干扰素（INF）融合蛋白通过弱阴离子交换色谱和随后的IMAC-Ni色谱纯化，产率为TSP的6%。包含His标记的GUS作为融合提高了表达60倍，同时简化了纯化。作为融合蛋白的INF使用因子Xa以58%的效率裂解，然后通过阳离子交换色谱纯化。使用硫酸铵的两次沉淀步骤和IgG亲和柱用于纯化与金黄色葡萄球菌Z域融合的胰岛素样生长因子（IGF）。在这种情况下，融合蛋白（~10% TSP）经过化学裂解，使用羟胺去除Z域。作为融合体在烟草植物叶片中积累的霍乱毒素B-前胰岛素融合体（高达TSP的47%），在通过IMAC-Ni柱金属亲和色谱纯化之前，经过溶解和复性，因为霍乱毒素B域具有三个相邻的His残基，允许Ni-琼脂糖树脂和融合蛋白之间强烈的相互作用。 桑托尼等人，2022年提出了使用瞬时表达含有6个组氨酸标签（His-tag）的重组蛋白，这些标签可以融合到重组疫苗候选物的N-或C-末端，其中标签使得可以轻松地初步评估植物衍生的候选疫苗。然而，在将其推广到临床试验阶段之前，必须从最终疫苗产品中去除His标签。同时，也需要评估His标签的适当位置，因为标签的位置可能会影响蛋白的积累和表达。 在稳定和瞬时表达系统中，弹性蛋白样多肽（ELP）衍生物（ELPylation）已被证明可以增强蛋白表达。ELP标签可以用于纯化融合蛋白，这对于需要低成本生产的兽医应用尤其有利。这对于生产确保动物健康的疫苗非常有利，对于受动物护理法规和防止因公共卫生问题导致的食品污染的需要驱动的生产者来说，这是一个关键目标。 近年来，猪流感和禽流感等动物传染病的爆发强调了开发有效、可扩展的疫苗接种程序的必要性。流感主要抗原血凝素（HA）的三聚体化是一个重要的工具，可以实现足够的抗原性。ELPylation已被证明可以增强表达，同时实现HA三聚体的可扩展和低成本纯化。 金等人，2021年克隆了肿瘤相关抗原GA733糖蛋白（在结直肠癌中特异性表达）和免疫球蛋白Fc片段（GA733-Fc）的融合基因，以及GA733-Fc与内质网保留基序（GA733-FcK）的融合到瞬时、拆解的植物表达载体pEAQ-HT中，该载体源自豇豆花叶病毒。两种融合克隆都转化到农杆菌中，然后渗透到本氏烟植物的叶片中。在确定了顶部叶片中它们的最大表达水平后，两种融合蛋白都是使用蛋白A亲和色谱纯化。沈等人，2023年选择了针对SARS-CoV-2刺突蛋白的人重链可变域（VHH）抗体片段，使用植物细胞悬浮液和转基因烟草植物进行快速表达。这种抗体的纯化是通过6x His标签和C-Myc标签实现的。这种植物衍生的VHH抗体证明能够像在哺乳动物和细菌细胞培养中表达的抗体一样有效地识别SARS-CoV-2刺突蛋白。 2.9.植物中的糖基工程 大多数具有治疗应用的重要生物蛋白都经历了N-糖基化，其中的糖分子显著影响它们的折叠、组装、溶解度和功能。因此，糖基工程，一种改变蛋白质的碳水化合物组分以实现特定蛋白质特性的过程，是提高药物蛋白的有效性、安全性和韧性的方法。困难在于创建能够可靠地按需生成均质糖蛋白的生物结构。这些结构的可用性将在两个层面上促进进步：（i）理解糖基团在各种生物过程中的作用；（ii）设计具有精确定制糖基化的创新生物物质，以满足其功能要求。 大多数真核细胞的N-糖基化模式都相似，直到形成中间体GnGn。然而，这一点之后的加工差异很大，导致合成几种复杂的N-糖基形态。糖基工程是植物基系统对生物制药开发最引人注目的特征。表1列出了各种表达宿主系统的优缺点。与哺乳动物的Golgi定位糖酶的大量减少相比，植物细胞只产生两种主要的糖链结构，GnGnXF和MMXF。因此，植物蛋白通常具有独特的主要N-糖链结构，与CHO细胞衍生蛋白中发现的多种N-糖链不同。GnGnXF和MMXF中发现的核心1,3-岩藻糖和木糖，不在人类糖蛋白中发现。人们担心植物基蛋白可能引发免疫反应，最终可能导致诱导植物糖链特异性抗体，这可能产生负面影响。与哺乳动物细胞不同，它们具有大量的糖组，导致糖链变异性，使得难以特异性地操纵N-糖基化途径，植物提供了一小系列N-糖基化的糖酶，这使得植物系统成为生产具有均质糖链的蛋白质的理想系统。此外，植物对不同的糖链修饰具有巨大的抵抗力，这不能显著影响它们的生长或发育表型。 在这一发展之后，已经在植物中有效地制造了各种明确定义的人类N-糖链结构，如具有1,6-岩藻糖基化、双分支模式、四天线结构和大乳糖基化的糖链。因此，CHO细胞不再无法生成多分支N-糖链，这都归功于糖基工程植物的创新。这些植物可以生产具有相同N-糖链轮廓的单克隆抗体（mAbs），仅在它们的核心1,6-岩藻糖上有所不同。这些研究还表明，实现人类糖基形态的针对性生产需要精确定位引入的糖酶在特定的亚细胞器中。随机引入哺乳动物酶将破坏自然的糖基化途径，导致次优或不寻常的混合N-糖链。通过使用瞬时表达方法，这些知识促进了通过同时表达和精确指导六种不同的哺乳动物糖酶到各种亚细胞位置，成功生产双天线唾液酸化N-糖链。 植物系统的另一个生物合成能力是生产末端多唾液酸（polySia）糖蛋白，这可以解决与现有的polySia偶联过程相关的挑战，如需要大量的发酵、产品纯化和体外化学相互作用。PolySia在各种生物过程中发挥多种作用，如细胞再生、各种免疫过程和大脑发育。通过将六种人类糖酶共转化到XF植物中，已成功地产生了能够生产具有功能活性的特定唾液酸化N-糖链结构的t植物。COVID-19疫苗和taliglucerase-alpha是使用植物系统生产糖基化生物制药的巨大潜力的显著例子。关于在中低收入国家有效生产疫苗候选物的最新研究突出了植物基糖基化生物制药的未来进步。这项研究，表明在植物系统中制造这些分子可以提供解决当前挑战的解决方案，如不平等的疫苗分配、每剂高成本和对冷链基础设施的需求。 尽管植物糖基工程在过去15年中取得了显著进步，但仍需设计一些目标，以最小化N-糖链和O-糖链的变异性，并防止潜在的免疫原性糖链表位。 表 1 不同表达宿主系统的优缺点 图 2 用于澄清、浓缩和纯化植物系统中表达的重组蛋白的下游工艺的示意图。 3.植物系统中重组蛋白表达和纯化的缺陷 3.1.植物中表达的重组蛋白受蛋白酶影响 植物细胞含有大量属于不同类别的蛋白水解酶，在溶酶体和小液泡中高度表达。N-糖基化和蛋白酶处理直接影响在植物中表达的许多异源蛋白的翻译后命运，除了影响相应重组蛋白的质量。蛋白酶在控制蛋白质的周转中起主要作用，并参与调节几种发育和细胞过程。然而，这些酶在植物组织中无处不在，同时高度多样化，并构成了一个重大障碍，损害了几种重组蛋白的成功表达。 蛋白酶与植物中的多种生物过程有关，包括植物发育、营养物的再动员、病原体防御和衰老。蛋白酶可以通过多种方式影响表达的重组蛋白的完整性，无论是在植物内生物合成后还是在细胞外的提取过程中。根据易受内源性蛋白酶水解肽键的位点数量和可访问性，重组蛋白可能在植物细胞内保持稳定，或者可能遭受完全水解或部分切割，这可能对它们的活性、结构完整性或均质性产生负面影响，从而影响它们的治疗价值。 除了对目标蛋白产量产生负面影响外，蛋白水解处理还可能导致生成具有与完整重组目标蛋白相同物理化学特性的降解产物，因此在下游提取过程中难以去除。 许多针对小液泡的重组蛋白已在植物中成功表达，但是小液泡内蛋白酶的丰富性和特异性不足经常构成一个主要障碍，与有效的重组蛋白表达方案不兼容。蛋白酶抑制剂已被用于增加植物中的重组蛋白表达。 3.2.提高重组蛋白积累的其他方法 提高重组蛋白表达的其他重要参数包括最大化或协调密码子偏好以及修改tRNA库以实现密码子协调，这需要事先了解源生物和宿主中的密码子使用情况和tRNA库的大小。此外，可以与重组蛋白共表达病毒沉默抑制剂，以阻止系统性和局部RNA沉默，通过阻止siRNAs的积累，破坏siRNA-AGO相互作用或引发AGO1降解。表2列出了使用各种植物系统产生的一些重组疫苗。建立ER应激抗性和改变降解途径的方法可以增加重组蛋白表达的途径。此外，通过促进膜合成来增加ER的蛋白质储存能力，可以增加ER的生产力和容量，从而克服ER应激。可以通过遗传工程改造细胞来合成更多的磷脂，特别是磷脂酰胆碱（PC），以促进ER容量的增加。 植物贮藏泡是种子中表达的重组蛋白的首选细胞内目的地。相比之下，叶细胞和未分化悬浮细胞中的液泡通常被视为蛋白表达的不理想部位，因为它们不提供稳定的环境。尽管如此，已经证明几种重组蛋白，如内溶菌素、纤维素酶和亲和素在叶中央液泡中高度积累。使用液泡定位信号在胡萝卜细胞中表达了人葡萄糖脑苷脂酶，实现了所需的N-糖链结构的整合，该结构具有末端甘露糖残基，由液泡中的糖链修饰酶催化。有趣的是，植物生产的taliglucerase alfa，一种用于治疗高雪氏病的酸性β-葡萄糖脑苷脂酶，能够承受溶酶体中普遍存在的高水解条件。通过调节内源性分子伴侣水平，通过过度表达选定的分子伴侣以及感兴趣的重组蛋白，也可以增加重组蛋白的表达。 3.3.监管和安全问题涉及植物中疫苗/重组蛋白的表达和纯化 在生产基于植物的疫苗过程中，监管考虑是批准重组产品的关键组成部分，因此必须遵循监管机构规定的良好实验室规范(GLPs)和良好生产规范(GMPs)的具体指南。一些健康组织，如国际协调理事会(ICH)和世界卫生组织(WHO)，在美国、日本和欧洲等地区在开发、实施、监管和执行监管策略方面发挥重要作用，以生产和使用高质量、有效和安全的生物制药，以实现有利的公共卫生结果。 根据2017年FDA的规定，烟草衍生的重组产品只有在满足改良风险烟草产品批准的要求，提供有关新植物基产品的治疗信息的证据后，才能获得使用批准(食品药品监督管理局，HHS(2017))。加拿大环境气候变化部(ECCC)和美国农业部动植物卫生检验局(USDAAPHIS)等特定国家的监管机构也执行严格的分子农业规则和法规，主要关注防止与生产重组疫苗的植物种植相关的环境风险。由于其生物相容性、低成本、大规模表达和低传播动物疾病风险，烟草已被证明是表达植物基疫苗的有利系统。然而，由于监管和安全限制的强大阻碍，长期的临床试验受到了阻碍。 FDA已经对植物基产品的安全应用提出了严格的指令。此外，欧洲药品管理局(EMA)已规定，只有在至少使用了30年，包括在欧盟至少使用了15年，并且不是通过肠外给药的情况下，草药治疗化合物才能被使用。此外，只有在有足够的科学信息证实植物基产品的纯化成分或活性成分具有可识别的效力时，才允许使用和销售这些植物衍生产品。考虑到植物中存在几种有毒物质，必须排除由于非规范管理的植物衍生产品的管理而产生的任何副作用。只有这样，针对疾病的植物基疫苗候选物才能被考虑有效使用。此外，监管操作的快速协调将有助于减少植物基产品从实验台到市场的适应时间。此外，基于植物的疫苗必须符合所有生物制品的严格GMP法规指南所指定的最佳质量标准。尽管植物基可食用疫苗具有优点，但它们的使用存在几个挑战。这些包括不适当的基因转移方法、低表达水平、密码子偏差和监管位点的障碍、不当的聚腺苷酸化、mRNA不稳定、表观遗传沉默、位置效应、管理后不充分的免疫反应、剂量一致性变化以及疫苗抗原和宿主植物组合的不当选择。Medicago Inc.最近完成了SAR-Cov-2候选疫苗的2期临床试验，并获得了加拿大卫生部的监管批准，这将为植物制造的产品铺平道路。 4.结论 随着植物表达平台的发展，研发的重点将从上游转移到下游处理，以提高整体生产力。下游处理占操作和产品制造总成本的大部分。因此，为了经济可行，越来越需要选择性和高效的产品提取和纯化过程。下游处理的效率取决于重组蛋白的浓度、无细胞培养基和植物提取物的复杂性以及最终产品所需纯度水平。本综述试图定义从植物中表达和发展疫苗和其他药物蛋白所需的阶段。随着对疫苗的环保和经济有效的表达平台的需求增加，这些步骤将进一步完善。 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摘要：人类疾病，特别是传染病和癌症，对公共卫生安全和全球经济构成了前所未有的挑战。开发和分发新型预防性和治疗性疫苗是人类疾病的优先对策。在所有疫苗平台中，病毒载体疫苗提供了显著的优势，代表了对于传统疫苗方法难以控制的病原体的突出选择。目前，病毒载体疫苗仍然是诱导针对人类疾病的强烈体液和细胞免疫的最佳策略之一。包括水泡性口炎病毒、狂犬病病毒、副流感病毒、麻疹病毒、新城疫病毒、流感病毒、腺病毒和痘病毒在内的许多不同家族和起源的病毒，被认为是在结构特征、设计策略、抗原呈递能力、免疫原性和保护效果方面有所不同的突出病毒载体。本综述总结了设计策略的总体概况、在推进中的进展以及为解决这些病毒载体疫苗部署障碍所采取的步骤，同时强调了它们在粘膜递送、癌症治疗应用以及其他关键方面对这些病毒载体疫苗合理应用的潜力。病毒载体疫苗在适当和准确的技术进步将巩固其作为加速新型疫苗突破和促进公共卫生紧急响应的领先方法的地位。 1.引言 传染病的爆发和癌症的发生对人类历史产生了巨大的影响。出血热，包括埃博拉、马尔堡和拉萨热，致死率高达50%。此外，自2003年以来，已有三波β冠状病毒的出现，其中2019年冠状病毒病（COVID-19）自2019年以来已造成数十亿确诊病例和数百万人死亡。全球每年估计有1930万新癌症病例和近1000万癌症死亡，这构成了主要的健康威胁。 对于传染病，疫苗接种和建立群体免疫至关重要。在所有疫苗技术中，重组病毒载体代表了有希望的疫苗平台，因为它们能够表达异源抗原并诱导细胞免疫反应和体液免疫反应，而无需外源性佐剂。病毒载体疫苗由基因组被修改以包含一个或多个编码目标抗原的外源基因的病毒颗粒组成。使用病毒传递“疫苗基因”的理由有几个方面。病毒载体疫苗是安全的，并且能够诱导先天和适应性免疫反应的两个方面，而不涉及完整的危险病原体。此外，由于表达多种病原体相关分子模式（PAMPs）和激活先天免疫，病毒载体具有内在的佐剂特性。同样，病毒载体可以被设计成将抗原传递到特定的细胞或组织。同样，它们可以被制成具有复制能力或无复制能力的，以增加它们的安全性并减少反应原性。值得注意的是，病毒载体疫苗可以再现特定病原体的自然感染过程，从而触发经典的急性炎症和通过自然产生PAMPs的免疫检测，使粘膜递送和诱导局部粘膜和系统免疫成为可能。几种基于病毒载体的预防性疫苗已进入III期临床试验或已获批准。在癌症领域，病毒载体是理想的溶瘤病毒（OVs），因为它们可以触发细胞免疫，并且可以被武装、屏蔽并针对肿瘤细胞。肿瘤相关抗原（TAAs）的释放可以激活和调节抗肿瘤免疫反应。几种OV制剂已获准上市，这为肿瘤免疫治疗提供了有希望的方向。 然而，这些病毒载体的系统性和比较性审查尚不完善。此外，这些病毒载体的普遍性和个体性尚未完全阐明。在这篇综述中，总结了水泡性口炎病毒（VSV）、狂犬病病毒（RABV）、副流感病毒（PIV）、麻疹病毒（MeV）、新城疫病毒（NDV）、流感病毒（IFV）、腺病毒（AdV）和痘病毒载体疫苗的一般概述，它们在应对威胁人类健康的致命性传染病以及癌症免疫治疗方面的应用。这些病毒载体的特征、优点和局限性进行了深入分析和呈现。综合考虑，这些问题将促使加速和批准新的病毒载体疫苗，以应对人类健康威胁。 1.1.病毒载体的结构和设计策略 非分段负链RNA病毒（NNSVs）作为疫苗载体。VSV和RABV是包膜NNSVs，属于弹状病毒科。