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关注小药说药，一起成长！ 前言 遗传和表观遗传变化都是癌症发生、肿瘤进展和转移的重要因素。从广义上讲，癌症的发病率与生物/遗传年龄直接相关。DNA甲基化是一种重要的表观遗传调控机制，在生命周期中不断变化，是“表观遗传衰老”过程的重要组成部分。值得注意的是，最近的研究已经证实表观遗传衰老在肿瘤发生中起主要作用。 表观遗传学改变通过影响广泛组织学中的多种致癌基因与抑癌基因途径，以及通过影响免疫细胞（如T细胞和NK细胞）的激活、分化和功能从而促进癌症的发生。事实上，最近的一项研究表明，正是组织环境诱导的表观遗传编程启动了肿瘤发生，这些发现为表观遗传药物的应用提供了强有力的理论基础，不仅可以作为癌症治疗药物，还可以用于预防癌症，因为它们可以协同靶向“正常”细胞，包括免疫细胞和癌前细胞。 基于表观遗传学的治疗旨在调节影响免疫细胞、其他正常细胞和/或癌细胞中各种信号通路的转录编程，从而影响这些细胞群体的命运。表观遗传药物是作用于细胞表观基因组以发挥其功能的化学物质，这些药物包括DNA甲基转移酶（DNMT）、DNA去甲基酶、组蛋白去乙酰化酶（HDAC）、组蛋白乙酰转移酶（HATs）、组蛋白甲基转移酶（HMT）、组蛋白去甲基酶（HDMs）和其他相关酶的抑制剂。此外，microRNA（miRNA）和长非编码RNA（lncRNAs）也是多种关键生物过程的重要表观遗传介质，包括致癌和免疫反应，这是有效癌症治疗的两个关键靶点。 表观遗传途径 DNA甲基化 DNA甲基化作为一种主要的表观遗传学标记，可通过有丝分裂遗传，并参与稳定基因转录抑制，尤其是当其位于哺乳动物基因转录起始点附近时。研究的最深入的DNA共价修饰是5-甲基胞嘧啶（5mC），这是一种由DNMT催化的标记。 在哺乳动物基因组中，5mC主要存在于CpG二核苷酸中，人类基因组中2800万CpG二核苷酸中70–80%的CpG被甲基化。在哺乳动物中，发现了三种活跃的DNMT，分别命名为DNMT1、DNMT3a和DNMT3b。 组蛋白乙酰化 组蛋白可以经历多种形式的翻译后修饰（PTMs），包括乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化以及ADP核糖基化、磺酰化和瓜氨酸化。这些组成所谓的“组蛋白密码”，调节染色质结构、重塑酶的募集和基因活动的调节。 组蛋白赖氨酸残基的乙酰化影响基因组的组织和功能。组蛋白H3和H4的乙酰化由两组酶决定：HATs和组HDAC。这两组酶决定组蛋白的乙酰化状态，并以可逆方式工作。 在人类中，有18种HDAC酶分为四类：Rpd3样蛋白的I类（HDAC1、HDAC2、HDAC3和HDAC8）；类Hda1蛋白的II类（HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC7、HDAC9和HDAC10）；Sir2样蛋白的III类（SIRT1、SIRT2、SIRT3、SIRT4、SIRT5、SIRT6和SIRT7）和第四类蛋白质（HDAC11）。这些酶及其在癌症中的功能已被广泛研究。 组蛋白甲基化 组蛋白甲基化是表观遗传修饰的第三种主要类型。为了完成这一可逆过程，涉及两大类催化甲基加成的酶：蛋白质精氨酸甲基转移酶（PRMT）和组蛋白赖氨酸甲基转移酶（HKMT）。癌症环境中的关键赖氨酸和精氨酸甲基转移酶包括zeste同源物2（EZH2）、G9a、DOT1L以及PRMTs 1和5。另一组称为组蛋白去甲基酶的酶逆转这一过程。 组蛋白磷酸化 磷酸化是另一种高度动态的组蛋白PTM形式。它发生在丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基上，主要发生在组蛋白N端尾部，受激酶和磷酸酶的竞争作用控制。作为“组蛋白代码”的重要组成部分，PTM在DNA损伤修复、染色质致密化、转录调控以及包括肿瘤发生和癌症进展在内的一系列生物学过程中起着关键作用。 肿瘤微环境的表观遗传调节 肿瘤微环境（TME）由多种细胞类型组成。除肿瘤细胞外，TME还包含多种非上皮细胞类型，包括构成血管系统的细胞（内皮细胞、周细胞和平滑肌细胞）、参与免疫监测的细胞（淋巴细胞、巨噬细胞和肥大细胞）以及基质细胞（即成纤维细胞），这些细胞在细胞外基质（ECM）中，分泌一系列可扩散生长因子、细胞因子和趋化因子。人们早就认识到，癌症发生促进以促血管生成生长因子表达、ECM表达改变、成纤维细胞增殖加速和炎性细胞浸润增加为特征的基质变化。 TME的表观遗传改变控制着组织缺氧状态，并在细胞对缺氧的反应和癌细胞代谢中起着关键作用。表观遗传调控因子可与缺氧诱导转录因子（HIF）家族基因协同工作，在HIF依赖性启动后很长时间内维持缺氧适应的细胞表型。表观遗传变化稳定HIF与其转录靶点的结合，从而影响直接HIF反式激活后的组蛋白去甲基化酶活性，并最终导致缺氧TME中组蛋白修饰和DNA甲基化的整体模式，JMJD1A表达的低氧上调作为信号放大器促进低氧基因表达，最终促进肿瘤生长。 巨噬细胞是TME中的关键固有免疫细胞，它们在TME中调节原发性肿瘤生长、血管生成、转移扩散和肿瘤对介入治疗的反应。在巨噬细胞中，缺氧减弱了Jumonji组蛋白去甲基化酶活性的表达，导致组蛋白H3K9甲基化增加和趋化因子表达降低，从而导致TME内免疫景观的变化。 免疫细胞的表观遗传调节 表观遗传机制在免疫细胞分化和功能中发挥关键作用，确保在不同组织微环境条件下免疫细胞中恰当的基因表达模式。重要的是，表观遗传机制在TME内的免疫细胞和基质细胞类型中起着决定性作用。 固有免疫细胞（髓系细胞和NK细胞） 髓系细胞在适应性免疫系统识别癌细胞中发挥重要作用，并协调炎症和保护性抗肿瘤免疫反应的启动。这些细胞包括粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、DC和MDSC。 DC细胞启动并协调针对感染和疾病的适应性免疫反应，它们是免疫记忆和免疫耐受发展的核心。树突状细胞迅速整合来自其组织微环境的信号，并相应地对这些信号作出反应，这种动态变化依赖于DC细胞染色质结构的表观遗传变化。 在巨噬细胞中，其功能极化状态需要对靶基因表达进行精确的时间和情境调节。在M1和M2极化期间，表观遗传变化在改变细胞信号和特征基因图谱中发挥作用。 MDSCs在肿瘤形成过程中被诱导，它们介导有效的肿瘤促进活动。研究表明，在肿瘤相关培养基存在的情况下，MDSCs的基因组中存在广泛的去甲基化和某些特殊位点的DNA甲基化，这些和免疫抑制特征的特异性基因增加有关。此外，许多研究表明，组蛋白修饰的表观遗传途径调节MDSCs的各个方面。例如，HDAC11是一种新的表观遗传调节因子，在肿瘤相关的MDSC中调节细胞的扩增和功能。 NK细胞在免疫监视和消除应激、感染或转化细胞方面发挥着重要作用。对于NK细胞，H3K4me3去甲基化酶Kdm5a是细胞激活所必需的。此外，慢性刺激的NK细胞在被肿瘤靶点重新激发时表现出功能紊乱，这些无能的NK细胞表现出特定的表观遗传重编程模式，DNA甲基化发生全基因组改变。 CD4+T细胞 表观遗传学机制在Th1和Th2细胞的细胞分化和功能中起着关键作用。STAT4和STAT6转录因子在辅助性T细胞分化过程中的表观遗传修饰和转录调节中起着调控作用。研究发现，STAT4在促进活跃的表观遗传标记方面具有更为显著的作用，而STAT6在对抗抑制性标记方面具有更为显著的作用。 对于T滤泡辅助细胞（Tfh）细胞，已经证明VHL-HIF-1α轴在通过糖酵解表观遗传重编程启动Tfh细胞发育过程中起着重要作用。EZH2是一种HMT，催化H3K27me3并主要通过HMT活性影响Th1、Th2和Treg细胞。研究表明，EZH2敲除会损害Tfh分化和转录编程的激活。 Treg细胞 Treg细胞的发育严重依赖于FoxP3，FoxP3的表达是最佳Treg抑制活性所必需的，过去几十年的研究表明，增强子区CpG岛的DNA甲基化控制着T细胞中FoxP3的表达。此外，TET-甲基胞嘧啶双加氧酶对Treg细胞的功能稳定性也至关重要。一系列研究证明了TET在维持Treg细胞中稳定的FoxP3表达中的关键作用。 EZH2在Treg细胞中的重要性也得到了证实。EZH2对Treg的分化和T效应细胞的扩张都至关重要，通过遗传或药理学手段破坏Treg细胞中的EZH2活性，导致肿瘤浸润性Treg细胞获得促炎功能，重塑TME，增强CD8+和CD4+效应T细胞的募集和功能，从而消除肿瘤。 CD8+T细胞 基因表达的表观遗传调控在获得和维持CD8+T细胞的效应器功能，以及记忆性CD8+T细胞对抗原再激发的快速而稳健的反应中起着关键作用。表观遗传机制也影响CD8+T细胞的干性及其命运。 组蛋白乙酰化通过效应分子的差异表达促进CD8+T细胞快速而稳健的记忆反应。与原始CD8+T细胞相比，记忆CD8+T细胞中效应基因H3赖氨酸9乙酰化（H3K9Ac）显著提高。此外，HDAC3已被确定为CD8+T细胞效应器分化和细胞毒性潜能的表观遗传调节因子。 