弹状病毒科由五个结构蛋白组成，包括核蛋白（N）、磷酸蛋白（P）、基质蛋白（M）、糖蛋白（G）和RNA依赖性RNA聚合酶（L）。PIV、MeV和NDV属于副黏病毒科。它们的核苷酸基因组包含六个结构基因，包括N、P、M、融合糖蛋白（F）、血凝素糖蛋白（H）和L。这两种表面包膜糖蛋白负责宿主细胞的结合和入侵。这些NNSVs的救援和操作是通过负单链RNA的反向遗传学方法完成的。1994年，RABV是第一个从克隆的cDNA中被救援出来的，这标志着NNSVs领域的一个重大里程碑。该病毒是从包含正义方向的完整基因组序列、两侧带有T7启动子和乙型肝炎δ病毒核糖酶的克隆cDNA中救援出来的。随后，其他NNSVs的反向遗传系统建立起来，这使得全长基因组的重建成为可能。对于这些NNSV载体，有两种主要的外源基因传递策略。(1) 删除病毒载体的糖蛋白基因，并用目标基因替换（NNSVΔG或NNSVΔF）（图1a、b）。(2) 在全长基因组中保留病毒载体糖蛋白基因的同时，涉及一个额外的转录单元用于外源抗原（rNSSV）（图1a、b）。外源基因可以作为额外的表达盒插入基因组的不同基因连接处。 图1 疫苗平台的水泡性口炎病毒(VSV)、狂犬病病毒(RABV)、副流感病毒(PIV)、麻疹病毒(MeV)、新城疫病毒(NDV)、流感病毒(IFV)、腺病毒(AdV)和痘病毒的设计策略。a rVSVΔG/rRABVΔG，其中载体的糖蛋白(G)被外源基因替换；rVSV/rRABV，基因组的G和L之间涉及一个额外的转录单元。N4CT1，涉及基因组3′端的额外转录单元，N基因的转位和VSV G细胞质尾部的截断。b 嵌合副黏病毒载体，其中副黏病毒的融合和血凝素糖蛋白被其他副黏病毒的糖蛋白替换；重组副黏病毒载体，涉及外源基因的额外转录单元。c 基于IFV的HA、NA和NS的基因组操作。c1. 基于HA的外源基因插入：外源基因插入HA头部的受体结合位点或HA的N端；保留包装序列的同时用外源基因替换HA。c2. 基于NA的外源基因插入：外源基因插入NA的茎部；保留NA的非编码序列和相邻编码区域以替换NA编码序列；在NA的5′端涉及额外的转录单元。c3. 基于NS的外源基因插入：在NS的第125个氨基酸后插入转基因；保留NS1和NEP，在NS1末端引入2个A自切割位点；用外源基因替换NS1。d AdV的基因组，E1、E3和(或)E4区域被设计用于转基因。e 痘病毒的基因组，D转录单元可以在启动子下被所需的转基因替换。（使用BioRender创建） 在NNSVΔG/NNSVΔF设计策略中，目标糖蛋白可以显示在重组病毒的表面。因此，重组病毒的细胞和组织趋向性在很大程度上取决于外源糖蛋白。在目标糖蛋白在分子大小和功能上与载体糖蛋白相似的情况下，NNSVΔG/NNSVΔF设计策略使重组病毒在生物学生长特性和最小化抗载体免疫方面理想化。尽管重组病毒可以重组大的外源基因，但重组病毒的生长滴度相对较低。例如，rVSVΔG-SARS-CoV-2-S和rVSVΔG-CCHFV-G代表了大约106 TCID50的最高生长滴度。为了解决这个问题，截断外源基因的细胞质尾部（CT）区域和筛选最佳病毒培养细胞系是替代措施。相比之下，携带额外转录单元的病毒载体可以实现更高的生长滴度。除了糖蛋白外，外源基因也可以被纳入重组病毒。在某些情况下，外源基因的跨膜（TM）和CT域应该被病毒载体的糖蛋白所取代，以最大化外源蛋白的病毒颗粒整合并优化免疫原性。特别值得注意的是，转录从基因组的3′端到5′端递减。例如，VSV转录的极性机制导致mRNA丰度梯度，最高在基因组的3′端，并逐渐向5′端减少，顺序为N > P > M > G > L，因此特定抗原的表达水平与插入位置相关。理想的外源基因插入位点应该平衡病毒复制和外源基因表达，并包含外源基因前后的优化基因连接序列排列。 分段RNA（IFVs）作为疫苗载体。IFV是包膜的、分段的RNA病毒，属于正交髓病毒科。IFV根据核蛋白（NP）分为四个属：流感A、B、C和D。其中流感A病毒（IAV）和流感B病毒（IBV）与公共卫生相关，因为它们有可能在人类中引起严重疾病。IAV和IBV携带8个单链、负义RNA片段，编码至少8种蛋白质：聚合酶基础1（PB1）、聚合酶基础2（PB2）、聚合酶酸性（PA）、血凝素（HA，表面糖蛋白）、NP、神经氨酸酶（NA，表面糖蛋白）、NB（表面糖蛋白）、基质蛋白1（M1和M2）、非结构蛋白（NS1和NEP）。基于IFV的反向遗传学方法，IFV的多个片段被操纵用于转基因，包括HA、NA、NS1等（图1c），也报告了IAV和IBV之间的嵌合体构建。当外源基因插入到HA头部的受体结合位点或HA的N端时，IFV HA的功能不受影响，因此保留了完整的复制能力。在构建无复制能力的重组病毒的情况下，只保留了HA的3′和5′端的包装序列，HA的编码区被外源序列替换。这种无复制能力的病毒可以在稳定表达HA蛋白的Madin-Darby犬肾（MDCK）细胞系中复制。对于NA茎部，只有28-41个氨基酸插入是允许的。将外源序列插入NA茎部会影响病毒的毒力。另一种关于NA融合蛋白的策略是通过保留NA的非编码序列和相邻的编码区域来制备。在这个策略中，IFV大多是无复制能力的，需要添加外源性NA酶。还有一种策略涉及在IFV NA的5′端增加一个额外的转录单元，这保持了NA的完整结构和功能。大约允许680 bp的外源基因片段。总的来说，大约1.5 kb的外源基因被允许纳入IFV NA片段。 非结构蛋白1（NS1）和核输出蛋白（NEP）由IFV的NS基因编码，能够容忍250个氨基酸插入。IFV的NS1蛋白是一种毒力因子，能够抑制干扰素的产生，导致IFV逃避最初的免疫反应。NS1基因的删除显著减弱了病毒的毒力，已被应用于IFV载体疫苗的开发。NEP在调节IFV核糖核蛋白复合体和病毒成核中起作用。NS不参与病毒颗粒的形成，因此NS蛋白的变化不会改变IFV的抗原性。基于NS片段构建嵌合IFV载体疫苗有三种方法。第一种构建方法是建立双顺反子阅读框，即在第125个氨基酸后插入一个起始-终止阅读框（UAAUG）。第二种构建方法保留了NS1和NEP，并在NS1末端引入了2个自切割位点。最后，在NS1删除构建的情况下，重组病毒在MDCK细胞中的复制能力显著减弱。为了解决这个问题，M基因A14U的突变增强了NS1删除病毒在MDCK细胞中的复制。事实上，NS1基因的删除可能不仅仅是一种减毒策略，而且通过激活多维免疫反应，与冷适应IFV相比，可能表现出更强大和持久的免疫力。 腺病毒作为疫苗载体。AdVs是属于Adenoviridae的非包膜dsDNA病毒。AdVs具有广泛的宿主来源，并可被划分为多种血清型。它们的双链线性基因组范围从26 kb到45 kb，这个大小易于操作。AdVs已经从基因替代疗法的工具转变为真正的疫苗传递载体。它们作为疫苗载体具有吸引力，因为它们在哺乳动物宿主中同时诱导先天和适应性免疫反应。通过操纵早期1（E1）区域或其部分，可以使基于AdV的载体具有复制能力或无复制能力。此外，由于E3基因对病毒复制是可有可无的，因此可以删除早期3（E3）基因以扩大转基因插入的容量。因此，E1或E3删除区域是转基因表达的表达盒（图1d）。AdV载体已经建立得很好，易于操作，易于快速、廉价生产和无需冷链存储。参与疫苗载体的有人类、灵长类和禽类来源的AdVs。 痘病毒作为疫苗载体。痘病毒是最大的包膜DNA病毒。在20世纪80年代，通过使用牛痘病毒（VACV）接种成功根除了天花。在同一时期，VACA被用作转基因表达载体。亲本VACA的传代导致了随机突变和缺失，这有助于降低VACV的致病性。第三代痘病毒载体包括Listeria clone 16m8（LC16m8）、Dairen I株（Dis）、M65、M101、改良的安卡拉牛痘病毒（MVA）以及几种减毒的禽痘病毒。MVA通过在鸡胚上传代570代高度减毒。由于病毒组装受阻，MVA不产生传染性后代，同时在大多数哺乳动物细胞中保持了强大的DNA复制和抗原表达能力。其中，MVA-572、MVA-I721和MVA-BN在编码区的核苷酸序列上100%相同，但表现出显著不同的表型。其中，MVA-BN比其他两个菌株显示出更好的安全性和免疫原性。MVA是一种出色的第三代天花疫苗，已在德国超过120,000人中接种。MVA-VLP HIV疫苗候选物在包括免疫受损个体和HIV患者在内的500人的临床试验中显示出极佳的安全性。重组MVA遗传稳定，易于修改，安全，并显示出良好的免疫原性，即使在预先存在的抗载体免疫下，特别是与其他病毒载体疫苗，如AdV载体疫苗结合使用时。这些特性使MVA成为一个有前途的疫苗载体。除了MVA，其他用作载体的痘病毒包括金丝雀痘病毒（ALVACL）、来自李斯特菌株的C16m8以及纽约减毒牛痘病毒NYVAC（图1e）。病毒载体的比较总结在表1中。 1.2.病毒载体疫苗在人类疾病中的应用 1.2.1.水泡性口炎病毒载体 VSV载体疫苗的单剂量有效诱导持久保护：在大多数情况下，VSV载体疫苗被设计为单剂量方案。对于病毒性出血热，VSV载体疫苗的单剂量诱导了持久的保护。代表性地，rVSVΔG-ZEBOV，一种重组EBOV疫苗候选物，其中VSV G基因被扎伊尔埃博拉病毒（ZEBOV）的G基因替换，用于重组病毒的救援。rVSVΔG-ZEBOV的单次肌肉内（IM）剂量疫苗接种完全保护了小鼠和非人灵长类动物（NHPs）免受EBOV的致命挑战。具有延迟激活先天反应的动物对挑战死亡。在几内亚环疫苗接种中，2 × 107 PFU的rVSVΔG-ZEBOV单剂量疫苗在志愿者中显示出良好的安全性和免疫原性。rVSVΔG-ZEBOV对EBOV疾病提供了实质性的保护，总体保护效果为100%。疫苗接种后，抗体在第14天出现，大约在第28天达到峰值，并在2年内可检测到。rVSVΔG-ZEBOV已获得欧洲药品管理局（EMA）的批准，并已获得紧急使用许可。同样，表达其他出血热病毒如马尔堡病毒（MARV）、拉萨病毒（LASV）和克里米亚-刚果出血热病毒（CCHFV）的糖蛋白的rVSVΔG载体疫苗的单剂量疫苗接种完全保护了NHPs。对于MARV疫苗候选物，一种表达MARV（Musoke株）GP（rVSVΔG-MARVGP）的重组VSV基病毒在NHPs中显示对MARV安哥拉和Ravn株的交叉保护。rVSVΔG-MARV-GP接种的猕猴在接种后约14个月被挑战，接种动物未观察到疾病的临床迹象。在非近交豚鼠中，单剂量的基于VSV的重组病毒表达LASV GP（rVSVΔG/LASV-GPC）诱导了快速和长期的保护。疫苗接种后25天、6个月和1年的保护率分别为83%、87%和71%。对于CCHFV，单剂量的rVSVΔG载体疫苗表达CCHFV糖蛋白前体（GPC）显示出良好的耐受性，并在小鼠中实现了100%的保护，免受CCHFV的致命挑战。 美国汉坦病毒心肺综合症（HCPS）由安第斯病毒（ANDV）和新博雷病毒（SNV）引起。Prescott, J. 等人构建了一种rVSVΔG载体疫苗rVSVΔG/ANDVGPC，其中VSV的GP被ANDV GPC所替代。rVSVΔG/ANDVGPC的单次肌肉注射（IM）疫苗接种在仓鼠中诱导了高滴度的中和抗体（NAbs），并实现了无菌免疫。挑战后的保护效果为100%。在另一项研究中，疫苗在仓鼠接种后6个月内对ANDV感染有效，而在接种后1年观察到没有保护效果。Warner, BM等人构建了两种活载体疫苗，rVSVΔG/SNVGPC和rVSVΔG/ANDVGPC，分别表达了SNV和ADNV的GPC。104 rVSVΔG/SNVGPC和rVSVΔG/ANDVGPC都诱导了交叉免疫反应，并在叙利亚仓鼠中发挥了保护作用。 同样，基于VSV的疫苗单剂量接种表达其他病原体表面糖蛋白，如尼帕病毒（NiV）、寨卡病毒（ZIKV）、严重急性呼吸综合征冠状病毒1（SARS-CoV-1）和中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV），在临床前动物模型中被证明是免疫原性和保护性的。上述研究强调了VSV载体疫苗在单次肌肉注射后能够完全保护大部分病原体，并且免疫反应持久，这代表了VSV载体疫苗的显著特点。 多价VSV载体疫苗保护动物免受多种病原体的致命挑战：在多种严重病原体重叠的地区，如西非，多价疫苗具有重要意义。根据先前的研究，rVSVΔG策略显示出减弱的神经毒力和较低的抗载体免疫。此外，表达不同外源蛋白的rVSV载体疫苗可以同时接种，不会干扰所有目标病原体的挑战后保护。这些结果启发了VSV载体疫苗多价给药的潜力。在一项临床前研究中，单剂量疫苗接种表达ZEBOV和ANDV糖蛋白的重组双价疫苗VSVΔG/DUAL在仓鼠中实现了对ZEBOV和ANDV的无菌免疫。Geisbert, T. W.等人进行了一项涉及苏丹埃博拉病毒（SUDV）、ZEBOV、科特迪瓦埃博拉病毒（CIEBOV）和MARV的多价疫苗。猕猴接种了由VSVΔG/SUDV GP、VSVΔG/ZEBOV GP和VSV ΔG/MARV GP等剂量组成的多价疫苗。在上述四种丝状病毒感染的挑战下，所有接种的猕猴都存活了下来。同样，表达来自LASV、EBOV、MARV和SUDV的抗原的四价VSV载体疫苗在两次剂量后实现了对包括LASV、EBOV、MARV和SUDV在内的四种出血热病毒的100%保护。在所有接种的动物中检测到针对四种丝状病毒糖蛋白的NAbs，而在大多数接种的猕猴中也检测到了针对糖蛋白的细胞介导的免疫反应。rVSV-N4CT1载体也被应用于针对EBOV、SUDV和MARV的三价疫苗开发。尽管三价疫苗与单价疫苗相比免疫原性降低，保护效果仍为100%。上述结果表明，基于VSV的单价疫苗是适用的。代表性的针对人类疾病的VSV载体疫苗总结在表2中。 1.2.2.狂犬病病毒载体 结合佐剂的灭活RABV载体疫苗提供完全保护并触发持久的免疫反应：尽管通过基因工程策略可以减弱活RABV，但由于安全问题，不太可能批准活重组RABV。同时，表达同源抗原的减毒和无复制能力的RABV载体疫苗与表达同源抗原的VSV载体疫苗相比免疫原性较低。另一种选择是，灭活RABV载体疫苗既安全又具有免疫原性，这是一个合理的选择。对于病毒性出血热，基于RABV BNSP333载体，生成了表达ZEBOV GP的复制能力和无复制能力的疫苗候选物。ZEBOV GP蛋白可以有效地整合到病毒颗粒中。接种活疫苗或灭活疫苗候选物诱导体液免疫，并在小鼠模型中对致命的RABV和EBOV挑战提供保护。在NHPs中的进一步评估表明，复制能力疫苗对EBOV感染提供了100%的保护，而无复制能力或灭活疫苗只提供了50%的保护。通过GP密码子优化增加RABV病毒颗粒中GP的整合量，以提高灭活疫苗的保护效果。之后，两剂或三剂BNSP333-coZGP（FILORAB1）与GLA-SE佐剂结合，诱导了强大的ZEBOV GP特异性IgG、NAbs，并在NHPs中对EBOV的致命挑战提供了100%的保护。同时，基于相同策略开发了SUDV和MARV疫苗。FILORAB3是一种基于RABV BSNP333载体的MARV疫苗，表达MARV安哥拉株的密码子优化GP。灭活的FILORAB3与Toll样受体4（TLR-4）激动剂（GLA-SE）佐剂结合，诱导了强大的MARV GP特异性IgG抗体。有趣的是，接种活FILORAB3疫苗的小鼠死于致命挑战，而单剂量灭活的FILORAB3与GLA-SE佐剂结合则提供了完全保护。NK细胞依赖的抗体介导的细胞毒性（ADCC）在小鼠的免疫保护中发挥了关键作用，这与RABV载体LASV疫苗的保护机制一致。RABV载体也被广泛用于基因组分段病原体的疫苗开发，如LASV和裂谷热病毒（RVFV）。LASSARAB是一种基于BNSP333的双价疫苗候选物，表达密码子优化的LASV GPC。灭活的LASSARAB与GLA-SE佐剂结合，在小鼠和豚鼠中诱导了对LASV和RABV的持久体液反应。LASSARAB主要通过非NAbs介导的ADCC和抗体依赖性细胞介导的吞噬作用（ADCP）保护豚鼠和小鼠免受LASV挑战。我们的团队基于RABV SRV9株，表达了密码子优化的RVFV eGn糖蛋白，称为rSRV9-eGn。灭活的rSRV9-eGn结合聚（I:C）和ISA201VG佐剂诱导了细胞免疫反应和RVFV特异性IgG抗体。此外，接种rSRV9-eGn的小鼠产生了记忆T细胞主导的增殖T细胞。 灭活RABV载体疫苗在新出现的β冠状病毒中也显示出效果。完整的S蛋白整合到RABV载体中降低了重组病毒的生长滴度。因此构建了BNSP333-S1，它包含与RABV G蛋白C末端融合的MERS-CoV S1域。灭活的BNSP333-S1在小鼠中诱导高水平的NAbs，并提供了对MERS-CoV致命挑战的完全保护。在我们之前的研究中，对表达MERS-CoV S1蛋白片段的重组RABV SRV9载体疫苗候选物和展示MERS-CoV受体结合域（RBD）蛋白的革兰氏阳性增强基质（GEM）颗粒进行了平行比较。基于RABV载体的疫苗诱导了显著更早的抗体反应和更高水平的细胞免疫，而基于GEM颗粒载体的疫苗即使在1微克的低剂量下也诱导了更高的抗体反应。这项研究描述了MERS疫苗的平台依赖性方式。CORAVAX是一种灭活的RABV SADB19载体COVID-19疫苗候选物，表达严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）刺突（S）的S1。单剂量的CORAVAX疫苗在小鼠中诱导了高水平的SARS-CoV-2和RABV NAbs，但需要两剂量才能在鼻甲中完全清除病毒。CORAVAX非常有效，并在SARS-CoV-2挑战后对仓鼠模型提供了保护。TLR4激动剂（AddaVax）根据优质抗体滴度被确定为具有最大潜力。预先存在的RABV免疫对免疫反应没有显著影响。抗原特异性血清抗体滴度和脾脏和骨髓中长期抗体分泌细胞在CORAVAX免疫后持续超过1年。CORAVAX的人类临床试验正在进行中。我们的团队基于RABV SRV9株开发了灭活重组病毒载体疫苗，该疫苗在RABV基因组的额外转录单元中嵌合表达SARS-CoV-2的RBD或S1。结合聚（I:C）和ISA 201VG佐剂，三剂量的灭活重组病毒（SRV-nCoV-RBD或SRV-nCoV-S1）诱导了针对SARS-CoV-2和RABV的持久NAbs。值得注意的是，灭活的SRV-nCoV-RBD比SRV-nCoV-S1更早并更好地维持了抗体产生。在进一步评估中，灭活的SRV-nCoV-RBD在猫和狗中诱导了针对SARS-CoV-2和RABV的NAbs，具有相对广谱的对SARS-CoV-2变异株（VOCs）的交叉中和能力。 对于脑炎病毒，基于BNSP333构建了一种表达NiV G的重组NIV疫苗，称为NIPARAB。经活NIPARAB鼻内（IN）接种后，小鼠未显示疾病临床症状。尽管肌肉注射单剂量活NIPARAB或两剂量灭活NIPARAB的小鼠产生了NAbs和NIV-G特异性结合抗体，但只有在灭活疫苗组中观察到更高的抗体水平。值得注意的是，抗NIV G特异性免疫血清对另一种导致致命脑炎的副黏病毒亨德拉病毒（HEV）具有交叉反应性。对基于VSV和RABV的HEV疫苗进行了平行比较密码子优化使HEV G在RABV BNSP333载体中的整合增加了2-3倍，而与表达原始抗原序列的VSV载体疫苗候选物相比没有影响。令人惊讶的是，两种疫苗候选物都安全，并在小鼠中诱导了高水平的HEV G特异性抗体。三剂量的灭活疫苗比单剂量活疫苗诱导了更高水平的HEV G特异性IgG和NAbs。在相同条件下，基于VSV的活疫苗比基于RABV载体的活疫苗诱导了更高水平的HEV G特异性抗体和NAbs，这可能是由于VSV的快速复制能力。总体而言，考虑到生物安全问题和与基于VSV的疫苗相比RABV的免疫原性较低，灭活形式似乎是一个更具吸引力的方向。代表性的基于RABV载体的人类疾病疫苗总结在表3中。 1.2.3.副流感病毒载体 单次IN剂量疫苗接种的PIV载体疫苗提供对呼吸道疾病的完全保护：副流感病毒因其安全性、基因组稳定性和在多个细胞系中培养的能力而成为潜在的病毒载体。44 多种PIV血清型参与病毒载体，包括PIV1、2、3和5。此外，B/HPIV3是由牛/人PIV组成的嵌合体，其中牛PIV3（BPIV3）株Kansas的BPIV3 HN和F糖蛋白被人类PIV3株JS的糖蛋白所取代。BPIV3骨干提供了在人类中复制的宿主范围限制，这在幼儿中耐受性良好且具有免疫原性。到目前为止，没有证据证实PIV载体疫苗中增强的致病性。PIV是针对呼吸道上皮的儿科病原体，这使它们成为开发诱导粘膜免疫反应的疫苗的有吸引力的候选者。一种基于人类副流感病毒2型（hPIV2）载体BC-PIV的复制缺陷型COVID-19疫苗已经开发出来，它表达了SARS-CoV-2全长融合前稳定S蛋白，称为BC-PIV/S-2PM。在病毒表面整合了大量的S蛋白。单次IN剂量接种BC-PIV/S-2PM在小鼠中诱导了高水平的S特异性IgG和粘膜IgA抗体，并保护了仓鼠免受SARS-CoV-2感染。需要加强疫苗接种以在仓鼠中提供完全保护。也开发了几种具有复制能力的PIV载体COVID-19疫苗。CVXGA1是一种表达SARS-CoV-2 WA1 S蛋白的重组PIV5载体疫苗。为了最大程度地发挥保护性免疫反应，生成了S蛋白的天然构型。单次IN剂量的CVXGA1诱导了病毒特异性NAbs，并在K18-hACE2小鼠中提供了100%的保护，并阻止了与同居的天真雪貂的接触传播。当CVXGA1作为两剂量COVID-19 mRNA疫苗之后的加强剂进行给药时，与三剂量COVID-19 mRNA疫苗相比，PIV5载体疫苗产生了更高水平的交叉反应性NAbs。这些结果表明，CVXGA1可以作为针对新出现的变体的加强疫苗。CVXGA1目前在美国进行I期临床试验（NCT04954287）。通过表达天然或融合前稳定S蛋白（S-2P）也构建了基于B/HPIV3的COVID-19。融合前稳定增加了B/HPIV3体外S蛋白的表达。在仓鼠中，单次IN剂量的B/HPIV3/S-2P诱导了12倍的更高NAbs滴度和显著更高的SARS-CoV-2特异性IgA和IgG，与B/HPIV3/S相比。在SARS-CoV-2挑战后，B/HPIV3/S-2P比B/HPIV3/S提供了更好的保护。此外，优化版本的B/HPIV3/S-2P，涉及另外4个脯氨酸突变以巩固融合前稳定的S蛋白（B/HPIV3/S-6P）在猕猴中进行了评估。单次IN/气管内（IT）剂量的B/HPIV3/S-6P在猕猴中诱导了强烈的S特异性气道粘膜IgA、IgG反应以及高滴度的外周S特异性抗体，这些抗体有效地中和了SARS-CoV-2 VOCs，但中和Omicron亚系的能力被削弱。此外，B/HPIV3/S-6P诱导了强大的系统性和肺S特异性CD4+和CD8+ T细胞反应，包括肺部的组织驻留记忆细胞。B/HPIV3/S-6P疫苗接种有效地抑制和消除了免疫猕猴的上呼吸道和下呼吸道中的病毒增殖。也证明了基于自然减毒的人类副流感病毒3型（HPIV3）载体的COVID-19疫苗是有效的同样，基于PIV5表达糖蛋白F（PIV5/F）和G（PIV5/G）的SARS-CoV-1和MERS-CoV疫苗通过单次IN剂量给药在临床前是免疫原性的。 人类呼吸道合胞病毒（RSV）是全球婴幼儿和儿童严重急性呼吸道感染的主要病原体。迄今为止，还没有获得许可的RSV疫苗。基于PIV的RSV疫苗是通过在额外的转录单元中表达RSV-F蛋白构建的。在重组B/HPIV3中，RSV的F蛋白被设计为融合前构象，其TM和CT域被HPIV3 F所取代，以增加在载体病毒中的整合。使用rB/HPIV3-RSV-pre-F作为加强剂，与使用活减毒RSV疫苗相比，在仓鼠和非洲绿猴中产生了显著更高水平的RSV NAbs。基于PIV的RSV疫苗提供了更大的RSV F抗原负荷，并与减毒RSV相比增加了免疫原性。然而，额外的减毒可能会使构建在人类中过度减毒，以至于免疫原性可能不是最佳的。由于这些原因，当rB/HPIV3-RSV-F过度减毒时，开发了rHPIV3 JS作为新一代载体。令人鼓舞的是，双价HPIV3/HRSV疫苗候选物在2个月以上的儿童中耐受性良好，并且优化版本正在进行进一步的临床开发作为儿童疫苗。基于PIV5的RSV疫苗分别构建了表达糖蛋白F（PIV5/F）和G（PIV5/G）的两种RSV疫苗。PIV5/F更具免疫原性，在动物模型中比PIV5/G提供了更好的保护。PIV5/F在RSV暴露后的非洲绿猴中增强了NAb反应。这些研究表明PIV5/F是RSV-naive和RSV-exposed个体的有前途的单剂量IN疫苗。此外，基于PIV5的RSV疫苗可以皮下注射，这对于可能因IN接种而鼻塞的婴儿来说是一个有利的接种途径。 基于PIV平台，通过将IAV H5N1的HA或NP整合到重组PIV病毒中，构建了几个IFV疫苗候选物。单次IN剂量接种携带IAV HA的重组病毒诱导了无菌免疫，并保护动物免受IFV的同源挑战。与HA相比，IAV的NP似乎更加保守，但其免疫原性较低。这个问题可以通过选择PIV基因组内适当的外源基因传递位置来解决。之后，单次IN接种携带IFV NA的PIV载体疫苗提供了对IFV的广泛保护。这些结果表明，NP可以作为IFV的广谱抗原进行进一步研究。 正在开发的基于PIV载体的EBOV疫苗：基于HPIV3载体，通过将EBOV的GP基因单独或与NP蛋白基因一起插入HPIV3基因组，构建了两种EBOV疫苗候选物。在上述疫苗候选物的单次IN接种后，豚鼠在两个疫苗组中均100%免受EBOV挑战。在猕猴中，任何表达GP的构建物的单剂量免疫对EBOV具有中等免疫原性，并对88%的动物免受EBOV引起的严重出血热和死亡的保护。两剂量疫苗接种具有高度免疫原性，所有动物在挑战后存活，没有疾病迹象和可检测的挑战病毒。基于PIV的EBOV疫苗的免疫反应与AdV载体疫苗相当，但低于基于VSV的疫苗。病毒特异性结合抗体滴度与保护效果直接相关。NP蛋白的整合对保护效果贡献不大。预先存在的抗载体免疫可能影响HPIV3的复制，但对抗原表达和免疫原性的影响有限。在预先存在HPIV3抗体的组中，针对GP蛋白的抗体滴度仅略低于对照组。第二次免疫后，两组之间的抗体滴度达到了相当水平。Bukreyev等人试图从HPIV3中去除HN和F蛋白，并用EBOV的GP蛋白替代其功能。他们成功地包装了不含HN和F蛋白的HPIV3载体EBOV疫苗。该疫苗保持了免疫原性，并完全保护豚鼠免受EBOV的致命挑战。最重要的是，该疫苗逃避了预先存在的HPIV3免疫。去除HN和F蛋白导致Ebola GP蛋白的表达水平更高。与此同时，也实现了病毒载体的减毒。同样，作为EBOV疫苗的IN传递，报告了一种表达EBOV GP膜锚定形式的减毒重组人类副流感病毒1型（rHPIV1）。GP经过密码子优化，表达为全长蛋白或工程嵌合形式，其中其TM和CT域（TMCT）被HPIV1 F蛋白所取代，以增强包装到载体颗粒中并提高免疫原性。GP基因插入到带有P/C基因（CΔ170）稳定减毒突变的rHPIV1的N基因之前（pre-N）或N和P基因之间（N-P）。这些构建物生长到高滴度并稳定表达EBOC GP。此外，重组病毒被减毒，在非洲绿猴的呼吸道中几天内以低滴度复制。从pre-N位置表达GP的候选物的两剂量比N-P病毒引发了更高的NAbs，未修改的GP比其TMCT对照物引发了更高水平的NAbs。未修改的EBOV GP被包装到HPIV1颗粒中，TMCT修饰并没有增加包装或免疫原性，反而降低了体内复制过程中GP表达的稳定性。这项研究表明，TMCT替代并不总是增强异位蛋白的整合和疫苗的免疫原性，这是由特定病原体的属性决定的。代表性的基于PIV载体的人类疾病疫苗总结在表4中。 麻疹病毒载体。活减毒麻疹病毒（MeV）疫苗是临床中最有效和安全的人类疫苗之一。因此，MeV疫苗的制造业已经非常成熟。鉴于MeV疫苗的显著成功，这种病毒被认为是针对其他疾病的病毒载体疫苗的支柱。其中，MeV株Schwarz和Moraten经常被应用为支柱。在基于MeV的疫苗方面取得了显著进展。表达不同形式抗原的MeV基疫苗提供对呼吸道疾病的保护：同源初免-加强免疫使用具有复制能力的rMeVs表达全长、截断或可溶形式的MERS-CoV S糖蛋白，在MeV易感小鼠中诱导了高水平的rMeV和MERS-CoV NAbs和T细胞。在MERS-CoV挑战后，接种疫苗的小鼠肺部病毒载量显著降低，与肺部病理变化减少相一致，表明rMeV-MERS疫苗对MERS-CoV感染提供完全保护。MeV表达的S的可溶版本没有增强NAb滴度，并且与表达全长MERS-S的MeV相比，略微损害了复制。这些结果表明，S蛋白的可溶结构阻碍了重组病毒的组装。同样，表达密码子优化S糖蛋白（S）的rMeV在小鼠中是免疫原性的。 麻疹病毒（MeV）基COVID-19疫苗的开发尝试：这些临床前候选物是通过携带膜锚定的野生型S蛋白、融合前稳定的S蛋白（S-2P）或带有自三聚体“foldon”结构域的分泌型S-2P构建的。两者在动物模型中都被证明是有效的。此外，新版本还被设计为编码在十二面体迷你铁蛋白骨架上展示的融合前稳定的、三聚体化的SARS-CoV-2 S糖蛋白。麻疹病毒表面糖蛋白被修改以绕过抗麻疹抗体。MeV基COVID-19疫苗的优化版本在小鼠中诱导了高滴度的NAbs。这些抗原工程策略也可能适用于麻疹基疫苗针对其他新出现的β冠状病毒。 不幸的是，在I/II期临床试验中，表达融合前稳定SARS-CoV-2 S蛋白（V591）的MeV基COVID-19疫苗在单次肌肉注射后的免疫原性不足，特别是在麻疹免疫个体中。目前，低免疫原性与抗载体免疫之间的关系尚不清楚。最重要的是，动物模型中进行了腹腔注射，而临床试验中应用了肌肉注射，这可能有助于解释临床前和临床试验结果之间的矛盾。 除了涉及另一个转录单元共同表达外源抗原的上述策略外，还构建了MeV的嵌合版本，其中MeV F和H的CT和TM域被保留，而MeV F和H的外细胞域分别被RSV F和G替代。嵌合MeV/RSV在棉鼠中诱导了针对RSV的NAbs，并在挑战后显著降低了病毒载量。外细胞域替代策略可能同样适用于其他副黏病毒，但在改变进入受体的趋向性时需要严格监控。 MeV基疫苗针对虫媒传播疾病：西尼罗河病毒（WNV）是一种节肢动物传播的黄病毒，导致众多人类脑炎病例。通过表达WNV的包膜糖蛋白构建了MeV基疫苗候选物（MeVSchw-sE）。