肿瘤细胞和免疫分子的表观遗传调节 癌细胞的代谢重编程是公认的癌症标志，这已成为调节抗肿瘤免疫反应的关键免疫抑制机制。代谢重编程和表观遗传重编程是相互关联的，并且在很大程度上，代谢状态决定了癌症的表观遗传学。 糖酵解或氧化磷酸化等代谢途径在炎症和组织修复过程中调节巨噬细胞功能，α-酮戊二酸通过代谢和表观遗传重编程协调巨噬细胞活化至M2表型。糖酵解增强也被确定影响骨桥蛋白基因表达的表观遗传修饰。最终，TME内的代谢条件加强了癌细胞和免疫细胞的表观遗传重编程，导致免疫抑制性微环境，然而，这些表观遗传修饰表现出可通过表观遗传调节剂纠正的可塑性。 在分子水平上，已知与免疫功能（STING）、CD8+细胞毒性T细胞（GzmB、IFN-γ、IL-2、IL-12）和FOXP3+Treg细胞相关的关键效应分子通过表观遗传途径进行调节。事实上，许多细胞因子和趋化因子在癌症中通过表观遗传途径调节。 免疫检查点分子（ICMs）包括程PD-1、CTLA-4、TIM-3、LAG-3以及TIGIT。这些分子及其受体在癌细胞和免疫细胞表面的表达，或其可溶性分泌形式，可帮助肿瘤细胞逃避免疫监视。表观遗传机制在调节TME中ICMs及其受体的表达中起着关键作用。作为一个具体的例子，LAG-3 DNA甲基化与肿瘤和免疫细胞中该免疫检查点分子的表达相关，影响透明细胞肾细胞癌中免疫细胞浸润的命运。 表观遗传靶向药物 表观遗传药物经常与其他免疫刺激剂联合使用，以实现五个目标：1）癌细胞生长停滞；2）诱导肿瘤细胞死亡（通过凋亡、坏死、自噬）；3）促进肿瘤相关新抗原的表达以提高免疫细胞识别能力；4.）缺氧逆转和肿瘤血管生成抑制；以及5）TME中免疫细胞（DC、T细胞等）功能的调节。 目前，大量涉及表观遗传调控途径的小分子酶抑制剂或激活剂正被开发用于临床。许多表观遗传药物已获得监管机构批准用于治疗人类恶性肿瘤。 2004年，FDA批准5-azaC（商品名Vidaza）用于骨髓增生异常综合征（MDS）的所有五个阶段，随后于2006年批准了5-aza-dC。这两种药物目前代表了干细胞疗法不适用时MDS的一线疗法。它们也被应用于慢性粒单核细胞白血病（CMML）和AML的治疗。 一些HDAC抑制剂（HDACi）也已获得FDA批准用于临床。Vorinostat和romidepsin是这类药物中最早被批准用于治疗皮肤T细胞淋巴瘤（CTCL）的药物。SAHA，也称为Zolinza或Vorinostat，于2006年获得FDA批准，目前是CTCL患者的第三线治疗选择。Romidepsin是2009年FDA批准的第二种HDAC抑制剂。随后，Belinostat和Panobinostat以及Chidamine均被批准用于治疗复发或难治性外周T细胞淋巴瘤（PTCL）或多发性骨髓瘤。 FDA药品批准的第三波浪潮发生在过去几年中。2017年和2018年，异柠檬酸脱氢酶1和2（IDH1/2）抑制剂Enasidenib和Ivosidenib分别被批准用于治疗复发或难治性AML。最后，在2020年，FDA加速批准了tazemetostat，一种EZH2的抑制剂，用于治疗上皮样肉瘤和复发/难治性滤泡性淋巴瘤。 表观遗传药物的临床前景 到目前为止，除了少数类型的实体瘤、T细胞淋巴瘤、上皮样肉瘤和难治性滤泡性淋巴瘤外，表观遗传学药物在晚期肿瘤中通常无法证明足够的疗效，从而无法获得FDA或其他监管机构的批准。 然而，一些关于实体瘤的临床研究显现出有希望的前景。首先，Tazemetostat是第一类抑制剂的代表，对两种实体瘤有效。单药治疗显示出有临床意义的、持久的反应，并且在经多次治疗的复发性或难治性滤泡性淋巴瘤患者或晚期上皮样肉瘤患者中普遍具有良好的耐受性。 其次，两种或两种以上的表观遗传药物的组合可能是提高治疗抗肿瘤疗效的一个很好的选择。在一项研究中，证明了azacitidine和romidepsin与IFN-α的联合具有很高的治疗潜力，其靶向的是结直肠癌最具侵袭性的细胞成分（即转移细胞和癌干细胞），并调节关键的生存和死亡途径（包括肿瘤ICD）。在另一项研究中，研究人员评估了使用azacitidine和entinostat对复发性转移性非小细胞肺癌患者的联合治疗，在一些难治性NSCLC患者中显示出客观、持久的反应。 此外，在临床前研究中，已报道EZH2抑制剂可增强ICIs的抗肿瘤反应。在一个病例报告中，一名使用EZH2抑制剂（tazemetostat）治疗的SMARCB1阴性脊索瘤患者对放疗的持续全身反应超过2年。功能分析显示，CD8+ T细胞和Treg细胞的肿瘤内和间质浸润显著增加，与T细胞上PD-1和LAG-3检查点分子的表达增强有关。这些结果表明EZH2抑制促进持续的抗肿瘤免疫反应，导致免疫检查点激活。新出现的临床数据也表明，表观遗传药物和ICIs的联合疗法有望用于一系列实体癌患者。 目前，有多项表观遗传药物和ICIs联合治疗的临床试验正在进行中。 小结 令人信服的证据表明，表观遗传调控影响癌细胞、免疫细胞、基质细胞、癌细胞和免疫细胞之间的相互作用以及免疫TME的状态。因此，作为一种干预手段，表观遗传调节本身可以诱导强大的抗肿瘤免疫。 因此，进一步增强免疫治疗效果的一个合理策略是将某些表观遗传调节因子与一种或多种经典免疫治疗方案相结合，如癌症疫苗、ICIs、溶瘤病毒、CAR-T细胞、TCR-T细胞或其他新型免疫刺激剂。表观遗传药物可以诱导ICD并使肿瘤由冷变热，它们可能与其他免疫治疗方案产生协同作用。未来，这些联合治疗方案可能在临床研究中显示出良好的应用前景。 参考文献： 1.Epigenetic modulation of antitumor immunityfor improved cancer immunotherapy. Mol Cancer. 2021; 20: 171. 公众号内回复“ADC”或扫描下方图片中的二维码免费下载《抗体偶联药物：从基础到临床》的PDF格式电子书！ 公众号已建立“小药说药专业交流群”微信行业交流群以及读者交流群，扫描下方小编二维码加入，入行业群请主动告知姓名、工作单位和职务。

关注小药说药，一起成长！ 前言 在过去的十年里，免疫疗法的出现确实彻底改变了癌症治疗的模式。许多靶向程序性细胞死亡蛋白-1（PD-1）或其配体（PD-L1）的治疗药物已被监管机构批准作为单一治疗药物，或与化疗和其他靶向药物联合使用。在临床研究中，PD-L1免疫组织化学（IHC）和肿瘤突变负荷（TMB）是迄今为止发现的主要预测性生物标记物，然而，PD-L1 IHC仍然是临床实践中用于告知免疫检查点抑制剂（ICI）治疗的主要辅助诊断试验。 PD-L1在肿瘤细胞和肿瘤浸润性免疫细胞表面表达，在多种肿瘤类型的研究已经确定了PD-L1水平与单药抗PD-1/PD-L1治疗的临床益处之间的关联。虽然PD-L1高表达的患者通常能获得最大的临床益处，但肿瘤低或无PD-L1表达的患者也依然能受益，这促使我们需要进一步探索不断进化的癌症基因组变化与浸润性免疫细胞亚型之间的因果关系。 考虑到PD-L1作为单一生物标记物的局限性，我们需要了解复杂的肿瘤微环境（TME），以开发更好的生物标记物和诊断方法，更准确地预测临床效益，至关重要的是，更有针对性地对肿瘤产生有效的免疫反应。 预测性生物标志物 PD-L1 IHC 与突变的二元性不同，PD-L1是一种线性生物标记物，因此可以在多个表达阈值下进行评估。由于肿瘤细胞和免疫细胞上PD-L1表达的复杂生物学特性，已批准的PD-L1 IHC分析不仅采用不同的表达阈值，而且采用不同的评分方法。PD-L1评分算法具有分析特异性、适应症依赖性，并且根据治疗路线而变化。有些检测仅对肿瘤细胞表达进行评分（忽略免疫细胞），而有些检测仅对免疫细胞的PD-L1进行评估（忽略肿瘤细胞），其它检测则对肿瘤和免疫细胞的PD-L1同时进行测量。下表显示了非小细胞肺癌（NSCLC）中使用的主要PD-L1 IHC分析的截止值。需要注意的是，这些经验证的截止值的批准和用途是特定于国家的。 PD-L1的表达是动态的，在肿瘤类型、肿瘤部位，甚至在同一肿瘤标本中表现出显著差异。肿瘤细胞中PD-L1的表达受基因组、表观遗传学和转录机制的调控。肿瘤细胞上的PD-L1与NSCLC中CD8+T细胞浸润程度之间的强相关性很可能是由于对炎症信号（如IFN-γ）反应中的转录调节，这些炎症信号是由活跃的抗肿瘤免疫反应产生的。 PD-L1的非均匀表达（通常局限于免疫浸润区域）表明，由于TME内相关细胞因子的高局部浓度，PD-L1被适应性诱导，并进一步突出了肿瘤内的异质性。PD-L1的肿瘤内异质性和可塑性可能会影响患者的管理决策，此外，由于采样可能会产生假阴性得PD-L1 IHC结果。活检的位置和已进行过的治疗是PD-L1表达的重要参数。由于临床原因，在治疗开始时获得新的活检可能不可行，但由于免疫反应的可塑性，尤其是PD-L1，存档肿瘤标本不一定反映复发或转移性病变中的TME。 多种免疫细胞类型，主要是巨噬细胞、树突状细胞（DC），以及T细胞、NK细胞和B细胞，可表达PD-L1。目前尚不清楚哪些特定免疫群体或免疫细胞的空间特征与临床最相关。