MeVSchw-sE的腹腔注射在小鼠和松鼠猴中诱导了高水平的特异性抗WNV NAbs和对WNV致命挑战的保护。基孔肯雅病毒（CHIKV）是一种蚊子传播的甲病毒，导致严重的多关节炎。表达CHIKV衣壳和包膜结构蛋白的rMeV导致了病毒样颗粒（MeV-CHIKV）的配方。MeV-CHIKV引发了广谱和高滴度的CHIKV抗体以及细胞免疫反应。所有小鼠在单次腹腔注射免疫后对CHIKV的致命挑战存活了下来。免疫血清的被动转移对天真小鼠提供了保护，突出了体液免疫反应在保护CHIKV中的重要作用。MeV-CHIKV的最终临床前评估在猕猴中进行。同源初免-加强接种MeV-CHIKV保护了猕猴免受CHIKV挑战后的异常临床症状、病毒血症、血细胞指标、细胞因子变化。 这种基于Schwarz株的rMeV编码CHIKV VLP已经在I/II期临床试验中进行了。尽管存在预先存在的抗MeV免疫，MeV-CHIKV仍然具有良好的耐受性和免疫原性，免疫力持续了6个月。需要两剂量才能达到100%的血清转化率。此外，6个月后的疫苗加强似乎在更大程度上增加了NAb滴度。通过表达LASV的GPC、GPC + NP或GPC + Z蛋白，分别构建了MeV基拉沙热疫苗。在猕猴中，MeV-GPC + NP在单次皮下（SC）剂量疫苗接种后的免疫反应和挑战后保护效果方面被确定为最佳时间表。进一步评估证实，单次SC剂量的MeV-GPC + NP保护了猕猴免受同源（Josiah，第四系）和异源（第二系和第七系）LASV菌株的侵害。在单剂量MeV-GPC + NP疫苗接种后一年，100%的猴子免受同源致命挑战的侵害。这些研究表明MeV-GPC + NP对LASV提供了长期和广谱的保护。目前，MeV-GPC + NP的I期临床试验正在进行中（NCT04055454）。 鉴于VSV基疫苗共表达ZIKV的prM和E蛋白的理想结果，构建了编码ZIKV prM和可溶性E蛋白（MV-Zika-sE）的重组MeV。通过腹腔注射两剂量的MV-Zika-sE对小鼠进行了免疫。接种MV-Zika-sE的小鼠免受体重减轻和血浆病毒血症的侵害。还有人试图筛选表达ZIKV-E、NS1或两者的MeV基疫苗构建物的小组。尽管MeV-E2在小鼠中提供了100%的生存率，但并未实现完全病毒清除。需要NS1才能提供完全保护。代表性的基于MeV载体的人类疾病疫苗总结在表5中。 新城疫病毒载体。新城疫病毒（NDV）是另一种高度传染性的副黏病毒，可在禽类中引起不同程度的疾病，但在宿主限制上表现出严格的行为。在哺乳动物中，NDV触发了干扰素反应，限制了NDV的复制，同时对适应性免疫产生了佐剂效应。低毒力NDV株，如LaSota和B1，被广泛用作致死性NDV的活减毒疫苗，并用于兽医和人类疫苗的工程。 通过在附加的转录单元中表达SARS-CoV的S蛋白，开发了基于NDV的SARS-CoV疫苗。在两次IN剂量疫苗接种后，非洲绿猴发展了针对SARS-CoV的高滴度NAbs。在高剂量SARS-CoV挑战后，与对照动物相比，肺组织中的病毒滴度显著降低。 基于NDV的COVID-19疫苗已经构建并在临床前和临床中进行了评估。先前的抗原工程策略在基于NDV的COVID-19疫苗中再次出现，包括通过引入6个脯氨酸稳定S蛋白，以及添加NDV融合蛋白的TM和CT域以增强S蛋白在病毒颗粒表面的表达。代表性地，rNDV‐S是通过在NDV载体基础上表达SARS-CoV-2的S蛋白构建的。在小鼠中，rNDV‐S通过肌肉免疫诱导了体液和细胞免疫，尽管通过IN注射没有检测到NAbs，但诱导了更高S特异性T细胞反应。同样，与肌肉注射相比，仅通过IN接种的rNDV‐S在猪中的免疫原性较低，尽管两种递送途径的组合诱导了强烈的NAbs。有趣的是，通过IN接种的活rNDV‐S在仓鼠中诱导了与肌肉注射相当的抗体反应和保护效果。这些概念验证研究说明了rNDV‐S疫苗的动物模型依赖性，强调了需要明确准确反映人类接种后状态的动物模型的必要性。 灭活的rNDV‐S在I期临床试验中进行了评估，证明是安全和具有免疫原性的。的确，这种疫苗候选物可以廉价且可扩展地生产。然而，基于NDV的灭活疫苗似乎不如针对COVID-19的新型蛋白疫苗那么有吸引力。活rNDV‐S也在I期临床试验中通过肌肉注射、IN注射或IN后肌肉注射的初免-加强方案进行了评估。活rNDV‐S安全且耐受性良好。肌肉注射和IN后肌肉注射被证明具有免疫原性。表面上，猪中rNDV‐S的临床前评估似乎更好地反映了人类的临床结果。然而，由于存在不平等，应该解决复杂的问题，因为这些IN递送途径存在差异。对于IN接种，人类和猪通过鼻喷雾装置给药，而仓鼠在麻醉下给药，这使得rNDV‐S深入分布，更有可能代表气雾吸入疫苗。因此，应该小心设计和处理临床试验，以防在递送途径中存在微妙的划分。 通过表达来自IFV的嵌合HA，已经开发了针对NDV和高致病性禽流感（HPAI）的双价rNDV疫苗。这些疫苗候选物可以提供不同IFV系之间的交叉保护。与基于NDV的COVID-19疫苗类似，通过肌肉注射的灭活rNDV比IN接种更具免疫原性。这可以通过活NDV的粘膜趋向性来解释，而灭活NDV显示更多的抗原蛋白，并从佐剂效应中受益。目前基于NDV的IFV疫苗被用作墨西哥的兽医疫苗。 由于NDV是一种强大的干扰素产生和树突细胞成熟诱导剂，一种表达RSV融合糖蛋白的重组NDV被施用于BALB/c小鼠。单次IN剂量的疫苗接种保护了动物免受RSV挑战。在棉鼠中的进一步评估表明，疫苗接种也保护了它们免受RSV挑战，并在6个月内诱导了长期存活的NAbs。 与基于PIV3的EBOV疫苗相比，同一团队开发了一种表达EBOV GP的基于NDV的EBOV疫苗，称为NDV/GP。在通过NDV/GP进行一次IN加IT剂量接种后，与HPIV3/GP在猕猴中诱导的相比，EBOV特异性结合抗体和NAbs不可检测或较低。加强疫苗接种导致血清IgG ELISA滴度大幅增加，但仍然低于第二次HPIV3/GP接种诱导的滴度。相反，呼吸道中的分泌型IgA滴度和NAbs等于第二次HPIV3/GP接种后诱导的水平。这些结果表明，基于NDV的EBOV疫苗等同于或略逊于基于PIV3的EBOV疫苗的免疫原性，特别是在单剂量方案中。为了克服Ad5的抗载体免疫，通过表达EBOV的GP蛋白生成了rNDV，并与AdV-5-MakGP结合，作为一种异源初免-加强策略。这种策略在小鼠中比接受相同疫苗两次的产生了更强的EBOV GP特异性抗体和细胞免疫反应。这些结果表明，AdV-5初免-NDV加强方案在刺激EBOV特异性免疫方面比同源方案更有效。代表性的基于NDV载体的人类疾病疫苗总结在表6中。 1.2.4.流感病毒载体 单独或作为加强疫苗时，IN传递的基于IFV的COVID-19疫苗是有效的：现有的流感疫苗生产基础设施高度优化，每年能够交付超过十亿剂。为了对抗另一种呼吸道疾病，COVID-19，已经开发了多种基于IFV载体的疫苗。scPR8-RBD-M2被指定为一种单轮复制的基于IFV的COVID-19疫苗。利用嵌合基因编码基于2A肽的SARS-CoV-2 RBD和IFA M2的双顺反子蛋白盒。RBD的C末端连接到IFV HA的细胞质域，将RBD锚定在生产细胞和病毒包膜的表面。通过两次IN免疫，可以在小鼠中产生针对RBD的细胞、体液和粘膜免疫反应。疫苗诱导的抗体对SARS-CoV-2变体表现出广谱中和活性。MDCK-HA细胞提供的HA蛋白可能导致插入基因的不稳定性。为了解决这个问题，可以产生含有混合抗原/表位的疫苗混合物，以规避这些限制。Chaparian等人将SARS-CoV-2-RBD插入到IFV A/Puerto Rico/8/1934 (H1N1) HA中，接种这种组合疫苗的小鼠对SARS-CoV-2和IAV的致命挑战都产生了NAbs并提供了保护。 最近，基于一种冷适应的IFV株，没有NS1，制造了一种活减毒SARS-CoV-2疫苗，通过基因重组插入了SARS-CoV-2的RBD基因，称为CA4-dNS1-nCoV-RBD（dNS1-RBD）。在临床前研究中，dNS1-RBD通过在呼吸道引起强烈的先天和适应性局部免疫反应，对SARS-CoV-2挑战提供了快速、长期、广谱的保护，尽管循环中的反应较弱，这可能归因于鼻上皮中的先天免疫反应和局部交叉变体特异性T细胞免疫反应。通过疫苗接种，可以在肺部诱导RBD特异性的居住记忆CD4+和CD8+ T细胞，而且在小鼠中单剂量免疫后，肺部组织中产生的T细胞免疫反应比外周单核细胞（PBMCs）中的大约强26倍。此外，这种细胞免疫对大多数SARS-CoV-2 VOCs相对不受损害，特别是对最新的Omicron变体。此外，这种疫苗还提供对IFV H1N1和H5N1的交叉保护。在I/II期临床试验中，健康成年人通过IN接种接受了dNS1-RBD。dNS1-RBD在成年人中耐受性良好，观察到的疫苗相关不良反应不到20%，没有严重的不良事件。在I/II期试验中，疫苗接种者在第二次剂量后1个月，特异性T细胞免疫反应、RBD特异性IgG的血清转化率和RBD特异性s-IgA的阳性转化率分别为44%、10%和12%。总体而言，疫苗接种者对SARS-CoV-2的T细胞、体液和粘膜免疫反应较弱。这项研究提供了由于IN疫苗在管理过程中产生的气雾造成的交叉污染的证据，这可能有助于为未来其他IN疫苗的临床发展铺平道路。尽管通过与接种疫苗的人密切接触传播疫苗株的可能性被认为非常低。这个问题应该通过评估疫苗接种者的病毒脱落和特异性免疫反应、环境感染的概率来妥善解决。dNS1-RBD的III期临床试验正在进行中（ChiCTR2100051391）。值得注意的是，已经实现了对Omicron的广谱效果。dNS1-RBD对COVID-19住院治疗的总体保护效果为100%。对于没有免疫史的人，免疫后3个月dNS1-RBD的绝对保护效果为55%。对于有免疫史的人，鼻腔喷雾COVID-19疫苗在加强免疫后6个月内的绝对保护效果为82%（未公布数据）。2022年12月2日，dNS1-RBD在中国获得紧急使用批准。 基于IFV的疫苗针对其他病原体：冷适应的、活减毒流感疫苗（CAIV；FluMist，AstraZeneca，伦敦，英国）在2003年被美国食品药品监督管理局批准为安全有效的疫苗，并获准用于2-49岁的人群。在FluMist的人类挑战试验中，低抗体反应与低保护效果没有直接关联。在接受单剂量的103名18-45岁成年人中，IAV/H1N1、IAV/H3N2和IBV/Harbin的血凝抑制抗体的血清阳性率分别为23%、33%和3%，鼻腔冲洗中IgA抗体的反应率分别为14%、32%和18%。令人鼓舞的是，病毒挑战结果表明，FluMist对A/H1N1、A/H3N2和B/Harbin的保护效果分别为80%、78%和100%，高于诱导更高血清反应率（91%、76%和76%）的肌肉注射疫苗候选物（60%、67%和100%）。同样，PIV5/G疫苗在棉鼠中没有产生可检测的NAbs水平，但仍然提供了对RSV挑战的保护。以上结果表明，除了外周抗体反应外，免疫反应可能为这些呼吸道疾病提供保护益处。 我们的团队基于冷适应的（ca）IBV B/Vienna/1/99骨干构建了一种H5N1嵌合IAV/B疫苗。插入了修饰的H5N1 HA，同时保留了IBV HA的包装信号。重组病毒保持了温度敏感和冷适应表型。H5N1疫苗在小鼠中减毒。诱导了系统性体液和细胞免疫以及局部粘膜IgA。两次IN接种H5N1疫苗候选物在小鼠中对IFV H5N1的致命挑战提供了完全保护。2021年，在A/Switzer land/9715293/2013 (H3N2) HA的N末端插入了IFV离子通道蛋白M2（M2e）的保守胞外域（4 × M2e）。这种疫苗的鼻腔接种在小鼠中诱导了抗体和T细胞免疫反应，从而实现了对H1N1、H3N2、H5N1、H7N9和H9N2病毒的保护。代表性的基于IFV载体的人类疾病疫苗总结在表7中。 1.2.5 腺病毒载体 同源或异源初免-加强接种AdV基疫苗可提供针对病毒性出血热的保护：5型腺病毒（Ad5）是最常用的腺病毒载体，它已经建立并易于获取。在临床前试验中，猕猴在初次接种DNA疫苗后，通过复制缺陷型Ad5载体疫苗候选物Ad5-EBOV编码EBOV GP进行加强免疫。这些动物产生了强烈的细胞和体液免疫，并获得了完全的交叉保护。将接种疫苗动物的多克隆抗体被动转移到天真猕猴中未能提供针对EBOV致命挑战的保护，而体内CD8+细胞的耗竭则取消了对NHPs的保护。这些结果表明，CD8+ T细胞在rAd5-EBOV诱导的针对EBOV感染的免疫保护中起主要作用。在I期临床试验中，Ad5-EBOV安全且具有免疫原性。然而，预先存在的抗载体免疫影响了体液反应。同样，单一肌肉注射剂量的Ad5-MakGP，一种表达EBOV Makona株GP的重组Ad5，为NHPs提供了无菌免疫和100%的保护。在I期临床试验中，Ad5-MakGP显示出良好的安全性和免疫原性。观察到免疫反应的剂量依赖性幅度。EBOV特异性抗体反应和T细胞反应都被抗载体免疫的存在所削弱，特别是在低剂量组中。初次免疫后6个月用Ad5-MakGP进行同源加强免疫，刺激了更强的体液免疫反应。加强免疫一年后，仍可检测到100%阳性率的GP抗体。根据Ad5-MakGP在塞拉利昂的II期临床试验的临床结果，当疫苗剂量增加到8 × 1010个病毒颗粒时，疫苗不良反应是可以接受的，并且发生率甚至低于I期临床试验。然而，非洲参与者中EBOV特异性抗体的持续时间比中国参与者短，这也在非洲和欧洲的rVSV-ZEBOV临床试验中看到。在Ad5-MakGP的I/II期临床试验中，rVSV-ZEBOV + Ad5-EBOV初免-加强方案诱导了强烈的免疫反应。异源初免-加强策略可以迅速唤醒免疫记忆，并诱导更强的免疫反应，同时减轻抗载体免疫的影响。2015年12月，俄罗斯批准了这种疫苗的注册。 腺病毒26型（Ad26）是另一种有前途的疫苗载体，其血清阳性率低于Ad5。也构建了基于Ad26的EBOV疫苗。Ad26-ZEBOV疫苗候选物的单一肌肉注射剂量在NHPs中提供了部分保护。随后用腺病毒35型（Ad35）-ZEBOV加强免疫显著增加了体液和细胞反应，并提供了完全保护。 关于重组黑猩猩腺病毒（ChAdVs）诱导的免疫反应的质量和幅度，它们同样被用作病毒载体。基于ChAdVs的疫苗唤起了与人类AdV载体相似的体液和细胞免疫反应。黑猩猩腺病毒3型（ChAd3）载体双价疫苗（cAd3-EBO）编码EBOV和SUDV的GP，在猕猴中诱导了优越的体液和细胞反应，并与黑猩猩腺病毒63型（ChAd63）和（MVA）载体疫苗相比，对EBOV挑战提供了统一的保护。用MVA载体疫苗加强cAd3-EBO，在NHPs中产生了对致命挑战的持久保护。急性保护与抗体反应强烈相关，而长期保护需要产生效应和记忆CD8+ T细胞反应和细胞因子。在I期临床试验中，cAd3-EBO安全并诱导了剂量依赖的免疫反应。基于ChAd3的单价疫苗（ChAd3-EBO-Z）编码ZEBOV的GP也已构建。在I期临床试验中，ChAd3-EBO-Z诱导的抗体略低于rVSV-ZEBOV诱导的抗体。当ChAd3-EBO-Z用MVA-EBO-Z加强时，病毒特异性抗体和CD8+ T细胞分别增加了12倍和5倍。用ChAd3-EBO-Z初免的参与者在免疫后6个月病毒特异性抗体反应仍呈阳性，但显著低于接受MVA-EBO-Z加强的个体。其他I期试验验证了ChAd3-EBO-Z的安全性和免疫原性。此外，涉及ChAd3-EBO-Z和MVA-BN-Filo（MVA载体疫苗候选物，表达ZEBOV GP、SUDV GP和MARV-Musoke GP）的初免-加强策略提供了持久保护。免疫反应在12个月内基本维持。 还在MARV上进行了DNA初免-Ad5加强策略。基于DNA或Ad5平台，通过表达EBOV GP构建了疫苗候选物DNA-MARV-GP和rAd5-MARV-GP。在NHPs中，比较了异源DNA-MARV-GP/rAd5-MARV-GP初免-加强策略、单剂量rAd5-MARV-GP方案和DNA-MARV-GP同源初免-加强策略的保护效果。所有三种方案都防止了NHPs的EBOV致命挑战。单一剂量的rAd5-MARV-GP接种诱导了与两剂量DNA疫苗相当的体液和细胞反应。包含rAd5-MARV-GP的疫苗方案，无论是单独使用还是作为加强剂，都表现出CD8+ T细胞主导的细胞反应。CD8+ T细胞亚群的主导地位与临床症状的低频率呈正相关，表明CD8+ T细胞的幅度和功能表型决定了疫苗对MARV感染的效果。 Maruyama等人开发了一种表达LASV-GPC的Ad5载体疫苗候选物，称为Ad5-LASV。两剂量的Ad5-LASV为豚鼠提供了完全保护。所有接种疫苗的动物产生了抗GP抗体，而只有37.5%产生了NAbs。在致命LASV挑战后，接种疫苗的豚鼠中未观察到可检测的病毒。Zivcec等人构建了一种基于Ad5的疫苗候选物Ad-CCHFV-N，该候选物表达CCHFV的核蛋白。Ad-CCHFV-N诱导了抗N的体液免疫反应。Ad-CCHFV-N的单剂量疫苗接种为IFNAR−/−小鼠提供了针对致命CCHFV挑战的30%保护，而初免-加强方案将保护效果提高到78%。这项研究证明了遗传保守的N蛋白作为针对CCHFV的保护性抗原的可行性。 ChAdOx1是一种复制缺陷型黑猩猩腺病毒载体，在人类腺病毒E中分类。Warimwe等人构建了一种复制缺陷型黑猩猩腺病毒载体疫苗，称为ChAdOx1-GnGc，编码RVFV的Gn和Gc。ChAdOx1-GnGc在小鼠中诱导了强大的RVFV特异性NAbs和CD8+ T细胞反应。每种疫苗候选物的单剂量都保护了小鼠免受致命RVFV挑战。与此同时，两种商业可获得的佐剂，Matrix-M™和AddaVax™，被证明显著增强了ChAdOx1-GnGc诱导的RVFV特异性中和反应。ChAdOx1-GnGc的单剂量疫苗接种引起了与已获得许可的家畜疫苗Smithburn相当的强效NAb，并在最易感的自然宿主物种绵羊、山羊和牛中提供了完全保护，以应对挑战。 在COVID-19疫苗方面取得了显著进展。在COVID-19大流行期间，设计了疫苗候选物Ad5-nCoV以传递SARS-CoV-2的S蛋白。在I/II期临床试验中，Ad5-nCoV的单剂量肌肉注射在健康成年人中是可耐受的，并且具有免疫原性，诱导了结合抗体、NAbs和SARS-CoV-2特异性T细胞反应。然而，预先存在的抗载体免疫损害了SARS-CoV-2 NAbs的血清转化，并减少了接种后的T细胞反应。III期临床试验的结果表明，在疫苗单剂量注射后14或28天，总体保护效果分别为68.83%和65.28%。14或28天的严重疾病的保护效果分别为95.47%和90.07%。2021年2月5日，Ad5-nCoV的有条件上市申请获得批准。 哈佛医学院构建了一种基于Ad26的COVID-19疫苗，称为Ad26.COV2.S，其中包含野生型SARS-CoV-2引导序列、全长膜结合S蛋白、在弗林切割位点的突变以及两个脯氨酸稳定突变。Ad26.COV2.S的单次肌肉注射剂量在NHPs中诱导了强大的NAbs，并在SARS-CoV-2挑战后的支气管肺泡灌洗液和鼻拭子中提供了完全或近乎完全的保护。俄罗斯开发并在I期临床试验中测试了单剂量的基于rAd26载体的COVID-19疫苗（卫星光），在血清阴性和血清阳性参与者中均显示出良好的安全性，并诱导了强烈的体液和细胞免疫反应。根据Ad26.COV2.S单剂量在III期临床试验中的有效性和安全性分析，Ad26.COV2.S对中度至重度关键COVID-19提供了52.9%的保护，保护作用持续了6个月。 牛津大学开发了一种基于ChAdOx1的COVID-19疫苗，编码密码子优化的全长S基因，称为ChAdOx1-S。在猕猴中，ChAdOx1-S诱导了一定水平的免疫反应，但保护效果并不理想。初免-加强方案在猪中显著增强了抗体和T细胞反应，但小鼠中没有。在I/II期和II/III期临床试验中，ChAdOx1 nCoV-19被耐受，大多数志愿者观察到体液和细胞免疫反应，在HIV感染个体中诱导了可比的T细胞反应。抗体和保护效果至少持续了3个月。两剂量疫苗的整体有效性为70.4%。然而，III期临床试验曾因一例横贯性脊髓炎的病例报告而暂停。此外，疫苗接种相关的血栓是可能的。ChAdOx1的这些安全问题需要进一步评估。 异源初免-加强策略是减轻抗载体免疫的有效对策。俄罗斯开发了基于rAd26和rAd5载体的异源初免-加强COVID-19疫苗，称为卫星V。与单剂量策略相比，基于异源rAd26和rAd5载体的COVID-19疫苗在参与者中诱导了明显更强的体液和细胞免疫反应。在I/II期研究中，卫星V在所有参与者中诱导了显著的体液反应，血清转化率为100%。在涉及近2万名受试者的III期试验中，报告了91.6%的保护效果。代表性的基于AdV载体的人类疾病疫苗总结在表8中。 1.2.6.痘病毒载体 结合其他疫苗平台的异源初免-加强策略：已有多次尝试通过使用更强的启动子、删除负责免疫调节的基因，以及将MVA181R/182 R替换为抗凋亡基因B13R来提高基于痘病毒载体的疫苗的免疫原性。不幸的是，这些尝试未能取得突破。通过与其他病毒载体疫苗候选物的初免-加强策略，可以改善痘病毒载体疫苗的保护效果。在一项随机临床试验中，进行了涉及AD26-ZEBOV和MVA-BN-Filo的初免-加强方案。在疫苗接种和8个月的随访期间，没有观察到严重的疫苗相关不良事件。Ad26-ZEBOV接受者的血清转化率高于MVA-BN-Filo组。所有疫苗接受者在接受替代疫苗加强和8个月随访后均有可检测的病毒特异性IgG。用Ad26-ZEBOV初免和MVA-BN-Filo加强引发了更强烈的细胞和体液免疫反应，持续了长达1年。Ad26-ZEBOV + MVA-BN-Filo方案于2020年7月1日获得EMA批准。 基于ChAdOx1和MVA，构建了一种基于保守区域的交叉丝状病毒免疫原，涉及丝状病毒N、M和L蛋白。这种疫苗候选物在小鼠中引发了针对埃博拉和MARV的保护。在缺乏GP特异性抗体和NAbs的情况下，ChAdOx1-MVA载体初免-加强策略引发了T细胞免疫并提供了完全保护，进一步证明了异源初免-加强策略的显著效果。对于具有复杂或多个免疫原优势蛋白的病原体，表达不同抗原的初免-加强策略是一种有前景的策略。Guillaume等人开发了分别表达NiV糖蛋白G和融合蛋白F的VACV载体疫苗，称为VV-NiV.G或VV-NiV.F。两剂量的VV-NiV.G或VV-NiV.F或联合两剂量方案在仓鼠中诱导了结合抗体和相对较低滴度的NAbs，并提供了100%的挑战后保护。此外，免疫血清的被动转移实验证明，抗体在免疫保护过程中发挥了重要作用。同样，使用鹦鹉痘病毒（ALVAC）载体构建了ALVAC-G和ALVAC-F。尽管所有方案都实现了完全保护，但接种ALVAC-F的猪显示低NAbs和少量病毒脱落，与基于VSV的NIV疫苗一致。接种两种抗原（ALVAC-F/G）的猪对HeV发展了中等水平的中和滴度。联合使用ALVAC-G和ALVAC-F诱导了最高水平的NAbs和抗原特异性抗体，很可能实现无菌免疫。猪的病毒脱落也被有效阻断，表明在切断NiV从猪到人的传播链中具有重要意义。 在III期临床试验中，ALVAC载体HIV疫苗ALVAC-HIV与重组糖蛋白120亚单位疫苗一起使用。然而，保护效果存在争议。表达基于痘病毒载体的VLP：VLP可以模拟天然病原体并呈现抗原的天然表达。Co-expression of VP40 and GP protein in EBOV resulted in the formation of EBOV-VLP and provided effective protection against challenge. Schweneker等人开发了MVA-BN-EBOV-VLP，其中基于MVA-BN载体共表达了EBOV Mayinga株的VP40和GP以及Tai森林病毒埃博拉的NP。感染MVA-BN-EBOV-VLP的人类细胞产生了大量EBOV VLPs，同时排除了痘病毒膜蛋白B5。接种MVA-BN-EBOV-VLP的小鼠产生了与MVA-BN-EBOV-GP定量相当的EBOV GP特异性细胞和体液免疫反应。同样，GP和VP40的共表达导致了VLPs的产生。然而，与MVA-BN-EBOV-GP相比，MVA-BN-EBOV-VLP疫苗候选物在免疫反应方面没有明显优势。此外，尽管1或2剂量的MVA-VLPs疫苗接种实现了完全保护，但在一些接种的豚鼠和NHPs中检测到低水平的短暂病毒血症。为了针对多种致病性EBOV物种，Karnail等人开发了一种包含ZEBOV和SUDV GP的双价球形埃博拉VLP疫苗。用双价VLPs接种的猕猴产生了强大的体液和细胞免疫反应。同时包含EBOV GP和SUDV GP显著扩展了与单独EBOV GP相比的NAbs和ADCC反应的广度。 GEO-LM01是一种基于MVA的疫苗，表达LASV GPC和Z蛋白，可以产生LASV VLPs。GEO-LM01的单次肌肉注射剂量在小鼠中诱导了高水平的CD4+和CD8+ T细胞，并提供了100%的针对LASV ML29的保护。Co-expression of ZIKV structural proteins PrM and E based on MVA resulting in the assembly of ZIKV VLPs. MVA-ZIKV VLPs induced potent NAbs and cellular immunity dominated by CD8 + T cell responses in mice.此外，MVA-ZIKV的单剂量在易感的免疫功能低下的IFNAR−/−小鼠中显著减少了ZIKV挑战后的病毒血症。 其他处于临床阶段的痘病毒载体疫苗：基于MVA的CCHFV（克里米亚-刚果出血热病毒）、MERS-CoV（中东呼吸综合征冠状病毒）和SARS-CoV-2（严重急性呼吸综合征冠状病毒2）疫苗已经被构建并推进到临床试验阶段。 单剂量的MVA载体疫苗候选物表达MERS-CoV S蛋白（MVA-MERS-S）在小鼠模型中诱导了高水平的NAbs。免疫反应是剂量依赖性的。对肺和支气管的组织病理学分析表明，MVA-MERS-S限制了MERS-CoV在动物模型下呼吸道的复制。MERS-CoV主要由单峰骆驼引入，因此在骆驼中进行了MVA-MERS-S的评估。在两次疫苗接种后，MVA-MERS-S在单峰骆驼中诱导了系统和局部免疫。在两次剂量免疫后，用MERS-CoV挑战时，排出的传染性病毒和病毒RNA显著减少。保护效果与NAbs的存在有关。此外，接种的血清对骆驼痘病毒具有交叉中和活性。I期临床试验表明，两次MVA-MERS-S接种以剂量递增的方式诱导了抗原特异性抗体和T细胞反应。未观察到严重不良事件。在最后一次加强12 ± 4个月后的第三剂MVA-MERS-S加强，持续诱导了长达2年的MERS-CoV-S特异性B细胞和抗体。 MVA-SARS-CoV-2-S是通过在MVA载体基础上表达全长SARS-CoV-2 S蛋白构建的。在两次疫苗接种后，在小鼠、黄金仓鼠和猕猴中诱导了针对SARS-CoV-2的结合IgG抗体和NAbs。在SARS-CoV-2挑战后，接种疫苗的动物显示出病毒载量、肺病理显著减少，并且无症状。肌肉注射、鼻内和腹腔内递送途径都已进行并证明有效。然而，没有进行MVA在相同动物模型中的点对点比较和递送途径依赖性方式。因此，很难确定最佳递送途径。代表性的基于痘病毒载体的人类疾病疫苗总结在表9中。 慢病毒载体（LV），最初来源于人类免疫缺陷病毒（HIV），是理想的疫苗平台，因为它们即使在单剂量免疫后也能产生高度免疫原性和持久的免疫反应。LV的生产涉及在适当的细胞系中共转染转移载体、包膜和包装质粒。待定，LV的复制和整合可以通过操纵长末端重复序列（LTRs）、包装信号和整合酶基因来废除。除了HIV，基于单剂量LV的疫苗在寨卡病毒和SARS-CoV-2的临床前研究中取得了进展，已被证明是免疫原性的、免疫反应持久的，并且在挑战模型中具有保护性。长期免疫可能归因于LV在体内的持久转录。据报道，在注射后3-6个月或更长时间，可以在免疫的小鼠和NHPs中检测到转基因表达。在细胞水平上，LV以染色体外形式存在，并为细胞的寿命产生编码蛋白，这引发了关于潜在插入突变的安全性问题的整合载体。与上文讨论的VSV/RABV ΔG策略类似，LVs的抗载体免疫可以与VSV GP血清型交换策略相结合，甚至是其他包膜糖蛋白。 病毒载体疫苗的粘膜递送诱导局部和外周免疫反应。粘膜递送和触发局部和系统免疫反应是病毒载体疫苗的非凡特征。通常，疫苗的粘膜递送途径包括鼻内、气管内、口服（OR）、气雾吸入等。已研究了通过鼻内或口服递送的VSV载体疫苗。当rVSVΔG/ZEBOVGP疫苗通过IN、OR或IM途径给予时，NHPs对ZEBOV的致命挑战100%保护。重组疫苗的IN免疫似乎比IM免疫更具免疫原性。对于COVID-19，通过rVSVΔG-S在黄金仓鼠和NHPs中的IN免疫比IM免疫显著提高了NAbs，并提供了更好的挑战后保护。在人类临床试验中，单剂量IM给药的rVSV-SARS-CoV-2的抗体反应不理想。这种令人失望的结果可能与疫苗递送途径的选择有关。对于呼吸道疾病，基于VSV的复制型COVID-19疫苗可以通过呼吸道更好地模拟SARS-CoV-2的自然感染过程，从而引发强烈和保护性的免疫反应。组织趋向性和血管紧张素转换酶2（ACE2）的表达和丰度，SARS-CoV-2的受体，可能有助于阐明rVSV-SARS-CoV-2在人类和动物模型中的递送途径依赖性方式。ACE2在上呼吸道和肺部广泛分布，而在骨骼肌中的分布较低。在SARS-CoV-2疑似动物模型中的挑战研究支持了这一假设。类似的结果在rVSV载体MERS疫苗的临床前研究中也有所呈现。 RABV载体作为口服双价狂犬病疫苗，被称为rERAG333E，其中包含RABV ERA株G蛋白的G333E突变。随后，拯救了表达ZEBOV或SUDV糖蛋白的重组病毒rERAG333E/ZGP和rERAG333E/SGP。两种疫苗在小鼠中诱导了病毒特异性NAbs和结合抗体反应。然而，rERAG 333E/ZGP诱导的ZEBOV NAbs低于通过OR或IM途径的VSV载体埃博拉疫苗。所有通过OR途径接种rERAG333E/ZGP的狗都发展了针对ZEBOV的持久NAbs，尽管预先存在抗RABV免疫。