需要使用多重IHC技术进一步描述肿瘤细胞与特定免疫细胞亚群的空间相互作用，以确定是否需要继续将免疫细胞分类为一个更广泛的类别，这需要更细致、更复杂的分析。 其它生物标志物 临床试验表明，具有大量效应T细胞的肿瘤对ICI治疗更为敏感。有研究使用以IFN-γ为中心的基因表达特征来显示使用抗PD-1抗体pembrolizumab治疗的黑色素瘤患者的总体应答率（ORR）和无进展生存率（PFS）的相关性。与这些发现一致，在NSCLC中进行的IMpower150试验报告了一种T效应细胞（Teff）基因表达特征，由PD-L1、CXCL9和IFN-γ组成，当比较atezolizumab联合化疗比较单独化疗时，该特征对PFS有益。 此外，具有高突变负荷的肿瘤患者从CI治疗中获得了更大的临床益处。TMB和PD-L1 IHC的一致性研究似乎表明，这些生物标记物是正交的，并独立预测CI治疗的益处。因此，pembrolizumab最近获得了监管部门的批准，用于治疗先前治疗后有进展且无替代治疗方案的不可切除或转移性高TMB实体瘤。 随着对更具预测性的生物标志物的研究不断深入，有必要摆脱单一分析方法，整合负责进行免疫反应的各种生物过程。初步的探索性分析表明，联合生物标志物可以转化为临床益处。在Checkmate-026和Checkmate-227研究中，肿瘤表达高水平PD-L1并具有高组织TMB状态的患者从抗PD-1抗体nivolumab治疗中获得最大益处。OAK研究也报告了类似的结果。 免疫效应细胞的表型多样性 许多研究已经描述了肿瘤浸润淋巴细胞及其空间分布与治疗效益之间的关系。识别各种免疫效应细胞的空间分布需要通过功能分析来补充，如激活标记物和抗原反应性，通过分析肿瘤样本中CD8+T细胞TCR序列的内在抗肿瘤反应性，表明识别自体肿瘤的能力仅限于少数肿瘤浸润CD8+T细胞。更复杂的是，肿瘤不同区域（中心与边缘浸润）的CD4+和CD8+T细胞群中可能存在显著的TCR异质性，异质性的程度具有预后意义。 通常，三种不同的CD8+T细胞群体可根据共同的转录谱识别： 表达CC-趋化因子受体7（CCR7）和转录因子7（TCF7）的原始或记忆细胞； 穿孔素1（PRF1）、颗粒酶A（GZMA）和GZMB阳性的细胞毒性细胞；以及 “功能失调”的多样性细胞群体，其特征是与耗竭状态相关的标记物，如PD-1（PDCD1）、LAG3和TIM3（HAVCR2）。 这三个群体的相对比例似乎高度可变，不仅在不同的肿瘤类型中如此，在相同组织学的肿瘤中也是如此。转录谱和TCR测序信息已被用于确定肿瘤内CD8+细胞表型是否发生改变。初步模型表明，TME诱导的表型异质性功能失调细胞群从幼稚的CD8+细胞进化而来，而后者以不依赖TME的方式产生细胞毒性细胞。“功能失调”细胞库中的细胞在多大程度上可以转化为“细胞毒性”状态目前尚不清楚，然而，了解这一点对于设计促进和触发这种转变的疗法非常重要。 此外，在几项研究中已经鉴定出对肿瘤表达的新抗原具有特异性的肿瘤内CD8+T细胞，但其只是表型异质性总群体的一小部分。有趣的是，CD39似乎能够区分肿瘤特异性（高CD39）和旁观者（低CD39）CD8+T细胞。其他表型和功能分析显示，CD39+亚群共表达CD103以及PD-1、TIM3和CTLA-4，这些标记通常与耗竭状态相关。CD39和CD103的共同表达依赖于通过TCR的长时间刺激和TGF-β的暴露。有趣的是，高水平的CD39+CD103+双阳性细胞似乎转化为鳞状细胞头颈癌患者的生存益处。 免疫效应细胞的空间分布 最新的研究分析了CD8+T细胞和MHCII类表达细胞（最可能的抗原呈递细胞）之间的空间关系。在肾细胞癌患者中，TCF1+/CD8+T细胞优先共定位于MHC II类表达细胞的区域，而TCF1−/CD8+细胞在整个肿瘤中呈弥散分布。TCF1+/CD8+细胞的发生率也与DC的发生率相关，而TCF1−/CD8+细胞没有表现出这种相关性。有趣的是，含有TCF1+/CD8+T细胞和表达MHC II类APC高密度区域的肿瘤具有更好的临床疗效，APC密集区可能为干细胞样CD8+T细胞分化为能够维持抗肿瘤免疫反应的效应细胞提供了肿瘤内环境。 很明显，成熟、活跃的树突状细胞向肿瘤床的肿瘤浸润增加了免疫激活和活性免疫效应细胞的募集。准确识别和量化DCs具有重要价值，然而，标记物如CD11c、CD11b、CD163和MHC-II不是DC特异性的，并且在其他细胞类型如巨噬细胞上表达。DC可以促进或抑制新生免疫反应的观察结果进一步增加了复杂性，因为目前还没有有效的标记来区分两种DC状态。 