此外，基于rERAG333E载体表达NIV马来西亚株的附着糖蛋白（NIV-G）或融合糖蛋白（NIV-F）的rERAG333E/NiVG和rERAG333E/NiVF被构建。在小鼠和猪中通过OR免疫后，rERAG333E/NiVG和rERAG333E/NiVF均诱导了RABV和NIV NAbs以及高水平的NIV-G或NIV-F特异性Ig G。这项研究首次提供了一种安全方便的NIV口服疫苗。因此，活的rERAG333E是RABV和其他病原体流行区自由漫游动物的潜在口服双价疫苗。 基于PIV和NDV的粘膜疫苗已在本综述的第二部分中总结。这些通过IN递送的疫苗为儿科疾病和呼吸道疾病提供了独特的优势。此外，已在病毒性出血热中进行了初步应用，其效果似乎不如呼吸道疾病。有趣的是，PIV5-G表达RABV G通过IN、IM和OR免疫在小鼠中诱导了针对致命RABV挑战的保护性免疫反应，被作为有效的副黏病毒载体口服狂犬病疫苗。这符合无针疫苗策略，保护流浪狗和野生动物免受狂犬病的侵害。目前，粘膜递送的IFV载体疫苗仅限于呼吸道疾病。外源基因表达的有限大小和稳定性问题阻碍了IFV在其他传染病中的合理应用。 腺病毒（AdV）载体疫苗与粘膜递送兼容，这归功于它们独特的组织趋向性，涉及上呼吸道、下呼吸道、胃肠道或结膜。与肌肉注射免疫相比，Ad5-EBOV的鼻内（IN）给药同样能够为小鼠、豚鼠和非人灵长类动物（NHPs）提供完全保护，使其免受致命挑战。此外，IN给药可以绕过对Ad5载体的预先存在的免疫力。在仓鼠中，Ad5载体COVID-19疫苗通过口服或鼻内递送减少了疾病的严重程度和传播。异源加强免疫接种，使用雾化Ad5-nCoV在两次灭活COVID-19疫苗初免后，是安全且高度免疫原性的，NAbs显著高于同源初免加强策略。ChAdOx1 nCoV-19也在临床试验中通过IN递送进行了测试。只有少数参与者在IN疫苗接种后检测到粘膜反应，这些反应通常低于SARS-CoV-2感染后所见。IN疫苗接种后的系统反应通常比ChAdOx1 nCoV-19肌肉注射后的反应更弱。有趣的是，在IN疫苗接种后，接种了mRNA疫苗的参与者中可检测到粘膜抗体。Vaxart开发了一种口服片COVID-19疫苗，由Ad5载体表达SARS-CoV-2的S和N基因以及RNA佐剂组成。在I期临床试验中，该疫苗耐受性良好。疫苗接种者显示出粘膜分泌型IgA的增加，持续时间长达360天。然而，没有观察到血清NAbs。其对COVID-19的保护效果需要进一步研究。上述结果表明，粘膜疫苗可能是新型COVID-19疫苗的重要补充资源。同样，通过IN和IM途径单剂量免疫ChAdOx1-S表达MERS-CoV S蛋白，也在致死转基因BALB/c小鼠模型中诱导了强烈的免疫反应，并提供了对致命挑战的保护。 在上述概念验证研究中，基于VSV的疫苗通过IN或OR递送，在病毒性出血热和β冠状病毒中表现良好。IN递送途径甚至比IM递送更具免疫原性。这可能归因于VSV的快速复制和丰富的抗原表达，同时与复杂的肺部免疫环境有关，这使得大量抗原呈递并触发了局部和系统的免疫反应。RABV载体作为口服狂犬病疫苗参与，诱导了持久的免疫反应。然而，RABV基疫苗的其他粘膜递送途径尚未得到充分研究。PIV、NDV和IFV载体疫苗主要设计为IN递送方案，特别是在呼吸道疾病中。这些单剂量疫苗具有免疫原性和保护性。与基于VSV的疫苗中所见类似，AdV基EBOV疫苗的IN给药比IM免疫提供了更好的保护。这一现象进一步证实了IN接种的潜力。然而，正如所讨论的，这些病毒载体疫苗通过不同的方案设计和递送，针对不同的抗原，使得粘膜递送的平行比较不适用。据我们所知，粘膜递送的潜力可能与重组病毒的复制能力密切相关。 在不久的将来，这些病毒载体疫苗的粘膜递送值得进一步研究。特别是，粘膜免疫与保护效果之间的关系应该明确界定。 病毒载体作为癌症治疗疫苗的应用。免疫疗法是癌症治疗中的一种有效方法，其中溶瘤病毒疗法是肿瘤免疫疗法的一个重要分支。简而言之，溶瘤病毒（OVs）是自然发生或基因工程改造的，它们优先在肿瘤细胞中复制并选择性地杀死肿瘤细胞，释放肿瘤相关抗原（TAAs），并通过外源基因递送刺激抗肿瘤免疫反应。目前，全球已有四种OV疗法获得批准，包括针对黑色素瘤、鼻咽癌、黑色素瘤和胶质瘤的Rigvir、Oncorine、Imlygic和Delytact。 图2 溶瘤病毒(OVs)的靶向和溶瘤机制。OVs靶向功能失常的信号通路。(1) 靶向Wnt信号通路，重组腺病毒表达肺癌抑制因子-1(TSLC1)，通过下调Tcf4/β catenin的转录活性，抑制CyclinD1和C-myc的表达，从而杀死Wnt异常激活的肝癌细胞。(2) 删除E1A(922-947)的AdVs复制并裂解肿瘤细胞。OVs针对肿瘤微环境(TME)的适应或改善。(3) VSV在缺氧条件下复制，eIF-2α的磷酸化亚基增加，并通过对翻译启动因子eIF-4E的去磷酸化抑制宿主细胞蛋白的翻译。(4) 缺氧诱导因子(HIFs)启动子被应用于AdV，以在缺氧条件下靶向递送基因。(5) VSV自然靶向血管内皮细胞并抑制肿瘤细胞的生长。(6) OVs表达血管生长因子抑制剂(sFlt-1)和抗血管生成细胞因子(IL-24)以抑制肿瘤血管生成。OVs靶向免疫抑制的TME。(7) 设计OVs表达多种细胞因子、趋化因子、免疫检查点抑制剂(ICIs)和新抗原。(8) 同时表达细胞因子(GM-CSF)和ICIs(iPD-L1)的OVs。(9) 编码新抗原的OVs和异源初免-加强策略(AdV+MVA)。(10) OVs激活免疫细胞进行肿瘤溶解。(11) 结合肿瘤特异性启动子衍生的转录靶向与转导靶向（通过病毒衣壳整合抗人癌胚抗原单变量域）。(12) 结合OV疗法与化疗、放疗和其他免疫疗法等。（使用BioRender创建） 与传染病的预防性疫苗相比，治疗性癌症疫苗更具挑战性，因为它们的活性可能会受到牢固的免疫抑制复杂肿瘤微环境（TME）和自体TAAs的低免疫原性的阻碍。有关OVs的靶向和溶瘤过程的几个方面，包括肿瘤细胞的表面受体、肿瘤相关信号通路、TME和抗肿瘤免疫细胞。通过基因组的改造和操纵，可以使OVs有效靶向并杀死肿瘤细胞，前提是选择了正确的肿瘤抗原，特别是所谓的肿瘤新抗原。针对肿瘤相关信号通路：肿瘤的发生和发展与细胞内信号通路的异常调节密切相关。Wnt信号通路在肿瘤中异常激活，主要是由于结肠腺瘤性息肉病的截断突变，使β-Catenin稳定形成，随后β-Catenin进入细胞核，结合Tcf/Lef家族转录因子并激活cyclin D、C-myc和其他Wnt靶基因，导致肿瘤发生。RB-E2F是另一个涉及肿瘤的信号通路。在正常细胞中，视网膜母细胞瘤肿瘤抑制蛋白（RB）通过招募组蛋白去乙酰化酶抑制E2F活性。当RB功能失常时，E2F释放并招募转录激活因子促进肿瘤的发生和发展。IFN信号通路与抗病毒免疫相关，同时也与肿瘤相关。IFN与干扰素受体（IFN-R）结合并诱导蛋白激酶R（PKR）的表达。当病毒的dsRNA结合到PKR时，激活的PKR导致elF-2α的磷酸化，抑制蛋白质合成，从而抑制病毒在细胞中的复制。OVs进入后，细胞IFN反应是溶瘤敏感性的关键决定因素。已设计出基因表达签名来预测溶瘤病毒治疗效果，指定恒定的IFN途径激活。基因工程化的OVs旨在作用于这些功能失常的信号通路。针对Wnt信号通路，构建了表达肺癌抑制因子-1的重组腺病毒Ad.wnt-E1A(Δ24bp)-TSLC1。Ad.wnt-E1A(Δ24bp)-TSLC1可以靶向并杀死Wnt信号通路异常激活的细胞，而对正常细胞没有明显的杀伤效果。进一步研究表明，TSLC1下调了Tcf4/β catenin的转录活性，并抑制了CyclinD1和C-myc的表达，从而杀死了Wnt异常激活的肝癌细胞，这在人肝癌SMMC-7721细胞的裸鼠移植瘤模型中得到了进一步证实。在AdV基因组中，E1A的922-947 bp是RB家族的结合区域。因此，删除E1A的922-947 bp构建了重组腺病毒dl922-947。感染RB缺乏的肿瘤细胞后，dl922-947可以复制并裂解肿瘤细胞。dl922-947还可以有效抑制乳腺癌异种移植模型中肿瘤转移的发生。正如所综述的，NS1蛋白是IAV的毒力因子，可以抵抗IFN信号通路中PKR介导的抗病毒反应。NS1缺失的IAV不能在正常细胞中复制，而激活的Ras可以在肿瘤细胞中去磷酸化PKR，因此NS1缺失的IAV可以在Ras激活的肿瘤细胞中复制。Bergmann等人敲除了IAV的NS1片段构建了delNS1。然后分别在正常细胞和表达N-ras基因的正常细胞中测试了delNS1。结果表明，delNS1选择性地在表达N-ras基因的正常细胞中复制，这证实了IAV作为一种有效的OV，针对IFN信号通路。因此，针对异常激活的信号通路可以提高OVs的靶向性。 靶向或改善肿瘤微环境（TME）的适应性：缺氧、新生血管生成和免疫抑制状态是决定肿瘤发生、进展和转移的微环境问题。因此，溶瘤病毒（OVs）通过改善缺氧环境、抑制新生血管生成和调节肿瘤的免疫抑制状态来发挥作用，相应地抑制肿瘤细胞的增殖和扩散。此外，OVs最常见的肿瘤靶向机制是处理与复制相关的基因，即在癌细胞中不需要复制功能的病毒基因的失活，但在健康组织中病毒复制是必需的。 巧合的是，在缺氧条件下，VSV在mRNA产生方面更有效。VSV能够在感染后期克服缺氧条件下增加的eIF-2α磷酸化亚基，并在感染初期抑制病毒蛋白合成。同时，VSV感染可以通过去磷酸化翻译启动因子eIF-4E来抑制宿主细胞蛋白翻译，这抑制了肿瘤细胞的生长和增殖。后来，在体外和体内证实了VSV的复制和细胞病变效应。缺氧诱导因子（HIFs）启动子也可以应用于缺氧下的靶向基因递送。作为肿瘤缺氧环境中的主要分子，HIFs在缺氧条件下被激活。缺氧诱导因子-1（HIF-1）通过直接结合缺氧反应元素（HRE）在缺氧条件下启动转录反应。因此，HIF-1和HRE基因是缺氧环境中肿瘤细胞的靶标。HYPR-Ad#1是一种改良的AdV，其中E1A基因受HIF-1启动子控制。HYPR-Ad#1只能在显示HIF-1激活的缺氧肿瘤细胞中复制。在HIF-1激活的脑肿瘤细胞中感染HYPR-Ad#1后，E1A过度表达，超过90%的细胞显示出显著的细胞病变效应（CPE）。以上结果表明，HYPR-Ad#1可以在被缺氧和HIFs激活的肿瘤细胞中复制。 肿瘤血管生成在侵袭性肿瘤的生长和转移中起着关键作用。因此，通过自然靶向杀伤效应或间接表达血管生长因子抑制剂来抑制肿瘤血管生成，可能有助于抑制肿瘤血管生成。VSV可以自然靶向血管内皮细胞。VSV感染可以有效抑制肿瘤细胞的生长。以前的研究表明，野生型VSV特异性感染肿瘤组织中的内皮细胞（ECs）并显示抗肿瘤效应。此外，OVs表达血管生长因子抑制剂可以提高它们抑制肿瘤血管生成的能力，从而抑制肿瘤生长和转移。ZD55-sflt-1是一种表达可溶性血管内皮生长因子受体抑制剂sFlt-1的溶瘤AdV。它在人类结肠癌动物模型中对肿瘤血管生成显示了抑制作用。具体来说，IL-24是一种有效的抗血管生成细胞因子，可以抑制血管生成并诱导肿瘤细胞凋亡。IL-24基因被插入AdV中，称为HE1B55D-RGD-IL-24。在此基础上，将额外的抗血管生成阻断片段插入AdV以构建HE1B55D-RGD。在裸鼠黑色素瘤移植瘤模型中给予这两种溶瘤腺病毒后，抑制了血管内皮生长因子（VEGF）和转化生长因子β，从而导致抗血管生成活性。 溶瘤效果可以通过肿瘤分泌的基质金属蛋白酶（MMP）进一步激活。最初，MeV融合蛋白包含一个furin切割位点，并依赖于细胞内蛋白酶处理蛋白质并激活颗粒。因此，用被基质金属蛋白酶识别的序列或尿激酶型纤溶酶原激活剂替换furin切割位点增加了肿瘤特异性，即表达修饰F蛋白的重组MVs只传播在分泌MMP的细胞中。这些研究强调了OVs在肿瘤微环境中的靶向和颗粒激活的结合。 靶向免疫抑制的TME：癌细胞适应通过表达多种抑制性配体来严格限制抗肿瘤免疫，这些配体为免疫细胞提供所谓的“免疫检查点”分子，从而传递抑制性信号，阻止T细胞的激活和存活。为了调节免疫抑制状态并增强抗肿瘤免疫，OVs被设计为表达各种细胞因子、趋化因子和免疫检查点抑制剂（ICIs），并与嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）联合作用。此外，新抗原被认为是癌症疫苗的有前途的肿瘤抗原，没有自我耐受，但有可能诱发强大和选择性的T细胞反应。新抗原的发现和使用取决于下一代测序等新技术。肿瘤特异性新抗原的定义以及有效ICIs的批准，有助于新型基于载体的癌症疫苗的临床发展。 表达如IL-12、IL-13、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、趋化因子CCL19和CD40L等细胞因子的OVs已被证明可以有效地招募和激活抗原呈递细胞（APCs）和CD4+T细胞和CD8+T细胞，并减少TGF-β和VEGF的表达，从而缓解免疫抑制。值得注意的是，80%的胶质母细胞瘤（GBM）肿瘤过度表达白细胞介素-13受体α2（IL-13Rα2）。为了通过IL-13Rα2重新靶向GBM，通过展示人类IL-13生成了MeV-GFP-HAA-IL-13。MeV-GFP-HAA-IL-13在IL-13Rα2过度表达的胶瘤系中表现出强大的合胞体形成。MeV-GFP-HAA-IL-13在GBM12同种异体植入GBM小鼠模型中的体内治疗显著延长了生存期。在小鼠中枢神经系统中给予MeV-GFP-HAA-IL-13后未观察到神经毒性。 水痘病毒VV-IPDL1/GM通过同时表达GM-CSF和程序性死亡配体抑制剂（iPD-L1）构建。在肿瘤细胞中，iPD-L1与程序性死亡配体（PD-L1）结合，从而恢复抗肿瘤细胞免疫。在B16-F10小鼠黑色素瘤模型中，VV-IPDL1/GM的肿瘤内给药可能促进肿瘤浸润树突细胞（DCs）的成熟和肿瘤特异性T细胞的激活。VV-IPDL1/GM为靶向肿瘤治疗提供了更有效的治疗方案，特别是对于对PD1/PDL1阻断疗法有抵抗力的患者。 远离使用传统的免疫介质，从TME中清除免疫抑制分子也已被考虑。一种溶瘤VACA被设计为表达前列腺素失活酶15-(NAD)（HPGD）。HPGD的表达选择性地耗尽了Treg和骨髓源抑制细胞（MDSCs）群体，从而通过上调与Th1相关的趋化因子来增强抗肿瘤免疫反应。同样，通过设计表达瘦素的溶瘤VACA实现了TME的代谢重编程。在OV诱导的免疫浸润背景下，瘦素改善了肿瘤浸润淋巴细胞中的线粒体氧化磷酸化（OXPHOS），防止了CD8 + T细胞的代谢耗竭，从而增强了治疗效果和抗肿瘤记忆的发展。 已开发出一种编码多达50个患者特异性新抗原的溶瘤腺病毒平台MY-NEOVAX。MY-NEOVAX治疗在改善两位患有最后一线治疗耐药的结直肠癌和高级别神经内分泌癌患者的生存方面证明有效。基于来自非人类大猩猩的AdVs，研究了一种新型大猩猩腺病毒（GAd）编码多种新抗原的效力和效果。预防性或早期治疗性接种GAd在小鼠中有效控制肿瘤生长。相比之下，需要将疫苗与检查点抑制剂结合以根除大肿瘤。