在肿瘤进展过程中，TME转变为一种主动保护肿瘤细胞免受免疫攻击的环境，被认为具有肿瘤保护功能的TME细胞包括T调节细胞（Treg）、肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）、肿瘤相关成纤维细胞（CAFs）和髓系抑制细胞（MDSCs）。 肿瘤保护作用通常通过分泌的细胞因子和趋化因子介导，这些细胞因子和趋化因子可防止免疫效应T细胞侵入肿瘤床或使这些细胞功能失效，例如，TGF-β。TGB-β抑制剂和抗PD-L1抗体的联合治疗可导致Teff的肿瘤内渗透，将表型从“排除”改变为“炎性”，减少转移并提高长期生存率。 MDSC是中性粒细胞和单核细胞样髓样细胞的异质群体，越来越多地被认为是各种癌症免疫抑制的关键介质。在癌症患者中，循环MDSC数量的增加与晚期临床分期、转移性疾病发病率的增加和免疫抑制相关。除了免疫抑制功能外，MDSC还可以通过与肿瘤细胞和周围基质的复杂串扰积极塑造肿瘤微环境，从而增加血管生成、肿瘤侵袭和转移。 肿瘤细胞的内在抗性 目前，我们对于肿瘤免疫治疗的不同反应和耐药机制的了解仍然有许多空白。虽然我们希望找到一颗灵丹妙药，但可能的事实是，有许多机制有助于产生抵抗。虽然肿瘤抑制因子（如p53）的突变增加了突变负荷，有助于放大新抗原的数量，并使肿瘤对免疫系统更敏感，但这些突变也可以驱动抗原呈递途径和关键细胞机制的突变，从而触发转录和代谢变化，进而对肿瘤浸润性免疫细胞产生间接影响。  肿瘤抗原呈递机制的一个关键组成部分是MHC I类分子，它由HLA I类（HLA-I）亚单位和β2微球蛋白（β2M）组成。MHC-I的下调存在于多种肿瘤类型中，可能通过多种机制发生，包括基因突变、表观遗传沉默、转录变化和翻译后修饰。 MHC-I的下调如何影响TME？研究发现，HLA-I阳性表达与免疫浸润密度相关，与PD-L1状态无关。所有HLA-I+/PD-L1+的肿瘤都有高度的CD8+T细胞浸润，而HLA-I缺失与肿瘤内T淋巴细胞数量减少相关，其空间局限于肿瘤周围的基质。而HLA-I-/PD-L1-的肿瘤较大，CD8+T细胞密度较低。这项研究表明，肿瘤免疫逃逸表型结合了两种独立的免疫逃逸机制：HLA-I的丢失和PD-L1的上调。 新辅助治疗中获得经验 最近对早期疾病免疫治疗的探索为了解TME及其在治疗反应中的变化提供了新的机会。新辅助研究特别丰富，因为治疗前经常收集诊断性活检，并可与新辅助治疗后立即进行的手术切除进行比较。 ABACUS试验是一项单臂2期研究，研究膀胱切除术前atezolizumab的新辅助治疗。升高的PD-L1水平（SP142；IC≥5%）,基线Teff基因表达和上皮内CD8+T细胞与临床益处相关。有趣的是，与术前相比，在治疗后肿瘤样本中观察到上皮内CD8+T细胞和PD-L1+免疫细胞的数量增加，并且这种增加在应答者中比在复发患者中更为明显。在治疗后样本中发现，TGF-β、成纤维细胞活化蛋白和细胞周期基因升高与耐药性相关。 PURE-01研究报告了类似的结果，膀胱上皮癌患者在根治性膀胱切除术前接受了三个周期的pembrolizumab。与PD-L1状态较低的患者相比，PD-L1 IHC升高的患者（22C3；CPS≥10%）获得了更高的病理完全缓解率。与治疗前活检相比，治疗后切除的PD-L1 CPS水平升高，TMB水平降低。此外，与治疗前样本相比，治疗后样本中的免疫相关基因（包括与IFN-γ信号、抗原呈递和T细胞功能相关的基因）也有所增加。 NABUCCO研究评估了III期尿路上皮癌切除术前使用ipilimumab和nivolumab的效果。与ABACUS和PURE-01研究相比，治疗结果与肿瘤内CD8+T细胞浸润或Teff信号的基线状态无关。相反，研究观察到，在获得完全应答的患者中，TMB升高与DDR基因改变频率升高之间存在一种趋势。无法获得完全应答的患者在基线样本中富含TGF-β基因表达特征，表明可能存在耐药机制。此外，还研究了TIL密度与反应之间的相关性，有趣的是，基线TIL与疗效之间没有相关性，但在治疗后获得CR的患者中观察到TIL富集。 这些观察结果并非膀胱癌所独有。NEOSTAR试验评估了nivolumab或nivolumab加ipilimumab作为可手术NSCLC患者的新辅助治疗。获得影像学或主要病理学反应的患者总体上比基线肿瘤样本的PD-L1更高。与单独使用nivolumab治疗相比，nivolumab加ipilimumab治疗后TIL、组织驻留记忆T细胞、TEFF和效应记忆T细胞的频率更高。 总体来说，基线PD-L1似乎可以预测ICI的反应。