与单独使用抗PD1相比，用GAd和抗PD1治疗的动物中活化的肿瘤浸润T细胞更丰富，TCR谱系更多样化。这项研究表明，在高肿瘤负担存在的情况下，疫苗的有效性与新抗原特异性T细胞的广度相关，并需要通过检查点阻断同时逆转肿瘤抑制。异源初免-加强策略也已应用于肿瘤疫苗，以克服抗载体免疫。Leoni等人为治疗微卫星不稳定性（MSI）肿瘤开发了一种基于新抗原的初免-加强疫苗。新抗原（FSP）被选择并克隆到非人类GAd和MVA载体中，产生一种病毒载体疫苗，称为Nous-209。在小鼠中，Nous-209能够有效地诱导广泛的FSP特异性CD8+和CD4+ T细胞反应。此外，FSP在体外由人类APCs处理，随后激活人类CD8+ T细胞。Nous-209编码许多在MSI肿瘤中共享的新抗原，这些新抗原诱导了最佳的免疫反应广度，可能实现临床治疗和预防MSI肿瘤的益处。另一种基于非复制AdVs与溶瘤马拉巴病毒MG1的异源初免/加强方案，两者都表达MAGE-A3，在Macaca中已显示可诱导TAA特异性免疫反应的扩增和长期持久。这些结果表明，异源初免-加强策略在癌症治疗中同样适用。 转录和转导双靶向：理论上，通过OVs的自然趋向性或基因修饰OVs基于表面受体靶向肿瘤细胞是可行的。然而，这种基于受体的策略对于具有广泛受体和细胞趋向性的OVs来说并不适合，这阻碍了对肿瘤的精确杀伤。通过在病毒颗粒上工程化TAA特异性配体（或抗体），实现了OVs对肿瘤特异性抗原的重新靶向。保持了OVs的完整复制活性，同时不损害它们的安全特性。 为了进一步提高靶向的精确度，人们尝试将肿瘤特异性启动子衍生的转录靶向与转导靶向（通过病毒衣壳整合抗人癌胚抗原单变量域）结合起来。结果显示，将单变量域遗传整合到AdV纤维中，提高了感染的特异性和单变量域靶向溶瘤AdV的复制效率。双重靶向，无论是转录层面还是转导层面，都是提高这些先进一代条件复制AdVs治疗指数的有希望的手段。这种重新靶向策略为OVs提供了对肿瘤细胞的选择性，同时使病毒从其自然受体上解靶向。这种方法被认为适用于系统递送，因为它最小化了在健康组织中的病毒复制。 免疫细胞的激活：MeV自然且优先在恶性细胞中复制，这有助于抗肿瘤免疫和肿瘤溶解。为了提高MeV激活的NK细胞针对肿瘤细胞的细胞毒性活性，开发了一种编码NK细胞上的CD16A和作为模型肿瘤抗原的癌胚抗原（CEA）的溶瘤MeV疫苗，称为双特异性杀手参与剂（MV-BiKE）。MV-BiKE介导了感染肿瘤细胞中功能性BiKE的分泌。在结直肠癌或胰腺癌细胞中，MV-BiKE通过NK细胞指定了抗肿瘤细胞毒性，并介导了效应细胞因子的表达和脱颗粒。在这项概念验证研究中，证明了利用NK细胞作为抗肿瘤效应器的病毒载体疫苗。类似地，OVs也可以增加髓系和浆细胞样DCs介导的细胞毒性，将巨噬细胞调节为抗肿瘤表型并激活中性粒细胞，导致相关细胞因子的分泌。 NDV已被报道为临床中的OV。儿童高级胶质瘤用溶瘤病毒MTH-68/H治疗，这是NDV的减毒株，结合口服丙戊酸。上述治疗导致丘脑胶质瘤的深远退缩，尽管随后需要第二次神经外科手术。这项研究记录了NDV的溶瘤效应，针对病毒存在和在肿瘤细胞中的复制。在GBM患者的I/II期试验中，当通过静脉内递送应用高剂量时，溶瘤NDV被良好耐受。 临床中的先进OVs和批准的OVs：1型单纯疱疹病毒（HSV-1）是一种杰出的OV，通过肿瘤内复制和诱导抗肿瘤免疫反应来工作。Talimogene laherparepvec（T-VEC，Imlygic）是一种基于HSV-1的OV，用于无法切除的IIIB–IV期黑色素瘤。在细胞系和动物模型中进行了临床前评估，T-VEC在临床试验中得到了广泛评估。在I期临床试验中，HSV-1被设计为表达GM-CSF，通过招募和成熟树突细胞，另一种增强局部和系统抗肿瘤免疫的机制被激发。进一步，在II期临床试验中评估了T-VEC的疗效。在50名晚期黑色素瘤患者中，有10名患者在接受了六次T-VEC注射后有完全反应（CR），3名患者有部分反应（PR），总有效率（ORR）为26%。总体生存率在1年时为58%，在24个月时为52%，这些证据证明了T-VEC的系统有效性。T-VEC在III期临床试验中改善了晚期黑色素瘤患者的持久反应。持久反应率在T-VEC治疗组（16.3%；95%CI，12.1–20.5%）明显高于GM-CSF治疗组（2.1%；95%CI，0–4.5%）；比值比，8.9；P < 0.001）。T-VEC治疗组的ORR和总体生存率也更优越，尤其在IIIB、IIIC或IV期黑色素瘤患者中疗效最明显。T-VEC仍然是唯一广泛批准的OV治疗，在临床应用过程中进行了优化。 G207是第二代溶瘤HSV-1，涉及γ34.5基因的缺失和ICP6基因的失活。这些修改减少了致病性并促进了抗肿瘤特性。除了直接的溶瘤活性外，G207在小鼠肿瘤模型中被证明可以加强抗肿瘤免疫。在恶性胶质瘤患者中，G207在肿瘤切除前后应用以及其他肿瘤治疗中被证明是安全的。在进化过程中，第二代溶瘤HSV-1的alpha47基因的缺失和US11启动子区域的重叠，增强了肿瘤特异性复制能力和肿瘤细胞中的细胞病变效应。这种第三代HSV-1，即G47Δ，在体内显著比其母体G207更有效，同时保持了安全特性。在I/II期临床试验中，G47Δ用于治疗残留或复发的胶质母细胞瘤患者，最多六剂或2周内两剂。G47Δ治疗与提高生存率和中位总体生存率相关。总体而言，在随访期间观察到患者的反应和稳定疾病。活检显示，通过增加肿瘤浸润性淋巴细胞的数量，TME得到了改善。G47Δ（Delytact）已在日本获得胶质母细胞瘤的批准。 H101是E1B-55 kDa基因缺失的复制选择性AdV，已在中国（Oncorine）作为OV批准。在III期随机临床试验中，H101用于治疗鼻咽癌。H101与化疗联合应用实现了72.7%的ORR，而单独化疗为40.3%。总体而言，H101对鳞状细胞癌患者安全有效。同样，基于AdV的OVs，DNX-2401，在复发恶性胶质瘤的临床试验中进行了测试，结果显示出强大的反应和长期生存，这可能归因于病毒的直接溶瘤效应，随后引发免疫介导的抗胶质瘤反应。Nadofaragene firadenovec（rAd-IFNa/Syn3）是一种复制缺陷型rAdV，将人干扰素alfa-2b cDNA传递到膀胱上皮，适用于卡介苗无反应的非肌层浸润性膀胱癌。Nadofaragene firadenovec治疗后，53.4%（55/103）的原位癌患者在首次剂量后的3个月内有完全反应，这种反应在12个月时在45.5%（25/55）的患者中得以维持。以上结果表明，nadofaragene firadenovec是有效的，并提供了有利的益处。 ECHO-7（Rigvir），一种批准用于I–II期黑色素瘤的肠道病毒，与其它实验性免疫疗法相比，降低了疾病进展的风险。 OVs的关注点和前景：天然病毒作为第一代溶瘤病毒疗法。尽管它们在治疗实体瘤和少数转移瘤方面取得了一定的疗效，但它们存在诸如靶向性差、副作用、无法有效引发肿瘤免疫以及只能瘤内给药等缺陷。此外，通过插入细胞因子等提高肿瘤靶向性、减少毒性副作用和增强抗肿瘤免疫反应，一直是治疗难治性实体瘤和转移瘤的研究方向。尽管溶瘤病毒疗法取得了巨大进展，但在治疗过程中也存在许多障碍。除了预防性病毒载体疫苗中出现的这些问题外，OVs的给药途径和临床患者的选择在OVs的开发过程中也将是困难的。尽管上述一些问题可以通过预防性病毒载体疫苗中的同等解决方案来解决，但还需要额外的对策。 为了进一步提高OVs的治疗效力，在溶瘤病毒疗法T-VEC、抗PD-1抗体和化疗的联合治疗中取得了显著的突破。在黑色素瘤治疗中，T-VEC与PD-1抗体联合使用，使肿瘤客观反应率达到62%，完全反应率为33%。对于对抗体治疗有抗性的患者，Oncorine与抗体药物的联合治疗提供了额外的好处。患者症状改善，并在肺组织部分坏死的情况下实现了病情稳定。这些发现表明，溶瘤病毒疗法与肿瘤相关抗体和化疗药物的结合，可能通过改变肿瘤微环境而表现更好。 然而，OVs诱导的免疫反应与抗肿瘤效力之间的相关性在很大程度上仍然未知，无论是先天还是适应性抗肿瘤免疫。关于OV和CPI联合使用的临床知识将有助于更好地了解如何优化这些病毒在癌症治疗中的使用。重要的是，深入理解和准确利用OVs的基础生物学和药理学可能实现OVs的系统给药，并扩大其在癌症中的应用范围。 1.3.病毒载体疫苗的几个关键方面 以递送途径依赖的方式触发免疫反应。阐明递送途径依赖的免疫反应对于疫苗设计和特定病原体的递送途径选择具有重要意义。图3（以重组AdV为例）说明了病毒载体疫苗肌肉注射后触发的抗原呈递和免疫反应的潜在机制。病毒通过受体和配体识别进入肌细胞。然后病毒通过内吞作用被吸收。在细胞质中，病毒从内体中逃逸，部分解聚衣壳，并通过微管网络进入细胞核。目标基因的转录在细胞核中进行，然后在内质网和高尔基体中分别完成抗原蛋白的翻译和翻译后修饰。APCs捕获抗原蛋白，分别通过MHC I类和MHC II类向CD8+ T细胞和CD4+ T细胞呈递。CD8+ T细胞在细胞因子的调节下介导感染细胞的溶解。同时，刺激的B细胞分化为记忆B细胞和浆细胞。浆细胞产生NAbs和结合抗体。这些抗体参与病毒中和和Fc介导的功能，包括ADCC和ADCP等。 图3 肌肉注射递送病毒载体疫苗的抗原呈递机制。(1) 重组病毒载体疫苗的构建和接种。(2) 病毒载体疫苗通过内吞作用被肌细胞摄取。(3) 病毒载体疫苗从内体逃逸。(4) 部分解体的病毒衣壳运输到细胞核，启动转录过程。(5) 在内质网和高尔基体中进行蛋白质翻译和翻译后修饰。(6) 抗原蛋白呈递给抗原呈递细胞。抗原可以装载到MHC I类分子上，直接呈递给CD8+ T细胞，以及装载到MHC II类分子上，直接呈递给CD4+ T细胞。(7) T细胞在细胞因子的介导下裂解感染细胞。(8) 刺激的B细胞分化为记忆B细胞和释放抗体的浆细胞。(9) 抗原蛋白被抗体识别，包括能够介导Fc效应功能的抗体，包括抗体介导的细胞毒性和抗体依赖性细胞介导的吞噬作用。(10) 中和抗体中和病原体并阻止它们进入。（使用BioRender创建） 在呼吸道的独特情况下，先天和适应性免疫反应被紧密调节，并在病原体清除、免疫调节和组织修复之间进行持续的平衡。与肌肉注射相比，重组病毒载体疫苗的鼻内递送诱导局部和外周免疫反应（图4，以rVSV为例）。疫苗接种和病毒进入粘膜后，由上皮下浆细胞产生分泌型免疫球蛋白（sIgA和sIgM）。它们与先天免疫对应物一起提供抗原特异性靶向。同时，招募了先天免疫细胞。它们中的一些将抗原处理并传递给APCs，主要是DCs。活化的DC迁移到引流淋巴结。在T细胞区，DC训练naïve T细胞并导致克隆扩增。然后，抗原识别通过T细胞激活B细胞。活化的B细胞进入生发中心（GC），进行扩增，导致长期记忆B细胞和高亲和力浆细胞。 图4 鼻内递送病毒载体疫苗诱导的局部和外周免疫反应。(1) 鼻内递送病毒载体疫苗和重组病毒的进入。(2) 由上皮下浆细胞产生的局部分泌型免疫球蛋白A。(3) 抗原被先天免疫细胞和抗原呈递细胞识别和处理。(4) 免疫细胞的招募，包括中性粒细胞、自然杀伤细胞和单核细胞。(5) 活化的树突细胞通过传入淋巴管流向引流淋巴结，以启动适应性反应。在淋巴结T细胞区，外源性抗原在II类MHC上呈递，促使CD4+ T细胞训练，而内源性抗原在I类MHC上处理并呈递给CD8+ T细胞。(6) 抗原呈递细胞促进naïve CD4+和CD8+ T细胞的成熟和扩增。CD8+细胞毒性T细胞和CD4+ T辅助细胞亚群流回感染部位。(7) 活化的B细胞经历扩增和B细胞受体（BCR）的体细胞突变，结果BCR特异性强烈结合在滤泡树突细胞（FDCs）表面维持的肽段。B细胞通过迭代轮次的扩增/体细胞突变和亲和力选择，导致选择高亲和力BCRs。(8) 与滤泡辅助性T细胞（Tfh）的相互作用导致B细胞分化和类别转换为长期记忆B细胞和高亲和力浆细胞，它们流向感染部位或作为长期记忆群体维持。（使用BioRender创建） 几个疫苗候选物在口服疫苗接种后显示出强大的潜力。然而，关于口服递送的重组病毒载体疫苗与复杂的口胃肠道（GI）环境之间的相互作用的数据有限，因此尚不清楚病毒进入以及在系统和粘膜部位建立体液和细胞免疫反应的机制。目前的证据表明，咽扁桃体和腺样体以及小肠的Peyer斑可能是诱导疫苗接种后免疫反应的潜在部位。值得注意的是，Peyer斑是刺激免疫反应的核心部位。这个过程涉及M细胞摄取抗原、抗原的运输和释放，以及T细胞的活化。然而，由于胃和肠道的化学条件恶劣，病毒载体疫苗似乎很难在没有特定材料包裹的情况下到达小肠。在不久的将来，需要进一步研究病毒载体疫苗口服接种后的抗原呈递机制。 选择病毒载体平台，平衡安全性和免疫原性。安全性和免疫原性是有望成为疫苗的关键组成部分。在大多数情况下，需要根据具体情况实现微妙的平衡。对于针对高死亡率的致命性出血热的紧急大规模疫苗接种，rVSV载体复制型疫苗是合理的选择，因为它具有单剂量方案、强大的免疫原性和快速的免疫反应特征。对于流感和COVID-19等经常出现的呼吸道疾病，PIV、IFV和NDV载体疫苗为鼻内递送的单剂量疫苗或加强疫苗提供了合适的选择。对于具有相应医疗条件的医疗工作者，多剂量接种基于RABV的灭活疫苗或基于AdV和痘病毒载体的异源初免-加强方案，在最小化抗载体免疫的同时结合了免疫原性和持久性。异源初免-加强方案可以最大化特定单一载体中看到的好处并规避限制。在不久的将来，需要更清晰地定义这些病毒载体的一般和独特特征，以进一步支持病毒载体的选择。 根据对这些NNSV载体疫苗的点对点比较的有限研究，VSV载体疫苗在单剂量肌肉注射后似乎比RABV或PIV和DNA病毒载体疫苗更具免疫原性和有效性。上述现象可以归因于VSV的强大复制动态。作为一种活载体，PIV被认为是一个相对安全的疫苗载体，这比其他开发的NNSV载体具有优势，后者遇到了病毒逆转、残留毒力等问题。特别是，PIV载体疫苗的安全性已在2个月以上的儿童中得到评估，这代表了儿科疾病的一个理想平台。 图5 口服递送病毒载体疫苗诱导免疫反应的潜在部位。在口腔内，病毒载体疫苗通过包括咽扁桃体、管扁桃体、腭扁桃体和舌扁桃体等的口腔淋巴组织进入。在小肠中，Peyer斑是免疫反应的核心部位(1) T细胞从血管进入Peyer斑。(2) M细胞通过内吞作用和吞噬作用摄取抗原。(3) 抗原通过M细胞在血管中运输并在基底表面释放。(4) Peyer斑中的T细胞遇到抗原并被树突细胞激活。（使用BioRender创建） 确实，复制型病毒载体疫苗为粘膜递送和免疫反应持续时间提供了额外的好处。相比之下，强大的复制能力可能伴随着更高的副作用风险，特别是在像孕妇、婴儿和老年人这样的免疫受损个体中。因此，需要一种减毒策略来解决生物安全问题。理想情况下，病毒载体疫苗的减毒应该保持免疫原性。对于VSV，实施了第二代rVSV设计策略，称为N4CT1，它涉及在基因组的3′端增加一个额外的转录单元，将N基因转移到第四个转录单元，以及截断VSV G CT域（图1a）。N4CT1通过改变基因组中特定蛋白的基因位置来减毒，已在人类临床试验中得到验证。这种策略也适用于其他NNSVs。