TMB、TIL和DDR等作为生物标志物也似乎很有希望，但需要进一步评估和验证。治疗方案的差异以及患者群体的异质性可能导致不同试验结果的不一致。随着新辅助免疫治疗和化疗-免疫治疗联合方案获得监管部门的批准，识别经验证的生物标记物以预测免疫反应对于帮助作出治疗决定至关重要。 小结 随着从化疗向靶向治疗和免疫治疗的过渡不断发展，研究人员将采用更复杂的临床试验设计，如靶向治疗和免疫治疗的联合，不同CI药物的联合，并且更加关注生物标记物的设计，这些生物标记物对预测单药或多药治疗方案的反应或耐药性具有更高的敏感性。 未来，很可能需要多参数的方法来确定最有可能对ICI治疗有反应的患者，开发基于组织的强大复合技术非常重要。这有助于更准备地描述TME的特征，并分析肿瘤和效应免疫细胞之间以及效应细胞和APC之间的相互作用。相关标记物的表达谱可能提示效应细胞的激活、抑制或耗竭状态，并提示耐药机制。 参考文献： 1.Microenvironmental regulation of tumourimmunity and response to immunotherapy. J Pathol. 2021 Jul; 254(4):374–383. 公众号内回复“ADC”或扫描下方图片中的二维码免费下载《抗体偶联药物：从基础到临床》的PDF格式电子书！ 公众号已建立“小药说药专业交流群”微信行业交流群以及读者交流群，扫描下方小编二维码加入，入行业群请主动告知姓名、工作单位和职务。

【导读】 黑色素瘤是一种恶性皮肤肿瘤，尤其是无法切除或已经转移的病例，治疗难度较大。 12月24日，中南大学周文虎教授研究团队在期刊《Advanced Science》上发表了研究论文，题为“Co-Delivery of aPD-L1 and CD73 Inhibitor Using Calcium Phosphate Nanoparticles for Enhanced Melanoma Immunotherapy with Reduced Toxicity”，本研究中，研究人员通过多组学数据分析发现，在黑色素瘤中CD73和PD-L1的空间共定位与更好的无进展生存期（PFS）相关，这表明这两种抑制剂具有协同潜力。在此基础上，研究人员开发了一种新型治疗策略，利用钙磷酸盐（CaP）纳米颗粒协同递送aPD-L1和APCP（CD73抑制剂）。这些纳米颗粒采用生物矿化方法制备，具有高药物负载能力和pH响应性药物释放特性。与游离的aPD-L1相比，CaP递送的aPD-L1有效避免了系统性副作用，同时显著增强了抗肿瘤效果，甚至超过了游离aPD-L1的20倍剂量。此外，CaP纳米颗粒协同递送aPD-L1和APCP显示出协同抗肿瘤效应，通过免疫记忆效应产生显著的免疫激活和防止肿瘤复发。 这些发现表明，利用CaP纳米颗粒协同递送aPD-L1和APCP是改善黑色素瘤免疫治疗的一种有前途的方法，可实现增强疗效和降低毒性的双重目标。 https://onlinelibrary-wiley-com.libproxy1.nus.edu.sg/doi/10.1002/advs.202410545 背景信息 01 黑色素瘤是一种预后不良的恶性皮肤肿瘤。虽然早期黑色素瘤可以通过手术切除有效治疗，但对于无法切除或已发生远处转移的黑色素瘤患者，治疗选择有限，且通常效果不佳。最近，免疫疗法，特别是针对PD-1/PD-L1的免疫检查点抑制剂（ICIs），在黑色素瘤治疗中显示出了有希望的前景。尽管ICIs取得了成功，但只有一小部分患者从这些治疗中受益，总体响应率仍然相对较低。此外，与化疗或靶向疗法相比，ICIs与特定器官的免疫介导的不良事件（irAEs）风险增加有关。由于PD-L1在正常组织中的表达，静脉注射aPD-L1可能会导致其与非肿瘤组织结合，导致肿瘤部位aPD-L1浓度降低，从而降低疗效。此外，这还可能导致非特异性免疫激活和靶点外的肿瘤相关不良事件（irAEs），包括转氨酶升高、肺炎和肾炎等，可能需要中断治疗甚至导致致命后果。因此，提高ICIs的治疗效果和安全性至关重要。 最近的临床试验结果表明，将PD-1/PD-L1抗体与其他免疫检查点抑制剂联合使用，与单用PD-1/PD-L1相比，显著提高了响应率（RR）、无进展生存期（PFS）和总生存期（OS）。例如，CD73抑制剂在某些肿瘤中与PD-(L)1抑制剂显示出协同作用，并在晚期实体瘤患者中显示出有希望的结果。CD73是一种由NT5E编码的细胞表面酶，广泛表达在各种细胞表面，在缺氧条件下肿瘤微环境中会上调表达。CD73与CD39共同作用，将具有免疫激活功能的ATP转化为具有免疫抑制作用的腺苷。