此外，病毒mRNA帽（甲基转移酶，MTase）活性是活减毒病毒载体疫苗开发的一个极好靶点，因为病毒mRNA帽对mRNA稳定性、蛋白质翻译和先天免疫逃逸至关重要。MTase的缺乏已被证明在免疫能力和免疫受损的小鼠中完全减毒，同时免疫原性并未减弱。此外，利用L111A的温度敏感组装缺陷突变，并结合rVSV M蛋白中的M51R突变，显著降低了病毒的致病性，同时保持了高效的病毒生产。这些策略可以单独使用或组合使用，以提高复制型病毒载体疫苗的安全性。在RABV中，先前的减毒策略集中在删除致病基因（G/P/M）。然而，这些策略使重组病毒复制缺陷，从而降低了挑战后的保护效果，使它们不太有吸引力。 相反，基于SADB19的减毒策略，SADB19是欧洲授权用于野生动物疫苗的菌株。涉及G蛋白R333E突变的RABV SADB19被证明在神经毒力上显著减毒。同样，在PIV载体疫苗中，过度减毒可能导致在人类中的效力不足。因此，在病毒载体减毒方面，应及时考虑并保持免疫原性。 目前，已有三代AdV载体。第一代AdV载体缺乏E1或E3基因。这种载体可以引起强烈的炎症反应和免疫反应。在第二代AdV载体中，进一步删除了E2A或E4基因，导致免疫反应减弱，但提高了容量和安全性。第三代AdV载体失去了所有或大部分AdV基因，仅保留了倒置末端重复（ITR）和包装信号序列。第三代AdV载体引起的细胞免疫反应进一步减少。AdV载体的演变也是安全性和免疫原性之间平衡的过程。 总之，选择病毒载体，复制型、单轮复制或灭活，是安全性和免疫原性之间的平衡，取决于给定病原体的特性和目标人群。粘膜递送是病毒载体疫苗的一个显著特点。由于内在的佐剂特性和活跃的粘膜感染，病毒载体疫苗可以通过粘膜途径递送，并提供几个独特的优势。(1) 除了系统免疫反应外，粘膜疫苗诱导的局部粘膜免疫反应将作为对抗外来病原体的第一道防线，预计会阻止病毒进入并提供更广泛的异亚型保护。如已综述，外周血单核细胞（PBMCs）中的体液免疫反应并不总是评估粘膜疫苗的独家指标。例如，自然感染SARS-CoV-2后，鼻腔中的分泌型免疫球蛋白A（SIgA）可以持续约9个月，而注射疫苗在产生和增强血液中的抗体以及预防严重疾病方面有效，但对鼻腔IgA水平影响很小。(2) 局部CD8+ T细胞和SIgA比NAbs具有更广泛的谱效应，这对于经常突变的病原体（如IFV和SARS-CoV-2）尤其重要。(3) 粘膜免疫可以在一定程度上减轻抗载体免疫对病毒载体疫苗的影响。(4) 这些粘膜免疫途径比注射疫苗更方便、更易接受，尤其是对于害怕针头的人群，这将有助于群体免疫的全面建立。同时，对于动物源性疾病，粘膜递送的疫苗方便且可行。鼻内或吸入接种可以在大型动物群体中实现大规模免疫，而口服接种有助于在野生动物栖息地中全面分配疫苗。(5) 在全球大多数人至少接种了两剂注射型COVID-19疫苗的情况下，无论是mRNA疫苗还是灭活疫苗，用粘膜递送的病毒载体疫苗加强将巩固系统免疫反应并提供额外的粘膜免疫反应。(6) 粘膜疫苗可能有助于填补传统疫苗的空白。例如，众多已授权SARS-CoV-2疫苗的临床试验结果表明，老年人的效力低于年轻人。而dNS1-RBD，一种通过鼻内递送的COVID-19疫苗，在18至86岁的所有参与者中耐受性良好，老年人（60岁及以上）的免疫原性与年轻参与者相似。(7) 对于那些通过呼吸道或消化道传播的粘膜相关病原体，病毒载体疫苗可以最大限度地模拟特定病原体的自然感染过程。因此，提供全面的免疫反应和保护。(8) 呼吸道和消化道并不完全分离。例如，Ad5nCoV通过口腔吸入喷雾给药，然后在呼吸道中完全分布，主要在肺部。也就是说，通过鼻内递送的疫苗可以转换为口服-呼吸道气雾吸入疫苗，因为吸入疫苗比鼻喷疫苗提供更好的免疫反应和保护。 然而，局部粘膜免疫与保护效力之间的关系尚未完全确立，特别是在人类临床试验中。应注意动物与人之间的转化差距。临床前动物研究中的结果可能不一定预示着人类的安全性和效力。人类免疫系统更为复杂，人类鼻腔或呼吸道的局部环境在参与试验之前可能已经暴露于各种病原体，而处于受控实验室环境中饲养的动物可能尚未接触过这些病原体，这可能影响对疫苗接种的免疫反应。这种物种间的差距需要进一步探索。此外，对于评估那些仅组装外源糖蛋白的复制型病毒载体疫苗，动物模型应严格反映人类在受体-配体识别、预先或暴露后以及免疫系统组成的实际情况。 最近，mRNA疫苗和蛋白亚单位疫苗等新型疫苗技术引起了关注，并也参与到粘膜疫苗平台中。对于mRNA疫苗，通过鼻内给药的COVID-19 mRNA疫苗在全身范围内诱导了与肌肉注射组相当的S特异性结合抗体和NAbs。然而，这项研究中在鼻甲和肺泡灌洗液中未检测到分泌型IgA，因此局部免疫反应以及组织驻留T或B细胞的激活情况尚不确定。对于蛋白亚单位疫苗，注意到了一种名为“初免和加强”的疫苗策略，通过鼻内给药的S蛋白疫苗加强肌肉注射的COVID-19 mRNA疫苗。在小鼠的呼吸道粘膜中诱导了强大的驻留记忆B细胞和T细胞反应以及IgA。实际上，这种策略在已经通过初次疫苗接种产生免疫的情况下，通过蛋白疫苗在呼吸道引发了粘膜免疫记忆。理论上，所有疫苗方法都可以像“初免和加强”一样进行。总的来说，关于mRNA疫苗和蛋白亚单位疫苗的粘膜疫苗的临床前数据有限。在很大程度上，仅由mRNA疫苗诱导的局部粘膜免疫是不确定的。蛋白亚单位疫苗的粘膜递送需要预先存在的免疫。相比之下，病毒载体平台在粘膜疫苗中得到了很好的建立，无论免疫状态如何，都能诱导局部和系统的免疫反应。 重要的是，先天髓样细胞，如单核细胞/巨噬细胞，在随后的接触中可以产生强烈的反应，即所谓的“天然免疫记忆”或“训练免疫”，这可能为粘膜递送的病毒载体疫苗提供支持。如报道所述，呼吸道病毒感染模拟了肺泡巨噬细胞记忆，并产生了训练免疫，促进了对二次挑战的持续反应，这个过程甚至可能获得效应CD8 T细胞的帮助。 免疫反应的持续时间。理想情况下，持久的保护效力将有助于根除病原体，减轻医疗和经济负担，特别是对发展中国家而言。单剂量肌肉注射的VSV载体疫苗已显示出潜力。如综述所述，接种rVSV-ZEBOV疫苗后2年，100%和89%的参与者分别保持高或低剂量的血清阳性。NAbs的持久性较差，在28天时血清阳性率为64-71%，6个月后降至27-31%。同样，VSV载体疫苗在其他出血热病毒中也实现了持久的免疫反应。VSVΔG/LASVGPC诱导了对LASV的快速和长期免疫。在豚鼠中进行单剂量肌肉注射后，保护率分别为100%、87%、83%和71%，分别在第14天、第25天、第6个月和第1年。进一步评估了通过鼻内或口服递送的VSV载体疫苗的持久性。 总的来说，RABV载体疫苗被设计为灭活或口服递送，而PIV载体疫苗通过鼻内递送。多样化的免疫程序阻碍了这些病毒载体之间的点对点比较。用rERAG333E单剂量口服接种的小鼠产生了强烈且长达一年的针对RABV的NAbs。100%的接种动物在免疫后12个月免受RABV挑战。接受rERAG333E单次或两次口服接种的狗产生了持续3年以上的强烈保护性NAbs反应，并且在唾液中也检测到适度的RABV特异性IgA。在PIV载体COVID-19疫苗的情况下，测量并比较了仓鼠接种一剂或两剂CVXGA疫苗后免疫反应的持续时间，以及两次COVID-19 mRNA疫苗接种后的免疫反应。在接种后第36天，2X mRNA诱导了最高的抗S ELISA滴度，接种2X CVXGA1的仓鼠比接种1X CVXGA1的仓鼠诱导了更高的抗S滴度。有趣的是，第108天的抗S滴度在所有三个疫苗接种组中都是相当的。与mRNA疫苗相比，CVXGA1疫苗组的抗S ELISA滴度和NAb滴度得到了很好的维持。动物挑战研究证实了这一现象。当仓鼠在接种后9个月受到挑战时，接种CVXGA1的仓鼠比接种mRNA疫苗的仓鼠得到了更好的保护。减毒活MeV疫苗也被证明可以引发持久的B细胞和T细胞反应，据报道麻疹特异性抗体的半衰期超过200年。保护性免疫反应的持续时间可以归因于MeV在淋巴组织中的长期复制和传播。 在IFV载体COVID-19疫苗中也观察到了持久的保护效力。例如，dNS1-RBD在仓鼠模型中至少持续一年的保护性免疫反应。上述结果表明，尽管通过不同的递送途径，复制型病毒载体疫苗在持久性保护免疫方面显示出卓越的特性，可以对抗多种病原体。 相比之下，AdV和痘病毒载体疫苗大多被设计为单轮复制或复制缺陷构建物。尽管这些疫苗的单剂量方案已在人类临床试验中进行了测试或获得批准。与复制型病毒载体构建物相比，当单独使用或作为单剂量方案应用时，观察到的免疫持久性较差。通常，为了延长免疫反应的持久性，采用了初免-加强策略。 克服抗载体免疫。预先存在的抗载体免疫是所有病毒载体疫苗面临的共同问题，尤其是在AdV载体疫苗中。相对较少的NNSVs由于其单剂量方案、低血清阳性率或表面糖蛋白的替换，受抗载体免疫的影响较小。然而，AdV的血清阳性率在全球范围内普遍存在，范围在58.4%到90%之间。目前的解决方案包括增加剂量、选择血清阳性率低的载体、改变递送途径和异源初免-加强策略。上述解决方案在一定程度上减少了抗载体免疫的影响。为了根本解决这个问题，新的解决方案涉及一种免疫逃逸策略，即删除或修改病毒载体中被预先存在的免疫识别的相关区域、序列或表位。例如，AdV中和的主要决定因素在纤维蛋白和六边形蛋白的高变区（HVRs），而将Ad5六边形蛋白表面的七个短高变区替换为稀有AdV血清型Ad48相应的HVRs，成功地绕过了抗Ad5免疫。在未来，确定抗载体免疫的主要位点和基于基因组修饰的免疫逃逸策略应该进行，以解决抗载体免疫的问题。 NNSV载体具有多个优点。NNSV的RNA不太可能整合到宿主基因组中，因此重组很少发生。此外，NNSV可以快速生长到高滴度，并在适当的细胞系中传播，便于大规模生产。同时，NNSV的基因组简单且易于操作，因此插入一个或多个外源抗原并挽救重组病毒是方便的。携带外源基因的NNSV基因组相对稳定。它没有像阳性链RNA病毒基因组那样经常发生基因组重组和外源基因丢失的问题。通常，NNSV的血清阳性率较低，并且可以通过更换糖蛋白进一步减轻抗载体免疫。关于这些NNSV载体的生物安全问题，已在第3.2部分进行了审查。 IFV有18个亚型的HA和11个亚型的NA。通过替换HA和NA，可以通过反向遗传学拯救嵌合病毒。目前，IFV疫苗生产平台高度优化，允许大规模生产。然而，容量限制可能阻碍了IFV的完全应用，因为外源基因插入的长度限制在大约1.5 kb或更少。更重要的是，需要改进IFV载体疫苗的转基因稳定性。最近，A/PR/8/1934 (H1N1) (PR8) 和 A/WSN/33 (H1N1) (WSN) 是最常用的IFV骨架。尽管它们都具有低致病性，并且可以在生物安全等级二级(BSL-2)实验室中处理，但鼻内免疫可能会与流通菌株发生重组，留下安全隐患。改变递送途径可以避免重组。需要进行额外的研究，以克服IFV的物种特异性限制，解决流感中的重组问题。 AdVs是在人类临床试验中得到充分评估的成熟病毒载体。这些单轮复制的重组病毒在人类中安全且耐受性良好。随后，这些疫苗的免疫原性和持续时间需要进一步优化。 痘病毒载体具有一些独特的特性。(1) 由于它们在细胞质中复制，不与宿主基因组整合。(2) 抗载体免疫的流行率较低。(3) 在人类中可接受的安全性概况，特别是对于ALVAC和MVA，它们不能在哺乳动物细胞中复制，进一步奠定了它们的安全性概况。(4) 建立了大规模生产临床级材料的程序。 与NNSV或AdV载体相比，痘病毒在预防病毒性出血热或β冠状病毒的疫苗应用中似乎免疫原性较低，因为痘病毒载体疫苗的临床试验大多与其他疫苗平台结合使用。为了优化痘病毒载体，已经实施了几种策略，包括异源初免/加强方案、使用共刺激分子、删除痘病毒基因组中仍存在的病毒免疫调节基因、增强病毒启动子强度、增强载体复制能力、优化外源异源序列的表达，并联合使用佐剂。 2.结论和展望 为了应对急性公共卫生事件，病毒载体疫苗平台促进了及时响应。值得注意的是，在COVID-19大流行期间，病毒载体COVID-19疫苗在人类临床试验中取得了显著进展，并在短时期内获得批准。尽管已经提供了强大的免疫反应和保护效力，但这些病毒载体疫苗的内在特性和非凡优势尚未得到充分利用，特别是粘膜递送和粘膜免疫。在治疗性癌症疫苗中也可以看到，病毒载体疫苗的进步依赖于对病毒生物学的改进理解以及对病毒与宿主免疫系统之间相互作用的更新见解。 在不久的将来，对这些病毒载体的相似性和个体性有更好的理解将推动革命性的进步。通常，NNSV是一个大组病毒载体，它们共享集体病毒生物学特性并面临同源障碍。事实上，由于对这些NNSVs的全面了解，包括反向遗传学方法、极性转录机制、保留TMCT原始来源的嵌合策略用于外源抗原的整合，以及减毒修饰，已经取得了一些进展。特别重要的是，呼吸道病毒引起的训练免疫为抗微生物感染和抗肿瘤活性提供了实质性的好处。 然而，在深入掌握病毒载体之间的相似性时，应该考虑更多的方面。相应地，像抗载体免疫和安全问题这样的问题可以以相同的方式解决。此外，应该根据目标病原体或肿瘤明确阐明这些病毒载体的个体性。在这个过程中，跨学科合作、结构生物学、人工智能和基因编辑等可能提供额外的支持。 正如已经详尽回顾的，VSV和MeV是杰出的病毒载体，有潜力进行粘膜递送并诱导持久的局部和系统免疫反应。然而，默克公司发起的基于VSV和MeV的COVID-19疫苗V590和V591在I期临床试验中得到了令人失望的反应，尽管临床前研究结果显示前景光明。这可能归因于临床前和临床试验之间联系和协调不足，具体来说，是递送途径选择不佳。理想情况下，动物模型应该准确全面地反映人类的免疫状态和接种后反应，反之，来自不适当动物模型的结果会误导临床试验的实验设计，最终决定最后的方向。对于VSV和MeV，它们在粘膜递送的潜力在很大程度上尚未被探索，特别是在临床试验中。因此，这些NNSVs的基本属性需要在人类临床试验中进一步研究，基于临床前试验中取得的令人信服的方法。总体而言，适当和准确的技术进步、充分探索潜力，以及临床前和临床研究之间的紧密联系将巩固病毒载体疫苗的地位，并推动新型病毒载体疫苗的加速和批准。 为了推动人用及兽用疫苗行业交流，共同探讨该领域的最新研发进展、产业化现状及未来发展趋势，生物制品圈联合四叶草会展将于2024年8月16日-17日在苏州共同举办“第三届新型疫苗研发峰会”。诚邀全国相关领域专家、学者和企业家共享学术盛会。现将有关事宜通知如下。 名称：2024第三届新型疫苗研发峰会 时间：2024年8月16-17日（周五-周六） 地点：苏州（酒店定向通知） 主办单位：四叶草会展、生物制品圈 媒体支持：药时空、抗体圈、细胞基因研究圈 会议费用：点击二维码即可查询。 报名方式：扫描下方二维码→ 填写表格 → 报名成功（报名志愿者，免交报名费，承担一定工作任务）！ 转发分享福利：疫苗研发企业、科研院校和监管机构人员，前30位报名人员转发分享会议信息可免费参会（不含餐饮）报名后，扫描下方二维码加工作人员微信后，发送截图即可。 组委会获得报名信息后，根据报名信息进行初筛，并进一步与报名者沟通确认，实现精准邀请，最终有机会进入大会微信群（严格审核通过）。 大会日程 已经确定的报告人 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。