腺苷通过与A2AR和其他腺苷受体结合来抑制免疫活性。据报道，与周围正常组织相比，黑色素瘤组织中CD73的表达上调，其高表达与肿瘤转移、对免疫治疗的反应降低以及不良预后有关，包括更差的总生存期（OS）和无病生存期（DFS）。这表明CD73可能是黑色素瘤的一种有前途的治疗靶点。越来越多的证据表明CD73是一种新型免疫检查点。目前，全球正在进行多项临床试验，探索CD73抑制剂与aPD-(L)1抗体在晚期实体肿瘤中的联合应用。然而，CD73抑制剂与aPD-(L)1抗体在黑色素瘤中的联合应用是否能增强免疫治疗的疗效还有待进一步研究。 体外实验表明，CaP纳米粒子能够有效递送aPD-L1，增强其抗肿瘤活性 02 为了研究纳米粒子递送对aPD-L1抗肿瘤效应的增强作用，研究人员制备了aPD-L1@CaP纳米粒子负载aPD-L1。在建立B16F10肿瘤模型后，进行了多种治疗，包括PBS、CaP、aPD-L1（2.25 mg/kg）、aPD-L1+CaP、aPD-L1@CaP、aPD-L1（4倍剂量，9 mg/kg）和aPD-L1（20倍剂量，45 mg/kg）。这些治疗在第4、7和10天注射，并持续监测肿瘤体积。通过肿瘤生长曲线、治疗后的肿瘤照片和肿瘤体积测量来评估疗效。结果表明，游离aPD-L1显示出剂量依赖性的抗肿瘤活性。aPD-L1@CaP组表现出最显著的治疗效果，与游离aPD-L1的20倍剂量相当。这些结果表明，纳米粒子递送可增强aPD-L1的疗效，主要是由于在肿瘤区域的积聚改善。进一步的免疫流式细胞分析显示，aPD-L1@CaP治疗组肿瘤组织中CD8+细胞毒性T细胞的浸润量增加，Granzyme B（GZMB）的释放量也更大。免疫荧光染色显示，当细胞毒性T细胞释放GZMB时，aPD-L1@CaP组肿瘤细胞的增殖显著受到抑制。这些发现表明，通过CaP纳米颗粒递送aPD-L1可以显著降低所需剂量，实现更有效的抗肿瘤免疫疗法。 aPD-L1/APCP@CaP通过免疫记忆效应防止肿瘤复发 03 免疫疗法相对于传统疗法的一个重要优势在于其能够诱导免疫记忆效应，有助于抑制肿瘤的转移和复发。为了研究aPD-L1/APCP@CaP纳米颗粒在这方面的潜力，研究人员研究了其通过免疫记忆效应抑制远端肿瘤生长的效果。将原发肿瘤接种在右侧腹侧的小鼠被分别给予PBS、CaP、APCP、aPD-L1、APCP+aPD-L1、APCP@CaP、aPD-L1@CaP和aPD-L1/APCP@CaP，在第4、6和8天进行治疗。在第10天，接种了次级远端肿瘤，并对其生长情况进行了20天的监测。 每种治疗方法对远端肿瘤的治疗效果与其对原发肿瘤的效果相似，其中aPD-L1/APCP@CaP显示出最显著的抑制作用，抑制率超过95%。为了阐明免疫记忆效应的机制，研究人员使用流式细胞术测量了远端肿瘤中效应记忆T细胞（TEM）的水平。结果显示，在使用aPD-L1/APCP@CaP治疗后，远端肿瘤中TEM细胞数量显著增加，证实了纳米颗粒能够激活长期免疫记忆，从而防止肿瘤转移和复发。 结论 04 本研究证明，CaP纳米颗粒在协同递送aPD-L1和APCP方面具有潜力，可同时解决增强治疗效果和减少毒性这两个在黑色素瘤免疫治疗中面临的挑战。协同递送系统诱导的免疫记忆效应凸显了其预防肿瘤复发和转移的潜力，提供了一种持久而强大的治疗选择。这种创新策略为黑色素瘤和其他癌症的联合疗法的制定提供了新的途径，为更有效、更安全的免疫疗法治疗铺平了道路。 【参考资料】 https://onlinelibrary-wiley-com.libproxy1.nus.edu.sg/doi/10.1002/advs.202410545 【关于投稿】 转化医学网（360zhyx.com）是转化医学核心门户，旨在推动基础研究、临床诊疗和产业的发展，核心内容涵盖组学、检验、免疫、肿瘤、心血管、糖尿病等。如您有最新的研究内容发表，欢迎联系我们进行免费报道（公众号菜单栏-在线客服联系），我们的理念：内容创造价值，转化铸就未来！ 转化医学网（360zhyx.com）发布的文章旨在介绍前沿医学研究进展，不能作为治疗方案使用；如需获得健康指导，请至正规医院就诊。 热门推荐活动 点击免费报名 🕓 线上｜2024年12月6日-2025年1月16日 ▶ 《我的2024》 🕓 全国｜2024年12月-2025年03月 ▶ 中国转化医学产业大会 🕓 上海｜2025年02月28日-03月01日 ▶ 第四届长三角单细胞组学技术应用论坛暨空间组学前沿论坛 点击对应文字 查看详情